Иммунометаболические контуры при инфекции для продвижения терапии, направленной на хозяина

Краткое содержание

В данной работе представлен протокол проектирования, создания и поставки индуцируемой синтетической схемы на основе тетрациклина. Влияние синтетических схем на элиминацию паразитов и экспрессию цитокинов можно изучить путем канализации представленного трубопровода. Этот протокол актуален для исследователей, изучающих терапию на основе синтетических схем при инфекционных заболеваниях.

Аннотация

Иммунометаболизм является ключевым фактором, определяющим прогрессирование лейшманиоза. Подход, основанный на синтетической биологии, привлек значительное внимание как шаг к терапевтическому вмешательству, направленному на факторы, связанные с хозяином, которые вызывают лейшманиоз. Синтетическая биология включает в себя инженерию генетических компонентов ортогональным и модульным образом для точной модуляции биологических систем, наделяя клетки новыми функциями. В представленном исследовании выяснение систематического конвейера разработки синтетической схемы на основе индуцируемого тетрациклина-управляемого (TetON) синтетического контура было направлено на доставку сукцинатдегидрогеназы в качестве терапевтического агента, способствующего элиминации внутриклеточных паразитов Leishmania . Изложенный протокол описывает проектирование синтетической схемы и ее последующую валидацию. Предлагаемая стратегия также концентрируется на включении синтетических схем в плазмидную магистраль в качестве средства доставки. Кроме того, в клеточных линиях мышиных макрофагов был использован механизм доставки, использующий наночастицы на основе полиплексов для доставки синтетических цепей, без ущерба для клеточной морфологии. Проведена стандартизация метода для отбора трансфицированных клеток и определения оптимальной индукционной концентрации для экспрессии синтетических контуров. Наблюдения показывают заметное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки в трансфицированных клетках по сравнению с инфицированными клетками. Провоспалительные цитокины экспрессировались после инфицирования в трансфицированных и индуцированных клетках синтетического контура в качестве механизма, способствующего элиминации паразитов. Это подчеркивает, что метод, основанный на синтетической биологии, является мощным подходом к лечению лейшманиоза путем воздействия на факторы хозяина, связанные с прогрессированием заболевания.

Введение

Развитие холистической, интегративной медицины является важной связью, которая была выявлена между метаболическими изменениями в иммунных клетках и их способностью модулировать фенотип иммунных клеток при инфекционных заболеваниях. Иммунометаболизм открывает новые перспективы для выяснения патогенеза распространенных инфекционных заболеваний у человека. Кроме того, в нем представлены перспективные методы разработки вакцин и лекарственных препаратов путем выявления новых мишеней для вмешательства¹. Метаболическое перепрограммирование иммунных клеток выявлено при различных инфекционных заболеваниях, включая лейшманиоз. Leishmania spp. отвечает за возникновение лейшманиоза, из которого Leishmania major (L. major) вызывает кожный лейшманиоз (CL). L. Основные паразиты оказывают значительное влияние на метаболизм клеток хозяина, особенно в макрофагах, для пролиферации и выживания в качестве внутриклеточных паразитов². Макрофаги, как правило, могут поляризоваться либо на классически активированные (M1), либо альтернативно активированные (M2) субпопуляции, где клетки M1 обладают высокой секрецией провоспалительных цитокинов и продукцией оксида азота (NO) в результате метаболизма форм азота. Клетки М2 демонстрируют повышенный уровень противовоспалительных цитокинов и проявляют высокую активность аргиназы за счет метаболизма азота³. Таким образом, оба фенотипа различаются не только по иммунному ответу, но и по метаболическим путям.

Системная биология лейшманиоза направлена на идентификацию молекулярных мишеней для разработки новых методов лечения путем проектирования и разработки лекарств. Реконструкция сигнальных сетей и метаболических путей помогает понять лейшманиоз как целостную модель и позволяет получить представление о главном компоненте, вызывающем заболевание. Математическое моделирование является одним из наиболее предпочтительных прикладных аналитических подходов для понимания сложностей лейшманиоза⁴. Иммунометаболические сети и математические модели позволили идентифицировать сукцинатдегидрогеназу (SDHA) как ключевой компонент фенотипа M1, который экспрессируется для элиминации паразита⁵. Синтетическая биология находит применение в диагностике, разработке вакцин и терапии лейшманиоза. Метаболизм, нацеленный на модуляцию иммунного ответа, может быть достигнут с помощью инструментов синтетической биологии. Для модуляции инозитолфосфорилцерамидсинтазы, которая регулирует метаболизм сфинголипидов и изменяет иммунную сигнализацию хозяина, генетическая цепь, обладающая бистабильным поведением, была использована для синтетической настройки внутренней устойчивости модели инфекции L. major ^6,7. Таким образом, системы и синтетическая биология могут обеспечить основанную на моделях генную инженерную платформу для развития точной медицины в модельной системе Leishmania.

Фенотип М1 характеризуется экспрессией иммунометаболических сигнальных сетей, в которых выработка воспалительных цитокинов и метаболических путей синергетически усиливает элиминацию паразитов. Поляризация М1 означает выработку провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-12 (IL-12), интерферон-гамма (ИФН-γ) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Метаболические пути, которые высоко обогащены в фенотипе М1, включают гликолиз, пентозофосфатный путь и усеченный цикл трикарбоновых кислот (цикл ТСА)⁵. Усеченный цикл ТСА управляет механизмом уничтожения паразитов за счет повышения уровня сукцината и цитрата, которые управляют производством^NO3. Накопление сукцината SDHA приводит к активации транскрипционного фактора гипоксии-индуцируемого фактора 1-альфа (HIF-1α), который индуцирует продукцию IL-1β⁸. При фенотипе М2 наблюдается окисление жирных кислот, увеличение утилизации глутамина и усиленное окислительное фосфорилирование глюкозы наряду с продукцией противовоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-10 (ИЛ-10), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), интерлейкин-4 (ИЛ-4) и интерлейкин-13 (ИЛ-13)³. Отличительной особенностью M2 являются удлиненные митохондрии, что приводит к повышению эффективности производства энергии. Они используют жирные кислоты, глюкозу и глутамин в качестве субстратов для подпитки цикла ТСА, тем самым генерируя АТФ путем окислительного фосфорилирования с более высокой скоростью, способствуя росту^и пролиферации паразитов. Фермент SDHA, ответственный за накопление сукцината через усеченный ТСА, может не только способствовать образованию NO, но и инициировать зависимое от сукцината потребление кислорода посредством электронного транспорта¹⁰. У макрофагов, инфицированных лейшманией, SDHA подавляется в 2,17 раза, что указывает на то, что аэробное дыхание также может быть подавлено¹¹. Для увеличения потребления сукцината для индуцирования провоспалительной цитокин-опосредованной продукции NO и содействия элиминации паразитов необходима экспрессия SDHA.

Синтетическая схема предлагает прецизионно-направленную терапию, которая может изменить больную систему для достижения бистабильной осцилляции, которая может восстановить здоровый фенотип на пространственно-временном уровне. Подача и экспрессия синтетической схемы делают систему динамичной и надежной. Одним из ключевых факторов, способствующих развитию синтетической биологии, является способность собирать генетические части и элементы модульным образом, что позволяет создавать сложные архитектуры и индивидуальные функциональные возможности^. Ограничения, связанные с традиционными методами экспрессии, стимулировали появление индуцируемых плазмидных синтетических схем на основе тетрациклинового оперона, что позволило быстро оценить плазмиду и легко доставить ее через различные типы клеток^. Тетрациклин-чувствительный репрессорный белок (TetR), когда он существует в виде димера, проявляет сильное сродство связывания с тет-опероном (TetO), эффективно подавляя транскрипцию. Однако при взаимодействии его лиганда, доксициклина (докса), TetR претерпевает структурное изменение, приводящее к его диссоциации от TetO, что позволяет транскрипции протекать беспрепятственно. Эта схема может демонстрировать контроль трансляции белка¹⁴. Таким образом, с помощью определенной методики разработанная синтетическая схема индуцированной плазмиды на основе тетрациклинового оперона получила возможность экспрессировать SDHA в векторе pEGFP-N1. Оценка эффективности преобразования контура и его производительности позволила получить представление о компетентности поставщика. Путем рестрикционного расщепления вектора было подтверждено определение эффективности клонирования. Кроме того, трансфицированная клеточная линия мышиных макрофагов RAW264.7, полученная из перитонеальных макрофагов мышей Balb/c, была обнаружена на предмет дозозависимой экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) доксициклина в трансфицированных клетках. Кроме того, эффект элиминации паразитов в трансфицированных клетках был подтвержден экспрессией синтетической цепи. Кроме того, наблюдалась индукция и экспрессия провоспалительных цитокинов, которая была направлена через увеличение временной точки инфекции в трансфицированных и индуцированных клетках синтетического контура, что было непосредственно связано с функционированием синтетического контура.

Протокол

1. Культивирование клеток RAW264.7

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используйте низкие номера проходов. Клеточная линия RAW264.7 была закуплена в Национальном клеточном репозитории Совета по инновациям в области биотехнологических исследований - Национального центра клеточных наук (BRIC-NCCS), Пуна. Поскольку клеточная линия RAW264.7 является линией макрофагальных клеток, она может начать дифференцироваться с увеличением пассажей. После оживления клеток используют клеточную линию для трансфекции через 2 пассажа.

1. Засейте 5 x 10^{5 клеток} клеточной линии RAW264.7^{в колбу} размером 25 см 2 с добавлением 5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 100 МЕ/мл пенициллина в качестве полной среды.
2. Храните клетки для роста и пролиферации в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C до тех пор, пока не будет достигнута 90% конфлюенция.
3. Выбросьте носитель и промойте 3 раза 1x фосфатным буферным раствором (PBS). Добавьте в колбу 1 мл PBS, соскребите клетки скребком и соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 5 минут при 24 °C и повторно суспендируйте гранулу с помощью пипетки объемом 1 мл в 1 мл полной среды DMEM.
5. Подсчитайте клетки в камере подсчета клеток, используя 0,5% трипанового синего, чтобы определить процент живых клеток.

2. Культура клеток L. major parasite

ПРИМЕЧАНИЕ: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) был подарком от BRIC-NCCS. Промастиготы должны иметь номер прохода меньше 10. Более низкое число пассажей гарантирует, что паразит здоров и его способность заражать макрофаги выше.

1. Выращивайте L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 20% FBS в качестве полной среды.
2. Семена 1 х 10⁶ промастигот в невентилируемую колбу 25 см² колбы, содержащую 5 мл готовой среды. Инкубируйте колбу при температуре 27 °C в течение 5 дней и наблюдайте в светлопольный микроскоп за паразитом в неподвижной фазе L. major при 20-кратном увеличении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промастиготы в стационарной фазе могут быть получены через 4-7 дней после культивирования. Для них характерно удлиненное жгутиковое состояние и сниженная подвижность.

3. Проектирование синтетической схемы в плазмиде в качестве вектора доставки

1. Проектирование деталей синтетической схемы
   1. Откройте программу Tinker cell и перейдите на вкладку «Детали». Выберите компонент Promoter из библиотеки и поместите его на холст, чтобы символизировать промотор цитомегаловируса (CMV) в синтетической цепи. Извлеките сайт связывания репрессора, аналогичный TetO, с вкладки «Детали» и расположите его рядом с промотором на холсте, органично интегрировав его с промотором CMV.
   2. Включите оператор тетрациклина (TetO), внутренние сайты входа рибосом (IRES) и кодирующую область, перетащив сайт связывания репрессора, сайт связывания рибосом (rbs) и кодирующую область на холст, интегрируя их с существующими генетическими компонентами.
   3. Переименуйте кодирующую область в TetR, обозначая тетрациклин-чувствительный репрессор, который функционирует как предполагаемый негативный регулятор в синтетической цепи. Объедините эти генетические элементы, чтобы облегчить создание синтетических деталей.
   4. Добавьте на холст спейсерную область (sd1), предназначенную для расщепления клеточными протеазами, такими как teschovirus-1 2A (P2A) свиньи. Введите дополнительную кодирующую область, представляющую интересующий ген, пометьте ее как SDHA в синтетическую конструкцию и интегрируйте ее с другими элементами.
   5. Рядом с кодирующей областью SDHA интегрировать еще одну расщепляемую область протеазы (sd2), которая будет расщепляться клеточной протеазой P2A. Введите кодирующую область, представляющую репортерный ген, и пометьте ее как GFP в конструкцию.
      Примечание: Экспрессия GFP может обеспечить оценку производства SDHA и гарантировать, что синтетическая схема имеет логическое функционирование¹³.
   6. Рядом с GFP добавьте терминатор (ter1) и проверьте собранные детали, проверив, все ли детали соединены. Цепь должна отображаться красным цветом при нажатии на любую деталь. Это подтверждает формирование функциональной генетической цепи.
   7. На вкладке Реакция назначьте регуляторные скорости, которые включают параметры и начальные значения для производства белка, TetR, SDHA и GFP, чтобы очертить реакцию трансляции в синтетическом контуре.
   8. Добавьте маленькую молекулу с вкладки «Детали», назовите ее «Доксициклин» (dox) и назначьте ей волновую функцию, выбрав «Вход » на вкладке «Детали и соединение», а затем нажав на «Волновой ввод».
   9. На вкладке «Регулирование » нажмите « Реакция на подавление». Перетащите Скорость реакции на холст между dox и TetR. Установите кинетику реакции между dox и TetR, дважды кликнув по значку Wave Function на dox и установив Doxyxycline.sin.amplitude на 10.
   10. Реализуйте транскрипционную регуляторную реакцию между белком TetR и сайтом связывания репрессора, выбрав реакцию на вкладке «Регуляция » и поместив ее на холст между TetR и TetO.
   11. Дважды щелкнув по каждому компоненту и реакции, установите начальную концентрацию и параметр для моделирования. Нажмите на Simulation, выберите Deterministic и смоделируйте цепь для 100 единиц времени. Настройте график моделирования с панели управления, которая появляется вместе с графиком, и наблюдайте за картиной графика для белков SDHA и TetR.
2. Идентификация генетических компонентов из реестра деталей iGEM
   1. Откройте Реестр стандартных биологических частей (Таблица материалов) и нажмите на кнопку «Поиск». Введите название генетического компонента, например, промотор ЦМВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс поиска iGEM ID должен быть выполнен для всех генетических компонентов синтетической цепи. Перечислены шаги по идентификации идентификатора iGEM промоутера CMV; Впоследствии действия необходимо повторить для других компонентов.
   2. Чтобы получить нуклеотидную последовательность промотора ЦМВ, нажмите на опцию Get Part Sequence и сохраните файл в виде текстового файла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что запасы всех генетических частей доступны.
   3. Повторите шаги 3.2.1 и 3.2.2 для всех генетических частей (оператор тетрациклина, последовательность Козака, TetR, P2A и GFP), кроме SDHA.
   4. Чтобы получить кодирующую белок последовательность SDHA, откройте NCBI и выберите Nucleotide из выпадающего списка рядом с окном поиска. Тип Сукцинатдегидрогеназа и Mus musculus и поиск нуклеотидной последовательности.
   5. Нажмите на опцию CDS , чтобы получить последовательность кодирования SDHA и сохранить последовательность в текстовом файле.
   6. Последовательно объедините нуклеотидную последовательность всех генетических регуляторных частей в одном файле. Добавьте стартовый кодон (ATG) сразу после последовательности Козака и удалите внутренние стоп-кодоны, чтобы избежать образования зарождающихся полипептидов.
   7. Откройте веб-сайт ExPASy¹⁵ и вставьте последовательность нуклеотидов. Нажмите на опцию «Перевести последовательность ». Выберите 5'3' Frame 1 и удалите стоп-кодоны, которые будут выделены красным цветом в разделе результатов.
      Примечание: Чтобы определить, эффективно ли нуклеотидная последовательность транслируется в желаемую полипептидную последовательность, можно использовать инструмент трансляции, такой как ExPASy. Это обеспечивает профилактику нежелательных зарождающихся полипептидов. Выбор вектора pEGFP-N1 для экспрессии синтетической цепи является оптимальным, учитывая, что промотор ЦМВ и ген GFP ранее существовали в векторе. Все генетические части были собраны с использованием протокола клонирования (который был передан на аутсорсинг). Ферментами рестрикции, используемыми для клонирования вставок, являются NotI и XhoI. Эти сайты фермента рестрикции расположены в сайте множественного клонирования вектора pEGFP-N1.

4. Трансформация синтетического контура в клетках Escherichia coli (E.coli) DH5α

1. Получение компетентных клеток E.coli DH5α
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется автоклавирование реагентов. Реагенты можно хранить при температуре 4 °C до использования.
   1. Заквашивайте 1 мл свежего инокулюма в 50 мл бульона Лурия (LB) при температуре 37 °C, 180 об/мин. Выращивайте клетки в течение примерно 2 ч до тех пор, пока при длине волны 600 нм не будет достигнута оптическая плотность (OD) 0,4-0,6.
   2. Центрифугируйте ячейки при 4 696 x g при 4 °C в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость вручную в колбу для выброса, перевернув пробирку центрифуги объемом 50 мл и собрав клеточную гранулу.
   3. Осторожно суспендируйте гранулу в 2 мл ледяного 0,1 М хлорида магния (MgCl2) с помощью пипетки объемом 1 мл. Восполните объем до 20 мл ледяным MgCl_2.
   4. Центрифугируйте пробирку при давлении 4,696 x g в течение 10 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно ресуспендируйте клетки с помощью пипетки объемом 1 мл в 1 мл ледяного 0,1М хлорида кальция (CaCl₂) и инкубируйте на льду в течение 2 часов. Используйте только что изготовленные грамотные клетки для преображения.
2. Трансформация компетентных клеток с помощью синтетической схемной конструкции
   1. Отмерьте 50 мкл компетентных клеток и добавьте их в пробирку объемом 1,5 мл. Поставьте трубку на лед. Добавьте в аликвоту 10 нг синтетической схемной конструкции и держите на льду 3 минуты.
   2. Ячейки теплового шока при 42 °C в течение 3 мин на сухом нагревательном блоке. После завершения инкубации на сухом нагревательном блоке поместите клетки обратно на лед на 3 минуты, добавьте в ячейки 1 мл LB и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа при 250 об/мин.
   3. Когда инкубация завершена, центрифугируйте клетки при концентрации 4696 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл LB и нанесите его на LB агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина. Переверните планшет и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 24 часов.

5. Изоляция синтетической схемотехнической конструкции

1. В центрифужную пробирку объемом 50 мл возьмите 10 мл LB среды и добавьте 50 мкг/мл канамицина в качестве селекционного бульона для культивирования трансформированных клеток для выделения плазмид. Подберите трансформированную колонию с помощью наконечника объемом 200 мкл и добавьте его в выбранный бульон.
2. Используя петлю инокуляции, выберите еще одну колонию, проведите полосу с помощью пятиугольной техники и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 24 часов, чтобы сохранить изоляты одной колонии.
3. Выращивайте клетки в течение ночи при 180 об/мин при 37 °C. На следующий день центрифугируйте культуру при 4 696 x g в течение 20 мин при 24 °C. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пробирку, и добавьте в гранулу 1 мл ресуспендирующего буфера (50 мМ трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорида (Tris-HCl), 10 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 100 мкг/мл РНКазы А (pH-8,0)) и ресуспендируйте клетки путем осторожного пипетирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ресуспендирования буфера добавьте РНКазу А за 5 минут до добавления смеси в клеточную гранулу.
4. Инкубируйте смесь в течение 5 минут при RT. Добавьте 1 мл буфера для лизиса (0,2 N гидроксида натрия (NaOH), 1 % додецилсульфата натрия (SDS)) в клетки и перемешайте, перевернув пробирку в течение 2 минут. Инкубируйте пробирку в течение 5 минут при RT.
5. Добавьте в клетки 1 мл нейтрализационного буфера (3 М ацетата калия (CH₃CO₂K)) и перемешайте, многократно перевернув пробирку. Центрифугируйте клетки при давлении 4696 x g в течение 20 мин в режиме ОТ и соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл.
6. Добавьте 500 мкл изопропанола в надосадочную жидкость и хорошо перемешайте, инвертируя. Надосадочную жидкость инкубировать на льду в течение 15 минут, а затем центрифугировать при 12 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация может длиться от 5 минут до 1 часа. Во время этого рекомендуется аккуратно перемешивать содержимое, переворачивая каждые 5 минут.
7. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в гранулу 1 мл 70% этанола (охлажденного) и центрифугируйте при 12000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Повторите этот шаг еще раз.
8. Гранулу высушить на воздухе и ресуспендировать полученную плазмиду в 20 мкл стерильной безнуклеазной воды (НФВ). Измерьте концентрацию плазмиды на спектрофотометре на длине волны 260/280 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте больше NFW, если концентрация плазмид очень высока для оценки с помощью нанокапель. Процесс разведения плазмид необходимо проводить в ламинарном колпаке.

6. Электрофорез в агарозном геле (AGE) синтетического контура

1. Подготовка образца плазмиды к КПГ
   1. В пробирке объемом 1,5 мл отмерьте 20 мкл 1x трис-ацетата-ЭДТА (ТАЭ). Добавьте 4 мкл 6-кратного загрузочного буфера и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
   2. Придайте пробирке быстрый отжим, добавьте 1 г вектора плазмиды синтетического контура и хорошо перемешайте, пипетируя смесь. Эту реакционную смесь можно загрузить на агарозный гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тщательного пипетирования, так как это может повредить структуру плазмиды. Вместо этого дайте быстрый отжим для смешивания реагентов.
2. Сужение сбраживания в синтетическом контуре
   1. В пробирку объемом 1,5 мл добавьте 2 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 1 мкл NotI и 1 мкл рестрикционного фермента XhoI и хорошо перемешайте, дав содержимому быстро отжаться. Добавьте 1 г вектора плазмиды синтетического контура и придайте содержимому быстрый отжим.
   2. Увеличьте объем пробирки до 20 μл, добавив NFW к содержимому и придав пробирке быстрый отжим. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C в течение 1 ч.
   3. После инкубации держите пробирку при температуре 70 °C в течение 15 минут в сухом нагревательном блоке, чтобы деактивировать ферменты рестрикции. Охладите содержимое пробирки и добавьте в реакционную смесь 6 мкл загрузочного буфера. Перемешайте содержимое, дав тюбику быстро отжаться. Эту реакционную смесь можно загрузить на агарозный гель.
   4. Установите агарозный гель и запустите гель по ранее описанному протоколу¹⁶. Вкратце, загрузите по 20 мкл образцов в каждую лунку, загрузите 5 мкл 1 Кб лестницы ДНК и запустите гель при напряжении 100 В. Отключите источник питания после завершения электрофореза, получите гель на гелевом тепловизоре и включите флуоресценцию для просмотра полос.

7. Трансфекция конструкции синтетической схемы в клеточной линии RAW264.7

1. Подготовка образцов
   1. Подготовьте образцы для определения эффекта уничтожения паразитов с помощью индуцированной синтетической цепи. Первый образец – нетрансфицированные клетки RAW264.7 (контроль), второй – клетки RAW264.7, инфицированные промастиготами L. major в течение 6 ч (инфицированные 6 ч), третий образец – клетки RAW264.7, трансфицированные синтетическим контуром и индуцированные доксом (IMT), образцы момента заражения – клетки RAW264.7, трансфицированные синтетическим контуром и индуцированные доксом, инфицированные L. major промастиготы (IMTI) для разных временных точек 6 ч (6 ч IMTI), 12 ч (12 ч IMTI), 18 ч (18 ч IMTI) и 24 ч (24 ч IMTI).
   2. Чтобы подготовить все образцы, соскребите ячейки RAW264.7 из колбы 25^{см 2} и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
   3. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды DMEM. Возьмите 10 мкл ресуспендированных клеток в пробирку объемом 100 мкл, добавьте к клеткам 10 мкл 0,5% трипанового синего и хорошо перемешайте.
   4. Загрузите 10 μL смеси ячеек и трипанового синего цвета на предметное стекло камеры подсчета клеток и отсчитайте ячейки из 4 камер.
   5. Пластинчатые ячейки в покровном дне 96 луночных планшетов по 2 х 10 по⁴ ячейки в лунку и инкубируют клетки в течение 24 ч. Этот образец является контрольным. Этот этап остается постоянным для подготовки других образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно нагрейте среду до 37 °C на водяной бане.
   6. Для получения инфицированного образца в течение 6 ч центрифугируют 1 мл промастигот стационарной фазы L. major при давлении 7273 x g в течение 10 мин. Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл полной среды DMEM и проведите подсчет клеток в камере для подсчета клеток, выполнив шаги 7.1.3-7.1.4.
   7. Добавьте в лунку 2 x 10⁵л. основных промастигот и инкубируйте их с 5%_CO2 при 37 °C в течение 6 часов. После инкубации промойте клетки 3 раза с PBS.
   8. Чтобы получить образец IMT, засейте клетки, выполнив следующие шаги (7.1.2-7.1.5), и выполните этапы трансфекции 7.2.1-7.2.6.
   9. Для подготовки образцов временных точек IMTI выполните шаги 7.1.2-7.1.5 и выполните этапы трансфекции 7.2.1-7.2.6. Выбросьте полную среду DMEM, содержащую 500 мкг/мл генетина (G418) и 1 мкг/мкл докса, и промойте клетки 3 раза 1x PBS.
   10. Добавьте в лунки 2 x 10⁵л крупных промастигот и инкубируйте их в течение 6 часов, 12 часов, 18 часов и 24 часов. После заражения выбросьте промастиготы, содержащие DMEM в сборе, и промойте лунки 3 раза 1x PBS. Добавьте в клетки 200 μл полной среды DMEM, содержащей 500 μг/мл генетина (G418) и 1 μг/μл докса, и инкубируйте в течение 24 часов.
2. Трансфекция синтетического контура
   1. В пробирку объемом 1,5 мл добавьте 24 мкл среды с уменьшенным содержанием сыворотки, которая является улучшенной минимальной эфирной средой. В среду добавляют 1 г вектора pEGFP-N1, клонированного с помощью плазмиды синтетической схемы.
   2. В свежую пробирку объемом 1,5 мл добавьте 24 μL Minimal Essential Medium и добавьте 1 μL Polyethylenimine (PEI; 1 μг/μл). Хорошо перемешайте, пипетируя смесь не менее 10 раз, и инкубируйте при RT в течение 5 минут.
   3. Перенесите смесь PEI в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую смесь ДНК. Хорошо перемешайте с помощью пипетки по каплям не менее 10 раз. Инкубируйте ДНК: перемешайте ПЭИ при РТ в течение 10 минут.
   4. Сбросить фильтрующий материал из лунок на 96-луночных покровных пластинах и 3 раза промыть элементы PBS. С помощью пипетки аккуратно добавьте DNA:PEI по каплям к клеткам и осторожно встряхните пластину. Инкубируйте клетки с 5%_CO2 при 37 °C в течение 3 ч.
   5. После инкубации добавьте в клетки 200 μL свежей среды Minimal Essential Medium, осторожно встряхните планшет и инкубируйте в течение 24 часов с 5%_CO2 при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭИ является цитотоксичным; Следовательно, рекомендуется не инкубировать клетки после трансфекции более 24 часов.
   6. На следующий день выбросьте носитель и промойте ячейки 2 раза с PBS. Добавьте в клетки полнорационные среды DMEM, содержащие 500 мкг/мл генетина (G418) и 1 мкг/л докса, и инкубируйте в течение 24 ч.
3. Фиксация образцов для конфокальной микроскопии
   1. Чтобы зафиксировать все образцы, промойте клетки 1x PBS 3x, добавьте в клетки 100 μL 4% параформальдегида и инкубируйте при RT в течение 10 минут.
   2. Промойте клетки PBS 3x. После завершения промывки добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в клетки и инкубируйте при RT в течение 15 минут в темноте.
   3. После инкубации промойте клетки 3 раза с PBS. Наблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом на предмет экспрессии GFP и окрашивания DAPI.

8. Получение трансфицированных клеток с помощью конфокальной микроскопии и количественного определения

1. Очистите дно колодцев покровным стеклом с помощью впитывающей салфетки. Включите органы управления конфокальным лазерным сканирующим микроскопом. Далее включаем компрессор и ртутную лампу.
2. Для работы с машиной необходимо последовательно включать элементы управления микроскопом, управление сканирующей головкой, лазерный ключ, лазерный модуль, лампу, контроллер микроскопа и центральный процессор.
3. На компьютере откройте программу (Table of Materials) и нажмите на кнопку Enable XY Stage Control. Откроется всплывающее окно, которое попросит выполнить очистку для 7S3. Нажмите на Нет. Закройте динамический график и отрегулируйте экраны настроек.
4. Чтобы добавить к цели 60x, добавьте каплю иммерсионного масла, поместите нижнюю пластину покровного стекла на 96-луночную пластину на сцену и переместите сцену в плоскости X-Y, чтобы отрегулировать положение цели на скважине. Нажмите на окуляр и выберите Alexa-488 Channel. Нажмите на кнопку Shutter Off, чтобы сфокусировать ячейки на окуляре. Отрегулируйте окуляр по сердечнику и точной фокусировке.
5. Нажмите на кнопку Затвор включен на блоке управления микроскопом и переместите объектив, чтобы отрегулировать его положение и сфокусировать область интереса для наблюдения за ячейками в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC). Переключитесь в режим EPI на блоке управления микроскопа, чтобы наблюдать за клетками в фильтре длины волны Alexa-488 на предмет экспрессии GFP. Ячейки должны отображаться зеленым цветом.
6. Нажмите « Выключить затвор», перейдите в раздел «Создание изображений LSM» и выберите разрешение изображения как 1,024 x 1,024. Нажмите « Добавить фазу » и перетащите, чтобы добавить зеленый канал в качестве фазы.
7. В программе Olympus нажмите на LSM и далее нажмите на Live Button , чтобы наблюдать за ячейками в фазовом контрасте и канале Alexa 488nm. Нажмите Control и прокрутите, чтобы сфокусировать ячейки из программного обеспечения для захвата изображений.
8. Отрегулируйте усиление и смещение, чтобы отрегулировать интенсивность флуоресценции, регистрируемую детектором. Нажмите « Захватить», присвойте изображениям имя и нажмите « Сохранить».
9. В программном обеспечении для работы с изображениями нажмите « Файл», выберите все изображения с расширением .oir и нажмите « Открыть».
10. Нажмите на Вид плиток , чтобы визуализировать изображения во всех каналах. Чтобы добавить масштабную линейку к изображениям, нажмите « Просмотр », а затем выберите опцию «Масштабная линейка ».
11. Чтобы сохранить изображения из отдельных каналов в виде 16-битных оттенков серого, нажмите «Файл» и выберите «Экспортировать изображение». Выберите изображение и проверьте галочки на всех каналах. На вкладке выбора рамки в параметре разделенного просмотра выберите Да. На вкладке вывода выберите 24-битный цвет RGB с опцией прогрева информации и выберите tiff в качестве типа файла для изображения. В папке экспорта в выберите подходящее место для сохранения изображений и нажмите OK.
12. Чтобы сохранить объединенные изображения, выполните те же действия, за исключением того, что в параметре разделенного просмотра выберите «Нет», а на вкладке вывода выберите «Объединенные каналы с записью информации».
13. Чтобы проанализировать экспрессию GFP в ячейках, откройте Fiji в Windows и экспортируйте файл tiff. Выберите зеленый цвет для анализа выражения GFP.
14. Выделите область ячейки с помощью опции инструмента «От руки» и нажмите « Анализ» для измерения интенсивности флуоресценции. Повторите процесс для 3 изображений.
15. Экспортируйте данные в аналитическое программное обеспечение и выполняйте статистические тесты на основе количественных данных.

9. Анализ паразитарной нагрузки

1. Визуализируя клетки на конфокальном микроскопе, подсчитайте общее количество паразитов, присутствующих в отдельных макрофагах.
2. Случайным образом исследуйте 100 макрофагов и отметьте количество внутриклеточных паразитов. Проведите статистический тест между инфицированными и временными точками образцов IMTI для изучения влияния экспрессии SDHA на количество паразитов.

10. Количественное определение IL-10 и IL-12 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)

1. Подготовьте образцы в соответствии с шагами 7.1 и 7.2 и соберите среду в пробирку объемом 1,5 мл. Держите среду на льду или храните ее при температуре -20 °C до дальнейшего использования. Следуйте инструкциям руководства по эксплуатации комплекта и выполните ИФА для самолетов Ил-10 и Ил-12.

11. Профилирование цитокинов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR)

1. Подготовьте образцы в соответствии с шагами 7.1 и 7.2. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 500 мкл реагента TRIzol и инкубируйте клетки в течение 2 минут при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы выделения РНК должны выполняться в ламинарном шкафу в качестве меры предосторожности против загрязнения РНКазой.
2. Соберите образцы в пробирку объемом 1,5 мл, добавьте к ним 100 мкл хлороформа и перемешайте, перевернув пробирки в 5-8 раз. Инкубируйте образцы в течение 15 минут в режиме RT. Центрифугируйте образцы при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
3. Будет соблюдено три слоя, соберите прозрачный водный верхний слой в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл изопропанола в водный слой, хорошо перемешайте, инвертировав 10x, и инкубируйте образцы в течение 15 минут при RT. Через каждые 5 минут снова перемешивайте образцы, переворачивая пробирки.
4. Центрифугируйте образцы при давлении 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 2 раза с 75% этанолом, содержащим 0,1% диэтилпирокарбонат (DEPC), содержащим воду, в течение 5 минут и центрифугируйте при 8 000 x g при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DEPC, содержащий воду, разрушает РНКазы, в связи с чем, рекомендуется использовать его для выделения РНК.
5. Наконец, высушите гранулу на воздухе в течение 5 минут при RT, растворите ее в 20 μл DEPC, содержащей воду, и измерьте концентрацию изолированной РНК в соотношении 260/280 и 260/230 с помощью спектрофотометра.
   Примечание: Соотношение 260/280 должно быть приблизительно 2,0, что в целом указывает на чистую форму РНК, а соотношение 260/230 должно быть в пределах 2,0-2,2, чтобы считать, что изолированная РНК не содержит нежелательных химических соединений, таких как тризол.
6. Для получения 20 мкл каждого образца кДНК разморозьте реагенты на льду и дайте им короткий отжим в течение 15 с на RT. Перед использованием дайте короткий отжим всем реагентам и даже образцам РНК.
7. В автоклавированную пробирку объемом 100 мкл возьмите 0,8 мкл 25x dNTP, 2 мкл 10x Primer, 2 мкл 10x буфера. Добавьте концентрацию РНК 1 мкг/мкл и добавьте 0,5 мкл фермента обратной транскриптазы. Доведите объем до 20 мкл с помощью DEPC, содержащего воду.
8. Дайте образцам кДНК короткий цикл в течение 1 минуты на RT. Держите образцы на льду.
9. Включите термоамплификатор, открутите верхнюю панель, чтобы ослабить держатель, и поместите образцы на блок. После размещения образцов плотно закрутите крышку.
10. Как только система будет включена, нажмите « Выполнить». Выберите опцию «Основной », затем войдите в меню «Программы» и выберите опцию CDNA . Определите объем образца как 20 мкл и нажмите кнопку RUN. Термоамплификатор запускает программу в четыре этапа. Первая ступень – 25 °C в течение 10 мин, вторая – 37 °C в течение 2 ч, третья – 85 °C в течение 5 мин, а последняя ступень – 4 °C навсегда.
11. Как только цикл перейдет к четвертому шагу, нажмите Enter и завершите цикл. Соберите образцы и приступайте к проведению qRT-PCR. Храните образцы РНК при -80 °C и образцы кДНК при -20 °C.
12. Для обнаружения цитокинов разморозьте необходимые реагенты 2x ПЦР мастер-микс, кДНК и зонды для TNF-α, IFN-γ, TGF-β и NFW на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, реакционные смеси и образцы должны храниться на льду.
13. В пробирке объемом 100 мкл приготовьте образец кДНК, добавив 1 мкл кДНК и 3,5 мкл NFW. Чтобы приготовить мастер-смесь, возьмите 5 μл мастер-смеси и добавьте 0,5 μл зонда в пробирку объемом 100 μл. Перемешайте содержимое, дав короткий отжим. Подсчитайте количество образцов и целевых генов и приготовьте соответствующую реакционную смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте NFW и мастер-микс на дно пробирки объемом 100 μл. Добавьте кДНК и зонд на стенку центрифужной пробирки в качестве меры предосторожности, чтобы обеспечить добавление объема и избежать перекрестного смешивания любого реагента.
14. Поместите 8-луночные полоски в охладитель ПЦР. Перенесите 5,5 мкл мастер-смеси и флакона, содержащего зонд, на дно каждой лунки в 8-луночных полосках. Соответственно, повторите шаг для всех целевых генов.
15. Перенесите 4,5 мкл смеси кДНК и NFW на стенку лунки в виде 8-луночных полосок. Соответственно, повторите этот шаг для всех образцов.
16. Запечатайте полоски крышками и дайте короткому отжиму в 10 с, чтобы смешать гены и образцы в лунке. Поместите полоску в слот для образца qRT-PCR и закройте слот.
17. На рабочем столе запустите программное обеспечение и войдите в систему как гость. На экране появится всплывающее окно. Нажмите « Продолжить без подключения».
18. В меню «Настройка» нажмите « Расширенная настройка». В поле Свойства эксперимента запишите название эксперимента на вкладке Название эксперимента . В каком типе эксперимента вы хотите настроить опцию, выберите Quantitation-Comparative CT (ΔΔ CT).
19. В разделе Какую скорость рампы вы хотите использовать в инструменте? нажмите на вкладку Быстро (~ 40 минут для завершения пробежки). В меню настройки планшета определите имена генов в опции Определить цели и введите имена образцов в поле Определить образцы.
20. На вкладке «Метод запуска» введите 10 мкл в поле «Реакционный объем на лунку». Прямо перед удержанием этапа нажмите на кнопку «Добавить этап» и выберите «Этап удержания». Измените температуру на 50 °C и время на 2 минуты. На втором этапе удержания не вносите никаких изменений, которые составят 95 °C в течение 1 с.
21. На этапе циклирования Шаг 1 измените температуру до 95 °C и время до 3 с. На шаге 2 измените температуру на 60 °C и время на 30 с. Нажмите « Выполнить », чтобы начать цикл qRT-PCR.

12. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех данных среднее значение представлено в виде столбца, а стандартное отклонение представляет собой полосу ошибки на столбчатом графике (p-значение< 0,05 считается значимым).

1. Откройте программу для анализа данных и вставьте полученные данные конфокального эксперимента.
2. Для анализа конфокальной микроскопии применяют обычный односторонний ANOVA с корректирующим тестом Тьюки для сравнения нескольких групп для экспрессии GFP. Рассмотрим данные с p < 0,05 как статистически значимые. Подготовьте графическое представление данных, среднее значение которого представлено в виде столбца, а стандартное отклонение — в виде полосы погрешности.
3. Для анализа паразитарной нагрузки создайте новый лист и введите данные подсчета паразитов для 100 макрофагов. Нанесите обычный односторонний ANOVA с коррекцией Тьюки между всеми образцами. Рассмотрим данные с p-значением< 0,05, как статистически значимые.
4. Для ИФА выполните двусторонний ANOVA с помощью теста множественных сравнений Тьюки. Для qRT-PCR выполните однофакторную ANOVA с корректирующим тестом Тьюки.

Результаты

Расположение генетических частей, образующих синтетическую цепь для экспрессии синтетической цепи, показано на рисунке 1А. Соответствующие части были клонированы в векторе pEGFP-N1 ортогональным и модульным образом, что представлено на рисунке 1B. Моделирование синтетической схемы выявило колебательную динамику как в SDHA, так и в тетрациклиновом репрессоре. Это наблюдение позволяет предположить картину обратной экспрессии, характеризующуюся периодическими волновыми функциями. Увеличение концентрации SDHA может быть связано с индукцией доксициклина, в то время как экспрессия TetR может быть результатом снижения уровня доксициклина (рис. 1C). Учитывая наблюдаемую in silico индуцируемую осцилляторную экспрессию SDHA и TetR, была разработана и реализована стратегия доставки синтетической цепи через плазмидный вектор pEGFP-N1.

Части iGEM, идентифицированные для исследования, включают BBa_K1493803 для TetO, BBa_K4344028 для последовательности Козака, BBa_C0040 для TetR и BBa_K1537016 для P2A соответственно. Идентификатор присоединения NCBI для SDHA — NM_025848. Эти компоненты были собраны для создания индуцируемой доксициклином синтетической схемы TetON, охватывающей в общей сложности 1317 пар оснований (Дополнительный файл 1). Поскольку TetO функционирует как регуляторный элемент ДНК, его последовательность не транслировалась. Последовательность ниже последовательности Козака, простирающаяся от 5' TetR до 3' конца P2A, расположенная ниже SDHA, была выбрана для валидации трансляции in silico . Наблюдение выявило отсутствие внутренних стоп-кодонов, обеспечивающих непрерывную трансляцию по всей длине последовательности (Дополнительный файл 2). Регулирующие части синтетического контура, содержащего 1317.н., были вставлены между сайтами рестрикции NotI и XhoI, которые находятся на 5' выше EGFP (рисунок 1B). Результаты секвенирования показывают, что последовательность вставки была клонирована в плазмиде (Дополнительный файл 3).

Введение иммунометаболической цепи в штамм E. coli DH5α привело к росту трансформированных колоний, проявляющих устойчивость к канамицину, антибиотику, используемому в качестве селективного маркера во время бактериальной трансформации. Обильное присутствие трансформированных колоний на селекционной пластине было выше, что позволяет предположить, что компетентные клетки демонстрировали высокий потенциал трансформации, что свидетельствует об эффективности используемого протокола трансформации (рис. 1D).

Выделяли одну колонию и засеивали в 10 мл ЛБ с добавлением канамицина для выделения плазмиды. Выход плазмиды, полученный из культуры объемом 10 мл, подробно описан в таблице 1. Для этой процедуры был использован стандартный метод выделения плазмид. Буферные растворы были свежеприготовлены за день до выделения плазмид, а условия инкубации были оптимизированы для максимального выхода плазмид. Полученная концентрация плазмид превышала 1 г/л, при этом соотношения 260/280 и 260/230 превышали 1,8 и 2,0 соответственно. Эти результаты указывают на то, что выделенные плазмиды были высокой чистоты и лишены таких загрязнителей, как белки, ЭДТА, углеводы и фенол.

Оценен сдвиг электрофоретической подвижности для изолированной синтетической схемы. Рестрикционное расщепление проводили с использованием ферментов рестрикции NotI и XhoI, так как именно они были сайтами рестрикции, в которые вводили синтетическую цепь. Две полосы наблюдались на 1% агарозном геле, одна полоса около 1500.н. и одна между 4 и 5.н. Учитывая, что размер вставки составляет 1317.о., полоса в 1500.о., скорее всего, соответствует вставки. Вектор pEGFP-N1 имеет размер 4,7 кб. Следовательно, полоса около 5 кб считается вектором pEGFP-N1. Следовательно, был сделан вывод о том, что в векторе доставки присутствует полная и неповрежденная синтетическая цепь. Кроме того, была обнаружена полоса размером около 6 КБ для нерасваренной интактной синтетической схемы, что указывает на то, что вектор pEGFP-N1 содержит вставку размером почти 1,3 КБ внутри плазмидного вектора (рис. 1E).

Рисунок 1: Проектирование и валидация синтетических схем. (A) Представление синтетических схем путем сборки генетических частей и регулирующих компонентов. (B) График детерминированного моделирования, показывающий периодическую экспрессию SDHA и TetR в 100-временных единицах. (C) Синтетическая цепь трансформировала колонии E. coli DH5α, устойчивые к канамицину. Единицей измерения является 100-временная единица, так как это детерминированное моделирование. (D) Электрофорез в агарозном геле интактного и рестрикционного расщепленного синтетического контура с использованием ферментов рестрикции NotI и XhoI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Концентрация плазмиды (мкг/мл)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

Таблица 1: Выход синтетической схемной конструкции, полученной после выделения плазмид. В таблице приведены концентрации плазмид в мкг/мл, их соотношение 260/280 и 260/230.

В контрольной и инфицированной клетках наблюдаемая интенсивность флуоресценции была низкой для GFP. Тем не менее, было обнаружено, что трансфекция синтетической цепи с соотношением плазмиды 1:1 и PEI с 500 мкг/мл G418 и индукция с 1 мкг/мкл докса индуцировали высокую экспрессию GFP в клетках IMT. В 6-часовых клетках IMTI экспрессия GFP также была значительно выше, хотя экспрессия GFP была ниже, чем в образце IMT (рис. 2A, B). Кроме того, увеличение экспрессии GFP наблюдалось в образцах IMTI за 12 часов, IMTI за 18 часов и за 24 часа. Это увеличение может быть связано с увеличением времени инфекции, что могло вызвать более высокие метаболические изменения в макрофагах под действием резидентного паразита¹⁷. Внутриклеточный уровень SDHA может быть затронут из-за увеличения времени инфекции¹⁸. Поскольку докс был добавлен к этим образцам IMTI, уровни SDHA через синтетические схемы могли увеличиться, что привело к увеличению экспрессии SDHA.

Окрашивание DAPI проводилось для определения количества резидентных паразитов в макрофагах. В инфицированных макрофагах через 6 ч L. major количество внутриклеточных паразитов составило 6 клеток на макрофаг, что выше по сравнению с образцом IMTI за 6 ч, в котором было 1-2 внутриклеточных паразита на макрофаг. После трансфекции и индукции докса наблюдалось значительное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки в разные временные точки инфекции (рис. 2В). Наблюдения показали, что синтетические схемы могут вызывать эффекты уничтожения паразитов, стимулируя экспрессию SDHA.

Рисунок 2: Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Изображения контрольных, инфицированных, IMT и IMTI образцов. (A) Анализ экспрессии GFP во всех экспериментальных образцах с масштабной линейкой 50 мкм для контроля, инфицированных через 6 ч и IMT, 20 мкм для 6 ч IMTI, 10 мкм для 12 ч IMTI, 18 ч IMTI, 24 ч IMTI соответственно. В качестве каналов использовались DIC, DAPI, GFP и объединенные изображения всех каналов. (B) Односторонний ANOVA с тестом коррекции Тьюки для всех экспериментальных образцов (n=3) для экспрессии GFP (p < 0,05 считается значимым) Погрешности представляют собой стандартное отклонение. (C) Проведен односторонний ANOVA с помощью корректирующего теста Тьюки анализ паразитарной нагрузки в 100 макрофагальных клетках для образцов из (A) (n=3) (p < 0,05 считается значимым). Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обнаружение уровней IL-10 и IL-12 в средах всех образцов показало, что концентрации IL-10 и IL-12 были наиболее высокими через 6 ч после заражения с подавлением уровня цитокинов через 24 ч заражения. Достоверной разницы в уровнях ИЛ-10 и ИЛ-12 при трансфекции и индукции синтетических контуров не выявлено. Кроме того, наблюдалась незначительная разница в уровнях IL-10 и IL-12 в образцах временных точек IMTI (рис. 3). Уже сообщалось, что инфицированный образец через 6 ч показал экспрессию IL-10 и IL-12^19,20, наблюдая незначимую разницу между IL-10 и IL-12, мы исследовали влияние синтетической цепи на другие цитокины.

Рисунок 3: ИФА ИЛ-10 и ИЛ-12 для определения их секреторных уровней в средах разных образцов. Образцы (n=2) включают контроль, инфицированный через 6 часов, инфицированный через 24 часа, IMT, IMTI через 6 часов, IMTI через 12 часов, IMTI через 18 часов, IMTI через 24 часа. Проведен двухфакторный ANOVA с анализом теста коррекции Тьюки (p <,05 считается значимым). Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обнаружение уровней транскриптов TNF-α, ИФН-γ и TGF-β в образцах инфицированных через 6 ч, IMT и 24 ч IMTI показало, что в образце IMTI за 24 ч наблюдалось значительное увеличение TNF-α до 2,5 раз по сравнению с образцами инфекции и IMT (рис. 4). В 24-часовой выборке IMTI наблюдалось 35-кратное увеличение уровней ИФН-γ по сравнению с инфекцией и образцами IMT. Уровни TGF-β, хотя они показали значительное повышение до 1,5 раз в 24-часовой выборке IMTI, относительное изменение было ниже по сравнению с TNF-α и IFN-γ, что позволяет предположить, что провоспалительные цитокины значительно повышаются в 24-часовой пробе IMTI.

Рисунок 4: qRT-ПЦР анализ цитокинов. (A) TNF-α, (B) IFN-γ и (C) TGF-β для инфицированных образцов через 6 ч, IMT и IMTI через 24 ч (n=2). Проведен однофакторный ANOVA с помощью корректирующего теста Тьюки (p < 0,05 считается значимым). Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Нуклеотидная последовательность генетических частей, собранных для формирования синтетической цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Транслируемая последовательность синтетической схемы, экспрессирующей TetR, P2A и SDHA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Результат секвенирования клонированной синтетической схемы в плазмиде pEGFP-N1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Полученные результаты подчеркивают эффективность трубопровода, который был направлен на проектирование и реализацию синтетической схемы. Создание этой синтетической схемы стало шагом на пути к развитию точной медицины для лечения инфекционных заболеваний, таких как лейшманиоз. С помощью сборки генетических частей in silico и детерминированного моделирования отслеживался выраженный модулирующий эффект системы TetON. В частности, эффект цепи мог привести к взаимной бистабильной экспрессии TetR и SDHA/GFP. Экспрессия SDHA была периодической, что может свидетельствовать о том, что только в присутствии доксициклина его экспрессия увеличивалась. Для наблюдения за потенциальными изменениями в паттернах экспрессии в течение определенного периода времени была выбрана временная единица 100. Результаты показывают, что синтетическая схема демонстрировала периодическое поведение для TetR и SDHA/GFP, что, вероятно, объясняется ее ортогональной природой²¹. Сборка генетических частей из реестра деталей iGEM играла ключевую роль, поскольку она обеспечивала генетические компоненты, необходимые для создания синтетических схем²². Модульное расположение генетических частей имеет важное значение, так как трансляция и функционирование цепи могут быть нарушены, что может привести к неэффективной экспрессии и модулирующему эффекту в клетках²³.

Размер вставки синтетической схемы составлял приблизительно 1,3.н., чтобы размер вектора не был слишком большим, что потенциально может снизить эффективность преобразования²⁴. Выбор подходящего вектора является критически важным этапом, поскольку он должен обладать генетическими частями, которые необходимы для увеличения числа копий в бактериальной системе и получения большого количества плазмидных копий, а его механизм экспрессии должен хорошо адаптироваться^{в системе} млекопитающих. Вектор pEGFP-N1 хорошо охарактеризован в клеточной линии RAW264.7 и обладает компактной плазмидной структурой с множественным сайтом клонирования²⁶. Для выделения плазмид были использованы стандартизированные в лаборатории буферные растворы, чтобы обеспечить производство высококонцентрированной и чистой плазмиды, что было подтверждено с помощью спектрофотометрической оценки и AGE. Включение синтетической схемы в вектор pEGFP-N1 было валидировано с помощью рестрикционного разложения, а образцы были проанализированы на КПГ и секвенировании. Результаты AGE представляли собой полосу 1,3 КБ вставки, 4,7 КБ вектора pEGFP-N1 и 6 КБ полосы всей синтетической схемы.

Проводили трансфекцию с использованием соотношения ДНК:ПЭИ 1:1, 1:2 и 2:1, где наблюдаемое соотношение 1:1 работало лучше всего, не нарушая морфологию клетки (данные не показаны). Для отбора трансфицированных^{клеток рекомендуется} использовать концентрацию 400 мкг/мл - 1000 мкг/мл G418. Для отбора трансфицированных клеток использовали 500 мкг/мл G418, поскольку он эффективно подавлял рост нетрансфицированных клеток без нарушения роста клеток или морфологии трансфицированных клеток (данные не показаны). Учитывая важность фенотипа клеток в эффективности трансфекции, особенно в клеточных линиях макрофагов, которые могут подвергаться дифференцировке и затрудняться трансфекции,^{для трансформации использовали} низкое число пассажей клеточной линии RAW264.7. Количество пассажей клеток также может быть критическим фактором эффективности трансфекции. Большое число пассажей может привести к неэффективной трансфекции²⁹. Dox является предпочтительным индуктором для индукционной системы Tet-ON из-за его высокой эффективности связывания с TetR, благоприятного распределения в тканях, низкой токсичности и периода полувыведения 24 часа³⁰ минут. После трансфекции клетки индуцировали доксом в течение 24 ч, и у них наблюдалась экспрессия GFP. Для элементов RAW264.7 концентрация докса, используемого для индукции синтетических контуров, составляла 1 г/мл, что находится в рекомендуемом диапазоне 1-2 г/мл³¹ (данные не показаны). Тем не менее, регуляция концентрации SDHA после индукции не была определена. В целом, определение и стандартизация числа клеточных пассажей, концентрации ДНК: ПЭИ, концентрации маркера трансфекции у млекопитающих и концентрации индукции доксициклина являются решающими факторами в процессе трансфекции.

После индукции синтетического контура после инфицирования в разные моменты времени наблюдалось значительное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки. Сравнение нагрузки паразитов между инфицированными образцами и образцами IMTI выявило более низкую нагрузку в клетках, индуцированную синтетической цепью, что, вероятно, связано с экспрессией SDHA. Поскольку экспрессия SDHA связана с продукцией NO, было обнаружено, что клетки IMTI имеют неправильную и грубую морфологическую форму, которая возникает в клеточной линии RAW264.7 при продуцировании NO³². Уровни IL-10 и IL-12 после 6-часовой инфекции были самыми высокими, поскольку сообщалось, что оба цитокина повышены в этот момент времени, что в дальнейшем претерпевает фенотипическую модификацию для производства IL-10 в большем количестве, чем^{IL-12 19}. Поскольку уровни IL-10 и IL-12 существенно не изменялись после трансфекции и в образцах IMTI, было проведено профилирование цитокинов для выявления провоспалительных и противовоспалительных цитокиновых реакций.

Уровни экспрессии TNF-α, ИФН-γ и TGF-β были идентифицированы в образцах инфекции через 6 часов, IMT и IMTI через 24 часа. Для уничтожения внутриклеточных паразитов принципиально необходимы TNF-α и ИФН-γ, поскольку они вызывают окислительные всплески за счет производства оксида азота. М2 поляризованные макрофаги экспрессируют TGF-β, который подавляет провоспалительные цитокины³³. 24-часовой образец IMTI показал повышенную экспрессию TNF-α и ИФН-γ по сравнению с TGF-β, что позволяет предположить, что макрофаги при трансфекции и инфицировании L. major могли поляризоваться в фенотип, экспрессирующий провоспалительные цитокины. Таким образом, исследование дает представление о фенотипических изменениях, вызванных трансфекцией с помощью синтетического контура, и подчеркивает динамику инфекции. Эффект синтетических цепей в качестве терапевтического может быть исследован, так как их индукция значительно увеличивала экспрессию провоспалительных цитокинов по сравнению с противовоспалительными цитокинами. Таким образом, исследование не только установило построение синтетической цепи и конвейер доставки, но и продемонстрировало ее терапевтический потенциал в модели лейшманиоза за счет повышения регуляции провоспалительных цитокинов в клетках-хозяевах, подверженных риску лейшманиоза.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 μ L наконечники	Tarson	521050
10X рестрикционный буфер	BioLabs	R0146S	Рестрикция сбраживание
1 мл	Tarson	521016
1 мл туба	Eppendorf	30121023
200 μ L наконечники	Tarson	521010
колба 25см2	Corning	430639	Для клеточных культур
4',6-диамидино-2-фенилиндол	ThermoFischer Scientific	D1306	ядерное окрашивание
50 мл туба	Corning	352070
60 мм пластины	Falcon	353002
6X TrackIt Голубой/оранжевый Загрузочный буфер	ThermoFischer Scientific	10488085	Загрузка образцов для AGE
96 луночная покровная нижняя пластина	ThermoFischer Scientific	160376	Для конфокальной визуализации и трансфекции
96 луночная микротестовая пластина плоское дно лунок	Tarson	941196
Agarose	Sigma	A9539	Для AGE
Сборка электрофореза в агарозном геле	GeNei	93	Для AGE
Бактериальный ламинарный поток	ESCO Lifesciences	2120765	Для трансформации
Хлорид кальция	Merck	C4901	Буфер/реагент
Ламинарный поток воздуха для клеточных культур	ThermoFischer Scientific	1323TS	Для клеточных культур
Скребок для клеток	Genetix	90020	Для клеточных культур
Распространитель клеток	Fischer Центрифуга Scientific	12822775
для пробирок объемом 1,5 мл	Eppendorf	EP5404000537
Центрифуга для сокола на 50 мл	ThermoFischer Scientific	75004210
хлор от	Fischer Scientific	67-66-3	Для выделения РНК
CO2 инкубатор	ThermoFischer Scientific	3110	Для кюветы
	для клеточных культурEppendorf	6138000018	Оценка концентрации плазмид
CYTIVA IQ 500 гель-имиджер	Cytiva	29655893	Для AGE
DEPC TRAINED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	Для выделения РНК
Доксициклин	Merck	33429	Для индукции трансфицированных клеток
Сухой нагревательный блок	Labnet		Для трансформации и инактивации ферментов рестрикции
Модифицированный Eagle Dulbecco's Medium Национальный	центр клеточной науки		Для клеточной культуры
Этанол	Sigma-Aldrich	1.00983	Буфер/Реагентный препарат
Бромид этидия	Sigma	E7637	Для AGE
Этилендиамин тетрауксусная кислота	Fischer Scientific	12635	Буфер / Препарат реагента
Evos светлопольный микроскоп	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		для построения синтетической схемы
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	16000-044	Для клеточной культуры
FV31S-SW программное обеспечение	Olypmus		Получение изображений
Geneticin	Gibco	1563411	для трансфекции
Метод сборки Gibson для клонирования	BIOMATIK		Построение синтетической схемы
Graphpad призма	Graphpad		Статистический анализ
Высокоемкую кДНК Набор для обратной транскрипции	ThermoFischer Scientific	4368814	для синтеза кДНК
Изопропанол	Fischer Scientific	13825	Буфер/реагентный препарат
Kanamycin	Sigma	60615	Для трансформации и селекции колоний
Luria Bertini бульон	Himedia	M1245	Для культивирования E.coli
Magnesium chloride	Fischer Scientific	BP214	Буфер/реагент Микрофильтр
Вертикальный ламинарный воздушный поток	Microfilt
MicroAmp Fast 8-tube Strip, 0,1 мл	ThermoFischer Scientific	4358293	для qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-cap Strips	ThermoFischer Scientific	4323032	для qRT-PCR
Микроволновая печь	LG	MC-7649DW	для AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Зонды Taqman
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Зонды Taqman
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman зонды
Мышь IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	для ИФА
Мышь ИФА Набор ИЛ-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	для ELISA
Multiskan Sky с сенсорным экраном + & Откидная пластина	ThermoFischer Scientific	51119600DP	для микропланшетных смесителей ELISA
MX-M 96-луночный микшер для клеточных культур Регулируемый 0-1500 об/мин Лабораторный шейкер Мешалка	DIAB
Национальный центр биотехнологической информации	https://www.ncbi.nlm.nih.gov		для создания синтетической схемы
Камера Нойбауэра	Marienfeld superior	640010	Для подсчета ячеек
Невентилируемый 25см<суп>2 колба	Corning	353014	Для культивирования паразитов
NotI	BioLabs	R3189M	Фермент рестрикции
Вода без нуклеаз	Биодизайн	1QIA	Препарат реагента
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 программное обеспечение	Olypmus		Обработка изображений
Olympus FV 3000	Olympus		Для конфокальной визуализации
OPTI-MEM среды	Gibco	31985070	среды для трансфекции
pEGFP-N1 вектор клонирован с синтетической схемой	Biomatik
Penicillin	ThermoFischer Scientific	15070063	Для клеточной культуры
Полиэтилениленимин	MERCK	764965	для трансфекции
Potassium Acetate	Fischer Scientific	YBP364500	Буфер/Реагент
Хлорид калия	Fischer Scientific	BP366	Буфер / Реагент
Фосфат калия Одноосновной	Sigma	P5655	Буфер / Реагент Блок
питания	BIORAD	1645070	Для AGE
Реестр стандартных биологических частей	https://parts.igem.org/Main_Page		для конструирования синтетической цепи
РНКисо Плюс	Takara	38220090	Для выделения
РНК РНКаза A	ThermoFischer Scientific	12091021	Буфер/Реагент Препарат
Розовелл Парк Мемориал Институт Медиум Национальный	центр клеточной науки		Для культивирования паразитов
Шейкер инкубатор	REMI	CIS 24 plus	Для культивирования E.coli
Sodium chloride	Qualigens	Q27605	Буфер/реагентный препарат
Додецилсульфат натрия	Sigma-Aldrich	L3771	Буфер/реагентный препарат
Гидроксид натрия	Fischer Scientific	15895	Буфер/реагентный препарат
Диосновной фосфат	натрия Sigma	S5136	Буфер/реагент препарат
Спектрофотометр	Eppendorf		Оценка концентрации плазмид
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Real Time PCR system	Life technologies	272006777	Для qRT-PCR
StepOne версия программного обеспечения 2.3	Life technologies		Для qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), без AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Построение и моделирование синтетических схем
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
Tris (гидроксиметил) аминометана гидрохлорид	Himedia	MB029	Буфер/реагент
Tris-ацетат-EDTA	SERVA	42549.1	Буфер/Реагентный препарат
Трипановый синий	Sigma	T8154	Для подсчета клеток
рестрикции	XhoI	BioLabs	R0146S