Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сборка органоидов сетчатки с микроглией

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67016

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Микроглия является уникальными резидентными иммунными клетками в сетчатке, играющими решающую роль в различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Создание модели совместного культивирования органоидов сетчатки с микроглией может способствовать лучшему пониманию патогенеза и прогресса развития заболеваний сетчатки.

Аннотация

Из-за ограниченной доступности сетчатки человека, органоиды сетчатки (РО) являются лучшей моделью для изучения заболеваний сетчатки человека, которые могут выявить механизм развития сетчатки и возникновение заболеваний сетчатки. Микроглия (МГ) — это уникальные резидентные макрофаги в сетчатке глаза и центральной нервной системе (ЦНС), выполняющие важнейшие иммунные функции. Тем не менее, органоиды сетчатки лишены микроглии, так как источником их дифференцировки является желточный мешок. Специфический патогенез микроглии при этих заболеваниях сетчатки остается неясным; Таким образом, создание модели органоида сетчатки, инкорпорированной в микроглию, оказывается необходимым. Здесь мы успешно построили совместно культивируемую модель органоидов сетчатки с микроглией, полученной из стволовых клеток человека. В этой статье мы дифференцировали микроглию, а затем совместно культивировали с органоидами сетчатки на ранней стадии. Поскольку эта модель включает в себя иммунные клетки, она обеспечивает оптимизированную платформу для моделирования заболеваний сетчатки и скрининга лекарственных препаратов для содействия углубленным исследованиям патогенеза и лечения заболеваний, связанных с сетчаткой и ЦНС.

Введение

Дифференцировка стволовых клеток человека в трехмерные (3D) органоиды сетчатки представляет собой многообещающую модель in vitro для моделирования сетчатки1. Он содержит различные типы клеток сетчатки, включая фоторецепторы, ганглиозные клетки сетчатки, биполярные клетки, клетки Мюллера, горизонтальные клетки и астроциты2. Эта модель позволяет имитировать и изучать как механизмы развития сетчатки, так и патогенез заболеваний сетчатки. Однако, благодаря методу направленной дифференцировки, органоиды сетчатки были получены из нейроэктодермы3, в то время как многие другие типы клеток происходят из других зародышевых слоев, таких как микроглия из желточного мешка и периваскулярные клетки из мезодермы 4,5,6.

В настоящее время доказано, что многие заболевания сетчатки, такие как пигментный ретинит7, глаукома8 и ретинобластома9, тесно связаны с микроглией в сетчатке. Однако из-за отсутствия надлежащих исследовательских моделей конкретные механизмы, иллюстрирующие взаимосвязь между микроглией и этими заболеваниями, до сих пор остаются неясными. В то время как мыши послужили благоприятной моделью для изучения заболеваний сетчатки, недавние исследования выявили значительные различия между мышиной и человеческой микроглией с точки зрения продолжительности жизни, скорости пролиферации и отсутствия гомологичныхгенов человека. Эти результаты свидетельствуют о том, что выводы, сделанные на основе мышиных моделей, могут быть не совсем надежными, что подчеркивает важность создания органоидов сетчатки человека, содержащих микроглию.

За последние несколько десятилетий были разработаны различные методы 3D-дифференцировки органоидовсетчатки12,13. Чтобы облегчить кокультуральную операцию микроглии в органоидах сетчатки, мы выбрали метод дифференцировки, предполагающий переход от адгезивной культуры к суспензионной. Такой подход успешно позволяет встраивать микроглию в органоиды сетчатки, поддерживая их в течение как минимум 60 дней14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по институциональной этике Пекинской больницы Тунжэнь Столичного медицинского университета. Клеточная линия H9 HESCs была получена из научно-исследовательского института WiCell. Предварительно подогрейте среду для культивирования клеток при комнатной температуре (ОТ) в течение 30 мин перед экспериментом.

1. Зарождение микроглии человека

  1. Культивируйте hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х10 по 6 ячеек в каждую лунку.
  2. Аспирируйте среду стволовых клеток и промойте клетки 1x DPBS (1 мл/лунка 6-луночного планшета). На следующем этапе требуется 2 x 107-1 x 108 ячеек. Если недостаточно, объедините ячейки из 2-5 лунок, чтобы проделать следующие действия.
  3. Диссоциируйте колонии стволовых клеток с помощью 0,5 мМ раствора ЭДТА в течение примерно 5 мин в инкубаторе при температуре 37 °C (1 мл/лунка 6-луночного планшета).
  4. Проверьте морфологию колонии через 5 минут. Когда края колонии слегка скручиваются с рыхлыми промежутками, клетки готовы к дифференцировке и аспирации ЭДТА. Если нет, инкубируйте клетки при 37 °C еще 1-2 мин. Не выдерживайте дольше 8 минут.
  5. Аккуратно промойте клетки в каждой лунке, используя 6 мл среды А (табл. 1) с 6 мкл 10 мл раствора ингибитора ROCK Y-27632. Аккуратно постучите по дну посуды, чтобы промыть клетки. Установите день как день 0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетируйте клетки. На следующий день клетки образуют эмбриоидные тельца (БЭ).
  6. Через 24 ч понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить образование БЭ. Соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
  7. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте БЭ 6 мл свежей среды А и перенесите их в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Выращивание в инкубаторе при температуре 37 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью пересадки лунки в 1-й день является снижение влияния большого количества мертвых клеток в процессе формирования БЭ, которые могут повлиять на состояние роста клеток.
  8. Обновляйте свежую среду А ежедневно до 4-го дня (6 мл на лунку 6-луночного планшета).
  9. На 4-й день обмажьте 10-сантиметровую чашку 3 мл 0,1% раствором рыбного желатина в течение не менее 1 ч в инкубаторе с 5% CO2, 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если время нанесения покрытия составляет менее 1 часа, выполнить следующие действия сложно.
  10. Осторожно соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
  11. Удалите 0,1% раствор желатина и ополосните 10-сантиметровую посуду один раз 5-6 мл 1x DPBS. Снимите DPBS.
  12. Аккуратно суспендируйте EB с 15 мл Medium B (Таблица 1) в центробежной пробирке объемом 15 мл и переложите их в чашку с покрытием 10 см. Выращивание в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В первые 7 дней не передвигайте посуду.
  13. Освежайтесь свежим Medium B один раз в неделю до 49 дня (чашка 15 мл/10 см) и осматривайте клетки под микроскопом раз в неделю.
    Примечание: После 49-го дня несколько секреторных клеток могут быть обнаружены в надосадочной жидкости в чашке для культивирования.
  14. Центрифугируйте надосадочные клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
  15. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 2 мл свежей среды В и перенесите в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Инкубировать в инкубаторе с 5%CO2, 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение следующих 7 дней не перемещайте тарелку. Микроглия может прилипать к дну лунки с низкой адгезией.
  16. На 56-й день замените на Medium C (Таблица 1) (2 мл/лунка 6-луночного планшета). Микроглия прилипает к дну колодца с низкой адгезией и под микроскопом будет выглядеть разветвленной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняя среду С каждые 3 дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета), микроглию можно культивировать в среде С в течение примерно 15 дней.

2. Генерация человеческих РО и совместное культивирование РО с микроглией

  1. Культивировали hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х10 по 6 ячеек в каждую лунку.
  2. Добавьте Disspase (1 мл/лунка 6-луночного планшета) в культуральную ячейку. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Отсасывайте раствор из скважины.
  3. Добавьте в лунку Medium D (Таблица 1) (1 мл/лунка 6-луночного планшета). Разрежьте ячейку на небольшие кусочки с помощью пипетки объемом 10 μл.
  4. Аккуратно соберите все кусочки клеток и среду в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
  6. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 200 мкл холодной матрицы. Переместите микроцентрифужную пробирку 1,5 в инкубатор на 20 минут. Работайте быстро, так как матрица затвердевает при комнатной температуре (RT). После 20 мин в инкубаторе матрица застынет.
  7. Приготовьте чашку диаметром 10 см с 15 мл Medium D. Суспендируйте матрицу с Medium D и слегка встряхните чашку Петри.
  8. Затем, поместите блюдо в инкубатор на 5 дней. Не перемещайте пластину. Установите день как день 0 (ROs). Клетки прилипнут через 3 дня.
  9. На 5-й день (ROs) и 10-й день (ROs) обновите среду с помощью Medium D.
  10. На 12-й день (ROs) удалите среду и добавьте по 3 мл Dispase в каждую чашку на 5 минут.
  11. Отсадите диспазу и добавьте 15 мл среды Е (табл. 1).
  12. Сбор микроглии: На 56-й день (MGs) осторожно аспирируйте среду C, добавьте Accutase (1 мл на лунку 6-луночного планшета) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 минут.
  13. Соберите клетки микроглии в центробежную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл. Центрифугируйте ячейки при 200 x g при RT в течение 5 мин.
  14. Аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость и суспендируйте микроглию с 1 мл Medium E. Добавьте микроглию к переваренным RO на 12-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 12-й день (ROs) клетки адгезивные. На 13-й день (ROs) клетки обнаруживаются суспензионными в среде Е. Если среда меняет желтый цвет с 12-го дня (ROs) на 19-й день (ROs), обновите среду с помощью среды E.
  15. На 19-й день (ROs) смешайте органоиды в центр блюда, осторожно поворачивая тарелку. Аккуратно аспирируйте Medium E и освежите среду Medium F.
  16. Переложите органоиды со Medium F в новую суспензию.
  17. Меняйте среду раз в неделю и подбирайте органоиды для экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедура генерации органоидов сетчатки описана в нашем предыдущем исследовании15. Здесь мы показываем репрезентативные результаты микроглии и ко-культуры микроглии и органоидов сетчатки.

Здесь мы демонстрируем каждый этап дифференцировки микроглии (рис. 1A). День 0 представляет собой стадию культивирования стволовых клеток. Затем стволовые клетки были расщеплены и культивированы для образования БЭ. В первые 4 дня процесса клетки образуют Б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Из-за ограниченной доступности сетчатки глаза человека наше нынешнее понимание воспалительных реакций сетчатки почти основано на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, были дифференцированы органоиды сетчатки. Разработка моделей органоидов сетчатки является активной областью исследований, направленных на повторение сложности сетчатки глаза человека для моделирования заболеваний и терапевтической разработки. В нескольких исследованиях сообщалось об успешном получении органоидов сетчатки из плюрипотентных ство...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам неизвестно о какой-либо аффилированности, членстве, грантах или финансовых вложениях, которые могли бы повлиять на объективность данного исследования.

Благодарности

Это исследование поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82101145) и Пекинским фондом естественных наук (Z200014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Антитело; разведение в соответствии с инструкцией производителя
Anti-IBA1Abcamab5076Antibody; разведение в соответствии с инструкцией производителя
B27Life Технологии17105-041
Dispase (1U/mL)Технологии стволовых клеток07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSБиологическая промышленность04-002-1A
ЖелатинSigmaG7041-100GТвердый
глутамаксGibco35050-061
H9 клеточная линияWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-ИЛ-050
Ил-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
МатричныйCorning356231
M-CSFRD Systems 216-МС-500 
MEM Раствор заменимых аминокислотSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
НейробазальныйGibco21103-049
Pen/streppingGibco15140-122
Среда стволовых клеток Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoethanolLife Technologies21985-023

Ссылки

  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298(2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222(2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629(2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Включение микроглиистволовые клетки человекамодель совместного культивированиямоделирование заболеваний сетчаткидифференцировка микроглиииммунофлуоресцентный анализмаркер фоторецепторовмаркер микроглиицентральная нервная система
Сборка органоидов сетчатки с микроглией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.