Методическая статья

Двухцветная коррелятивная световая и электронная микроскопия для визуализации взаимодействий между митохондриями и лизосомами

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 сентября 2024 г.

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает механизм использования коррелятивного света и электронной микроскопии для визуализации взаимодействия митохондрий и лизосом, меченных mEosEM и APEX2, соответственно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные органеллы, такие как митохондрии и лизосомы, демонстрируют динамическую структуру. Несмотря на более высокое разрешение просвечивающей электронной микроскопии для структурного анализа, световая микроскопия имеет важное значение для визуализации динамических органелл путем мечения, специфичного для мишени. Следующий протокол описывает метод, который сочетает в себе двухцветный коррелятивный свет и электронную микроскопию (CLEM) для наблюдения за взаимодействием между митохондриями и лизосомами. В этом исследовании митохондрии были помечены mEosEM (Mito-mEosEM), а лизосомы — TMEM192-V5-APEX2. Результаты, полученные по изображениям CLEM, позволяют наблюдать изменения во взаимодействиях между митохондриями и лизосомами в условиях внешнего стресса. Лечение бафиломицином (БФА), который подавляет лизосомальную функцию, привело к увеличению контакта между митохондриями и лизосомами, что привело к образованию фрагментированных митохондрий, захваченных внутри лизосом. И наоборот, лечение U18666A, которое ингибирует экспорт холестерина из лизосом, привело к тому, что лизосомы были окружены митохондриями, что указывает на особую форму взаимодействия. В этом исследовании представлен эффективный метод наблюдения за взаимодействием между митохондриями и лизосомами в фиксированных клетках. Кроме того, визуализация CLEM с помощью двухцветных зондов предлагает мощный инструмент для будущих исследований динамики органелл и их влияния на функцию и патологию клетки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии и лизосомы являются основными мембраносвязанными органеллами, которые необходимы для поддержания клеточного гомеостаза. Митохондрии — это высокодинамичные клеточные органеллы, модулируемые событиями деления и слияния1. В целом, митохондрии считаются электростанцией клетки и известны своей важной ролью в окислительном фосфорилировании, производстве АТФ и хранении метаболитов, таких как класс кальция2. В дополнение к своей роли в энергетическом метаболизме, митохондрии участвуют в ряде других клеточных сигнальных процессов, включая apoptosis3,4, calcium signaling5,6, и липидный метаболизм7,8. Точно так же лизосомы являются высокодинамичными клеточными органеллами, которые играют множество ролей в качестве центров клеточной переработки для поддержания клеточной чистоты за счет деградации белка, аутофагии, эндоцитоза и фагоцитоза9. Помимо своей роли в деградации, лизосомы также играют роль в клеточной физиологии, такой как восприятие питательных веществ, класс гомеостаза10, метаболизм липидов11 и клеточная дедифференцировка12.

Несмотря на существование многочисленных исследований функций отдельных клеточных органелл, наши недавние исследования были сосредоточены на менее изученной перекрестной связи между митохондриями и лизосомами, которая, как было показано, влияет как на клеточную физиологию, так и на патологию. Контакты между митохондриями и лизосомами наблюдались в различных типах клеток, включая раковые клетки, нейроны и клетки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)13, и они в основном наблюдаются при клеточном стрессе или при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона13,14 и болезнь Шарко-Мари-Тута15. Контакт между митохондриями и лизосомами играет важную роль в поддержании метаболического гомеостаза посредством обмена ионами (например, Ca2+)16, cholesterol17, и iron18 между двумя органеллами. Кроме того, контакт между митохондриями и лизосомами играет решающую роль в контроле качества клеточных органелл. Например, поврежденные митохондрии могут быть мишенью для деградации в процессе митофагии, в котором они поглощаются аутофагосомами и доставляются в лизосомы для деградации. Следовательно, удаление дисфункциональных митохондрий может быть облегчено до того, как они вызовут дальнейшее повреждение клетки или нормальных митохондрий. Это взаимодействие между митохондриями и лизосомами имеет решающее значение для поддержания клеточного гомеостаза и предотвращения накопления дисфункциональных органелл. Таким образом, избирательно удаляются только поврежденные митохондрии, что позволяет здоровым митохондриям оптимально функционировать в клетке.

Коррелятивная световая и электронная микроскопия (CLEM) - это метод визуализации, который в последнее время привлек внимание как метод исследования, сочетающий преимущества световой микроскопии (LM) и электронной микроскопии (EM) для получения подробной структурной информации в различных масштабах. В CLEM образец сначала визуализируется с помощью LM для определения конкретных областей интереса, а затем следуют этапы подготовки ЭМ-образца, такие как фиксация, обезвоживание и встраивание. Затем тот же образец рассматривается под электронным микроскопом. Несмотря на то, что недавно сообщалось о методах CLEM с живыми клетками19,20,21,22, точное объединение оптических изображений высокодинамичных биологических образцов с электронно-микроскопическими изображениями фиксированных клеток в единую плоскость остается сложным. Для высокодинамичных органелл, таких как митохондрии и лизосомы, их точная локализация может измениться, поскольку они наблюдаются вживую под световым микроскопом, и они продолжают двигаться даже в течение короткого времени задержки, необходимого для фиксации.

Следовательно, в этом протоколе для визуализации взаимодействия между митохондриями и лизосомами, которые играют важную роль в поддержании метаболического гомеостаза через обмен ионами (например, Ca2+)16, cholesterol17, и iron18 между этими органеллами. Конструкции TMEM192-V5-APEX2 и Mito-mEosEM были использованы для наблюдения за взаимодействием митохондрий и лизосом в культивируемых клетках как на уровне EM, так и на уровне LM. Для митохондрий метка mEosEM была выбрана за ее способность сохранять флуоресцентный сигнал во время подготовки ЭМ-образца в фиксирующем растворе и классе OsO423. Для лизосом была использована метка APEX2, белок с массой около 28 кДа, для изучения локализации специфического белка на уровнях EM и LM24. В присутствии перекиси водорода субстрат APEX2, Amplex-Red, образует нерастворимый полимер, который можно наблюдать с помощью конфокальной микроскопии в целевом месте. В этом протоколе двухцветный CLEM был использован для визуализации структуры взаимодействий между лизосомами и митохондриями в фиксированных клетках.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пошаговый рабочий процесс подготовки образцов показан в Рисунок 1.

1. Клеточная культура и трансфекция

  1. Культивирование клеток HeLa при плотности 1 × 105 клеток в 35 мм стеклянных культуральных чашках с сетчатым дном, содержащих DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина при 37 °С.
  2. На следующий день после посева клеток сотрансфектируйте клетки при конфлюенции 30%-40% с плазмидами TMEM192-V5-APEX2 и Mito-mEosEM с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя (по 1 мкг плазмидной ДНК TMEM192-V5-APEX2 и Mito-mEosEM с 3 мкл реагента для трансфекции). После трансфекции клетки обрабатывают ДМСО или U18666A (2 мкг/мл) и бафиломицином А1 (100 нМ) в течение 18 ч.

2. Конфокальная микроскопическая визуализация

  1. После обработки клеток бафиломицином и U18666A в течение 18 ч удалить питательную среду и немедленно добавить 250 мкл теплого (30 °C-37 °C) фиксирующего раствора (2,5% глутаральдегида и 2% параформальдегида в 0,1 М растворе какодилата натрия [pH 7,0]) путем щадящего пипетирования. Немедленно снимите фиксатор, замените его 1,5 мл свежего фиксатора и выдержите на льду в течение 30 минут. Затем промойте клетки в течение 3 х 10 минут в 1 мл ледяного 0,1 М буфера какодилата натрия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пары альдегида токсичны. Все эксперименты следует проводить в вентилируемом вытяжном шкафу.
  2. Добавьте 1 мл холодного 20 мМ раствора глицина, чтобы погасить альдегид и выдержать на льду в течение 10 мин. Промыть 3 х 10 мин в холодном 0,1 М буфере из какодилата натрия.
  3. Приготовьте свежий раствор, содержащий 300 мкМ Амплекс-Ред, добавив 10 мМН2О2 в 0,1 М раствор какодилата. Добавьте 500 μL раствора Amplex-Red в чашку для образца и инкубируйте в течение 5 минут на льду.
  4. Удалите раствор Amplex-Red и промойте 3 x 10 мин буфером из 0,1 М какодилата натрия.
  5. После окрашивания Amplex-Red используйте конфокальный микроскоп для визуализации области вокруг интересующих клеток в режиме сканирования плитки 3 x 3. Захват дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентного сигнала для идентификации и записи сетки и букв на сетчатой тарелке с помощью объектива с 40-кратным (или 60-кратным) увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти обзорные изображения служат картой для идентификации конкретных клеток-мишеней в образцах, внедренных в пластик.
  6. Визуализируйте целевые ячейки с большим увеличением с помощью объектива с 40-кратным (или 60-кратным) увеличением и получите изображение Z-стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это изображение с большим увеличением накладывается на изображение электронного микроскопа для создания коррелятивного изображения.

3. Подготовка образцов для ЭМ блока

  1. После LM-визуализации добавьте 1 мл 1% восстановленного тетраоксида осмия (полученного путем содержания 3% ферроцианида калия в 0,3 М какодилатном буфере с равным объемом 2% водного тетраоксида осмия) для постфиксации при 4 °C в течение 1 ч, а затем промойте в течение 3 x 10 мин дистиллированной водой при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пары тетраоксида осмия токсичны. Все эксперименты следует проводить в вентилируемом вытяжном шкафу.
  2. Промойте 3 x 10 минут дистиллированной водой комнатной температуры, затем обезвоживайте в сортированном этаноле в течение 15 минут каждый раз (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% и 100%) при комнатной температуре.
  3. Смешайте этанол с эпоксидной смолой в объемном соотношении 3:1, 1:1 и 1:3, приготовив в общей сложности 300 μл каждой смеси. Налейте каждую эпоксидную смолу в посуду, дав ей инкубироваться при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем используйте 100% эпоксидную смолу для ночной пропитки.
  4. Подготовьте встраиваемую капсулу или пробирку для ПЦР, заполнив ее свежей эпоксидной смолой, поместите пробирку или капсулу вверх дном на интересующую область и поместите ее в духовку при температуре 60 °C на 48 часов для полимеризации.

4. Срезирование и визуализация ПЭМ

  1. После того как эпоксидная смола полностью полимеризуется, отделите нижнее стекло от полимерного блока, погрузив его в жидкий азот.
  2. Поместите блок образцов в держатель образца ультрамикротома и установите его в обрезной блок. С помощью лезвия бритвы обрежьте смолу в трапециевидную или прямоугольную форму вокруг интересующего объекта.
  3. Поместите обрезанный блок образцов в держатель образца и отрегулируйте алмазное лезвие. Убедитесь, что передняя кромка блока образцов идеально параллельна кромке алмазного диска.
  4. С помощью ультрамикротома вырежьте ультратонкие срезы примерно в 60-70 нм от плоских встроенных ячеек. Соберите серийные секции на шлицевой сетке с формварным покрытием и высушите их на горячей плите.
  5. Закрасьте участок контрастным веществом в течение 2 минут и цитратом свинца в течение 1 минуты.
  6. Поместите сетку в держатель образца ПЭМ для наблюдения. Определите интересующую клетку-мишень на основе изображения DIC, полученного под световым микроскопом. Визуализируйте всю площадь ячейки с помощью мозаичных, перекрывающихся изображений с увеличением 1700x.

5. Сшивание изображений с помощью imageJ Fiji.

  1. Чтобы начать сшивание изображений, запустите imageJ Fiji25 и нажмите на Файл | Новое | TrakEM2 (пустой) | Выберите папку хранения для создания нового проекта TrakEM226 (рисунок 2A1).
  2. Откройте набор данных изображений плиток, перетащив необработанные данные изображения плитки в рабочую область (Рисунок 2A2).
  3. Нажмите правую кнопку мыши и выберите Выровнять | Монтаж всех изображений в этом слое | elastic (нелинейные блочные соответствия), а затем нажмите OK, чтобы принять значения по умолчанию для остальных параметров (Рисунок 2A3).
  4. Нажмите правую кнопку мыши и выберите Экспорт | Создайте плоское изображение, чтобы создать сшитое изображение, затем нажмите «Файл» | Save As для сохранения изображения.

6. Изменение размера флуоресцентного изображения

  1. Откройте программу для увеличения фотографий (см. Таблицу материалов). Нажмите на Файл | Откройте и выберите флуоресцентное изображение.
  2. Введите ширину и высоту, которые будут иметь тот же размер, что и изображение электронного микроскопа, и выберите алгоритм, который будет применяться в методе изменения размера (Рисунок 2B1).
  3. Нажмите на Файл | Save AS, чтобы сохранить изображение с измененным размером.

7. Регистрация изображений на основе ориентиров с помощью плагина Big Warp

  1. Откройте ImageJ Fiji и перетащите флуоресцентную микрофотографию измененного размера (FM-изображение) и сшитую электронную микрофотографию (EM-изображение).
  2. Нажмите на Плагины | Просмотрщик BigData | Big Wrap, чтобы начать регистрацию, затем нажмите на выпадающее меню, чтобы выбрать изображение FM в качестве движущегося изображения и изображение EM в качестве целевого изображения (Рисунок 2C1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое изображение FM и EM будет иметь три новых всплывающих окна (движущееся изображение BigWrap, фиксированное изображение BigWrap и ориентиры) для отображения ориентиров.
  3. Сравните изображения в формате FM и EM с помощью таких функций, как масштабирование (колесико мыши), поворот изображения (перемещение мыши при зажатой левой кнопке) и перемещение (перемещение мыши при удержании правой кнопки), а затем нажмите клавишу пробела на клавиатуре, чтобы включить режим ориентиров, и нажмите левую кнопку мыши, чтобы отметить не менее трех ориентиров, обозначенных на изображениях FM и EM ( Рисунок 2C2, розовые точки и красная стрелка).
  4. Отметив все выявленные ориентиры, перейдите в Файл | Экспорт движущегося изображения | OK и появится новое всплывающее окно с преобразованным изображением FM (Рисунок 2C3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вновь созданное всплывающее окно представляет собой FM-изображение, преобразованное на основе ориентира. Просмотрите трассу и при необходимости внесите коррективы, добавив или изменив ориентиры и пересчитав преобразование.
  5. Нажмите на Файл | Save As для сохранения преобразованного FM-изображения.

8. Наложение изображений CLEM

  1. В ImageJ перетащите преобразованное FM-изображение и сшитое EM-изображение.
  2. Нажмите на изображение | Тип | 8-Bit Color для установки одного и того же типа изображения для LM и EM изображений (Figure 2D1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭМ-изображение должно быть преобразовано дважды в следующем порядке: 8-битный -> RGB Color -> 8-битный цвет.
  3. Нажмите на изображение | Цвет >| Объедините каналы, чтобы объединить изображения в составное изображение, выбрав изображения FM и EM из выпадающего меню соответственно (Рисунок 2D2).
  4. Нажмите на Файл | Save As для сохранения образа CLET.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы визуализировать взаимодействия между митохондриями и лизосомами с помощью этого двухцветного протокола CLEM, мы использовали Mito-mEosEM и TMEM192-V5-APEX2. Сначала неподвижные клетки были визуализированы с помощью светового микроскопа, а затем последовала выборка и визуализация с помощью ЭМ. Результаты коррелированных изображений показаны в Рисунок 3A,B и Рисунок 4A. Следуя описанному выше протоколу, мы проверили, можем ли мы наблюдать изменения во взаимодействии между митохондриями и лизосомами при внешнем стрессе.

Обработка клеток BFA, лизосомальным ингибитором V-АТФазы, ингибирует аутофагию, что приводит к снижению качества митохондрий и увеличению взаимодействия между митохондриями и лизосомами27. В клетках, обработанных БФА, мы наблюдали митохондрии, захваченные в лизосомах (Рисунок 3B), по сравнению с контрольными клетками, обработанными ДМСО (Рисунок 3A). Несмотря на то, что фрагментированные электронно-плотные митохондрии и клеточные компартменты в лизосомах трудно различить только на электронных микрофотографиях, их можно легко различить на коррелированных изображениях (Рисунок 3B1,B2). Структура митохондриального разрушения (рисунок 3A1,A2; синяя стрелка), наблюдаемая в митохондриях клеток, обработанных ДМСО, не связана с лизосомами, а структура на флуоресцентном изображении, которая выглядит как лизосома, захваченная внутри большой митохондрии, представляет собой структуру, в которой митохондрия окружает лизосому (рисунок 3A2; красная стрелка).

Далее мы проверили эффекты U18666A (2 мкг/мл в течение 18 часов), хорошо известного ингибитора NPC1, который блокирует движение холестерина из лизосом28. Клетки, обработанные U18666A, показали повышенное прямое взаимодействие между митохондриями и лизосомами (Рисунок 4). Кроме того, контакты между митохондриями и лизосомами в образцах, обработанных U18666A, отличались от контактов в образцах, обработанных БФА. В клетках HeLa, обработанных BFA, фрагментированная митохондрия полностью захвачена лизосомой, ранее описанная морфология митофагии12,29. Тем не менее, в группе, получавшей U18666A, некоторые из TMEM192-положительных лизосом, по-видимому, поглощены митохондриями (Figure 4D,E)30,31.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематический обзор CLEM на основе TEM с использованием генетически помеченного флуоресцентного зонда. (A) Клетки HeLa выращивали в 35-мм стеклянных чашках с сетчатым дном. (B) Фиксированные клетки были помечены Amplex-Red белком APEX2. (C) Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокального микроскопа. Моторизованная сцена и функция сканирования плитки были использованы для захвата большого обзорного изображения и изображения целевой ячейки с высоким разрешением. Большое изображение служит навигационной картой для определения местоположения целевой клетки в образцах, встроенных в пластик. (D) Приступайте к последующей фиксации и обезвоживанию. (E) Встраивание осуществлялось с помощью ПЦР-пробирки или капсулы BEM, заполненной смолой, поверх целевой ячейки на покровном стекле. (F) После полимеризации смолой при удалении покровного стекла на нижней поверхности блока оставлялся отпечатанный сетчатый рисунок. (G) Клетку-мишень идентифицировали по отпечатанному рисунку на поверхности смолы, и клетку-мишень разрезали на толщине примерно 60 нм с помощью ультрамикротома. (H) Серийные срезы собирались на медной щелевой сетке с формварным покрытием. (I) Изображения сеток были получены с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Сокращения: ТЭМ = просвечивающая электронная микроскопия; CLEM = корреляционная световая и электронная микроскопия; ROI = область интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Обработка изображений и генерация изображения CLEM с использованием imageJ Fiji. (A1) Основной графический интерфейс Фиджи и TrakEM2. (А2) Импорт набора данных изображений тайлов, полученных с помощью TEM при 1 700-кратном увеличении. (А3) Выравнивание и пример сшитого изображения с использованием метода выравнивания изображений TrakeEM2. (В1-В3) Преобразование маленьких световых микрофотографий в большие высококачественные изображения с помощью программного обеспечения для увеличения фотографий. (С1-С3) Рабочий процесс для регистрации между изображениями световой микроскопии и изображениями электронной микроскопии с помощью подключаемого программного обеспечения Big Wrap. (Д1-Д3) Процесс наложения преобразованного FM-изображения и ЭМ-изображения для синтеза коррелированного изображения микроскопа. Сокращения: ТЭМ = просвечивающая электронная микроскопия; CLEM = корреляционная световая и электронная микроскопия; FM = флуоресцентная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: CLEM-изображения митохондриальных и лизосомальных контактных участков, обработанных бафиломицином А1 или без него. Клетки HeLa ко-трансфицировали Mito-mEosEM (митохондрии; зеленый) и TMEM192-APEX2 (лизосомы; красный), а затем окрашивали красителем Amplex-Red. (А) Необработанные клетки HeLa. Молекулярная информация из сигнала флуоресценции (левая панель) и ультраструктурная информация, полученная с помощью ПЭМ (средняя панель), накладывались друг на друга (правая панель) на основе митохондриального сигнала и морфологии. (А1,А2) В необработанных клетках HeLa внутренняя мембрана митохондрий нарушена (синяя стрелка), или митохондрии и лизосомы находятся очень близко друг к другу (красная стрелка). (В1,В2) В клетках HeLa, получавших бафиломицин А1 в течение 18 ч, наблюдалась митофагия, характеризующаяся захватом недеградированных митохондрий в лизосомах (зеленая стрелка). Масштабные линейки = 1 мкм (A1,A2,B1,B2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: CLEM-изображения митохондриальных и лизосомальных контактных сайтов, обработанных U18666A (A) Двухцветные CLEM-изображения Mito-mEosEM и TMEM192-V5-APEX2 (Amplex-Red-labeled) экспрессировали клетки HeLa под U18666A обработкой (2 мкг/мл в течение 18 ч). (А1,А2) Красными стрелками обозначены места контакта между митохондриями и лизосомами. Масштабные линейки = 1 мкм. (B1-B3,C1-C3) Красная стрелка указывает на появление межорганелального слияния между митохондриями и лизосомами по серийным изображениям. Масштабные линейки = 500 нм (В1-В3). Масштабные линейки = 1 мкм (C1-C3). (D,E) ПЭМ-изображения сайтов слияния митохондрий и лизосом с высоким увеличением. Псевдоцвета используются для различения митохондрий (зеленый) и лизосом (красный). Масштабные линейки = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает двухцветную CLEM для наблюдения за взаимодействием митохондрий и лизосом в фиксированных клетках с использованием генетически кодируемых меток mEosEM и APEX2. За последние несколько десятилетий достижения в области микроскопии значительно улучшили возможности наблюдения за изменениями в сетях органелл, а изучение взаимодействий органелл становится все более интересным. Микроскопия сверхвысокого разрешения использовалась для наблюдения изменений в высокодинамичных контактах между митохондриями и лизосомами 34,35,36. Однако, несмотря на использование микроскопии сверхвысокого разрешения, трудно различить изменения толщины внутренней и наружной митохондриальных мембран (примерно 22 нм) и кристинных соединений (примерно 28 нм)37. Преимущество просвечивающей электронной микроскопии заключается в том, что она позволяет наблюдать за структурой биологических образцов с очень высоким разрешением, но имеет недостаток, заключающийся в том, что изображения могут быть просмотрены только в черно-белом цвете, что затрудняет различие органелл на сложных изображениях. В нашем протоколе мы использовали метод CLEM, который сочетает в себе преимущества световой и электронной микроскопии для мониторинга взаимодействия двух разных органелл путем окрашивания их в разные цвета. В частности, двухцветный CLEM является бесценным инструментом для наблюдения и анализа митофагии, процесса деградации митохондрий в лизосомах, как показано на рисунке 3.

Визуализация живых клеток обычно выполняется в физиологических условиях, что позволяет исследователям наблюдать за динамическими клеточными процессами в режиме реального времени. Однако методы электронной микроскопии часто требуют трудоемких процедур подготовки образцов, включая фиксацию и окрашивание. Временная задержка между визуализацией живых клеток и подготовкой образцов с помощью электронной микроскопии ограничивает временное разрешение метода и может привести к потенциально пропущенным динамическим клеточным событиям. Для преодоления ограничения CLEM живых клеток нами был разработан двухцветный метод CLEM, в котором зонд mEosEM23 и химический краситель (Amplex-Red) окрашиваются ферментом38 бесконтактного мечения APEX2 без потери флуоресцентного сигнала даже в жестких фиксирующих средах. В предыдущем исследовании CLEM39 с живыми клетками были обнаружены расхождения между флуоресцентными сигналами и ЭМ-изображениями из-за проблем с временным разрешением в выборке TEM после визуализации живых клеток и технических ограничений при подготовке образцов. Однако, получая флуоресцентные изображения неподвижных клеток в течение достаточного времени (z-стековая визуализация целых клеток при большом увеличении), мы можем решить проблему временного разрешения и улучшить корреляцию между LM и EM изображениями (рис. 3 и рис. 4).

Еще одним ключевым фактором для получения успешных результатов CLEM является то, как точно зарегистрировать LM-изображение с EM-образом. Для этого мы сначала использовали комбинацию режимов ДВС-и флуоресцентной визуализации во время световой микроскопии, чтобы создать навигационную карту вокруг клеток-мишеней. Используя эту навигационную карту, мы могли бы легко идентифицировать интересующие нас клетки на ультрамикротоме и ПЭМ. Во-вторых, получая изображения целых ячеек с помощью ПЭМ-плиток с большим увеличением, мы смогли получить множество ориентиров, которые можно было бы использовать для регистрации изображений. По нашему опыту, чем больше ориентиров, тем лучше точность выравнивания LM и EM изображений в плагине Big Warp.

В этом исследовании мы показали домены взаимодействия лизосом и митохондрий с результатами CLEM с высоким разрешением. Кроме того, двухцветный зонд позволил провести точное различие между митохондриями и лизосомами. Однако этот метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, если время реакции во время проксимального мечения Amplex-Red ферментом APEX2 слишком велико, Amplex-Red будет диффундировать и окрашиваться шире, чем местоположение белка-мишени38. Во-вторых, толщина (объем по оси Z) области, где лизосома поглощена митохондриями, довольно мала, поэтому слияние двух мембран органелл не может быть определено в последовательном сечении толщиной 50 нм. Кроме того, является серьезной проблемой точное выравнивание оси z оптического сечения с помощью светового микроскопа и механического сечения с помощью ультрамикротома. Для преодоления этих ограничений можно использовать двухцветный CLEM в сочетании с обычной электронной томографией40 или серийным срезом объемного CLEM41.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано программой фундаментальных исследований KBRI через Корейский институт исследования мозга, финансируемой Министерством науки и ИКТ (24-BR-01-03). Плазмиды TMEM192-V5-APEX2 были любезно предоставлены Хён-Ву Ри (Hyun-Woo Rhee) из Сеульского национального университета. Данные ПЭМ были получены в Brain Research Core Facilities в KBRI.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты и реагенты
25% ГлутаральдегидЭлектронная микроскопия Sciences16200Пары альдегида чрезвычайно токсичны. Используйте только в вытяжном шкафу.
30% раствор перекиси водородаMerck107210
4% раствор параформальдегидаBiosesangPC2031-100-00пары лдегида чрезвычайно токсичны. Используйте только в вытяжном шкафу.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Электронная микроскопия Науки14120
ЭтанолMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Плазмидная трансфекция
ГлицинSIGMAG8898
Цитрат свинца 3%Электронная микроскопия Науки22410
Тетраоксид осмия 4 % водный растворЭлектронная микроскопия Sciences16320Очень токсичен. Используйте только в вытяжном шкафу.
Тригидрат гексацианоферрата калия(II)SIGMAP3289
Тригидрат какодилата натрияSigma-AldrichC0250-500G
УранилацетатЭлектронная микроскопияНауки 22400
UranyLess ЭМ окрашиваниеЭлектронная микроскопия Науки22409
Плазмидная конструкция
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.Н/ДDOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 мкм шприцевой фильтрSartorius16534
35 мм Решетчатая покровная покровная чашкаMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM Встраиваемые капсулыTed Pella130
Formvar Supported Однощелевая медная сеткаTed Pella01705
Алмазный ножDiATOMEDU4530
Ультра-микротомLeicaARTOS 3D
<стронг>микроскопы
инвертированная конфокальная микроскопияNikonA1 Rsi/Ti-E
Просвечивающая электронная микроскопияFEITecnai G2
Software и Алгоритмы
Fiji/Image JNIH / открытый исходный кодhttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp программный пакетNIH / открытый исходный кодhttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Alternative software
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 изменить размер : https://www.on1.com/products/resize-ai/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HeLa

Похожие статьи