Сборка органоидов сетчатки с микроглией

Summary

Микроглия является уникальными резидентными иммунными клетками в сетчатке, играющими решающую роль в различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Создание модели совместного культивирования органоидов сетчатки с микроглией может способствовать лучшему пониманию патогенеза и прогресса развития заболеваний сетчатки.

Abstract

Из-за ограниченной доступности сетчатки человека, органоиды сетчатки (РО) являются лучшей моделью для изучения заболеваний сетчатки человека, которые могут выявить механизм развития сетчатки и возникновение заболеваний сетчатки. Микроглия (МГ) — это уникальные резидентные макрофаги в сетчатке глаза и центральной нервной системе (ЦНС), выполняющие важнейшие иммунные функции. Тем не менее, органоиды сетчатки лишены микроглии, так как источником их дифференцировки является желточный мешок. Специфический патогенез микроглии при этих заболеваниях сетчатки остается неясным; Таким образом, создание модели органоида сетчатки, инкорпорированной в микроглию, оказывается необходимым. Здесь мы успешно построили совместно культивируемую модель органоидов сетчатки с микроглией, полученной из стволовых клеток человека. В этой статье мы дифференцировали микроглию, а затем совместно культивировали с органоидами сетчатки на ранней стадии. Поскольку эта модель включает в себя иммунные клетки, она обеспечивает оптимизированную платформу для моделирования заболеваний сетчатки и скрининга лекарственных препаратов для содействия углубленным исследованиям патогенеза и лечения заболеваний, связанных с сетчаткой и ЦНС.

Introduction

Дифференцировка стволовых клеток человека в трехмерные (3D) органоиды сетчатки представляет собой многообещающую модель in vitro для моделирования сетчатки¹. Он содержит различные типы клеток сетчатки, включая фоторецепторы, ганглиозные клетки сетчатки, биполярные клетки, клетки Мюллера, горизонтальные клетки и астроциты². Эта модель позволяет имитировать и изучать как механизмы развития сетчатки, так и патогенез заболеваний сетчатки. Однако, благодаря методу направленной дифференцировки, органоиды сетчатки были получены из нейроэктодермы³, в то время как многие другие типы клеток происходят из других зародышевых слоев, таких как микроглия из желточного мешка и периваскулярные клетки из мезодермы ^4,5,6.

В настоящее время доказано, что многие заболевания сетчатки, такие как пигментный ретинит⁷, глаукома⁸ и ретинобластома⁹, тесно связаны с микроглией в сетчатке. Однако из-за отсутствия надлежащих исследовательских моделей конкретные механизмы, иллюстрирующие взаимосвязь между микроглией и этими заболеваниями, до сих пор остаются неясными. В то время как мыши послужили благоприятной моделью для изучения заболеваний сетчатки, недавние исследования выявили значительные различия между мышиной и человеческой микроглией с точки зрения продолжительности жизни, скорости пролиферации и отсутствия гомологичных^{генов человека.} Эти результаты свидетельствуют о том, что выводы, сделанные на основе мышиных моделей, могут быть не совсем надежными, что подчеркивает важность создания органоидов сетчатки человека, содержащих микроглию.

За последние несколько десятилетий были разработаны различные методы 3D-дифференцировки органоидов^{сетчатки12,13}. Чтобы облегчить кокультуральную операцию микроглии в органоидах сетчатки, мы выбрали метод дифференцировки, предполагающий переход от адгезивной культуры к суспензионной. Такой подход успешно позволяет встраивать микроглию в органоиды сетчатки, поддерживая их в течение как минимум 60 дней¹⁴.

Protocol

Данное исследование было одобрено Комитетом по институциональной этике Пекинской больницы Тунжэнь Столичного медицинского университета. Клеточная линия H9 HESCs была получена из научно-исследовательского института WiCell. Предварительно подогрейте среду для культивирования клеток при комнатной температуре (ОТ) в течение 30 мин перед экспериментом.

1. Зарождение микроглии человека

1. Культивируйте hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х^{10 по 6} ячеек в каждую лунку.
2. Аспирируйте среду стволовых клеток и промойте клетки 1x DPBS (1 мл/лунка 6-луночного планшета). На следующем этапе требуется 2 x 10^7-1 x 10⁸ ячеек. Если недостаточно, объедините ячейки из 2-5 лунок, чтобы проделать следующие действия.
3. Диссоциируйте колонии стволовых клеток с помощью 0,5 мМ раствора ЭДТА в течение примерно 5 мин в инкубаторе при температуре 37 °C (1 мл/лунка 6-луночного планшета).
4. Проверьте морфологию колонии через 5 минут. Когда края колонии слегка скручиваются с рыхлыми промежутками, клетки готовы к дифференцировке и аспирации ЭДТА. Если нет, инкубируйте клетки при 37 °C еще 1-2 мин. Не выдерживайте дольше 8 минут.
5. Аккуратно промойте клетки в каждой лунке, используя 6 мл среды А (табл. 1) с 6 мкл 10 мл раствора ингибитора ROCK Y-27632. Аккуратно постучите по дну посуды, чтобы промыть клетки. Установите день как день 0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетируйте клетки. На следующий день клетки образуют эмбриоидные тельца (БЭ).
6. Через 24 ч понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить образование БЭ. Соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
7. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте БЭ 6 мл свежей среды А и перенесите их в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Выращивание в инкубаторе при температуре 37 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью пересадки лунки в 1-й день является снижение влияния большого количества мертвых клеток в процессе формирования БЭ, которые могут повлиять на состояние роста клеток.
8. Обновляйте свежую среду А ежедневно до 4-го дня (6 мл на лунку 6-луночного планшета).
9. На 4-й день обмажьте 10-сантиметровую чашку 3 мл 0,1% раствором рыбного желатина в течение не менее 1 ч в инкубаторе с 5% CO₂, 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если время нанесения покрытия составляет менее 1 часа, выполнить следующие действия сложно.
10. Осторожно соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
11. Удалите 0,1% раствор желатина и ополосните 10-сантиметровую посуду один раз 5-6 мл 1x DPBS. Снимите DPBS.
12. Аккуратно суспендируйте EB с 15 мл Medium B (Таблица 1) в центробежной пробирке объемом 15 мл и переложите их в чашку с покрытием 10 см. Выращивание в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В первые 7 дней не передвигайте посуду.
13. Освежайтесь свежим Medium B один раз в неделю до 49 дня (чашка 15 мл/10 см) и осматривайте клетки под микроскопом раз в неделю.
    Примечание: После 49-го дня несколько секреторных клеток могут быть обнаружены в надосадочной жидкости в чашке для культивирования.
14. Центрифугируйте надосадочные клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
15. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 2 мл свежей среды В и перенесите в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Инкубировать в инкубаторе с 5%_CO2, 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение следующих 7 дней не перемещайте тарелку. Микроглия может прилипать к дну лунки с низкой адгезией.
16. На 56-й день замените на Medium C (Таблица 1) (2 мл/лунка 6-луночного планшета). Микроглия прилипает к дну колодца с низкой адгезией и под микроскопом будет выглядеть разветвленной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняя среду С каждые 3 дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета), микроглию можно культивировать в среде С в течение примерно 15 дней.

2. Генерация человеческих РО и совместное культивирование РО с микроглией

1. Культивировали hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х^{10 по 6} ячеек в каждую лунку.
2. Добавьте Disspase (1 мл/лунка 6-луночного планшета) в культуральную ячейку. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Отсасывайте раствор из скважины.
3. Добавьте в лунку Medium D (Таблица 1) (1 мл/лунка 6-луночного планшета). Разрежьте ячейку на небольшие кусочки с помощью пипетки объемом 10 μл.
4. Аккуратно соберите все кусочки клеток и среду в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
6. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 200 мкл холодной матрицы. Переместите микроцентрифужную пробирку 1,5 в инкубатор на 20 минут. Работайте быстро, так как матрица затвердевает при комнатной температуре (RT). После 20 мин в инкубаторе матрица застынет.
7. Приготовьте чашку диаметром 10 см с 15 мл Medium D. Суспендируйте матрицу с Medium D и слегка встряхните чашку Петри.
8. Затем, поместите блюдо в инкубатор на 5 дней. Не перемещайте пластину. Установите день как день 0 (ROs). Клетки прилипнут через 3 дня.
9. На 5-й день (ROs) и 10-й день (ROs) обновите среду с помощью Medium D.
10. На 12-й день (ROs) удалите среду и добавьте по 3 мл Dispase в каждую чашку на 5 минут.
11. Отсадите диспазу и добавьте 15 мл среды Е (табл. 1).
12. Сбор микроглии: На 56-й день (MGs) осторожно аспирируйте среду C, добавьте Accutase (1 мл на лунку 6-луночного планшета) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 минут.
13. Соберите клетки микроглии в центробежную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл. Центрифугируйте ячейки при 200 x g при RT в течение 5 мин.
14. Аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость и суспендируйте микроглию с 1 мл Medium E. Добавьте микроглию к переваренным RO на 12-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 12-й день (ROs) клетки адгезивные. На 13-й день (ROs) клетки обнаруживаются суспензионными в среде Е. Если среда меняет желтый цвет с 12-го дня (ROs) на 19-й день (ROs), обновите среду с помощью среды E.
15. На 19-й день (ROs) смешайте органоиды в центр блюда, осторожно поворачивая тарелку. Аккуратно аспирируйте Medium E и освежите среду Medium F.
16. Переложите органоиды со Medium F в новую суспензию.
17. Меняйте среду раз в неделю и подбирайте органоиды для экспериментов.

Results

Процедура генерации органоидов сетчатки описана в нашем предыдущем исследовании¹⁵. Здесь мы показываем репрезентативные результаты микроглии и ко-культуры микроглии и органоидов сетчатки.

Здесь мы демонстрируем каждый этап дифференцировки микроглии (рис. 1A). День 0 представляет собой стадию культивирования стволовых клеток. Затем стволовые клетки были расщеплены и культивированы для образования БЭ. В первые 4 дня процесса клетки образуют БЭ (рис. 1B). Впоследствии переносим подвешенные КЭ в прилипшие 10 см посуды. Примерно через 7 дней клетки становятся похожими на те, что показаны на рисунке 1C. По мере развития культуры адгезивные клетки выделяют гемопоэтические предшественники в надосадочную жидкость (рисунок 1D). Этот процесс занимает примерно 45 дней. На этом этапе клетки могут быть собраны из надосадочной жидкости и перенесены на 6-луночные планшеты. В течение следующих 7 дней микроглия станет зрелой (Рисунок 1E) и будет готова к дальнейшим экспериментам.

На 12-й день дифференцировки органоидов сетчатки адгезивные клетки расщепляют до культуры суспензии, а к органоидам сетчатки добавляют среду Е, содержащую микроглию. Микроглия мигрирует в органоиды сетчатки. Чтобы четко проследить морфологию микроглии, мы добавили трансфекцию EGFP-лентивируса в hESCs, что привело к тому, что дифференцированная микроглия экспрессирует GFP с автофлуоресценцией (Green) (Рисунок 2A-C). Мы также изучили тканевую структуру органоидов сетчатки, совместно культивируемых с микроглией, с использованием фоторецепторного клеточного маркера CRX и микроглиального клеточного маркера IBA1 методом иммунофлуоресцентного анализа в микроглии, совместно культивируемых органоидах сетчатки после дифференцировки в течение 50 дней (рис. 2D).

Рисунок 1: Принципиальная схема и временная шкала клеток микроглии, полученных из hESC. (A) Протокол начинается с размораживания и пропускания hESCs в 6-луночном планшете. (В) Образующиеся гомогенные БЭ, содержащие среду А. (В) БЭ переносят в покрытую покрытием чашку, и кроветворные предшественники формируются на 4-56 день. (Д,Э) На 56-й день надосадочную жидкость с клетками собирают (D) и переносят в 6-луночный планшет с низкой адгезией для образования микроглии на 63-й день (E). Масштабная линейка: 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения на временной шкале во время совместного культивирования микроглии и органоидов сетчатки. (A) Репрезентативные изображения клеток микроглии, полученные с помощью EGFP-hESC. (B) Совместное культивирование микроглии EGFP⁺ с органоидами сетчатки после дифференцировки в течение 18 дней. (C) Совместное культивирование микроглии EGFP⁺ с органоидами сетчатки после дифференцировки в течение 30 дней. Масштабная линейка: 300 мкм. (D) CRX (маркер фоторецепторных клеток; красный) и IBA1 (маркер микроглии; зеленый) использовали для обнаружения структуры тканей органоидов сетчатки, совместно культивируемых с микроглией после 50 дней дифференцировки. DAPI (синий) окрашивает ядро. Масштабная линейка: 30 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав сред, использованных в данном исследовании. Компоненты, необходимые для приготовления объема 500 мл каждой среды, перечислены в таблице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Из-за ограниченной доступности сетчатки глаза человека наше нынешнее понимание воспалительных реакций сетчатки почти основано на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, были дифференцированы органоиды сетчатки. Разработка моделей органоидов сетчатки является активной областью исследований, направленных на повторение сложности сетчатки глаза человека для моделирования заболеваний и терапевтической разработки. В нескольких исследованиях сообщалось об успешном получении органоидов сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека 1,2,12,13. Тем не менее, в большинстве этих моделей отсутствует наличие микроглии, которая, как известно, играет решающую роль в развитии сетчатки и патогенезе заболевания. В недавних исследованиях предпринимались попытки интегрировать микроглию в органоиды сетчатки или модели органоидов мозга 16,17,18, но подробный метод неясен. Здесь мы предоставляем подробный пошаговый протокол совместного культивирования микроглии с органоидами сетчатки на ранней стадии, полученными из одной и той же линии hESC. В то время как в некоторых исследованиях изучалась роль микроглии при заболеваниях сетчатки с использованием животных моделей или систем клеточных культур ^7,8,9, представленная здесь модель совместного культивирования предлагает более физиологически значимую систему на основе человека для изучения взаимодействий микроглии и сетчатки и их влияния на патогенез заболевания.

Критическими этапами являются клеточное состояние стволовых клеток человека и дифференцировка микроглии и органоидов сетчатки. Микроглия и RO должны быть дифференцированы поэтапно, а правильные реагенты и чашка (обработанная тканью или суспензионная чашка) должны использоваться на разных стадиях. Эта модель может помочь нам понять, как микроглия способствует возникновению заболеваний сетчатки. Это имеет значительные последствия для будущего скрининга лекарств и исследований механизмов заболевания. Тем не менее, методы, которые мы сейчас публикуем, все еще имеют некоторые ограничения. В связи с длительным периодом дифференцировки микроглии и отсутствием подходящих методов криоконсервации, мы должны разумно планировать свое время для дифференцировки микроглии и органоидов сетчатки для совместного культивирования.

В дополнение к органоидам сетчатки, мы считаем, что интеграция иммунных клеток в другие модели органоидов также может способствовать развитию органоидов. Поэтому тестирование других органоидных систем имеет решающее значение. Интеграция различных типов клеток и органоидов для формирования полноценных органов представляет собой многообещающую модель на будущее.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Антитело; разведение в соответствии с инструкцией производителя
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; разведение в соответствии с инструкцией производителя
B27	Life Технологии	17105-041
Dispase (1U/mL)	Технологии стволовых клеток	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Биологическая промышленность	04-002-1A
Желатин	Sigma	G7041-100G	Твердый
глутамакс	Gibco	35050-061
H9 клеточная линия	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-ИЛ-050
Ил-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Матричный	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-МС-500
MEM Раствор заменимых аминокислот	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Нейробазальный	Gibco	21103-049
Pen/strepping	Gibco	15140-122
Среда стволовых клеток	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023