Оптимизированный протокол для кишечных булочек и иммунофлуоресцентного окрашивания тканей, залитых парафином

Краткое содержание

Кишечник жизненно важен для пищеварения и всасывания. Каждый регион – двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, толстая кишка – выполняет различные функции благодаря уникальным клеточным структурам. Изучение физиологии кишечника требует тщательного анализа тканей. Этот протокол описывает фиксацию и обработку тканей с использованием швейцарского вала, обеспечивая точное иммуноокрашивание за счет правильного сохранения и ориентации тканей.

Аннотация

Кишечник – сложный орган, состоящий из тонкой и толстой кишки. Тонкую кишку можно разделить на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку. Каждая анатомическая область кишечника обладает уникальной функцией, которая отражается в различиях в клеточной структуре. Исследование изменений в кишечнике требует глубокого анализа различных областей тканей и клеточных изменений. Чтобы изучить кишечник и визуализировать большие куски ткани, исследователи обычно используют технику, известную как кишечные швейцарские булочки. При этой методике кишечник делится на каждую анатомическую область и фиксируется в плоской ориентации. Затем ткань аккуратно сворачивают в рулон и обрабатывают для заделки парафина. Правильная фиксация и ориентация тканей — это часто упускаемый из виду лабораторный метод, но он критически важен для последующего анализа. Кроме того, неправильное швейцарское скручивание кишечной ткани может повредить хрупкий эпителий кишечника, что приведет к ухудшению качества тканей для иммуноокрашивания. Обеспечение хорошо закрепленной и правильно ориентированной ткани с неповрежденными клеточными структурами является важным шагом, обеспечивающим оптимальную визуализацию клеток кишечника. Мы представляем экономичный и простой метод изготовления рулетов, включающий все отделы кишечника в один блок, залитый парафином. Мы также описываем оптимизированное иммунофлуоресцентное окрашивание кишечной ткани для изучения различных аспектов кишечного эпителия. Следующий протокол предоставляет исследователям исчерпывающее руководство по получению высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, метода Swiss-roll и иммуноокрашивания. Использование этих усовершенствованных подходов позволяет сохранить сложную морфологию кишечного эпителия и способствует более глубокому пониманию физиологии кишечника и патобиологии.

Введение

Клеточная архитектура кишечника представляет собой уникальную проблему в поддержании его структурной целостности, когда кишечная ткань сохраняется для иммуноокрашивания. Тонкая кишка состоит из удлиненных пальцевидных структур, известных как ворсинки¹. Эти ворсинки часто деформируются в процессе внедрения. Обеспечение того, чтобы исследователи располагали методами правильного встраивания кишечника для получения поперечных сечений, позволяющих визуализировать все области кишечника, а также слои, составляющие кишечник (т.е. собственную мышечную мышцу, слизистую оболочку и серозу), имеет решающее значение для надежного^{экспериментального анализа.} Недостаточная фиксация, чрезмерная фиксация и неправильное обращение с тканями нарушают целостность тканей, что приводит к непреднамеренному повреждению эпителия кишечника ^3,4. Повреждение эпителия кишечника на этих этапах может значительно снизить качество последующих анализов, таких как иммунофлюоресценция, независимо от эффективности протоколов иммуногистохимии и используемых антител.

Иммуноокрашивание, как и правильная фиксация тканей, является важной частью биомедицинских исследований. При правильном подходе иммуноокрашивание может пролить свет на ранее неизвестные аспекты клеточной структуры и функции. Иммунофлуоресцентное окрашивание парафиновых срезов может быть затруднено из-за физико-химических изменений, возникающих в процессе фиксации и встраивания парафина⁵. Фиксация и встраивание парафина приводят к маскировке антигена, которая может препятствовать иммунофлуоресцентному детектированию эпитопов, представляющих интерес⁶. Отсроченная фиксация может индуцировать протеолитическую деградацию, что приводит к ослаблению или отсутствию окрашивания критических эпитопов⁷. Кроме того, антитела часто неточны и имеют высокий уровень фона. Протоколы иммуноокрашивания, которые способствуют последовательному и специфическому связыванию антител и высокому соотношению сигнал/шум, могут предоставить ценную информацию для исследователей.

Здесь мы предоставляем комплексный протокол, предназначенный для получения высококачественных иммунофлуоресцентных изображений с помощью фиксации кишечной ткани, подготовки швейцарского рулона⁸ и иммуноокрашивания. Подчеркивая рекомендации по сохранению целостности кишечника, протокол направлен на то, чтобы предоставить исследователям надежную методологию для повышения качества и надежности исследований иммунофлуоресцентной визуализации. Мы также стремились использовать экономически эффективные ресурсы, включая фильтровальную бумагу и самодельный забор антигенов, блокирующие растворы и разбавители антител, чтобы сделать протокол более доступным для лабораторий, которые могут иметь ограниченное финансирование. Как и в случае со всеми экспериментальными протоколами, исследователи должны оптимизировать текущий протокол, исходя из своего экспериментального подхода и областей интересов.

Протокол

Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины одобрил весь уход, содержание и лечение животных. Кишечная ткань была собрана у взрослых мышей C57BL/6J (самцы и самки в возрасте 3-5 месяцев, массой около 30 г) для использования в настоящем исследовании.

1. Фиксация тканей кишечника

1. Осторожно извлеките весь кишечник усыпленной мыши и поместите его в весовую лодку или чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
2. Извлеките кишечник из ПБС и с помощью ножниц аккуратно удалите лишний жир и соединительную ткань. Разрезание соединительной ткани помогает ткани лежать ровно на последующих этапах.
3. Разделите кишечник на отдельные сегменты с помощью ножниц (т.е. двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, слепую кишку и толстую кишку). Разделите сегменты в зависимости от анатомических особенностей и/или длины, при этом примерно 13% длины кишечника приходится на двенадцатиперстную кишку, 58% - на тощую кишку, 8% - на подвздошную кишку, 6% - на слепую кишку, а на толстую кишку - 15%⁹. Двенадцатиперстная кишка следует за желудком, а подвздошная кишка — это конечный отдел тонкой кишки непосредственно перед слепой кишкой.
4. Освободите толстую кишку, разрезав ножницами место ее соединения с слепой кишкой. Поместите двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку и толстую кишку в весовую лодку или чашку Петри PBS. Выбросьте слепую кишку или зафиксируйте ее по другим опубликованным способам¹⁰.
5. Прикрепите наконечник для пипетки P200 к шприцу объемом 10 мл, отрезав большой конец наконечника лезвием бритвы. Наполните шприц PBS.
6. Введите наконечник шприца в отверстие кишечного сегмента с помощью щипцов. С помощью щипцов удерживайте кишечный сегмент на шприце и осторожно промойте со скоростью ~50 мкл/с, чтобы удалить содержимое кишечника. Соберите содержимое кишечника в пустую лодку для взвешивания или чашку Петри.
7. Положите влажный кишечный сегмент по прямой линии на полоску целлюлозной фильтровальной бумаги с сухой этикеткой (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что кишечный сегмент достаточно влажный, чтобы правильно прилипнуть к сухой фильтровальной бумаге. Пометьте фильтровальную бумагу с помощью карандаша информацией о количестве мыши, генотипе, экспериментальной группе и т.д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ручки для маркировки фильтровальной бумаги может привести к потере этикеток во время фиксации.
8. С помощью ножниц для рассечения кишечника разрежьте его в продольном направлении по брыжеечной линии. Режьте ~5 мм за раз, используя нижний край ножниц или пару щипцов, чтобы положить разрезанную ткань на фильтровальную бумагу. Продолжайте до тех пор, пока весь участок кишечника не будет разрезан и положен на фильтровальную бумагу. Позаботьтесь о том, чтобы разрезать кишечник как можно более прямой линией, так как так будет легче сворачивать ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага можно использовать ножницы с шариковым наконечником, чтобы избежать повреждения тканей.
9. Положите еще один лист фильтровальной бумаги поверх кишечного сегмента. Убедитесь, что фильтровальная бумага облегает кишечный сегмент, предотвращая скручивание кишечника или потерю его уплощенной формы во время фиксации.
10. Скрепите края фильтровальной бумаги, чтобы закрепить салфетку на месте. Не сшивайте салфетку. Наложите на салфетку достаточное количество скоб, чтобы она не отделилась от фильтровальной бумаги во время фиксации.
11. Повторите шаги 1.5-1.10 для каждого из сегментов кишечника (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки и толстой кишки).
12. Погрузите ткани в 10% нормального буферного формалина (или фиксатор по выбору, такой как 4% параформальдегид, фиксатор Карноя и т.д.) на ночь при 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что вы правильно носите средства индивидуальной защиты, так как фиксаторы, такие как формалин, токсичны.

2. Скручивание и обработка кишечной ткани

ВНИМАНИЕ: Выполняйте действия 2.1-2.6 в вентилируемой вытяжке.

1. Аккуратно снимите верхний кусок фильтровальной бумаги (тот, который касается просветной стороны кишечника). С помощью щипцов осторожно отклейте кишечник от нижнего куска фильтровальной бумаги. Выбросьте фильтровальную бумагу.
2. Заполните три весовые лодки PBS. Промойте салфетку в PBS 3x, чтобы удалить формалин из ткани.
3. С помощью щипцов обратного действия (см. Таблицу материалов) возьмите кусочек кишечника по короткому краю просветной стороной вверх. Поверните щипцы, чтобы свернуть ткань. Используйте пару обычных щипцов, чтобы направлять ткань во время ее сворачивания. Если ткань сложилась, разверните ее и повторите попытку.
4. Поместите салфетку в сухую лодку или чашку Петри. Удерживайте ткань на месте щипцами в одной руке. Осторожно раскройте щипцы обратного действия и освободите ткань, используя другие щипцы для вытеснения ткани из щипцов обратного действия.
5. Вставьте в ткань рассекающий штифт размера 00 или мельчайший булавочный штифт (см. Таблицу материалов). С помощью кусачек удалите острый кончик булавки. Поместите салфетку в большую кассету, а затем поместите кассету в контейнер с 70% этанолом до готовности к обработке.
6. Повторите шаги 2.1-2.5 со всеми сегментами кишечника (двенадцатиперстной кишкой, тощей кишкой, подвздошной кишкой и толстой кишкой), поместив все четыре рулона ткани в одну большую кассету (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что кассета промаркирована карандашом, чтобы предотвратить смывание этикетки в растворах этанола и ксилола (см. Таблицу материалов).
7. После того, как все образцы будут свернуты, поместите образцы в тканевый процессор. Используйте следующие настройки для тканей кишечника: 70% этанол в течение 35 мин; 90% этанол в течение 35 мин; 95% этанол в течение 35 мин; 100% этанол в течение 35 мин, 3х; ксилол в течение 35 мин, 3х; парафин на 60 мин, 3х. Кассеты можно оставлять в расплавленном парафиновом воске на длительное время.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что вы носите надлежащее защитное снаряжение, так как ксилол является токсичным химическим веществом.

3. Встраивание тканей кишечника

1. Разогрейте большие закладные формы, чтобы парафин расплавился.
2. Извлеките кассеты из тканевого процессора и поместите их в стакан с расплавленным парафином.
3. На станции заделки поместите небольшое количество парафина в форму. Достаньте четыре рулета из кассеты и поместите их все в одну форму, выложив как можно ровнее. Добавьте еще парафина, чтобы заполнить форму.
4. Переместите форму на холодную плиту и убедитесь, что все швейцарские рулеты ровно лежат на дне формы. Поместите на форму крышку небольшой кассеты с маркировкой (см. Таблицу материалов) и при необходимости добавьте еще парафина.
5. Как только воск застынет, извлеките блок из формы. Теперь ткань готова к разрезанию на срезы размером 5 мкм и размещению на заряженных стеклянных предметных стеклах для иммуноокрашивания¹¹.

4. Адгезия тканей и подготовка предметного стекла

1. Чтобы подготовленный срез парафиновой ткани толщиной 5 мкм прилегал к предметному стеклу, стекло нагревают на нагревателе предметного стекла или нагревательном блоке, установленном на 60 °C в течение 15-30 минут. Горки также можно оставить нагревать на более длительный срок; Этот шаг не зависит от времени.
2. Дайте предметным стеклам остыть до комнатной температуры (~15 минут).

5. Депарафинизация

1. Начав депарафинизацию предметных стекол, следите за тем, чтобы ткань оставалась в растворе и не пересыхала в течение всего курса иммуноокрашивания.
2. Используйте штатив для слайдов (см. Таблицу материалов) для удержания стеклянных стекол и поместите их внутрь устойчивой к растворителям чашки (см. Таблицу материалов), заполненной реагентом для очистки/депарафинизации (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что реагент полностью покрывает ткань на каждом предметном стекле. Перед полным погружением предметных стекол в очищающий реагент несколько раз окуните или втолкните штатив для предметных стекол в раствор для очистки. Оставьте предметные стекла погруженными в воду на 10 минут или дольше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребоваться выполнить в вентилируемом вытяжном шкафу из-за опасных испарений, в зависимости от выбранного очищающего агента. Депарафинизация ткани на этом этапе не чувствительна ко времени, если используется нетоксичный очищающий агент.
3. Снимите и перемешайте штатив для слайдов, чтобы удалить излишки очищающего реагента. В новой посуде, устойчивой к растворителям, повторите шаг 5.2.
4. В новой посуде, устойчивой к растворителям, повторите шаг 5.3. Оставьте предметные стекла погруженными в воду на 15 минут или дольше. Этот шаг не зависит от времени.

6. Регидратация

1. Снимите и перемешайте штатив для слайдов, чтобы удалить излишки очищающего реагента. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 100% этанолом, опустите или встряхните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени. Повторите 2 раза.
2. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 100% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 95% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени. Повторите 1 раз.
3. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 95% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 70% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
4. Снимите и перемешайте решетку для слайдов, чтобы удалить излишки 70% этанола. В новую стойкую к растворителям посуду, наполненную 50% этанолом, опустите или втолкните решетку для слайдов несколько раз и оставьте предметные стекла погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
5. Снимите и перемешайте решетку, чтобы удалить излишки 50% этанола. В новую стойкую к растворителям чашку, наполненную деионизированной (DI) водой, опустите или встряхните решетку для слайдов несколько раз и оставьте слайды погруженными в воду на 5 минут. Этот шаг чувствителен ко времени.
   1. Чтобы сделать паузу, поместите предметные стекла в контейнер с PBS до тех пор, пока иммуноокрашивание не будет возобновлено после 5-минутного этапа регидратации воды.

7. Забор антигена

1. Заполните новую устойчивую к растворителям чашку подходящим буфером для извлечения антигена. Непосредственно перенесите направляющую стойку в это решение. Убедитесь, что предметные стекла полностью погружены в раствор для извлечения антигена, полностью покрывая ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные решения для получения антигена могут варьироваться в зависимости от конкретного используемого антитела. Извлечение антигена, необходимое для отдельных антител, может потребоваться определить исследователю.
   1. Чтобы сделать 1x буфер для извлечения цитратного антигена, добавьте 2,94 г дигидрата цитрата натрия (см. Таблицу материалов) на 1 л деионизированной воды. После того, как дигидрат цитрата натрия растворится, добавьте хлористый водород (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока раствор не достигнет pH 6. Наконец, добавьте 500 μL Tween20 (см. Таблицу материалов) на 1 л деионизированной воды.
   2. Чтобы сделать 1x Tris-EDTA буфер для извлечения антигена, добавьте 1,211 г Tris Base и 0,292 г ЭДТА в 1 л деионизированной воды. После растворения отрегулируйте pH до 9.
2. Накройте устойчивую к растворителям чашку, содержащую раствор для извлечения антигена, и горки крышкой и зафиксируйте крышку резинками.
3. Поместите надежную устойчивую к растворителям тарелку в скороварку (см. Таблицу материалов) на металлическую решетку или подставку. Убедитесь, что в скороварке достаточно воды, чтобы она достигала металлической решетки или подставки, чтобы давление могло нарастать.
4. Поставьте крышку на скороварку и поверните по часовой стрелке, чтобы зафиксировать крышку на месте. Поверните ограничительный клапан давления, который находится на крышке, в положение, установленное для давления.
5. В настройках меню выберите «Высокое давление в скороварке», затем в параметре «Время» установите скороварку на 30 мин. Выберите «Пуск».
6. Через 30 минут скороварка издаст звуковой сигнал и автоматически перейдет на режим поддержания тепла. Подождите, пока давление не ослабнет естественным образом и крышка свободно открутится.
7. Используйте термостойкие перчатки (см. Таблицу материалов), чтобы снять устойчивую к растворителям посуду из скороварки и снять резинку и крышку. Поместите блюдо на ледяную баню на ~30 минут, чтобы горки остыли до комнатной температуры. Этот шаг не зависит от времени.
8. После охлаждения до комнатной температуры снимите решетку для слайдов с устойчивой к растворителям чашки и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную деионизированной водой, чтобы удалить остаточный раствор для извлечения антигена. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду.
9. Извлеките решетку для слайдов из деионизированной воды и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную PBS, на 5 минут. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду. Этот шаг не зависит от времени.

8. Блокировка неспецифических фоновых окрашиваний

1. Подготовьте увлажненную камеру, взяв большую задвижку и сняв картонную крышку, прилипшую к крышке. У основания слайд-бокса положите влажные бумажные полотенца вертикально вниз. Убедитесь, что влажные бумажные полотенца лежат ровно.
2. Снимайте слайды по одному с решетки для слайдов, погруженной в PBS. Тщательно сотрите излишки PBS на предметном стекле, избегая салфетки.
3. С помощью гидрофобной ручки (см. Таблицу материалов) сформируйте барьер, который окружает ткань, нарисовав коробку вокруг ткани с помощью гидрофобной ручки. Будьте осторожны, избегайте ткани и не используйте гидрофобную ручку слишком близко к ткани.
4. Положите намеченную горку горизонтально на влажные бумажные полотенца. Добавьте блокирующий буфер, чтобы покрыть ткань (~100 μл).
   1. Чтобы сделать блокирующий буфер, добавьте 100 мкл холодноводного желатина рыбьей кожи (Teleostein Gelatin; см. Таблицу материалов) в 9,85 мл PBS. Наконец, добавьте 50 мкл 20% Triton X-100 (см. Таблицу материалов) и перемешайте до полного растворения.
5. Повторите шаги 8.2-8.4 для каждого слайда. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 90 минут.

9. Блокировка мышкой

1. При использовании первичного мышиного антитела для иммуноокрашивания тканей мыши выполните дополнительный этап блокирования. реагенты-блокаторы «мышь на мыши» (блок «мышь на мыши»; см. Таблицу материалов) имеются в продаже; Следуйте рекламной инструкции при подготовке блока «мышь на мыши».
2. Аккуратно постучите по блокирующему раствору и сразу же добавьте подготовленный блок мыши-на-мыши, чтобы покрыть ткань (~100 μл). Повторите то же самое для каждого предметного стекла, содержащего мышиную ткань, которая будет окрашена с помощью первичного антитела, выращенного у мышей.
3. Срезы тканей инкубировать в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 15 минут.
4. Извлеките предметные стекла из увлажненной камеры и поместите их непосредственно в решетку для слайдов, погруженную в PBS. Оставьте слайды в PBS на 5 минут, чтобы смыть блок мыши-на-мыши.

10. Первичные антитела

1. Для каждого слайда выберите первичные антитела, которые вырабатываются у разных видов. Разведите первичные антитела в разбавителе антител в соответствии с инструкцией производителя. Использовали следующие первичные антитела: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATENIN (1:200) и LAMP1 (1:50).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если производитель не предоставляет рекомендуемых разведений, разведение 1:100 является хорошей отправной точкой. Если первичное антитело, представляющее интерес, конъюгировано с флуорофором, см. шаг 12.2.
   1. Чтобы сделать антитело разбавителем, добавьте блокирующий буфер 1:20 в PBS, если используется описанный выше буфер, блокирующий рыбий желатин.
2. Извлеките предметные стекла из PBS или из увлажненной камеры, аккуратно постучите излишки блокирующего раствора или PBS и поместите их горизонтально обратно в увлажненную камеру. Убедитесь, что барьер, созданный с помощью гидрофобной ручки на шаге 8.3, остается; При необходимости еще раз наметьте ткань.
3. Добавьте соответствующим образом разведенные первичные антитела, представляющие интерес, чтобы покрыть ткань (~100 μL).
4. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла на ровной поверхности при температуре 4 °C в темноте на ночь.

11. Мытье горок

1. Извлеките предметные стекла из увлажненной камеры, аккуратно постучите по первичным антителам и поместите предметные стекла в решетку для предметных стекол, погруженную в PBS, на 5 минут.
2. Снимите решетку и поместите ее в новую устойчивую к растворителям чашку, наполненную PBS, на 5 минут. Повторите шаг 1 раза.

12. Вторичное окрашивание антител и ядер

1. Для каждого слайда выберите флуорофоры вторичных антител, предназначенные для связывания с первичными формами антител. Разведите флуорофоры вторичных антител или конъюгированные первичные антитела в разбавитель вторичных антител. В качестве вторичных антител использовались donkey anti-goat 488 (1:200), donkey anti-rabbit cy3 (1:200), donkey anti-mouse 647 (1:200), donkey anti-rabbit 647 (1:200) и donkey anti-rat cy3 (1:200). Первичное антитело γ-ACTIN, конъюгированное с флуорофором 647, использовали в разведении 1:100.
   1. Чтобы получить вторичный разбавитель антител, добавьте блокирующий буфер 1:100 в PBS, если вы используете буфер, блокирующий рыбий желатин, как описано выше.
2. Снимите предметные стекла с PBS, аккуратно постучите по излишкам PBS и поместите их горизонтально обратно во увлажненную камеру. Убедитесь, что барьер, созданный с помощью гидрофобной ручки на шаге 8.3, остается; При необходимости еще раз наметьте ткань.
3. Добавьте соответствующим образом разведенные флуорофоры вторичных антител или конъюгированные первичные антитела, представляющие интерес, для покрытия ткани (~100 мкл).
4. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч.
5. Разведите 10 мг/мл Hoechst (см. Таблицу материалов) или DAPI с использованием PBS до конечной концентрации 1 мкг/мл Hoechst или DAPI с использованием PBS и добавьте непосредственно в ткань (~100 μл). Выдерживать 5 минут при комнатной температуре в темноте.
6. Выньте предметные стекла из увлажненной камеры и поместите их в решетку для слайдов, которая погружается в PBS на 5 минут в темноте.
7. Снимите решетку и поместите в новую устойчивую к растворителям посуду, наполненную PBS, на 5 минут в темноте. Повторите шаг 1 раза.

13. Монтаж и подготовка к микроскопии

1. Извлекайте по одному слайду за раз из штатива для слайдов, погруженного в PBS, сохраняя оставшиеся слайды погруженными в PBS в темноте. Аккуратно постучите излишки PBS и, при необходимости, используйте безворсовую салфетку, чтобы осторожно стереть излишки PBS со стекла, избегая салфетки.
2. Добавьте одну-две капли монтажного средства с защитой от выцветания (см. Таблицу материалов) в центр ткани.
3. Держите чистый покровный стекло (см. Таблицу материалов ) за края и медленно опустите его на предметное стекло под углом 45°. Убедитесь, что монтажная среда равномерно распределена по ткани.
4. Начиная с центра ткани, осторожно надавите на покровный лист двумя пальцами, чтобы удалить пузырьки воздуха и излишки монтажной среды. При необходимости продолжайте надавливать по направлению к краям и поддерживайте мягкое давление на протяжении всего движения.
5. Отрежьте маленький конец нефильтрованной пипетки P200 и прикрепите его к кончику серологической пипетки, подключенной к вакууму.
6. Следуя за краями покровного стекла, используйте пылесос, чтобы удалить излишки монтажной среды.
7. В новой коробке слайдов горизонтально положите предметное стекло и дайте ему высохнуть в темноте при комнатной температуре.
8. Повторите этот процесс для каждого слайда.

Результаты

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) проводили, как описано ранее¹². Используя оптимизированный метод, кишечные швейцарские булочки включали в себя все три сегмента тонкой кишки и толстой кишки на одном слайде. Размещение всего кишечника на предметном стекле позволяет исследователям анализировать изменения во всех отделах кишечника и экономит затраты на срезы и окрашивание реагентов (рис. 1). Кроме того, одновременное воздействие одних и тех же растворов на все сегменты кишечника при иммуноокрашивании помогает обеспечить точные результаты. Микрофотография H&E демонстрирует сохранившуюся архитектуру кишечника всех отделов тонкой и толстой кишки (рис. 2). Измерение ворсинок двенадцатиперстной кишки не показало существенной разницы в высоте ворсинок в неоткрытой кишечной ткани по сравнению с этим методом Swiss roll, что позволяет предположить, что вскрытие кишечника не нарушает архитектуру ткани (рис. 2D). Иммуноокрашивание кишечных булочек показывает различные слои кишечника, а также всю ось ворсинчатой крипты. Флуоресцентные изображения демонстрируют низкие фоновые уровни окрашивания первичными и вторичными антителами и четко изображают отдельные клетки, присутствующие в эпителии. На рисунке 3 показана морфология различных сегментов кишечника и окрашивание бокаловидных клеток (MUC2-положительных клеток)¹³, апикальной мембраны (γ-АКТИН)¹⁴, латеральной мембраны эпителиальных клеток (E-CADHERIN)¹⁵ и ядер. Этот протокол подходит для идентификации многих различных клеточных компартментов, включая пролиферативные клетки (PCNA)¹⁶, интерстиций (ЛАМИНИН; Рисунок 4А) ¹⁷, лизосомальный домен (LAMP1)¹⁴ и эпителий (β-КАТЕНИН; Рисунок 4В) ¹⁸.

Рисунок 1: Рабочий процесс приготовления и обработки кишечных швейцарских булочек. (A) Кишечные сегменты промываются шприцем, содержащим PBS, а затем промываются в PBS. (В) Влажная кишечная ткань затем помещается на сухую фильтровальную бумагу. (В) Кишку разрезают в продольном направлении на фильтровальной бумаге и (Г) аккуратно расправляют. (E) На вскрытую кишку кладут кусок фильтровальной бумаги, а кишку аккуратно зажимают между фильтровальной бумагой и скрепляют. Кишечные сегменты фиксируются на ночь, а (F) сворачивается с помощью щипцов. (G) Кишечник аккуратно вытесняется щипцами обратного действия, и (H) имеет вид розетки. (И, Дж) Кишечную ткань прикалывают и помещают в большую кассету. (K) Все четыре кишечных сегмента помещаются в одну и ту же кассету для обработки тканей и внедрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Окрашивание гематоксилином и эозином всех четырех сегментов кишечника. (А) Сканирование плитки демонстрирует возможность визуализации всего кишечника на одном слайде с помощью отдельных швейцарских валиков двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки и толстой кишки. (B) Микрофотография кишечного швейцарского булочка и (C) вставка с большим увеличением, показывающая архитектуру ворсинок и крипты. (D) Количественная оценка длины ворсинок тонкой кишки в тонкой кишке не показывает существенной разницы между швейцарской свернутой тканью и неоткрытой тканью. Масштабные линейки = 1000 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Иммунофлуоресцентное окрашивание всех четырех сегментов кишечника. Взрослым мышам контрольной группы C57BL/6J иммуноокрашивали на ядра (голубой), маркер боковой мембраны, E-CADHERIN (зеленый), бокаловидные клетки, идентифицированные MUC2 (желтый), и маркер апикальной каймы, γ-ACTIN, (пурпурный). Масштабные линейки = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Иммунофлюоресцентное окрашивание кишечника. (А) Репрезентативная микрофотография иммунофлуоресцентного окрашивания кишечника мыши выделяет ядра (голубой), пролиферативные клетки, PCNA (зеленый) и собственно пластинку, ЛАМИНИН (пурпурный). (B) Иммунофлуоресцентное изображение, идентифицирующее ядра (голубой), маркер клеточной мембраны β-КАТЕНИН (зеленый) и лизосомный маркер LAMP1 (пурпурный) в кишечнике. Масштабные линейки = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В этой статье мы представляем оптимизированный метод фиксации тканей с использованием швейцарского валка для сохранения архитектуры кишечника и обеспечения точного иммуноокрашивания. После освоения эта методика может быть использована для исследования широкого спектра исследовательских вопросов, связанных с физиологией кишечника и клеточной биологией^. Несколько оптимизированных швейцарских методов прокатки были опубликованы и очень полезны^20,21. Преимуществом такой методики является легкость точного вскрытия кишечника на фильтровальной бумаге. Это позволяет зафиксировать ткань плоско, предотвращая скручивание ткани внутрь при скручивании, что особенно полезно при анализе воспаленной ткани с утолщенной мускулатурой. Кроме того, важно подчеркнуть решающую роль срезов тканей в достижении надежных результатов. Правильное срезирование обеспечивает сохранение архитектуры тканей и способствует точному иммуноокрашиванию, что в конечном итоге способствует успеху последующих анализов¹¹. Оптимизированный подход менее сложен по сравнению с другими протоколами, что дает стабильные результаты среди разных людей. Метод, представленный в этой статье, также обеспечивает хорошо сохранившуюся тканевую архитектуру, универсальность и высокую воспроизводимость иммуноокрашивания с использованием различных антител.

Важнейшим аспектом этого протокола является время фиксации и обработки. Неправильная фиксация и обработка тканей может нарушить гистохимические анализы. Чрезмерно зафиксированная ткань становится хрупкой, в то время как недостаточно зафиксированная ткань остается слишком мягкой. Как сверхфиксированные, так и недостаточно фиксированные ткани трудно поддаются разрезу и ставят под угрозу иммуноокрашивание. После препарирования на фильтровальной бумаге ткань должна быть немедленно помещена в формалин, чтобы уменьшить посмертные^{изменения.} В этом протоколе мышиная ткань фиксируется в формалине на ночь. В нескольких исследованиях использовалось время фиксации 20,23,24. Тем не менее, Boenisch et al. показали, что иммуноокрашивание стабильно в тканях, зафиксированных в формалине, в течение 4 дней²⁵ дней. В зависимости от требуемых анализов требуется оптимизация времени фиксации и фиксации. Например, фиксатор Карноя часто предпочтителен для окрашивания слизи²⁶. Выбор фиксаторов и длительность времени фиксации должны быть оптимизированы каждым исследователем в зависимости от его экспериментального подхода. Рекомендуется использовать автоматизированный тканевый процессор для обеспечения точного и стабильного времени обработки. В нашей лаборатории используются маленькие булавки для удержания кишечной ткани на месте в виде рулонов. Без штифтов ткань может развернуться во время обработки. Поскольку эти штифты довольно маленькие и острые, необходимо соблюдать меры предосторожности. Мы советуем использовать кусачки, чтобы удалить острый конец штифта перед обработкой тканей. Некоторые гистологические керны не принимают ткань со штифтами; Поэтому лучше всего проверить перед использованием. Альтернативный подход заключается в использовании агара для закрепления ткани перед обработкой²⁷ или в кассетах можно использовать кассетные губки для поддержания рулонов.

Иммуноокрашивание — это протокол, который требует оптимизации для каждого антитела. По возможности рекомендуется использовать антитела, подтвержденные нокаутом. Этот метод фиксации и обработки тканей приводит к прозрачному окрашиванию, что позволяет легко идентифицировать связывание антител по сравнению с фоновым сигналом при использовании невалидированных антител. Выбор фиксатора, извлечение антигена и разведение антител могут влиять на специфичность антитела. Мы рекомендуем исследователям тщательно оценить и оптимизировать протокол, регулируя фиксацию, извлечение антигена и время инкубации для каждого антитела. Для получения наилучших результатов антитела следует тестировать при различных разведениях для определения оптимальной концентрации и в различных буферах для извлечения антигена. Извлечение эпитопов улучшает иммуноокрашивание за счет разрушения метиленовых мостиков, образующихся во время фиксации. В этом протоколе используется извлечение эпитопов, индуцированное теплом, а не протеолитически-индуцированное извлечение эпитопов^{, поскольку} переваривание ферментов с большей вероятностью нарушает морфологию тканей. Наиболее распространенными буферами для извлечения эпитопов, индуцированными теплом, являются цитратный буфер, трис-HCl и трис-ЭДТА, причем цитратный буфер является наиболее щадящим по морфологии тканей²⁹. Выбор буфера варьируется и должен определяться для каждого антитела. Многие буферы для извлечения антигенов, блокирующие растворы и разбавители антител доступны в продаже. Однако эти решения могут быть крайне дорогими и непомерно дорогими. Мы предоставили рецепты распространенных растворов для извлечения антигенов, а также растворов для блокирования и разбавления антител для обеспечения экономической эффективности.

Ограничением этого метода является то, что фиксация и обработка могут изменить ткани и замаскировать эпитопы. Альтернативным подходом является иммуноокрашивание свежезамороженных тканей. Свежезамороженная ткань подвергается быстрой заморозке, что позволяет избежать воздействия токсичных фиксаторов, сохранить структуру белка и улучшить доступность некоторых эпитопов. Тем не менее, архитектура и морфология тканей хуже, чем у неподвижных и залитых парафином тканей. К другим проблемам, связанным со свежезамороженной тканью, относятся материалы и логистика, необходимые для секционирования и хранения замороженных блоков и стекол. Анализ швейцарских рулонов по сравнению с полосками кишечной ткани показывает различия в высоте и ширине ворсинок, а также различия в иммунных клетках в собственной пластинке, как описано в более раннем отчете³⁰. Эти результаты свидетельствуют о том, что кишечные булочки изменяют некоторые особенности кишечника, которые следует учитывать при планировании экспериментов. Кроме того, требуется повторная валидация антител, поскольку многие антитела, которые специфически связываются с тканью, залитой формалином, залитым парафином, плохо окрашиваются в свежезамороженной ткани³¹.

Иммуноокрашивание тканей кишечника может быть использовано для ответа на широкий круг вопросов, касающихся биологии и физиологии клеток желудочно-кишечного тракта. Этот метод широко используется для выявления эпителиальных изменений на фоне воспаления кишечника, после бактериальной инфекции и во время прогрессирования рака. Представленный здесь метод идеально подходит для сохранения кишечной ткани, поскольку он экономически эффективен, технически не сложен и легко воспроизводим. Чтобы обеспечить наилучшие результаты, мы поощряем оптимизацию шагов, изложенных в этом протоколе, на основе плана эксперимента и проверяемой гипотезы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Целлюлозная фильтровальная бумага	Cytiva	10427804	Толстая ватманская бумага
Заряженные стеклянные предметные стекла	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Препарирующие штифты размер 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	НИР D Systems	AF748
Морозильные перчатки	Tempshield	UX-09113-02
Нагревательный блок	Premiere	XH-2001	Подогреватель слайдов
Histo-Clear II	Электронная микроскопия Sciences	64111-04	Очищающий реактив
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Соляная кислота	Sigma Aldrich	320331
Гидрофобная ручка	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Большие кассеты	Tissue-Tek	4173
Minutien	Pins Fine Science Tools	NC9679721
реактив для блокировки мыши на мыши	Vector Laboratories	MKB-2213	Блок мыши-на-мыши
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Скороварка	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Монтажная среда
Щипцы обратного действия	Dumont	5748
Штатив для слайдов	Tissue-Tek	62543-06
Набор для окрашивания слайдов	Tissue-Tek	62540-01	Устойчивая к растворителям посуда и металлический каркас
Маленькие кассеты	Fisherbrand	15-200-403B
Дигидрат цитрата натрия	Биореагенты Fisher	BP327-1
Teleostein Желатин	Sigma	G7765	Блокирующий буфер
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Салфетки	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
&-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638