Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Филамент ручной работы с силиконовым покрытием для мышей модели окклюзии средней мозговой артерии

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67002

⸱

9 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Fifth Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Provincial People's Hospital, 2Department of Neurology, Taiyuan Central Hospital, Shan Xi Medical University, 3Experimental Animal Center, Shanxi Medical University, 4Collaborative Innovation Center for Molecular Imaging of Precision Medicine, Shan Xi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает простой метод создания покрытых нитей для модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у мышей с использованием силикона, нейлоновых швов и игл шприца. Этот метод позволяет производить филаменты с постоянным диаметром и различной длиной силиконовой оболочки в соответствии с экспериментальными потребностями.

Аннотация

По мере старения населения планеты ишемический инсульт становится второй по значимости причиной инвалидности и смертности во всем мире, ложась огромным бременем как на общество, так и на семьи. Несмотря на то, что такие методы лечения, как внутривенный тромболизис и эндоваскулярные вмешательства, могут значительно улучшить исходы лечения пациентов с острым ишемическим инсультом, только небольшой процент людей получает пользу от этих методов лечения. Чтобы улучшить наше понимание болезни и найти более эффективные методы лечения, исследователи постоянно разрабатывают и совершенствуют животные модели. Среди них модель окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) выделяется как наиболее часто используемая модель в исследованиях цереброваскулярных заболеваний. Нить, используемая в этой модели, имеет решающее значение для ее разработки. В этом протоколе описывается метод создания нитей с постоянным диаметром и различной длиной силиконового покрытия. Модель MCAO, полученная с использованием этого метода на мышах C57, продемонстрировала высокий успех и согласованность, предлагая ценный инструмент для специализированных исследований ишемических цереброваскулярных заболеваний.

Введение

Инсульт является одной из наиболее распространенных причин смертности и инвалидности во всем мире. Ишемический и геморрагический инсульты являются основными типами цереброваскулярных событий, при этом ишемические инсульты составляют примерно 87% случаев 1,2,3. В настоящее время существует два метода лечения пациентов с ишемическим инсультом: фармакологическая терапия рекомбинантным тканевым активатором плазминогена (РТПА) и механическая тромбэктомия. Тем не менее, узкое терапевтическое окно и обширные критерии исключения ограничивают применение этих методов лечения, принося пользу лишь меньшинству пациентов. Это подчеркивает необходимость продолжения усилий по совершенствованию методов лечения ишемического инсульта 4,5. Модели in vitro неадекватны для воспроизведения сложных патофизиологических реакций после инсульта, что делает животные модели незаменимым компонентом доклинических исследований инсульта. Фокальная ишемия головного мозга человека чаще всего вызвана тромботической или эмболической окклюзией средней мозговой артерии (МКА), что делает модели грызунов, предназначенные для имитации окклюзии МКА (МКАО), весьма актуальными6.

Нитевидная модель MCAO, наиболее широко используемая в исследованиях инсульта, способствует окклюзии в начале средней мозговой артерии (MCA) и последующей реперфузии, что приводит к обширным инфарктам в подкорковых и корковых областях мозга. Преимущество данной модели заключается в ее способности восстанавливать кровоток после индукции очаговой ишемии, тем самым параллельно патофизиологическим процессам, наблюдаемым при инсультечеловека7. Кроме того, модель моделирует реперфузионное повреждение, которое является критическим фактором в степени повреждения8. Тем не менее, модель MCAO имеет ограничения, в том числе вариабельность объема инфаркта, при этом стандартное отклонение потенциально достигает до 64% от среднего значения в некоторых исследованиях9. Несмотря на более чем три десятилетия использования, усилия по повышению надежности модели продолжаются, но значительные вариации объема ишемического поражения сохраняются в исследованиях и лабораториях 10,11,12.

В этой статье представлен филамент собственного производства для индуцирования моделей, оценивающих показатели неврологического дефицита и области инфаркта головного мозга. В нем исследуется корреляция между длиной нити, покрытой силиконом, и успехом и стабильностью модели MCAO. Такая технология производства позволяет получать филаменты с похвальной стабильностью, что способствует разработке относительно стабильной модели MCAO.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных соответствовали экспериментальным процедурам и стандартам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Народной больницы провинции Шаньси (номер утверждения: 2024 Провинциальный комитет по медицинской этике No 64). В этом эксперименте использовались мыши-самцы C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, весом 24-26 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка филамента

  1. Маркировка оригинальной нити: равномерно намотайте нейлоновый шов 6-0 на пластиковую пластину линейки. Сделайте отметки на расстоянии 5 мм и 10 мм от головки филамента (включая точку отметки покрытия и точку отметки глубины вставки).
  2. Отрежьте вертикально вниз лезвием, чтобы оба конца были идеально круглыми, в результате чего получится начальная нить длиной 2 см (Рисунок 1).
  3. Изготовление устройства для нанесения покрытия: С помощью гемостатических щипцов отломите головку иглы шприца 26 G, затем отполируйте отверстие иглы в идеальный круг с помощью наждачной бумаги. Наберите 2 мл силиконового герметика K-704 с помощью шприца 10 мК и, наконец, прикрепите головку иглы к шприцу.
  4. Нанесение покрытия на нить: Вставьте исходную нить в подготовленное отверстие для иглы с точностью до отмеченного положения 5 мм или 10 мм. Медленно и неуклонно нажимайте на шприц до полного покрытия нити под стереомикроскопом (Рисунок 2).
  5. Установка нити с покрытием: Зафиксируйте нить с покрытием вертикально с помощью клейкой ленты и подождите около 20 минут, пока силикон полностью схватится.
  6. Стерилизация и упаковка: Подготовленные нити замочите в 75% спирте, вытрите насухо ватным тампоном, а затем расфасовайте в центрифужные пробирки объемом 5 мл.

2. Модель MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты стерилизовали автоклавированием (121 °C при 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 60 минут). Операционный стол и другое оборудование были продезинфицированы с использованием этанола на 75%. Мышей голодали в течение 8 ч перед операцией, но им разрешали свободный доступ к воде.

  1. Введите 5 мг/кг мелоксикама подкожно для обезболивания за 60 минут до операции. Подключите тепловое одеяло, чтобы поддерживать температуру тела мыши на уровне 37 °C во время анестезии.
  2. Вводите анестезию 4% изофлураном до тех пор, пока не прекратятся спонтанные движения и подергивания усов, затем поддерживайте анестезию на уровне 1,5% (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Нанесите глазную мазь на оба глаза.
  3. Поместите мышь в лежачее положение, закрепите ее голову и конечности, сбрейте волосы на шее и верхней части груди и продезинфицируйте кожу 75% этанолом изнутри.
  4. Сделайте разрез кожи длиной 2,5 см по средней линии шеи, от нижней челюсти до грудины.
  5. Тупо рассеките правые мышцы шеи, чтобы обнажить влагалище сонной артерии. С помощью офтальмологических щипцов откройте влагалище и отделите общую сонную артерию (CCA), наружную сонную артерию (ECA) и внутреннюю сонную артерию (ICA), стараясь не повредить блуждающий нерв.
  6. Перед бифуркацией временно перевязать ОСА скользящим узлом и пережать ВСА микрохирургическим зажимом для артерии.
  7. Прижгите верхнюю щитовидную артерию от ЭКА с помощью биполярного коагуляционного шприц-ручки.
  8. Оставьте две нити на ECA для лигирования: одну на дистальном конце для постоянной лигирования, а другую на проксимальном конце со слабым узлом для дальнейшего использования. Сделайте разрез примерно 0,5 мм между двумя лигатурами на ECA с помощью офтальмологических ножниц, чтобы ввести нить.
  9. Вставьте нить с силиконовым покрытием толщиной 5 мм или 10 мм в CCA через разрез, а затем закрепите ее, затянув ослабленный узел.
  10. Отрезав дистальный конец ЭХА и сняв зажим с ВСА, втяните филамент в зону бифуркации ОСА. Затем переверните и продвигайте нить в глубокий ВСА, пока не почувствуете сопротивление. Слегка оттяните нить и закрепите ее, затянув узел.
  11. Зашить кожу животного швом 3-0 и продезинфицировать рану йодом. Поместите мышь в камеру восстановления на 1 час.
  12. Снова обезболите мышь, аккуратно удалите нить, перевяжите нить для лигирования ECA, фиксирующую нить, и отпустите узел CCA для восстановления кровотока и реперфузии средней мозговой артерии.
  13. Обрежьте лишние нити, зашите кожу шеи и еще раз продезинфицируйте область.

3. Фиктивная операция

  1. При фиктивных операциях введите филамент с силиконовым покрытием толщиной 7 мм, чтобы окклюзировать правую среднюю мозговую артерию, а затем немедленно удалите ее, чтобы обеспечить мгновенную реперфузию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующая процедура идентична той, которая проводится на животных с ишемией головного мозга.

4. Нейрооценка

  1. Экспериментальных животных из каждой группы поместить в открытый грунт и провести поведенческую послеоперационную оценку через 4 ч после реперфузии ишемии головного мозга.
  2. Для успешного моделирования учитывайте баллы от 1 до 3. Критерии оценки основаны на скоринговом методеЛонга 10, как подробно описано в таблице 1.
  3. Оценивайте неврологические дефициты в соответствии с модифицированной шкалой тяжести неврологического расстройства (mNSS)13, проводя оценку через 24 ч и 72 ч после реперфузии (см. Таблицу 2).

5. Транскардиальная перфузия

  1. Обезболите мышь 1,5% пентобарбиталом натрия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Поместите мышь обратно в клетку и подождите 10 минут. Затем ущипните пальцы ног мыши, чтобы проверить отсутствие рефлексов и обеспечить глубокую анестезию.
  2. Расположите мышь в лежачем положении на подставке из пенопласта и закрепите ее конечности.
  3. Отрежьте кончик иглы 25 G, чтобы затупить его, не допуская прокола стенки аорты. Подсоедините иглу к шприцу, наполненному 20 мл физраствора.
  4. Поднимите шерсть грудной клетки и с помощью ножниц срежьте кожу, чтобы обнажить мечевидный отросток. Возьмитесь за мечевидный отросток и разрежьте горизонтально под ним, чтобы обнажить диафрагму, открыв мышечный слой. Аккуратно разрежьте диафрагму ножницами, не допуская повреждения сердца.
  5. Разрежьте вдоль внешней стороны грудины, чтобы открыть грудную клетку с обеих сторон, переверните переднюю стенку грудной клетки и закрепите ее гемостатитом.
  6. С помощью ватного тампона удалите жир у основания сердца, обнажив корень аорты.
  7. Закрепите сердце щипцами, введите иглу в верхушку сердца и продвигайтесь наискось вверх, пока игла не станет видна через стенку аорты. Зажмите иглу на месте.
  8. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы наблюдать за кровотоком. Неуклонно прокалывайте физиологический раствор с помощью шприца, следя за тем, чтобы кровь выходила из правого предсердия. Как только сточные воды станут прозрачными, прекратите перфузию14.
  9. После перфузии обезглавьте мышь, чтобы собрать мозг15 и поместите его в морозильную камеру при температуре -20 °C для дальнейшей обработки.

6. Оценка объема инфаркта с помощью окрашивания ТТС

  1. Быстро заморозьте полученные ткани мозга в морозильной камере при температуре -20 °C на 20 минут, затем поместите их на предварительно охлажденную форму для нарезки мозга и нарежьте на ломтики толщиной 1 мм.
  2. Полученные участки мозга погрузить в 2% раствор ТТС и инкубировать при 37 °С в течение 20 мин.
  3. Погрузите срезы мозга в 4% параформальдегид на ночь и сделайте фотографии на следующий день.
  4. Измерьте площадь инфаркта для каждого среза и общую площадь мозга с помощью ImageJ. Рассчитайте коэффициент объема инфаркта по формуле: Объем инфаркта % = (Сумма инфарктных площадей / Сумма общих площадей мозга) × 100%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При создании модели MCAO основные инструменты, используемые для изготовления нитей и готовых нитей, показаны на рисунке 3. После производства филамента модель MCAO устанавливается путем введения филамента через наружную сонную артерию, при этом продолжительность операции записывается. Успешное моделирование определяется оценкой по шкале Лонга в 1-3 часа после удаления филамента. Масса тела контролируется ежедневно после операции. Неврологические дефициты оцениваются с помощью модифицированны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данное исследование демонстрирует простой и экономически эффективный метод изготовления нити, подтверждая его целесообразность при создании модели MCAO. Длина силиконового покрытия нити может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными потребностями, что обеспечивает дополнительную гибкость. При приготовлении нитевидной эмболии диаметром 5 мм достигнут 100% успех без каких-либо случаев субарахноидального кровоизлияния (САК) у мышей. В группе, использующей эмболы с 10 мм нитям...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Медицинским фондом Ву Цзепина (320.6750.161290).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 10 млHaidike Medical Products Co., Ltd.Инструмент для изготовления нитей
2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС)Sigma-AldrichG3005Краситель для окрашивания ТТС
24-луночной культуральной пластинойCorning CLS3527Сосуд для окрашивания TTC
иглой для шприца 26 GHaidike Medical Products Co., Ltd.Инструмент для изготовления нитей
4% параформальдегидаServicebioG1101Фиксация тканей
6-0 нейлоновый шовHaidike Medical Products Co., Ltd.Материалы для изготовления нитей
Система анестезии для изофлуранаRwd Life Science Co., Ltd.Р610 Животное под наркозом
Биполярный электрокоагуляционный генераторYirun Medical Instrument Co., Ltd.ZG300Оборудование для хирургии
Водяная баня с постоянной температуройИсточник  Instrument Co., Ltd.HH-M6TTC окрашивание
Глазная мазьГуанчжоу ФармацевтическийH44023098Материал для хирургии
Тепловое одеялоZH Biomedical Instrument Co., Ltd.Поддерживать температуру тела 
ИзофлуранRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Обезболенное животное
МелоксикамBoehringer-IngelheimJ20160020Обезболивание животных
Микрохирургический зажим артерииShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. W40130Инструмент для хирургии
Микрохирургические гемостатические зажимные щипцыShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. M-W-0022Набор инструментов для хирургии
Набор микрохирургических инструментовRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-RОборудование для хирургии
Мышиный термометрHubei Dasjiaer BiotechnologyFT3400Интраоперационный мониторинг температуры
Пентобарбитал натрияSigma-AldrichP3761Усыпленный животный
БритваJoyu ЭлектроприборыPHC-920Оборудование для хирургии
Силиконовый герметикKafuterK-704Материалы для изготовления
нитей СтереомикроскопRwd Life Science Co., Ltd.77001SОборудование для хирургии
Шовная нить с иглой (3-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. F404SUS302Оборудование для хирургии

Ссылки

  1. Collaborators GBDS. Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: A systematic analysis for the global burden of disease study 2019. Lancet Neurol. 20 (10), 795-820 (2021).
  2. Kleindorfer, D. O., et al. Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  3. Saini, V., Guada, L., Yavagal, D. R. Global epidemiology of stroke and access to acute ischemic stroke interventions. Neurology. 97 (20 Suppl 2), S6-S16 (2021).
  4. Hill, M. D., Coutts, S. B. Alteplase in acute ischaemic stroke: The need for speed. Lancet. 384 (9958), 1904-1906 (2014).
  5. Asif, K. S., et al. Mechanical thrombectomy global access for stroke (mt-glass): A mission thrombectomy (mt-2020 plus) study. Circulation. 147 (16), 1208-1220 (2023).
  6. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  8. Shaik, N. F., Regan, R. F., Naik, U. P. Platelets as drivers of ischemia/reperfusion injury after stroke. Blood Adv. 5 (5), 1576-1584 (2021).
  9. Zhang, S. R., et al. Large-scale multivariate analysis to interrogate an animal model of stroke: Novel insights into poststroke pathology. Stroke. 52 (11), 3661-3669 (2021).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  11. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174 (1), 18-24 (2008).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in c57bl/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Bieber, M., et al. Validity and reliability of neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion. Stroke. 50 (10), 2875-2882 (2019).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  15. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  16. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  17. Mccoll, B. W., Carswell, H. V., Mcculloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond mca territory after intraluminal filament occlusion in c57bl/6j mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  18. Liu, Z., et al. Optimisation of a mouse model of cerebral ischemia-reperfusion to address issues of survival and model reproducibility and consistency. Comput Intell Neurosci. 2022, 7594969(2022).
  19. Ward, R., Collins, R. L., Tanguay, G., Miceli, D. A quantitative study of cerebrovascular variation in inbred mice. J Anat. 173, 87-95 (1990).
  20. Hanna, K. L., Hepworth, L. R., Rowe, F. Screening methods for post-stroke visual impairment: A systematic review. Disabil Rehabil. 39 (25), 2531-2543 (2017).
  21. Rowe, F. J. Stroke survivors' views and experiences on impact of visual impairment. Brain Behav. 7 (9), e00778(2017).
  22. Scoles, D., Mcgeehan, B., Vanderbeek, B. L. The association of stroke with central and branch retinal arterial occlusion. Eye (Lond). 36 (4), 835-843 (2022).
  23. Kim, Y. D., et al. Cerebral magnetic resonance imaging of coincidental infarction and small vessel disease in retinal artery occlusion. Sci Rep. 11 (1), 864(2021).
  24. Emiroglu, M. Y., et al. Effects of obstructive carotid artery disease on ocular circulation and the safety of carotid artery stenting. Heart Lung Circ. 26 (10), 1069-1078 (2017).
  25. Cotofana, S., Lachman, N. Arteries of the face and their relevance for minimally invasive facial procedures: An anatomical review. Plast Reconstr Surg. 143 (2), 416-426 (2019).
  26. Xu, X., et al. Dibazol-induced relaxation of ophthalmic artery in C57bl/6J mice is correlated with the potency to inhibit voltage-gated ca(2+) channels. Exp Eye Res. 231, 109468(2023).
  27. Justic, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель MCAOишемический инсультмодель инсульта на животныхмыши C57цереброваскулярное заболеваниеподготовка филаментаисследование инсультаэкспериментальная модель инсульта

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.