В этом протоколе описывается применение хирургической техники, используемой для переноса клонированных эмбрионов свиней с помощью лапаротомии у свинок.
Методическая статья
Операция по переносу эмбрионов с помощью лапаротомии у свинок
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол направлен на демонстрацию хирургической техники переноса клонированных эмбрионов свиньи в яйцевод, метода, широко используемого в производстве генетически модифицированных свиней для биомедицинских исследований. Девяти свинкам была проведена гормональная синхронизация и лапаротомия для переноса клонированных эмбрионов, полученных путем переноса ядра соматических клеток (SCNT) на стадии до 4 клеток на 2-й день в яйцевод. Гестационная диагностика проводилась с помощью ультразвукового исследования через 30 дней после операции. У шести из девяти оперированных свинок при ультразвуковом исследовании были обнаружены признаки беременности. Однако, поскольку не было никакого прогресса в развитии плода, оцененного с помощью эхографии, свинкам было проведено вскрытие через 60 дней для сбора биологического материала и оценки репродуктивной системы. Спайки наблюдались в рогах матки, яичниках и яйцеводах. Из просвета матки двух усыпленных свинок были получены одна и четыре эмбриональные структуры с гестационным возрастом от 12 до 20 дней. Несмотря на отсутствие живых поросят, вероятно, объясняющееся низкой эффективностью переноса клонированных эмбрионов свиней, на которую влияют различные факторы, в том числе количество и качество переносимых эмбрионов, представленная хирургическая методика оказалась быстрой и безопасной.
Введение
Свиньи являются отличной экспериментальной моделью для биомедицинских исследований из-за их анатомического, физиологического и генетического сходствас человеком. Эти животные часто использовались в исследованиях, связанных с ксенотрансплантацией, с целью получения органов, клеток или тканей, которые способствуют низкому риску отторжения при трансплантации человеку. Исследования в области ксенотрансплантации направлены на увеличение поставок органов для трансплантации человеку, тем самым сокращая лист ожидания пациентов2.
Производство свиней для ксенотрансплантации включает в себя несколько этапов, в том числе получение клонов из генетически отредактированных клеток свиней. После производства in vitro генетически модифицированных клонированных эмбрионов эмбрионы переносятся в репродуктивную систему свиноматки с синхронизированным эстральным циклом для подготовки физиологии матки к приему и вынашиванию нового зачатия3.
Перенос эмбрионов у свиней может быть выполнен неинвазивными или инвазивными методами4. К числу неинвазивных методов относится трансцервикальная пересадка, которая не требует хирургического вмешательства. Однако этот метод ограничен переносом эмбрионов на более поздних стадиях развития (т.е. на стадиях морулы или бластоцисты) и не позволяет точно определить место введения катетера или отложения эмбриона. Лапароскопия и лапаротомия считаются инвазивными методами переноса эмбрионов. Лапароскопия менее инвазивна, но требует специального и дорогостоящего оборудования, а ее эффективность значительно варьируется (от менее чем 20% до более чем 80%) из-за различных факторов, таких как сложность манипуляций с репродуктивными структурами и тип используемого катетера 4,6. Таким образом, перенос с помощью лапароскопии все еще менее эффективен по сравнению с хирургическими методами переноса с помощью лапаротомии4.
Операция по переносу эмбрионов у свиноматок с помощью лапаротомии является относительно простой и быстрой процедурой, обычно занимающей около 30 минут. Однако она должна проводиться в хирургическом центре, оснащенном аппаратом для ингаляционной анестезии и специализированной бригадой. Для коммерческих пород свиней (таких как ландрасы, крупные белые или их помеси) необходимо специальное оборудование, такое как подъемники для подъема свиней и широкий, прочный хирургический стол из-за значительного веса животных (около 130-150 кг).
Чтобы операция прошла успешно, эмбрионы должны быть предварительно оценены на стадии их развития. Эмбрионы до 4 клеток рекомендуется переносить в маточную трубу. Эмбрионы на стадиях выше 4 клеток, такие как морулы и бластоцисты, должны быть перенесены в рог матки 7,8.
Несмотря на то, что исследовательские группы по всему миру занимаются производством и хирургическим переносом генетически модифицированных клонированных эмбрионов свиней, до сих пор нет четко определенных протоколов, демонстрирующих эту процедуру с помощью видео. Этот подход имеет решающее значение для успеха гестации, так как этот метод требует точного размещения эмбрионов в точном месте яйцевода, включая локализацию устья труб и введение пипетки, содержащей эмбрионы. Эту технику можно лучше понять с помощью поясняющих видеороликов обо всей процедуре. Таким образом, цель данной статьи – продемонстрировать лапаротомическую операцию по переносу клонированных эмбрионов в яйцевод свинок, что является важной предпосылкой для будущего производства генетически модифицированных свиней, которые будут использоваться для ксенотрансплантации или других связанных с этим целей.
Протокол
Данное исследование было одобрено Этическим комитетом по использованию животных в научных исследованиях Колледжа ветеринарной медицины и зоотехнии Университета Сан-Паулу, протокол No 6088030523. Девять семимесячных свинок из свинофермы Água Branca, расположенной в городе Иту, штат Сан-Паулу, Бразилия, были использованы сразу после обнаружения второй течки9. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка животных
- Голодайте животных в течение 12 часов и ограничьте доступ к воде в течение 4 часов перед хирургической процедурой.
- С помощью иглы размером 40 мм x 12 мм наберите 10 мг/кг кетамина и 0,2 мг/кг мидазолама в тот же шприц объемом 50 мл. Прикрепите шприц к набору для внутривенного введения, чтобы облегчить введение лекарства, сохраняя безопасную дистанцию от животного и позволяя ему свободно двигаться.
- Вводите препарат перед анестезией путем внутримышечной инъекции в трапециевидную мышцу, каудально к наружному слуховому проходу.
- Канюлировать ушную вену с помощью катетера 20 G и подключить ее к набору для введения макрокапель для интраоперационной инфузионной терапии 0,9% раствором NaCl со скоростью 10 мл/кг/ч.
- Ввести анестезию с помощью 4 мг/кг пропофола внутривенно (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
- Проводят оротрахеальную интубацию животного с помощью ларингоскопа и оротрахеальной трубки размера 9 с манжетой10.
- Поддерживайте анестезию при ингаляции от 1,5% до 2% изофлурана. Кроме того, контролируйте анестезию, оценивая физиологические параметры, такие как частота сердечных сокращений, которая должна поддерживаться в диапазоне от 100 до 120 ударов в минуту, сатурация кислорода, которая должна поддерживаться в диапазоне от 99% до 100%, мышечное расслабление, отсутствие движения и оценка рефлексов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела также должна контролироваться и контролироваться, оставаясь в пределах 37,5-38,5 °C. При необходимости, помимо изофлурана, для поддержания контроля параметров может использоваться пропофол. Фентанилгидрохлорид следует назначать в качестве анальгетика в дозе 0,02 мг/кг каждые 20 минут. Все параметры должны регистрироваться каждые 5 минут. - Вводите периоперационную анальгезию однократно в 0,002 мг/кг фентанила внутривенно и 4 мг/кг трамадола гидрохлорида внутримышечно в ягодичную или трапециевидную мышцу.
- Поместите сердечные электроды в грудной отдел для интраоперационного мониторинга частоты сердечных сокращений. Записывайте частоту сердечных сокращений, ректальную температуру и сатурацию кислорода каждые 5 минут.
2. Хирургическое вмешательство
- Расположите свинку на операционном столе в положении лежа на спине.
- Накройте ноги животного процедурными перчатками, чтобы свести к минимуму загрязнение операционного поля.
- Выполните удаление волос в вентральном каудальном отделе живота между предпоследней парой молочных желез с помощью хирургической машинки для стрижки.
- Выполняйте предоперационную антисептическую обработку кожи антисептической щеткой, пропитанной хлоргексидином, совершая круговые движения от области пупочного рубца к последней паре молочных желез. Удалите хлоргексидин с помощью чистого, увлажненного компресса.
- Убедитесь, что хирург и ассистент выполняют хирургическую антисептическую обработку и надевают стерильные хирургические халаты и перчатки для операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно быть подготовлено к операции в зоне подготовки, отдельной от места операции. - Подготовьте операционный стол с помощью соответствующих и предварительно стерилизованных инструментов, перечисленных в Таблице материалов.
- Проведите заключительную хирургическую полевую антисептическую обработку с использованием стерильной марли и антисептика хлоргексидина, очищая область по схеме «рыбья кость», начиная с места разреза и расширяясь в стороны.
- Повторите эту процедуру трижды с хлоргексидиновым антисептиком, а затем повторите процедуру со спиртовым хлоргексидином.
- Полностью накройте животное стерильной хирургической простыней, и с помощью ножниц создайте прямоугольное отверстие в хирургической простыне, примерно 10 х 20 см², если драпировка не фенестрирована.
- Расположите хирургическую простыню над предпоследней парой паховых молочных желез. Поместите 4 зажима Backhaus, чтобы закрепить хирургическую простыню на коже животного.
- Надрежьте кожу скальпелем, создав разрез примерно 10 см в длину.
- Добиться гемостаза подкожных сосудов с помощью гемостатических щипцов и/или рассасывающегося шовного материала размера 2.
- Рассеките подкожную клетчатку пальцами или с помощью ножниц с тонким острием, углубляя разрез так, чтобы достичь белой линии в мышцах живота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пальпируйте среднюю линию живота, чтобы почувствовать белую линию как более жесткую и волокнистую область; Наблюдайте за разделением прямых мышц живота и отмечайте изменение консистенции тканей во время рассечения, чтобы точно определить белую линию 11. - С помощью щипцов Allis захватите мускулатуру и поднимите ее, чтобы сделать колотый разрез в белой линии с помощью скальпеля.
- Введите указательный палец в разрез, чтобы оценить наличие спаек. Осторожно расширьте разрез над белой линией каудально и краниально тупыми/тупыми или тонкими/тупыми ножницами, чтобы не повредить другие органы и нижележащие структуры.
- Сделайте разрез достаточной длины, чтобы одна рука хирурга могла быть введена в брюшную полость для локализации и экстериоризации рогов матки и/или яичников. Ретрактор Госсета может быть использован для облегчения входа в брюшную полость и наложения швов на мускулатуру в один слой в конце процедуры.
- Если один из рогов матки расположен перед яичниками, аккуратно проследите за ним до достижения кончика маточного рога и ипсилатерального яичника. Во время этой процедуры оцените наличие жидкости внутри матки, которая может поставить под угрозу беременность.
- Обнаружив яичник, аккуратно потяните его и осторожно обнаживьте. Оцените наличие преовуляторных фолликулов, геморрагических желтых тел, циклических желтых тел и белых тел, чтобы оценить, соответствует ли ожидаемая синхронизация свинки.
- Аккуратно удалите фимбрии маточной трубы, покрывающей яичник, выверните ее слизистую оболочку и найдите устье маточной трубы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если хирург затрудняется определить устье фимбрии, карман на ампуле яйцевода может быть сделан с помощью круглой иглы для наложения швов, избегая прокола кровеносных сосудов, чтобы ввести катетер Tomcat, содержащий эмбрионы. - Осторожно введите катетер Tomcat, содержащий эмбрионы, в устье фимбрий, пока не дойдете до ампульной области маточной трубы.
- Прикрепите шприц объемом 1 мл к катетеру Tomcat, чтобы протолкнуть жидкость, содержащую эмбрион, в маточную трубу. Накройте яичник фимбриями и верните его в брюшную полость.
- Найдите контралатеральный маточный рог и яичник и повторите шаги 2.17-2.21.
- Переместите структуры внутри брюшной полости и добавьте 1 л физиологического раствора или раствора лактата Рингера, подогретого (39 °C), чтобы предотвратить спайки перед началом абдоминорафии.
- Сшиваем мускулатуру живота рассасывающимся швом размера 2 в "Х" швами (Султан) прерываем.
- Аппроксимируйте подкожную клетчатку непрерывным матрасным швом с помощью рассасывающегося шовного материала размера 2.
- Закройте кожу нейлоновым швом размера 2 прерывистыми простыми швами, хирургическими скобами или этилцианоакрилатным клеем. В этой процедуре мы остановили свой выбор на использовании клея.
- Очистите операционную рану марлей, смоченной в перекиси водорода, и обсушите компрессом для усиления фиксации хирургического клея на операционной ране. Нанесите рифамицин или мазь Пирсона, накройте марлей и, наконец, нанесите хирургический клей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рана должна оставаться закрытой с помощью повязки в течение 5 дней.
3. Послеоперационный уход
- Оценивайте животных на наличие признаков характерной клинической боли в течение как минимум следующих 3 дней подряд в соответствии со шкалой, предложенной Luna et al.12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта шкала основана на различных формах поведения, проявляемых свиньями при испытании разного уровня боли, таких как осанка, взаимодействие и интерес к окружающей среде, активность, аппетит и внимание к пораженной области. Оценка колеблется от 0 до 3, в зависимости от типа демонстрируемого поведения, для каждого оцениваемого параметра. В конце оценки сумма всех баллов отражает интенсивность боли, испытываемой животным, где 0 означает отсутствие боли, а 18 представляет очень интенсивную боль12. - Вводите однократную дозу 15 мг/кг амоксициллина и 0,4 мг/кг 2% мелоксикама внутримышечно (в ягодичную или шейную мышцу) один раз в сутки в течение 3 дней в качестве послеоперационного ухода для предотвращения боли, воспалительных процессов и инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если оценка боли равна или превышает 6 баллов по используемой шкале боли (оценка от 0 до 18), введите 5000 мг/животное дипирона натрия внутримышечно (в ягодичную или шейную мышцу) один раз в день в дополнение к противовоспалительным препаратам и антибиотикам. В качестве альтернативы можно провести анальгезию в соответствии с местными рекомендациями IACUC. - На 6-е сутки после операции удалить хирургический клей для очистки раны марлей, смоченной в 2% спиртовом растворе хлоргексидина, и нанести мазь Пирсона для местного применения до 10-го дня, когда рекомендуется снятие швов или хирургическое снятие скоб, если оно используется.
4. Ультразвуковая гестационная диагностика беременности
- Проведите трансабдоминальную ультразвуковую оценку беременности с помощью ультразвукового аппарата (диапазон частот от 4,5 до 8,5 МГц) через 30 дней после операции по переносу эмбрионов.
- Нанесите ультразвуковой гель на зонд и расположите его возле паховой области живота, лицом медиально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация округлых безэховых эмбриональных пузырьков, обусловленных жидкостью в просвете матки, указывает на беременность. Отсутствие визуализации внутриматочной жидкости или наличие внутриматочной жидкости без разграничения эмбриональных пузырьков свидетельствует об отсутствии гестации.
5. Эвтаназия животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпить свинок, у которых при ультразвуковом исследовании не было плодов размеров и внешнего вида, соответствующих гестационному возрасту.
- С помощью иглы размером 40 мм x 12 мм наберите 15 мг/кг кетамина и 2 мг/кг мидазолама в тот же шприц объемом 50 мл, прикрепленный к набору для внутривенного введения, и введите внутримышечно в трапециевидную мышцу в шейном отделе каудально к наружному слуховому проходу в качестве предобезболивающего препарата.
- Канюлируйте ушную вену с помощью катетера 20 G и вводите анестезию 4 мг/кг пропофола внутривенно в болюсе до тех пор, пока не произойдет брадикардия (в соответствии с институционально утвержденными протоколами).
- Затем введите от 10 до 20 мл 19,1% хлорида калия внутривенно. Подтвердите остановку сердца и легких, наблюдая за отсутствием дыхательных движений, бледностью слизистых оболочек, потерей роговичного рефлекса и отсутствием сердцебиения, поместив стетоскоп на сердечную область.
- Соберите любой тип внутриматочного содержимого (эмбриональная ткань, жидкость или слизистый секрет) у вскрытыхсамок13 и отправьте его на микробиологический анализ для выявления возможных патогенов, а также для генотипической характеристики клонов (при необходимости). Визуально проверьте наличие или отсутствие желтых тел, кист яичников, аномальных выделений, а также возникновение спаек в матке, яичниках и яйцеводах14.
Результаты
Целью данной статьи является демонстрация лапаротомической операции по переносу клонированных эмбрионов в яйцевод свинок. Все животные оставались в адекватной анестезиологической плоскости, без каких-либо интраоперационных инцидентов и осложнений во время восстановления после анестезии. Свинкам требовалось в среднем 2-3 часа, чтобы встать после окончания операции.
Все хирургические процедуры длились, в среднем, 44 минуты. Девять свинок были прооперированы, в среднем 185 клонированных эмбрионов были перенесены на одну свинку, в общей сложности 1664 эмбриона были перенесены двусторонним путем (Таблица 1). Локализация яичников, их экстериоризация, а также введение катетера Tomcat с эмбрионами в устье яйцевода соответствовали самым деликатным моментам операции. Яичники всех свинок были осмотрены во время операции, и у всех были обнаружены недавно овулированные геморрагические фолликулы, что соответствовало ожиданиям от протокола синхронизации течки, целью которого было проведение переноса эмбрионов вскоре после овуляции. Все процедуры проходили без интраоперационных инцидентов.
Ни у одного животного не наблюдалось признаков интенсивной боли после операции, со средней оценкой боли 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 и 0,33 по шкале боли (в диапазоне от 0 до 18), проведенной в течение 3 послеоперационных дней для каждого из прооперированных свинок (Таблица 2). Только у 1 из прооперированных свинок на12-е сутки после операции наблюдалось скопление подкожной жидкости (серома) с признаками инфекции и воспаления, локализованными вблизи операционной раны. После дренирования жидкости иглой 40 мм х 1,6 мм под контролем ультразвука, наложения холодных компрессов на воспаленный участок по 30 минут ежедневно в течение 7 дней, введения цефтиофура (3 внутримышечных инъекции, с интервалом 72 ч между инъекциями) и 2% мелоксикама (0,4 мг/кг СИД, внутримышечно, в течение 3 дней), рана свищевалась и дренировалась оставшееся слизисто-гнойное содержимое, в результате чего происходит полное оздоровление животного. Другие прооперированные свинки оставались с хирургической повязкой в течение 5 дней без необходимости ее замены или снятия для очистки раны, которая проводилась только с6-го по10-й день после операции.
У свинок 2, 8 и 9 не наблюдалось накопления жидкости и образования эмбриональных пузырьков в просвете матки (рис. 1А). Поэтому гестационный диагноз этих животных был признан отрицательным. У других свинок наблюдалось накопление внутриматочной жидкости и образование эмбриональных везикул, визуализированных в виде четко выраженных безэхогенных округлых структур (Рисунок 1B-D). На32-й день гестации удалось идентифицировать у двух свинок-реципиентов гиперэхогенную область относительно структуры эмбриона в ранней фазе развития внутри эмбриональных везикул (рис. 1E, F).
После отрицательного гестационного диагноза или отсутствия гестации свинок усыпляли, а также анализировали репродуктивную систему. Спайки в областях яичников, яйцеводов и рогов матки в меньшей или большей степени наблюдались у свинок 1, 2, 3 и 4, а кисты яичников наблюдались у свинок 8 (рис. 2). Четыре эмбриональные структуры с гестационным возрастом, сопоставимым примерно с 12-20 днями гестации, были получены из матки свинки 3, и одна структура была получена из свинки 7 (Рисунок 3). Анализ фрагментов эмбриональной ткани дал отрицательный результат на обнаружение парвовируса, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae и цирковируса свиней типов 2 и 3 (PCV2/PCV3), которые могут вызывать гибель эмбриона или аборты.
Рисунок 1: Ультразвуковые изображения матки свинок реципиента эмбриона через 30 дней после хирургической процедуры. (А) Матка свинки 2 без наличия жидкости внутри, что характеризует отрицательный гестационный диагноз. Подтяжная матка позолочки 1 (В), свинки 3 (С) и свинки 4 (D), содержащая эмбриональные пузырьки с жидкостью внутри (звездочки). Гравидная матка свинки 3 (E) и свинки 7 (F) с гиперэхогенной структурой (стрелкой) внутри эмбрионального пузырька, что указывает на формирование плода на ранней стадии на 32 день гестации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ репродуктивной системы. Изображения матки, яичников и яйцеводов после вскрытия позолотки 1 (A), позолотки 2 (B), свинки 3 (C), свинки 4 (D), свинки 5 (E), свиньи 6 (F), свинки 7 (G), свиньи 8 (H) и свинки 9 (I). Стрелками выделены спайки в рогах матки, яичниках и яйцеводах, а стрелками – кисты яичников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Гестационный диагноз. Эмбрионы на ранних стадиях, удаленные из свинок 3 (A-D) и свинок 7 (E), при ультразвуковом исследовании имеют положительный гестационный диагноз и гиперэхогенные структуры внутри эмбриональных везикул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Таблица 1: Количество и тип эмбрионов, перенесенных на одну свинку, диагностированная беременность и количество эмбрионов, полученных после вскрытия оперированных свинок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Значения, присвоенные каждому из прооперированных свинок в отношении проявления болевых признаков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Обсуждение
Описанный хирургический метод ранее был выполнен другими исследовательскими группами, работающими с производством клонированных свиней или генетически модифицированных клонированных свиней, с сообщениями о рождении после внедрения этой методики 15,16,17,18,19,20. Показатели беременности и рождения эмбрионов SCNT, полученных из различных клеточных линий, колеблются в пределах 20%-30% (из 264 переносов с 2017 года), в среднем 3,2 ± 0,4 поросенка рождаютсяв помете 3,21. С низкой эффективностью этого метода связано несколько факторов, в том числе протокол синхронизации, используемый для свиноматок-реципиентов, синхронизация между свиноматкой-реципиентом и стадией перенесенных эмбрионов, место депонирования эмбрионов, качество ооцитов, использованных для ПЯЯ, и полученных эмбрионов, качество и клеточная стадия соматических клеток донора ядра, а такжеколичество перенесенных эмбрионов.
Согласно настоящему исследованию, описанная операция оказалась эффективной, быстрой и безопасной для выполнения хирургического переноса клонированных эмбрионов (до 4-клеточной стадии) у свиней, что привело к положительным ультразвуковым гестационным диагнозам и визуализации эмбриональных структур внутри просвета матки после вскрытия, с гестационным возрастом примерно между 12-20 днями гестации22. Другим менее инвазивным методом переноса эмбрионов ПЯЯО в яйцевод свиноматок является лапароскопия. Тем не менее, эффективность этого метода значительно варьируется от менее чем 20% до более чем 80% из-за различных факторов, таких как анатомия структур, тип используемого катетера и место отложения эмбриона 4,6,23,24,25,26,27. При переносе 2-4 эмбрионов бластомерных свиней методом лапароскопии через инфундибулум 6 свиноматкам у Wieczorek et al.4 не было достигнуто положительной беременности на 28-31 день после процедуры, и этот результат был связан с трудностями введения катетера в яйцевод, неглубоким введением катетера в яйцевод и возникновением перфорации инфундибулума катетером. Поэтому метод переноса эмбрионов с помощью лапаротомии в яйцевод свиноматок по-прежнему представляется наиболее эффективным.
Хирургический риск, связанный с процедурой лапаротомии для переноса эмбрионов у свиноматок, невелик; Однако важно отметить возможность злокачественной гипертермии во время наркоза, которая обычно наблюдается у коммерческих свиней пород ландрас и крупная белая28. При этом ни у одного из оперированных свинок не было выявлено клинических признаков злокачественной гипертермии во время анестезии. Также существует риск незначительного местного кровотечения из более крупных сосудов в подкожной области, которое можно легко остановить с помощью гемостатических щипцов или наложения швов рассасывающимся швом. Также может возникнуть возможность случайного разреза любого органа брюшной полости, такого как мочевой пузырь или петли кишечника, во время разреза скальпелем в колотую форму и разреза при разгибании белой линии ножницами. В этом случае хирург должен быть очень внимателен во время разреза белой линии и наложения швов на мышцы живота, чтобы избежать разрезания или разрыва нижележащих структур.
Ловкость рук хирурга необходима для правильной манипуляции с яичниками и тщательной экстериоризации, избегая разрыва сосудов ножки яичника. При возникновении трудностей с локализацией яичника (яичников) можно начать процедуру с определения местоположения одного из маточных рогов и следить за его расширением до достижения кончика маточного рога в маточно-трубном соединении рядом с яичником. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать спаек яичников и матки из-за чрезмерных манипуляций с этими органами. Гидратация этих структур раствором лактата Рингера или физиологическим раствором при температуре 39 °C во время операции может помочь предотвратить образование адгезии29. Манипуляции с маточной трубой, особенно в области фимбрий, должны выполняться очень деликатно, чтобы избежать растяжения и разрыва. Хотя односторонний перенос эмбрионов, только в одну из маточных труб, может быть выполнен, чтобы избежать чрезмерных манипуляций с маткой и сократить время операции, двусторонний перенос может быть более безопасным и выгодным, особенно в тех случаях, когда имеет место случайный разрыв одной из маточных труб или сомнения в размещении эмбриона в правильном месте. Кроме того, двусторонний перевод более рекомендован, так как он способствует более высоким показателям стельности и количеству рожденных поросят по сравнению с односторонним переводом16,30. Наличие кист связано с регулярным или нерегулярным возвращением к течке, при этом до 10% самок с кистами яичников остаются в анеструсе. Это связано с различными причинами, такими как стресс, использование гормональных протоколов или генетическая наследственность31,32. В нашем случае фолликулярные кисты возникли, несмотря на соблюдение дозы и времени введения, рекомендованных производителем гормона для синхронизации тепла.
Знание того, как расположить устье маточной трубы по отверстию фимбрий, имеет принципиальное значение для правильного размещения эмбрионов в соответствующем месте. Во избежание ошибок в отношении места отложения эмбриона рекомендуется провести предварительную подготовку по прохождению катетера Tomcat, заполненного раствором (например, водой), через устье маточной трубки у образцов из бойни. Когда пипетка введена в нужное место, можно наблюдать увеличение объема маточной трубки при введении раствора. Стоит отметить, что чем меньшее количество жидкости переносится вместе с эмбрионами, тем выше шансы на беременность33. Если хирургу очень сложно найти устье маточной трубы, можно сделать карман на яйцеводе и ввести через него катетер. Хотя последний метод является более быстрым и включает в себя меньше манипуляций с яйцеводом, хирург должен избегать кровеносных сосудов и быть уверенным, что катетер был правильно введен в просвет яйцевода.
Несмотря на то, что риск послеоперационных инфекций в результате этой хирургической процедуры низок, он может возникнуть из-за таких факторов, как уровень чистоты территории, где содержатся животные, продолжительность хирургической процедуры, сохранение повязки в течение достаточного времени и правильное назначение лекарств, таких как профилактическая антибиотикотерапия и противовоспалительные средства. Наиболее правдоподобная гипотеза возникновения инфекции, наблюдаемой у одной из оперированных свинок, связана с отпадением повязки вскоре после того, как животное встает после анестезии. Несмотря на то, что ежедневная очистка операционной раны этой свинки проводилась марлей, смоченной в физрастворе, и местным применением мази Пирсона, такой процедуры было недостаточно для предотвращения восходящего загрязнения, что потребовало применения холодной воды в месте заболевания, дренирования, системной антибиотикотерапии и дополнительных 3 дней противовоспалительного лечения. Даже при возникновении подкожной инфекции эта свинка при ультразвуковом исследовании показала признаки беременности.
После использования нейлоновых нитей и хирургических скоб для закрытия кожи во время предыдущих операций, мы решили использовать этилцианоакрилатный клей, чтобы уменьшить напряжение при снятии швов и предотвратить образование оставшихся нитей или скоб. Наличие нитей или скоб способствует небольшому местному воспалению с образованием пустулы. Этилцианоакрилатный клей уже безопасно используется в хирургических процедурах, доказав свою эффективность, нетоксичность и бактерицидность34,35. Все животные показали отличное заживление ран, без осложнений, за исключением свинки, у которой повязка отпала вскоре после хирургической процедуры.
Раскрытие информации
Ни один из авторов не раскрывает какой-либо конфликт интересов
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Ветеринарную больницу для лошадей и Ветеринарную больницу жвачных животных Колледжа ветеринарной медицины Университета Сан-Паулу (FMVZ/USP), Сан-Паулу, Бразилия, FAPESP (грант 2022/11459-3, Исследовательский фонд Сан-Паулу), EMS Pharma, CNPq (грант 405254/2022-9) и свиноферму Água Branca, Иту, Сан-Паулу, Бразилия.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25 мл соломинка | дженерик-Хирургический | материал | |
| 1 мл шприц | Descarpack | 341001 | Хирургический материал |
| 10 мл шприц | Descarpack | 324601 | Хирургический материал |
| 20 мл шприц | Descarpack | 324801 | Хирургический материал |
| 3 мл шприц | Descarpack | 324201 | Хирургический материал |
| Шприц 5 мл | Descarpack | 324401 | Хирургический материал |
| 60 мл шприц | Descarpack | 323201 | Хирургический материал |
| 9 мм эндотрахеальная трубка | Rusch | 112482-000090 | Хирургический материал |
| Allis щипцы | дженерик-хирургический | инструмент | |
| Amox LA | JA Saú de Animal | MAPA регистрационный: 8.781/2004 | Фармацевтический препарат |
| Bakhaus щипцы | дженерик-хирургический | инструмент | |
| катетер 20G | Descarpack | 362401 | катетер для внутривенного доступа |
| Cetamin | Agener Uniã o | Регистрация в MAPA: SP-000292-5.000011 | анестезирующий |
| Кондуктивный клинический гель | RMC | ANVISA регистрация: 80122200013 | Хирургический материал |
| Dipyrone D-500 | Zoetis | MAPA регистрация: SP0000728-46 | Фармацевтический препарат |
| Одноразовый скальпель n. 22 | Wiltex | ANVISA регистрация: 10150470565 | Хирургический инструмент |
| Одноразовая стерильная губка-щетка | Rioquimica | 7.89778E+12 | Хирургическая асептика |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Ультразвуковой |
| эндозим AW Plus | Ruhof | 34514 | Моющее средство для хирургических инструментов |
| Фентанил (Фентанест) | Кристá lia | ANVISA регистрация: 1029800810159 | Анестетик |
| Госсет ретрактор | дженерик-Хирургический | инструмент | |
| Холстед-комар гемостатические щипцы | дженерик-Хирургический | инструмент | |
| Заживляющая мазь - Унгвенто Пирсон | Пирсон SA | MAPA регистрация: SP0000094-16 | Фармацевтический препарат |
| раствор перекиси водорода | Риокимика | Регистрация в ANVISA: 218690015 | Хирургический материал |
| Изофторан | Биохимико | ANVISA регистрация: 100630222 | Анестетик |
| IV Набор для капельниц разгибатель | дженерик-Инфузионная | терапия | |
| IV Макро набор | для капель Descarpack | 410301 | Инфузионная терапия |
| Лактофур (цефтиофур) | Ourofino SA | MAPA регистрация: SP0000051-50 | Фармацевтический препарат |
| Ларингоскоп | - | - | Хирургический инструмент |
| Максикам 2% | Ourofino SA | MAPA регистрация: SP0000051-69 | Фармацевтический препарат |
| Микропористый клей 5 см х 10 см | дженерик | 1530 | Хирургический материал |
| Мидазолам | Hipolabor | ANVISA регистрация: 1134301430035 | Анестезирующий |
| многоходовой внутривенный инфузионный набор | Descarpack | 413201 | Игла для инфузионной терапии |
| 40 мм х 1,2 мм | Descarpack | 353601 | Стерильная игла для применения лекарственных средств и анестетиков. |
| Игла 40 мм х 1,6 мм | Wiltex | ANVISA регистрация: 10150470664 | Стерильная игла для нанесения лекарственных средств и анестетиков. |
| Иглодержатель | дженерик-Хирургический | инструмент | |
| Нейлон 2 шовный трхед | Шалон Медицинский | N502CTI40 | Хирургический материал |
| Обычная ручка | неженская-Обычная | ручка для заметок | |
| Физиологический раствор 0,9% 500 мл мешок | JP Farma MS | :1.0491.0070 | Инфузионная терапия |
| Полигликолевая кислота 2 шовная нить | Atramat | G4099-75H Хирургический | материал |
| Хлорид калия | Samtec | ANVISA регистрация: 1559200010139 | Парентеральный препарат |
| Перчатки для процедуры | Descarpack | 122401 | Средства индивидуальной защиты (СИЗ) |
| Пропофол (Провиве) | Uniã o Quí слюда | ANVISA регистрация: 1049714490057 | Анестетик |
| Рингер раствор лактата 500 мл мешок | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Инфузионная терапия |
| Риохекс 0,5% клорексидин спиртовой раствор | Риокимика | 218690356 | Хирургическая асептика |
| Риохекс 2% раствор клорексидина с поверхностно-активным веществом | Риокимика | 218690356 | Хирургическая асептика |
| кожи головы 21 г | Descarpack | 421201 | Хирургический материал |
| Бахилы | Универсальные | средства индивидуальной защиты (СИЗ) | |
| Стерильные компрессы | Cremer | ANVISA регистрация: 10071150065 | Хирургический материал |
| Стерильная марлевая салфетка | Procitex | ANVISA регистрация: 80245210083 | Хирургический материал |
| Стерильные хирургические простыни 140 см x 90 см | Venkuri | 7010003 | Хирургический материал |
| Стерильные хирургические простыни 150 см x 190 см; | PolarFix | F00208 | Хирургический материал |
| Стерильные хирургические перчатки | Mucambo | CA: 39.317 | Средства индивидуальной защиты (СИЗ) |
| Стетоскоп | Дженерик-Хирургическое | оборудование | |
| Хирургическая шапочка | Descarpack | 93201 | Средства индивидуальной защиты (СИЗ) |
| Хирургический халат | Descarpack | 231101 | Средства индивидуальной защиты (СИЗ) |
| Хирургическая маска | Descarpack | 110701 | Средства индивидуальной защиты (СИЗ) |
| Хирургические ножницы тупой-тупой | дженерик-Хирургический | инструмент | |
| Хирургические ножницы острые-острые | дженерик-Хирургический | инструмент | |
| Хирургический степлер | Tradevet-Хирургический | материал | |
| Tekbond супер клей | Tek Bond | 78072720030 | Хирургический материал |
| Термометр | Дженерик-Хирургическое | оборудование | |
| Трехсторонний запорный кран | Solidor | 374 | Хирургический материал |
| Трамадол гидрохлорид | Agener Uniã o | MAPA регистрация: SP-000292-5.000002 | Анестезирующая |
| прозрачная пленочная повязка | Skinupper | ANVISA регистрация: 82307460014 | Хирургический материал |
| Водостойкий клей 10 см x 4,5 см | Дженерик | 364828 | Хирургический материал |
Ссылки
- Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
- Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
- Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
- Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
- Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
- Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
- Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
- Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
- Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
- Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
- Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
- Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
- Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
- Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
- Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
- Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
- Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
- Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
- Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
- Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
- Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
- Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
- Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
- Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
- Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
- Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
- Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
- Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
- Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
- Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
- Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
- Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
- Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).
Перепечатки и разрешения
Теги
