Методическая статья

Интеграция поведенческой оценки поведения животных и сверточной нейронной сети для изучения взаимодействия вкуса и запаха васаби и алкоголя

DOI:

10.3791/66981

⸱

16 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Environmental and Biological Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, 2Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Laboratory for Contaminants Exposure and Health, School of Environmental Science and Engineering, Institute of Environmental Health and Pollution Control, Guangdong University of Technology, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development of Natural Drugs, and School of Pharmacy, Guangdong Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описан набор методов измерения подавляющей способности вдыхания алкогольных напитков по вызываемому васаби ощущению жжения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коммерческие пасты васаби, обычно используемые для приготовления пищи, содержат гомологичное соединение хемосенсорных изотиоцианатов (ITC), которые вызывают раздражающее ощущение при употреблении. Влияние вдыхания диетических алкогольных напитков на ощущение остроты васаби никогда не изучалось. В то время как большинство исследований сенсорной оценки сосредоточены на отдельных продуктах питания и напитках по отдельности, существует недостаток исследований обонятельного изучения вдыхания спиртных напитков во время употребления васаби. Здесь разрабатывается методология, сочетающая в себе использование поведенческого исследования на животных и сверточной нейронной сети для анализа мимики мышей, когда они одновременно нюхают спиртное и употребляют васаби. Результаты показывают, что обученная и валидированная модель глубокого обучения распознает 29% изображений, изображающих совместное лечение васаби и алкоголя, принадлежащих к классу васаби отрицательной алкогольно-положительной группы без необходимости предварительной фильтрации обучающих материалов. Статистический анализ шкалы гримас мыши, полученных по выбранным изображениям видеокадров, выявил значимую разницу (P < 0,01) между наличием и отсутствием ликвора. Этот вывод свидетельствует о том, что диетические алкогольные напитки могут оказывать уменьшающее влияние на реакции, вызванные васаби у мышей. Эта комбинаторная методология имеет потенциал для скрининга отдельных соединений ITC и сенсорного анализа компонентов спирта в будущем. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для изучения основного механизма подавления остроты васаби, вызванного алкоголем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Васабия японская, широко известная как васаби, получила признание в приготовлении пищи 1,2. Хорошо известен интенсивный сенсорный опыт, который он вызывает при употреблении, характеризующийся слезоточивостью, чиханием или кашлем. Эту характерную остроту васаби можно объяснить гомологичным соединением хемосенсорных изотиоцианатов (ИТК). Они представляют собой летучие сероорганические фитохимические вещества, которые можно разделить на ω-алкенил и ω-метилтиоалкилизотиоцианаты3. Среди этих соединений аллилизотиоцианат (АИТК) является наиболее преобладающим природным продуктом ИТК, обнаруженным в растениях, принадлежащих к семейству крестоцветных, таких как хрен и горчица4. Коммерческие пасты васаби обычно готовятся из хрена, что делает AITC химическим маркером, используемым для контроля качества этих коммерческих продуктов5.

Сочетание диетических алкогольных напитков с блюдами, настоянными на васаби, можно считать примером культурной предрасположенности6. Субъективно, это сочетание может дополнить остроту и остроту между васаби и напитком, улучшая общее кулинарное впечатление. Качественная поведенческая оценка животных (QBA) — это комплексный методический подход на всех животных, который изучает поведенческие изменения у испытуемых в ответ на краткосрочные или долгосрочные внешние стимулы с использованием числовыхтерминов. Этот метод включает в себя тесты на боль, моторные тесты, тесты на обучение и память, а также тесты на эмоции, специально разработанные для грызунов модели8. Тем не менее, исследования, изучающие синергетическую сенсорную оценку вкуса вместе с обонянием, до сих пор остаются редкими в литературе 9,10. Большинство исследований хеместетических ощущений ограничиваются изучением индивидуального потребления продуктов питания и напитковпо отдельности 11. Следовательно, существует недостаток исследований взаимодействия вкуса и запаха, связанного с вдыханием спиртного во время употребления васаби.

Поскольку считается, что вызванное васаби ощущение жжения является формой ноцицепции12, поведенческие оценки животных хорошо подходят для оценки ноцицептивных сенсорных реакций у животныхгрызунов 8,13,14. Метод оценки ноцицепции у мышей, известный как оценка по шкале гримас мышей (MGS), был разработан Langford et al.15,16. Этот метод поведенческого исследования представляет собой подход к оценке, связанный с болью, основанный на анализе выражений лица, демонстрируемых экспериментальными мышами. Экспериментальная установка проста и включает в себя прозрачную клетку и 2 камеры для записи видео. Используя передовые технологии 17,18,19 для автоматического сбора данных, можно получить количественные и качественные поведенческие показатели, улучшающие благополучие животных во время поведенческого мониторинга 20. Следовательно, MGS имеет потенциал для применения в изучении воздействия различных внешних стимулов на животных непрерывно и ad libitum. Тем не менее, процесс подсчета баллов включает в себя только отбор нескольких (менее 10) изображений видеокадров для оценки членами комиссии, и требуется предварительное обучение. Оценка большого количества образцов изображений может быть трудоемкой. Чтобы преодолеть эту трудоемкую задачу, в нескольких исследованиях использовались методы машинного обучения для прогнозирования балла MGS21,22. Тем не менее, важно отметить, что MGS является непрерывным измерением. Таким образом, модель многоклассовой классификации была бы более подходящей для оценки логической и категориальной проблемы, такой как определение того, похожи ли изображения мышей, одновременно глотающих васаби и нюхающих ликер, на изображения нормальных мышей.

В данном исследовании была предложена методология изучения взаимодействия вкуса и запаха у мышей. Эта методология сочетает в себе поведенческие исследования на животных со сверточной нейронной сетью (СНС) для анализа мимики мышей. Две мыши наблюдались трижды при нормальных поведенческих условиях, во время ноцицепции, вызванной васаби, и во время вдыхания спиртного в специально разработанной клетке. Выражения лиц мышей были записаны на видео, а сгенерированные кадровые изображения были использованы для оптимизации архитектуры модели глубокого обучения (DL). Затем модель была проверена с использованием независимого набора данных изображений и развернута для классификации изображений, полученных от экспериментальной группы. Чтобы определить степень подавления остроты васаби, когда мыши одновременно нюхали ликер во время употребления васаби, идеи, полученные с помощью искусственного интеллекта, были дополнительно подтверждены путем перекрестной проверки с помощью другого метода анализа данных, набравшего16 баллов MGS.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании два 7-недельных самца мышей ICR весом от 17 до 25 г были использованы для оценки поведения животных. Все процедуры содержания и экспериментов были одобрены Комитетом Гонконгского баптистского университета по использованию предметов с участием человека и животных в преподавании и исследованиях. В помещении для животных поддерживалась температура 25 °C и влажность воздуха 40%-70% в течение 12-часового цикла свет-темнота.

1. Конструкция клетки

  1. Подготовьте кирпичи из акрилонитрилбутадиенстирола в 3 различных размерах для строительства каркаса: 8 мм x 8 мм x 2 мм, 16 мм x 16 мм x 6 мм и 32 мм x 16 мм x 6 мм.
  2. Подготовьте пластину из бутадиенакрилонитриенстирола (312 мм x 147 мм x 2 мм) в качестве основания клетки.
  3. Подготовьте непрозрачную акриловую пластину размером 239 мм x 107 мм толщиной 2 мм, которая будет использоваться в качестве нижней пластины.
  4. Подготовьте прозрачную акриловую пластину размером 239 мм x 107 мм толщиной 5 мм, которая будет использоваться в качестве верхней пластины.
  5. Подготовьте прозрачную акриловую пластину размером 107 мм x 50 мм толщиной 7 мм, которая будет использоваться в качестве клеммной пластины.
  6. Соорудите 2 непрозрачные боковые стены, сложив кирпич на высоту 54 мм.
  7. Вставьте акриловые пластины в клетку на основе бутадиенакрилола, как показано на рисунке 1A.
  8. Приготовьте камеру для чау, которая состоит из пяти прозрачных акриловых пластин размером 90 мм x 50 мм и толщиной 2 мм, как показано на рисунке 1B. Среди 5 прозрачных акриловых пластин используйте 2 пластины по бокам, 1 пластину для верха, 1 пластину для нижней части и 1 пластину для терминала.
  9. Подготовьте прозрачную акриловую тарелку размером 60 мм x 50 мм и 2 мм в качестве вступительной тарелки для чау и поместите ее в камеру чау.

2. Оценка поведения животных

  1. Однопометники 2 7-недельных самцов мышей ICR живут вместе в обычной клетке.
  2. Обеспечьте однопометникам из 2 мышей свободный доступ к гранулам корма и водопроводной воде на 1-недельный период адаптации.
  3. Через 1 неделю познакомьте однопометников из 2 мышей с бутылочкой этанола (~40% v/v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что им разрешено нюхать или вдыхать предоставленный водный этанол только в неограниченном количестве, в то время как употребление алкоголя ограничено.
  4. Проведите поведенческие эксперименты с использованием модели мыши в возрасте 9-10 недель и прозрачной клетки в кабинке, которая изображена на рисунке 1А.
  5. Разберите все акриловые пластины и пластины из бутадиен-акрилонитрина и тщательно очистите их. Начните с полоскания их сверхчистой водой не менее 3 раз, а затем высушите бумажными полотенцами. Затем сбрызните их 75% этанолом, а затем очистите их бумагой для линз. Наконец, дайте им высохнуть на воздухе не менее 15 минут.
  6. Взвешивайте мышей и записывайте вес их тела перед каждым повторением поведенческого эксперимента.
  7. В свежем виде приготовьте смесь васаби и арахисового масла, взвесив 1 г покупного васаби и 4,5 г арахисового масла. Смешайте их в полиэтиленовом пакете на молнии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за летучести изотиоцианатов в васаби важно хранить коммерческий васаби в морозильной камере при температуре -20 °C.
  8. Взвесьте и положите на тарелку для введения чау две пасты по 0,5 г арахисового масла или смесь васаби и арахисового масла, как показано на рисунке 1B, C.
  9. Поместите готовую тарелку для введения чау-чау в камеру чау-чау, как показано на рисунке 1B, C, чтобы позволить двум мышам иметь свободный доступ к пище во время каждого сеанса видеозаписи.
  10. Заполните нижнюю канавку 30 мл жидкости, чистой воды или раствора (~42% v/v этанола), чтобы облегчить одновременный вдох, как показано на рисунке 1B, C.
  11. Начните запись с помощью камер на 2 смартфонах, размещенных на подставках для телефона у каждого терминала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические характеристики видеороликов следующие: ширина кадра, 1920; высота рамы, 1080; скорость передачи данных, 20745 кбит/с; Частота кадров, 30,00 кадров в секунду (fps).
  12. Осторожно поместите 2 обученных однопометников мышей в спроектированную платформу для изучения поведения животных сверху и быстро закрепите клетку верхней пластиной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что этот шаг выполнен в течение 15 секунд.
  13. Записывайте каждое видео в течение 2-3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вся продолжительность эксперимента, от приготовления смеси арахисового масла и васаби до завершения видеозаписи, ограничена 5 минутами.
  14. Повторите весь эксперимент 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каждая реплика эксперимента разделена не менее чем на 6 часов.
  15. Имитируйте разные сценарии.
    Примечание: Например, в этой работе пара мышей была разделена на 4 группы с 4 различными сценариями, которые были смоделированы с использованием экспериментальных условий, описанных выше. Эти сценарии включают сценарий А для исследования предыстории, сценарий В для исследования положительного контроля, сценарий С для исследования взаимодействия вкуса и запаха васаби и алкоголя и сценарий D для исследования отрицательного контроля. В таблице 1 приведена краткая информация об этих сценариях.

3. Распознавание изображений

Как и во многих исследованиях по обработке изображений 23,24,25, классификационная модель была получена путем обучения СНС. Скрипт для операций DL был написан на Python v.3.10 на Jupyter Notebook (anaconda3). Он доступен в следующем репозитории GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Для создания и обучения CNN использовались библиотеки с открытым исходным кодом, в том числе: numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 и keras v.2.11.0. Эти библиотеки предоставляли необходимые инструменты и функциональные возможности для разработки и обучения СНС распознаванию изображений.

  1. Экспортируйте серию изображений видеокадров из собранных видеоклипов, чтобы создать набор данных для обучения модели с помощью предоставленной записной книжки Jupyter Notebook с именем Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
  2. Выбирайте изображения только с помощью хотя бы 1 мыши, потребляющей предоставленную пасту. Примеры выбранных изображений представлены на Дополнительном рисунке 1, Дополнительном рисунке 2, Дополнительном рисунке 3, Дополнительном рисунке 4, Дополнительном рисунке 5, Дополнительном рисунке 6 и Дополнительном рисунке 7.
  3. Выполняйте увеличение данных путем горизонтального переворачивания созданных изображений, реализуя скрипт, предоставленный в записной книжке Jupyter Notebook с именем Step2_DataAugmentation.ipynb.
  4. Резервируйте данные изображений из каждой секундной репликации для внешней независимой проверки модели СНС. Используйте образы из каждой первой и третьей репликации для внутреннего обучения и тестирования модели.
  5. Предварительная обработка данных изображения, используемых в моделировании CNN, путем запуска скрипта в Jupyter Notebook с именем Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, включая изменение размера изображения, преобразование черного цвета и нормализацию сигнала изображения.
  6. Случайным образом разделите учебные материалы на внутренние обучающие и тестовые наборы данных в соотношении 8:2.
  7. Инициализируйте архитектуру для CNN. Спроектируйте количество выходов CNN на основе количества сценариев, которые необходимо изучить.
    Примечание: Например, в этом исследовании нейронная сеть была предназначена для классификации 3 классов. Убедитесь, что скрипт для обработки дисбаланса данных по весу класса скомпилирован.
  8. Найдите комбинацию гиперпараметров, которая дает минимальные потери на внутренних тестовых образцах для построения СНС.
  9. Примите оптимальную комбинацию гиперпараметров для построения архитектуры CNN.
  10. Откройте предоставленные записные книжки Jupyter Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb и Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Проверьте полученную модель, используя независимые (исходные и перевернутые) изображения из второго тиража поведенческого эксперимента на животных.
  11. Разверните полученную и проверенную модель для классификации изображений видеокадров, сгенерированных экспериментальной группой, с помощью Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в данной работе это сценарий С.

4. Ручная оценка шкалы гримас мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки выводов, полученных в результате прогнозирования модели CNN, был применен другой метод, ранее разработанный и проверенный Langford et al.16. Этот метод включает в себя оценку MGS на основе 5 конкретных единиц действия лица мыши (AU): сжатие орбиты, выпячивание носа, выпячивание щек, сужение ушей наружу и изменение усов. Каждому AU присваивается балл 0, 1 или 2, указывающий на отсутствие, умеренное присутствие или очевидное присутствие AU соответственно. Эта система оценки позволяет количественно оценить и масштабировать каждую AU для оценки уровня ноцицепции или дискомфорта, испытываемого мышами.

  1. Сделайте 3 видеокадра, на которых однопометники глотают пасту для каждого видеоклипа. Убедитесь, что каждый кадр разделен не менее чем 3 секундами.
  2. Выполняйте слепой код и случайным образом переупорядочивайте изображения из разных классов сценариев в последовательности, используя предоставленный файл шаблона с именем "shuffleSlides.pptm" (дополнительный файл 1) и выполняя встроенный код макроса.
  3. Предложите не менее 10 членам команды-организатора оценить образцы изображений.
  4. Обучите участников комиссии оценивать образцы изображений с помощью MGS. Предоставьте участникам дискуссии учебные материалы, которые включают в себя оригинальную статью о MGS и руководство к ней15,16.
  5. Рассчитайте балл MGS каждого животного в захваченном кадре, усреднив все баллы соответствующих 5 AU лица. Представьте оценку MGS в виде среднего значения ± стандартной погрешности измерения (SEM).
  6. Определение наличия статистически значимых различий между различными классами сценариев с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с помощью апостериорного теста множественного сравнения Бонферрони.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение P < 0,05 считается статистически значимым.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной целью данного исследования является создание надежной основы для изучения взаимодействия вкуса и запаха у мышей. Эта структура включает в себя использование искусственного интеллекта и QBA для разработки модели предиктивной классификации. Кроме того, выводы, полученные в ходе DL, подвергаются перекрестной проверке с помощью количественной оценки MGS для проведения внутреннего независимого анализа. Основное применение этой методологии заключается в изучении степени подавления ноцицепции, вызванной васаби, когда мыши нюхают пищевые алкогольные напитки.

Распознавание 29% изображений совместного лечения васаби и алкоголем, относящихся к классу васаби-негативной алкогольно-положительной группы, с помощью модели глубокого обучения
Чрезмерная реакция на лице может возникнуть у людей при употреблении пасты васаби в коммерческих целях. Аналогичный опыт можно наблюдать и у мышей (Дополнительное видео 1). Поскольку ноцицептивная сенсорика хорошо коррелирует с мимикой грызунов, поведение двух однопометников контролировалось, чтобы определить их реакцию на предоставление чау, содержащих или отсутствующих коммерческий васаби. В этом исследовании СНС обучалась с использованием методов дистанционного обучения. Поскольку для каждого сценария было проведено 3 репликации, материалы изображений с1-й и3-й реплик были использованы для настройки гиперпараметров модели CNN и внутреннего обучения и тестирования моделирования. Эволюция архитектуры СНС в данном исследовании подробно описана в таблице 2. Оптимизированная архитектура СНС состояла из входного слоя с разрешением 268 x 268 пикселей, за которым следовали 4 двумерных слоя свертки, каждый из которых имел 8 фильтров. Кроме того, для задачи классификации по 3 классам были включены 2 слоя объединения, 2 слоя отпадения, слой выравнивания и 2 плотных слоя. Обратитесь к дополнительному файлу 2 для архитектуры CNN.

Модель в этом исследовании была обучена с использованием набора данных из 35 486 изображений и протестирована на 8 872 изображениях в течение 7 эпох. Производительность обученной модели во время обучения, включая такие метрики, как потери, коэффициент точности-полноты, точность и чувствительность (или полнота) во внутренних обучающих и тестовых наборах данных, можно увидеть на дополнительном рисунке 8A-D. Модель продемонстрировала свою точность, прецизионность и чувствительность 1 как для внутреннего обучения, так и для тестовых наборов. Это указывает на то, что прогнозы модели совпадают с фактическими классами изображений как во внутренних обучающих, так и в тестовых наборах данных. После обучения модели изображения совторого повтора были использованы для обеспечения и независимой проверки того, что переобучение не является проблемой для полученной модели CNN. Модель продемонстрировала надежность прогнозирования благодаря значениям точности, прецизионности и чувствительности 1 для 4820 изображений в фоновом исследовании (сценарий А), 3900 изображений в положительном контрольном исследовании (сценарий В) и 2731 изображению в отрицательном контрольном исследовании (сценарий D). Полученная прогностическая модель была развернута для классификации видеокадров изображений мышей, нюхающих спирт и потребляющих арахисовое масло, содержащее васаби (сценарий С), в различные сценарии исследования, т.е. сценарии А, В и D. Результаты показывают, что 0% и 29% изображений были классифицированы по классам фонового исследования (сценарий А, присутствует чистая вода и арахисовое масло без васаби) и отрицательного контрольного исследования (сценарий D, присутствует китайский спирт и арахисовое масло без васаби), соответственно, в то время как 71% изображений были классифицированы как классы положительной контрольной группы (сценарий С, где присутствовала чистая вода и смесь васаби и арахисового масла). Эти результаты подразумевают, что присутствие пищевого ликера может уменьшить ноцицепцию, вызванную васаби, у мышей. Чтобы оценить, что компьютер узнал из предоставленных обучающих материалов, для каждого слоя свертки были сгенерированы карты признаков. Как показано на дополнительном рисунке 9A-D, было замечено, что внимание аппарата сосредоточено на различных чертах лица, таких как глазная орбита, нос, края щек и тела, уши, а также на контактной поверхности чау. На основе этих наблюдений был проведен еще один метод анализа данных — MGS. MGS фокусируется на лицевых AU мышей, что позволяет провести статистическую оценку и дальнейшую проверку подавляющей способности представления алкогольных напитков к ноцицепции, вызванной васаби.

Оценка по шкале гримас мыши вручную статистически подтверждает прогнозы машинного обучения.
Интенсивность ноцицепции, вызванной васаби, оценивалась с использованием шкалы MGS, которая присваивает баллы от 0 до 2, где 0 баллов представляет наименее тяжелый, а 2 балла указывает на наиболее тяжелый ответ. В этом исследовании 22 обученных участника панели оценивали баллы MGS 24 мышей (т.е. 2 мыши были представлены на 12 выбранных изображениях как показано на дополнительном рисунке 10, дополнительном рисунке 11, дополнительном рисунке 12, дополнительном рисунке 13 ). Анализ однопометника из 2 мышей с помощью тройных экспериментов показал, что внутрипартийная и межпартийная точность имели относительный стандартный вывод в диапазоне от 0% до 25% и 9% до 33% соответственно. Это свидетельствует о хорошей точности и последовательности в процессе подсчета баллов MGS. Наблюдалась значительная разница между баллами MGS у мышей, получавших пасту из арахисового масла (рис. 3А, 0,73 ± 0,04), и у мышей, получавших смесь васаби и арахисового масла (рис. 3В, 1,59 ± 0,11). Это подтверждает экспериментальную установку для поведенческого исследования на животных и эффективность васаби в индуцировании ноцицептивных реакций. Несмотря на то, что пары алкоголя, выделяющиеся из предоставленного алкогольного напитка (~42% v/v алкоголя), могут вызывать раздражение, оценка MGS (рис. 3D, 0,86 ± 0,16) не показала существенной разницы по сравнению с контрольной группой (рис. 3A, 0,73 ± 0,04). Тем не менее, наблюдалась значительная разница между показателями MGS у мышей, получавших смесь васаби и арахисового масла (рис. 3B, 1,59 ± 0,11), и у мышей, получавших пары алкоголя во время употребления васаби (рис. 3C, 0,95 ± 0,07) со значением P <0,05. Эти результаты свидетельствуют о том, что совместное применение васаби и алкогольных напитков может потенциально уменьшить раздражение, вызванное васаби, что согласуется с перспективой искусственного интеллекта. Необходимы дальнейшие исследования для изучения эффективного ингредиента в китайском спиртном напитке, который способствует подавлению остроты васаби, вероятно, связанной с присутствием этанола.

Пример кода, который уже доступен. Весь код для выполнения распознавания изображений, связанный с текущей заявкой, доступен в общедоступном репозитории GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Любые обновления также будут опубликованы в репозитории GitHub со ссылкой на итоговый DOI этой работы.

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальная установка для исследования поведения животных, связанного с болью. (А) Вся установка для видеозаписи выражений лица двух мышей с помощью камер на двух смартфонах, размещенных на телефонах, стоит на каждом терминале. (В) В камере чау-чау 2 мышам вливали две пасты по 0,5 г арахисового масла или смеси васаби и арахисового масла в неограниченном количестве, а в углубление под пастами для одновременного ингаляции заливали 30 мл жидкости (воды или ~42% v/v ликера). (C) Более пристальный взгляд на бороздку, которая была заполнена 30 мл жидкости и содержала 2 пасты смеси васаби и арахисового масла. Смесь готовили путем смешивания 1 г коммерческого васаби с 4,5 г арахисового масла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Архитектура модели сверточной нейронной сети и ее вход и выход. Для обучения использовались изображения из 3 различных сценариев, в том числе сценарий А для исследования фона, сценарий Б для исследования положительного контроля и сценарий D для исследования с отрицательным контролем. Изображения сценария C для исследования взаимодействия вкуса и запаха васаби и алкоголя были классифицированы по сценариям A, B или D после обучения модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3:Шкала гримас мышей (MGS) оценивает мышей, которым давали разные чау-чау. Оценка MGS составляет от 0 до 2, где оценка 0 означает наименее тяжелую, а оценка 2 — наиболее тяжелую. Эталонная шкала MGS была адаптирована из Langford et al. (2010)16. Гримаса мышей, которым давали (А) арахисовое масло для употребления, набрала 0,73 ± 0,04; (В) смесь васаби и арахисового масла (1 г коммерческого васаби на 4,5 г арахисового масла) для приема внутрь набрала 1,59 ± 0,11; (В) смесь васаби и арахисового масла для приема внутрь, при этом вдыхание алкоголя было доступно из-под предоставленного спирта (~42% v/v алкоголя), набрало 0,95 ± 0,07; (D) арахисовое масло для употребления в то время, когда вдыхание алкоголя было доступно снизу, набрало 0,86 ± 0,16 балла. *, P < 0,05; **, P < 0,01; При одностороннем дисперсионном анализе с помощью апостериорного критерия множественного сравнения Бонферрони при 95% доверительном интервале не было существенной разницы. Полосы погрешностей представляли стандартную погрешность измерений (SEM). Тройные измерения проводились для 2 мышей в каждом сценарии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Резюме четырех сценариев, имитируемых при оценке поведения животных. Примечание: Смесь была приготовлена путем смешивания 1 г коммерческого васаби с 4,5 г арахисового масла. b Китайский спирт, содержащий ~42% v/v алкоголя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Сводка производительности модели. Гиперпараметры размера партии 64, номер фильтра1-го слоя 2D свертки 8 без последующего выпадения, номер фильтра2-го слоя 2D свертки 8, номер фильтра3-го слоя 2D свертки 8 с выпадением 0,1, номер фильтра4-го слоя 2D свертки 8, А фильтр номер плотного слоя 64 с отпадением 0,5 дал наименьшие потери для внутреннего набора для раздельного тестирования. Затем эти гиперпараметры были приняты для обучения модели классификации из трех групп (сценарий A, B и D) для прогнозирования изображений сценария C. Сценарий A предназначался для фонового исследования. Сценарий В предназначался для исследования положительного контроля. Сценарий D предназначался для исследования негативного контроля. Сценарий С предназначался для исследования взаимодействия вкуса и запаха васаби и алкоголя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Примеры учебных материалов для глубокого обучения класса сценария А (фоновое исследование). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Примеры учебных материалов для глубокого обучения класса сценария B (исследование позитивного контроля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Примеры учебных материалов для глубокого обучения класса сценария D (исследование негативного контроля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Прогнозы и примеры независимых материалов класса сценария А (фоновое исследование) для валидации модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Прогнозы и примеры независимых материалов класса сценария B (исследование положительного контроля) для валидации модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Прогнозы и примеры независимых материалов класса сценария D (исследование отрицательного контроля) для валидации модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Прогнозы и примеры материалов класса сценария C (исследование взаимодействия васаби и алкоголя между вкусом и запахом) для применения модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 8: Предиктивная производительность оптимальной модели глубокого обучения. (А) потери в обучении и потеря внутренней валидации в течение 7 эпох; (B) Кривые точности-полноты, (C) Прецизионность и (D) Вспоминание обучения и внутренней валидации на протяжении 7 эпох. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 9: Карты признаков каждого слоя свертки. Карты признаков (A) первого, (B) второго, (C) третьего и (D) последнего слоя свертки в сценариях A, B и D отсортированы в порядке от верхнего к нижнему. Сценарий А предназначался для исследования предыстории. Сценарий В предназначался для исследования положительного контроля. Сценарий D предназначался для исследования негативного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 10: Выбранные изображения для оценки по шкале гримас мыши вручную для сценария А (фоновое исследование). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 11: Выбранные изображения для ручной оценки по шкале гримас мыши для сценария B (положительное контрольное исследование). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 12: Выбранные изображения для ручной оценки шкалы гримас мыши для сценария C (исследование взаимодействия васаби и алкоголя между вкусом и запахом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 13: Выбранные изображения для ручной оценки по шкале гримас мыши для сценария D (исследование негативного контроля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Гримасы мышей после употребления васаби при наличии или отсутствии предусмотренных в нем алкогольных напитков. От 0 до 8 секунд в видеоклипе была представлена нормальная мимика мышей при употреблении арахисового масла. От 8 с до 17 с он иллюстрировал гримасы мышей при проглатывании васаби. У мышей наблюдалось сжатие орбиты, выпячивание носа, выпячивание щек, сужение ушей наружу и изменение усов. От 17 до 29 секунд было показано, что ноцицепция, вызванная васаби, может быть подавлена, когда под ней доступен спирт. С 29 с и до конца он показывал коллекцию гримас в разных сценариях, описанных выше. Обратите внимание, что предоставленное видео используется только для иллюстрации. Его качество отличается от описанных требований к качеству распознавания изображений и моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: shuffleSlides.pptm. Дополнительная презентация с поддержкой макросов Microsoft PowerPoint под названием "shuffleSlides.pptm". Этот файл был подготовлен для перетасовки изображений для слепого теста оценки по шкале гримас мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Архитектура CNN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предлагаемый метод изучения взаимодействия вкуса и запаха в данной работе основан на оригинальном методе поведенческого кодирования выражения боли на лице у мышей, который был разработан Langford et al.16. В нескольких недавно опубликованных статьях была представлена технология CNN для автоматического отслеживания лица мыши, и последующая оценка MGS составила 21,26,27,28. Применение СНС имеет преимущество по сравнению с исключительно оригинальным методом, так как это приводит к созданию серии видеокадровых изображений, которые могут быть использованы для обучения модели прогнозирования. В отличие от этого, первоначальный метод требовал предварительного отбора ограниченного количества изображений для MGS, что могло привести к субъективности и предвзятости.

Среди ранее опубликованных методов, основанных на СНС, все были разработаны для оценки степени дистресса или дискомфорта при прямом введении обезболивающего агента в кровоток26,28. Одним из недостатков этого подхода к введению препарата является то, что требуется значительное количество усилий для фильтрации изображений видеокадров, которые не захватывают профиль лица мыши. В этом исследовании коммерческий васаби, вызывающий ноцицепцию, предоставляется в неограниченном количестве. Помимо маскировки летучего ингредиента AITC, арахисовое масло также способно привлекать объекты мыши, чтобы они демонстрировали четкий жест спереди, облегчая захват их профилей лица во время видеозаписи. Кроме того, такой подход устраняет любые потенциальные помехи от боли, вызванной введением иглы. Тем не менее, важно отметить, что глотательные движения мышей могут мешать оценке MGS для выпячивания носа и выпячивания щек. Чтобы решить эту проблему, необходимо провести контрольный эксперимент, в котором мышам давали чистое арахисовое масло.

В некоторых алгоритмах изучения поведения животных, основанных на СНС, только подмножество единиц действий лица мыши выбирается из обучающих изображений и программируется на захват21,22. Эти вычислительные методы опираются на заранее определенные признаки, которые связаны с ощущением ноцицепции, потенциально пренебрегая другими важными особенностями, специфичными для отдельных мышей. В результате это может привести к потере информации. В отличие от этого, в этом исследовании используется другой подход, использующий полное изображение лица мыши для обучения модели СНС. Было показано, что этот метод, основанный на использовании только изображений (IOU), является более эффективным для классификации изображений25. Таким образом, предлагаемый в настоящем исследовании подход к моделированию СНС аналогичен некоторым предложенным методам, которые сначала обучают модель СНС с использованием всего изображения без аннотации области, а затем проверяют модель с помощью ручной оценки человеком27,29. Такой подход позволяет сохранить больше информации на изображениях и предотвратить внедрение субъективности.

Тем не менее, ограничением экспериментальной установки в этой работе является то, что испытуемые мыши были размещены в качестве однопометников для 2 особей, а не в отдельных местах обитания. Это решение было преднамеренным, учитывая, что мыши являются социальными животными и обычно процветают в групповых условиях. Интересным открытием является то, что в период обучения животных только 2 однопометника в 1 клетке из 3 клеток были обучены адаптироваться к присутствию китайского духа. В итоге только тройные эксперименты проводились исключительно на этих 2 однопометниках. Для учебных материалов по моделированию CNN индивидуальное изображение, содержащее обоих 2 однопометников, также было взято в качестве индивидуальной выборки без проведения какой-либо сегментации. Такой подход позволил нам зафиксировать взаимодействие между однопометниками и проанализировать их поведение вместе с мимикой в целом.

Подобно методу оценки MGS на основе изображений, предложенный в данном исследовании метод может быть перенесен на другие виды животных, такие как кошачьи и лошади30,31. Применяя предложенную методологию, метод введения пищи с применением компьютерного зрения может стать подходом для облегчения изучения поведения животных, в частности, взаимодействия вкуса и запаха у различных животных.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

З. Цай хотел бы выразить признательность за финансовую поддержку со стороны благотворительного фонда Kwok Chung Bo Fun для создания кафедры экологического и биологического анализа Kwok Yat Wai.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абсолютный этанол (EtOH)VWR Chemicals BDHCAS# 64-17-5
Акрилонитрилбутадиенстирольный кирпичФлагманский магазин Jiahuifenghttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Пластины акрилонитрилбутадиенстиролаФлагманский магазин Jiahuifenghttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
аллилизотиоцианата (AITC)Sigma-AldrichCAS# 57-06-7
Безводный диметилсульфоксидSigma-AldrichCAS# 67-68-5
Китайский спиртYanghe Qingcihttps://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Коммерческий васабиS& БИ ФУДС ИНК.
Муравьиная кислота (FA)VWR Chemicals BDHCAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5GraphPadhttps://www.graphpad.com
ацетонитрил ВЭЖХ (ACN)VWR Chemicals BDHCAS# 75-05-8
Метанол ВЭЖХ (MeOH)VWR Chemicals BDHCAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016Microsofthttps://www.microsoft.com 
Microsoft PowerPoint 2016Система водоснабжения Microsofthttps://www.microsoft.com
Milli-Q Milliporehttps://www.merckmillipore.com
мышь:Центр обслуживания лабораторных животных ICR (Китайский университет Гонконга, Гонконг, Китай)Н/Д
Арахисовое маслоSkippyhttps://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10Python Software Foundationhttps://www.python.org 
Прозрачные акриловые пластиныTaobao Storehttps://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797<чел/> 0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM
ЕГУ
https://www.sbfoods-worldwide.com

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isshiki, K., Tokuoka, K., Mori, R., Chiba, S. Preliminary examination of allyl isothiocyanate vapor for food preservation. Biosci Biotechnol Biochem. 56 (9), 1476-1477 (1992).
  2. Li, X., Wen, Z., Bohnert, H. J., Schuler, M. A., Kushad, M. M. Myrosinase in horseradish (Armoracia rusticana) root: Isolation of a full-length cDNA and its heterologous expression in Spodoptera frugiperda insect cells. Plant Sci. 172 (6), 1095-1102 (2007).
  3. Depree, J. A., Howard, T. M., Savage, G. P. Flavour and pharmaceutical properties of the volatile sulphur compounds of Wasabi (Wasabia japonica). Food Res Int. 31 (5), 329-337 (1998).
  4. Hu, S. Q., Wei, W. Study on extraction of wasabi plant material bio-activity substances and anti-cancer activities. Adv Mat Res. 690 - 693, 1395-1399 (2013).
  5. Lee, H. -K., Kim, D. -H., Kim, Y. -S. Quality characteristics and allyl isothiocyanate contents of commercial wasabi paste products. J Food Hyg Saf. 31 (6), 426-431 (2016).
  6. Bacon, T. Wine, wasabi and weight loss: Examining taste in food writing. Food Cult Soc. 17 (2), 225-243 (2014).
  7. Fleming, P. A., et al. The contribution of qualitative behavioural assessment to appraisal of livestock welfare. Anim Prod Sci. 56, 1569-1578 (2016).
  8. Shi, X., et al. Behavioral assessment of sensory, motor, emotion, and cognition in rodent models of intracerebral hemorrhage. Front Neurol. 12, 667511(2021).
  9. Stevenson, R. J., Prescott, J., Boakes, R. A. Confusing tastes and smells: How odours can influence the perception of sweet and sour tastes. Chem Senses. 24 (6), 627-635 (1999).
  10. Pfeiffer, J. C., Hollowood, T. A., Hort, J., Taylor, A. J. Temporal synchrony and integration of sub-threshold taste and smell signals. Chem Senses. 30 (7), 539-545 (2005).
  11. Simons, C. T., Klein, A. H., Carstens, E. Chemogenic subqualities of mouthfeel. Chem Senses. 44 (5), 281-288 (2019).
  12. Andrade, E. L., Luiz, A. P., Ferreira, J., Calixto, J. B. Pronociceptive response elicited by TRPA1 receptor activation in mice. Neuroscience. 152 (2), 511-520 (2008).
  13. Palazzo, E., Marabese, I., Gargano, F., Guida, F., Belardo, C., Maione, S. Methods for evaluating sensory, affective and cognitive disorders in neuropathic rodents. Curr Neuropharmacol. 19 (6), 736-746 (2020).
  14. Topley, M., Crotty, A. M., Boyle, A., Peller, J., Kawaja, M., Hendry, J. M. Evaluation of motor and sensory neuron populations in a mouse median nerve injury model. J Neurosci Methods. 396, 109937(2023).
  15. Langford, D. J., et al. Mouse Grimace Scale (MGS): The Manual. , https://www.nc3rs.org.uk/sites/default/files/documents/Guidelines/MGS%20Manual.pdf (2015).
  16. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  17. Liu, H., Fang, S., Zhang, Z., Li, D., Lin, K., Wang, J. MFDNet: Collaborative poses perception and matrix Fisher distribution for head pose estimation. IEEE Trans Multimedia. 24, 2449-2460 (2022).
  18. Liu, T., Wang, J., Yang, B., Wang, X. NGDNet: Nonuniform Gaussian-label distribution learning for infrared head pose estimation and on-task behavior understanding in the classroom. Neurocomputing. 436, 210-220 (2021).
  19. Liu, T., Liu, H., Yang, B., Zhang, Z. LDCNet: Limb direction cues-aware network for flexible human pose estimation in industrial behavioral biometrics systems. IEEE Trans Industr Inform. 20 (6), 8068-8078 (2023).
  20. Grant, E. P., et al. What can the quantitative and qualitative behavioural assessment of videos of sheep moving through an autonomous data capture system tell us about welfare. Appl Anim Behav Sci. 208, 31-39 (2018).
  21. Vidal, A., Jha, S., Hassler, S., Price, T., Busso, C. Face detection and grimace scale prediction of white furred mice. Mach Learn Appl. 8, 100312(2022).
  22. Zylka, M. J., et al. Development and validation of Painface, A software platform that simplifies and standardizes mouse grimace analyses. J Pain. 24 (4), 35-36 (2023).
  23. Liu, H., Zhang, C., Deng, Y., Liu, T., Zhang, Z., Li, Y. F. Orientation cues-aware facial relationship representation for head pose estimation via Transformer. IEEE Trans Image Process. 32, 6289-6302 (2023).
  24. Liu, H., Liu, T., Chen, Y., Zhang, Z., Li, Y. F. EHPE: Skeleton cues-based Gaussian coordinate encoding for efficient human pose estimation. IEEE Trans Multimedia. , (2022).
  25. Liu, H., et al. TransIFC: Invariant cues-aware feature concentration learning for efficient fine-grained bird image classification. IEEE Trans Multimedia. , (2023).
  26. Akkaya, I. B., Halici, U. Mouse face tracking using convolutional neural networks. IET Comput Vis. 12 (2), 153-161 (2018).
  27. Andresen, N., et al. Towards a fully automated surveillance of well-being status in laboratory mice using deep learning: Starting with facial expression analysis. PLoS One. 15 (4), e0228059(2020).
  28. Ernst, L., et al. Improvement of the mouse grimace scale set-up for implementing a semi-automated Mouse Grimace Scale scoring (Part 1). Lab Anim. 54 (1), 83-91 (2020).
  29. Tuttle, A. H., et al. A deep neural network to assess spontaneous pain from mouse facial expressions. Mol Pain. 14, 1744806918763658(2018).
  30. Lencioni, G. C., de Sousa, R. V., de Souza Sardinha, E. J., Corrêa, R. R., Zanella, A. J. Pain assessment in horses using automatic facial expression recognition through deep learning-based modeling. PLoS One. 16 (10), e0258672(2021).
  31. Steagall, P. V., Monteiro, B. P., Marangoni, S., Moussa, M., Sautié, M. Fully automated deep learning models with smartphone applicability for prediction of pain using the Feline Grimace Scale. Sci Rep. 13, 21584(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи