Сочетание визуализации и электрофизиологии для визуализации и регистрации распространяющейся деполяризации у мышей

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует комбинацию визуализации и электрофизиологии для надежного обнаружения распространяющейся деполяризации у взрослых мышей после легкой черепно-мозговой травмы.

Аннотация

Распространяющиеся деполяризации (SD) - это массовые события в мозге, которые часто остаются незамеченными из-за их медленного распространения через серое вещество. Поскольку обнаружение SD может быть труднодостижимым, его оптимально подтверждать с помощью нескольких методов. Этот протокол описывает методы объединения визуализации и электрофизиологии для обнаружения SD таким образом, чтобы большинство лабораторий могли надежно и легко внедрить. СД возникают после черепно-мозговых травм, инсульта, субарахноидальных кровоизлияний, ишемии и мигренозной ауры. Исторически сложилось так, что SD регистрировались с помощью усилителей постоянного тока, которые могут решить проблему медленного внеклеточного сдвига и снижения высокочастотной активности. Тем не менее, усилители постоянного тока практически невозможно использовать для хронической записи in vivo. В этом протоколе используется общий усилитель переменного тока для записи электрофизиологии in vivo для подтверждения высокочастотной депрессии, наряду с неинвазивной визуализацией, необходимой для обнаружения распространяющейся волны SD. Эти методы могут быть надежно приняты и/или модифицированы для большинства экспериментальных подходов для подтверждения наличия или отсутствия СД после черепно-мозговой травмы.

Введение

Распространяющаяся деполяризация (SD) связана с различными неврологическими состояниями, включая черепно-мозговую травму (ЧМТ), инсульт, субарахноидальные кровоизлияния, ишемию и мигрень aura¹. SD были вовлечены в прогрессирование повреждения тканей при инсультах и ЧМТ². Точный механизм, лежащий в основе прогрессирования потери тканей, остается неясным^3,4. Тем не менее, SD возникают, когда метаболические потребности нейронов не удовлетворяются достаточным количеством кислорода и глюкозы, поскольку функция АТФ-зависимого натрий-калийного насоса становится недостаточной для поддержания ионных градиентов. Чтобы понять роль SD в потере тканей, необходимы точные методы их измерения и изучения, что имеет решающее значение для продвижения научных знаний. СД являются значительными неврологическими событиями, которые часто могут оставаться незамеченными из-за экспериментального дизайна и/или ограничений инструментария.

Роль распространяющихся деполяризаций (SD) в прогрессировании травмы в настоящее время выясняется, но их роль в легких черепно-мозговых травмах (mTBI) остается неясной. Недавние исследования с использованием методов, описанных в этой рукописи, показали, что SD инициируются в моделях мышей с закрытым черепом mTBI, даже когда нет явного повреждения тканей или кровотечения ^{5, 6}. Эти исследования показывают, что СД могут способствовать развитию острых неврологических нарушений и нейровоспаления. Кроме того, наличие индуцированных mTBI SD тесно связано с острым поведенческим дефицитом^6,7. Таким образом, вполне вероятно, что СД инициируются во всех моделях ЧМТ, но их роль остается трудно установить без подтверждения. Подтверждение наличия УР имеет решающее значение для точной оценки исходов ЧМТ.

Распространяющиеся деполяризации (SD) идентифицируются значительным падением внеклеточного потенциала, известным как "сдвиг постоянного тока", и снижением высокочастотной активности⁸. "Сдвиг постоянного тока" обычно занимает секунды для разрешения (~10 с)⁹. Для захвата «сдвига постоянного тока» требуется усилитель постоянного тока и электроды с серебряной проволокой. Тем не менее, электрофизиология in vivo обычно выполняется с помощью усилителей переменного тока, которые предназначены для фильтрации низкочастотных событий для уменьшения артефактов движения. К сожалению, эта низкочастотная фильтрация также устраняет «сдвиг постоянного тока». Кроме того, серебро токсично и не подходит для хронической записи. Обычно используемые усилители переменного тока могут обнаруживать снижение высокочастотной активности, но без сопутствующего «сдвига постоянного тока» подтвердить наличие SD является сложной задачей.

Распространяющиеся деполяризации (SD) также могут быть обнаружены с помощью различных методов визуализации. Чаще всего SD визуализируются с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации, которая измеряет мозговой кровоток через интактный череп¹⁰. СД существенно влияют на сосудистую сеть головного мозга и кровоток. У большинства видов, кроме мышей, SD вызывают распространяющуюся волну гиперперфузии, которая распространяется вместе с передним краем класса SD¹¹. SD также можно визуализировать с помощью флуоресцентных индикаторов кальция или глутамата¹², хотя для этого требуется загрузка ткани красителями или генетически закодированными флуоресцентными индикаторами^12,13. Интересно, что SD можно наблюдать невооруженным глазом благодаря собственным оптическим сигналам (iOS), связанным с SD¹⁴. iOS — это сложные сигналы, состоящие из автофлуоресцентных молекул, таких как NAD(P)H и FADH^15,16, отек тканей¹⁷, а также потенциальные изменения мозгового кровотока. Несмотря на свою сложность, сигналы iOS надежны и могут быть захвачены мышами дикого типа ¹⁸. Этот протокол описывает метод визуализации iOS, поскольку этот метод может быть реализован в любой лаборатории без необходимости использования специализированных вирусов или трансгенных животных.

Общая цель этого метода - экспериментально подтвердить наличие или отсутствие распространяющейся деполяризации (SD) после легкой черепно-мозговой травмы (mTBI) с использованием одновременной визуализации и электрофизиологии. Электрофизиология in vivo, поддерживаемая передовыми усилителями, является широко используемым методом. Тем не менее, эти усилители не могут обнаружить характерный сдвиг постоянного тока. Поэтому методы визуализации, описанные в этом протоколе, используются для уверенного подтверждения наличия или отсутствия SD. Преимущество объединения визуализации и электрофизиологии заключается в том, что визуализация может обнаружить распространение SD, в то время как электрофизиология может идентифицировать связанную с этим высокочастотную депрессию.

В целом, этот метод подходит для исследования наличия распространяющихся деполяризаций (SDs) после черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Его применение может улучшить понимание функции корковой сети после ЧМТ и СД. Этот протокол может быть адаптирован от модели закрытого удара черепа к другим моделям, таким как контролируемое кортикальное воздействие, перкуссия жидкости или падение веса. Внедрение этого протокола в нескольких лабораториях может пролить свет на роль СД при различной степени тяжести ЧМТ. Можно использовать любую установленную модель ЧМТ с последующими процедурами визуализации и электрофизиологии iOS, описанными в этом протоколе.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Нью-Мексико. Мыши C57BL/6J были получены из коммерческого источника. Использовалось равное количество самцов и самок мышей в возрасте от 8 до 14 недель. Все мыши весили примерно 20 г. Подробная информация о животных, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов. Дополнительный файл 1 содержит список сокращений.

1. Подготовка черепа к визуализации и электрофизиологии

1. Обезболите животное в индукционной коробке изофлурана с 2%-3% изофлураном в 100% кислороде, обеспечивая надлежащую глубину анестезии без вздрагивания от щипки лапы.
2. Вводите предоперационные анальгетики (бупренорфин с медленным высвобождением, 3,25 мг/кг, SQ) перед помещением животного в стереотаксическую рамку и поддерживайте анестезию (2% изофлуран).
3. Добавьте офтальмологическую мазь и поддерживайте температуру тела животного с помощью грелки, которая имеет обратную связь по температуре тела.
4. Сбрейте волосы над черепом, где будет разрез, вниз по средней линии от глазной щели к лямбде.
5. Перед стерилизацией кожи удалите подстриженные волосы с помощью антисептического и дезинфицирующего скраба и раствора. В завершение добавьте 70% этанола и повторите три раза, чтобы обеспечить стерильность места операции.
6. Используя лезвие скальпеля #10, сделайте разрез по средней линии от рострального к каудальному, сразу после чего нанесите на разрез медицинский цианоакрилатный клей. Раздвиньте кожу в сторону, чтобы обнажить череп.
7. Добавьте еще одну-две капли цианоакрилатного клея на череп, чтобы добавить дополнительную защиту черепу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение клея чувствительно ко времени, так как череп начинает становиться непрозрачным при воздействии воздуха дольше 10 секунд. Это затруднит визуализацию SD с помощью методов визуализации.
8. Пока клей высыхает, используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы увеличить размер разреза над мозжечком. После того, как клей схватится, приступайте к имплантации винтовых электродов черепа.
   1. Стерилизуйте винты черепа с помощью стерилизатора с шариками в течение 20-30 с до имплантации.
   2. Винты с черепом должны быть размещены в области, удаленной от места инициации SD, чтобы сохранить открытое визуальное окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для хронических записей в первичной зрительной коре используются три винта в виде черепа. Первый винт размещается примерно на расстоянии y = -6,00 мм от брегмы, в мозжечке, выполняя роль электрода сравнения. Записывающие электроды расположены на расстоянии y = -2,79 мм от брегмы и x = ±2,5 мм от средней линии, в левом и правом полушариях.
   3. С помощью сверла размером 0,8 мм просверлите направляющие отверстия в черепе. Чтобы гарантировать отсутствие повреждения подлежащих тканей, идеальным является -0,5 мм в z. Используйте винты #00-90, которые предварительно припаяны к золотым контактам с проволокой из нержавеющей стали.
   4. Поверните винты вниз в череп.1.5-2 полных оборота винт пройдет через череп и войдет в контакт с кортикальной поверхностью.
   5. Намотайте лишнюю проволоку на винт, чтобы дать небольшой провисание проволоке для размещения на сцене позже.
   6. Используя те же процедуры, установите другие винты с черепом.
   7. Как только все винты будут на месте, вставьте все золотые контакты в нужный разъем для головного монтажа. Удерживайте разъем на месте с помощью стереотаксического рычага и держите контакты разъема близко над головками винтов, следя за тем, чтобы провода не соприкасались.
   8. Запечатайте всю область цианоакрилатным клеем, следя за тем, чтобы не повредить область визуализации перед винтами черепа.
   9. Нанесите стоматологический цемент вокруг основания золотых штифтов, следя за тем, чтобы золотые штифты от винтов черепа не были соединены с золотыми штифтами в головном столике.
   10. Дайте стоматологическому цементу застыть, прежде чем снимать соединитель для верхней части.
   11. Извлеките животное из стереотаксической рамы и поместите его обратно в домашнюю клетку для восстановления. Соблюдайте стандартный послеоперационный уход и держите животных на грелке во время восстановления после анестезии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После операции животные содержались в одном помещении и ежедневно контролировались на предмет боли. Следуйте местным рекомендациям по обезболиванию. При использовании бупренорфина с медленным высвобождением следите за болью и потенциально давайте дополнительную дозу через 72 ч.
9. Удалите все предметы, которые могут зацепиться за электроды, включая корпус и обогащение. Используйте стандартные постельные принадлежности с свободным доступом к еде и воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставьте двухдневный восстановительный период между операцией и записью.

2. Обнаружение распространяющихся деполяризаций с помощью визуализации собственного оптического сигнала (iOS) и электрофизиологии AC

1. Обезболивайте животных 2% изофлураном в 100% кислороде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализационная часть этой процедуры должна занимать ~5 минут, а количество воздействия изофлурана должно быть постоянным.
2. Поместите животное в стереотаксическую рамку. Через носовой обтекатель поддерживайте 1%-2% изофлурана в кислороде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно поддерживать надлежащую глубину анестезии, так как известно, что изофлуран снижает SD. Рекомендуется поддерживать 60-70 вдохов/мин на протяжении всего эксперимента.
3. Поместите животное под камеру и убедитесь, что камера сфокусирована на поверхности коры головного мозга, отрегулировав кольцо фокусировки.
4. Нанесите минеральное масло на область визуализации для повышения прозрачности.
5. Включите компьютеры, светодиодную панель, электрофизиологическое оборудование><. ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодная панель лучше всего работает при размещении перед животным для освещения окна визуализации при выключенном верхнем свете. Свет был установлен на ~2,400 люкс (95% мощности) с настройкой холодной температуры 4000K.
6. Настройка загрузки для iOS с помощью Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Нажмите кнопку Live, чтобы просмотреть мышь под камерой, и отцентрируйте череп животного под камерой. Закройте окно "Live".
   2. Нажмите Multi-D acq.
   3. В окне «Многомерная съемка» выберите нужные временные точки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подсчет 750 изображений с интервалом 250 мс.
   4. Сохраняйте изображения в нужном пути к файлу и префиксе имени.
7. Подсоедините золотые контакты от животного к разъему для головы, а затем к сцене.
8. Настройка нагрузки для программного обеспечения Intan.
   1. Нажмите на иконку «Выбрать формат файла» и во всплывающем окне выберите «Формат типа одного файла на сигнал». Это позволит сохранить файл в качестве ".dat" для дальнейшего использования в MATLAB.
   2. На вкладке BW в разделе Hardware Bandwidth (Аппаратная полоса пропускания) выберите полосу пропускания усилителя 0,13–500 Гц.
   3. В разделе Выбор фильтра дисплея выберите WIDE, чтобы охватить максимально широкий диапазон сигналов.
   4. Чтобы выбрать нужный путь к файлу для сохранения, нажмите на иконку «Выбрать имя файла».
9. Выполните удар с помощью электромагнитного импактора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость удара составляет 4 м/с и отклонение 5 мм.
   1. Включите импактор и убедитесь, что наконечник втягивается и выдвигается соответствующим образом, щелкнув 3-позиционным переключателем, чтобы втянуть наконечник и вытянуть наконечник. Наконечник должен быть вытянут перед тем, как поместить животное под наконечник.
   2. Быстро двигаясь, уложите животное на поролоновую подстилку и сдвиньте подстилку под кончик.
   3. Выровняйте кончик ударного элемента по средней линии и на расстоянии 1 мм ростраль брегмы.
   4. Опустите кончик ударного элемента так, чтобы он плотно касался макушки головы животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не надавливайте кончиком вниз на голову.
   5. Нажмите на рычаг, чтобы втянуть наконечник ударного элемента, а затем вручную опустите его на 5 мм перед активацией ударного рычага.
   6. Немедленно снимите животное с поролонового слоя и поместите животное под камеру для получения изображения в течение 5 секунд, так как SD инициируется от удара.
10. Запустите изображение iOS, нажав кнопку «Получить!» в окне «Многомерное сканирование». Изображение за 4 минуты для захвата всего SD.
11. Начните запись электрофизиологии, нажав на значок «Запись» в программном обеспечении Inteltan.
12. Снимите животное с поролоновой прокладки и дайте животному восстановиться на открытой арене или в домашней клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется записывать электрофизиологию в течение не менее 1 часа, чтобы позволить функции корковой сети восстановиться.
13. По завершении записи отключите животное от головного пульта и разъема и поместите животное обратно в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оставлять 24 часа между каждым ударом и сеансом записи. Животное может оставаться в своей домашней клетке в течение всего времени вне сессий записи.

3. Визуализация и количественная оценка изображений iOS

1. В ImageJ^19,20,21,22, откройте стек изображений, нажав на последовательность Файл > Импорт > Изображение.
2. Вручную прокручивайте изображения, чтобы убедиться в отсутствии движения или каких-либо других артефактов.
3. Чтобы построить график SD, создайте ROI, нарисовав квадрат с помощью курсора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать квадрат размером 30 x 30 пикселей. Можно использовать любую форму или размер, но убедитесь, что размер ROI не меняется у разных животных.
4. Создайте график, щелкнув по Image > Stacks > Plot Z-axis Profile. На только что созданном графике нажмите на кнопку «Живая». Вернитесь к стеку изображений SD и перемещайте ROI, пока на графике не появится кривая SD. График должен выглядеть как волна Грех с последующим последующим падением ниже базовой линии и медленным возвращением к исходной линии в течение нескольких минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Графики могут быть выражены в виде условных единиц измерения (AU) или в процентах от базовой линии с использованием первых нескольких изображений в качестве базового среднего значения.
5. На сгенерированном графике нажмите «Список», чтобы создать список значений, которые могут быть построены в другом программном обеспечении для создания графиков или Matlab.
6. Для визуализации превратите изображение в оттенках серого в таблицу подстановки в ImageJ по изображению > таблицах подстановки > Fire.

4. Электрофизиологический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется активно использовать опыт лаборатории Бузсаки и их код, сгенерированный MATLAB, для визуализации и анализа данных электрофизиологии. Для анализа потребуется скачать MATLAB с кодом активации учреждения и zip-файл «Buzcode» лаборатории Бузсаки через GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

1. В программе электрофизиологии Intan убедитесь, что экспортированные исходные данные сохранены в формате ".dat><". ПРИМЕЧАНИЕ: Matlab можно установить с веб-сайта MathWorks. Институциональный или индивидуальный код активации необходим для покупки и использования Matlab. Для выполнения этого анализа необходим некоторый предварительный опыт работы с кодом в Matlab.
2. Используйте функцию bz_LoadBinary кода Бузаки для загрузки данных в Matlab.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример "'data' = bz_LoadBinary ("полный путь к файлу данных", 'частота', частота дискретизации, nChannels, количество каналов);
3. Отфильтруйте шум переменного тока с помощью режекторного фильтра с центром в частоте 60 Гц.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Пример notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, data);
4. Изолируйте высокочастотную активность с помощью полосового фильтра с диапазоном 0,5-100 Гц, в соответствии с рекомендациями группы COSBID по анализу и визуализации распространяющихся деполяризаций (SD).
5. Рассчитайте спектрограмму мощности с помощью команды pspectrum в MatLab.
6. Для визуализации постройте высокочастотную и мощностную спектрограмму на одной временной шкале и в одном столбце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Судя по графикам, произойдет расширение высокочастотной депрессии и потеря мощности.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует графическое представление экспериментальной установки. Записывающие черепные винты расположены в первичной зрительной коре, а один черепно-винтовой электрод помещен в черви мозжечка в качестве заземляющего электрода. Винты для черепа и золотые штифты крепятся к черепу с помощью цианоакрилатного клея и стоматологического цемента. Крайне важно ограничить ввод зубного цемента в каудальную часть черепа, чтобы оставить пространство для воздействия и визуализации. Место удара, центрированное по средней линии и примерно на 1 мм ростраль к брегме, указано в Рисунок 1.

Репрезентативные изображения собственных оптических сигналов (iOS) показаны в Рисунок 2A. Изображения в оттенках серого преобразуются с помощью таблицы Fire Lookup Table для улучшения визуализации распространяющихся деполяризаций (SD). iOS поддерживает различные сигналы, включая NAD(P)H, FADH и отражательную способность тканей, что затрудняет интерпретацию и сравнение этих сигналов. Крупные сосуды должны быть хорошо видны через окно суперклея (обозначено стрелками), в то время как пунктирная линия в Рисунок 2А отмечает распространяющуюся волну SD. Несмотря на то, что SD трудно наблюдать в режиме реального времени, они становятся более заметными при ускорении изображения (см. дополнительное видео 1). Может показаться, что некоторые маленькие ветви "исчезают" из-за сужения сосудов (Рисунок 2A). Небольшая область интереса (ROI), извлеченная из стека изображений, должна дать график по оси Z, похожий на Рисунок 2B. Судя по электрофизиологическим записям, извлеченный высокочастотный сигнал должен напоминать верхние панели Рисунок 2C,D. Эти записи были начаты сразу после легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ), при этом животные оставались под анестезией изофлураном в течение 4 минут визуализации iOS. После удаления изофлурана высокочастотная активность должна быстро восстановиться в течение минуты у фиктивных животных, как показано на рисунке Рисунок 2C (красный прямоугольник). И наоборот, если произойдет SD, высокочастотная активность будет оставаться подавленной в течение нескольких минут до восстановления (Рисунок 2D, красный прямоугольник). Нижние панели Рисунок 2C,D отображают расчетную мощность (V²) для каждого высокочастотного графика. Эти графики мощности помогают определить подавление и восстановление высокочастотной активности по быстрому росту мощности (обозначено правым краем красных прямоугольников).

Рисунок 1: Экспериментальная установка и расположение ударных винтов и винтов с черепом. Дорсальная поверхность черепа обнажается через разрез кожи. Череп и кожа герметизируются цианоакрилатным клеем для повышения прозрачности. Отверстие для заусенцев для земли просверливается при y = -6.00 и x = 0 от брегмы. Отверстия для записывающих электродов расположены на y = -2,79 и x = ±2,5 от брегмы. Винты из нержавеющей стали продеваются через череп и припаиваются к золотым штифтам с помощью проволоки из нержавеющей стали без покрытия. Следует избегать чрезмерного покрытия поверхности черепа стоматологическим цементом, чтобы обеспечить достаточное пространство для воздействия и визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения iOS и записи AC. (A) Репрезентативные изображения iOS со стрелками, указывающими на кровеносные сосуды. Изображения в оттенках серого преобразуются в таблицу поиска Fire в ImageJ для улучшения визуализации. Пунктирная черная линия обозначает распространяющуюся SD, визуализированную как волна повышенной интенсивности в iOS. SD хорошо видна при быстрой прокрутке всего стека изображений. Сигнал iOS отражает различные физиологические и метаболические изменения, связанные с SD, включая митохондриальную продукцию NAD(P)H и FADH, а также отек нейронов. Черным прямоугольником выделена область интереса (ROI), используемая для создания трассировки в (B). Масштабная линейка: 1 мм. (B) Репрезентативная кривая iOS SD, выраженная в процентах от базового уровня. Сигнал iOS поднимается и возвращается к исходной линии в течение примерно 60 секунд. Хотя изменения в сигналах iOS невелики (около 10%), их достаточно для идентификации SD. В записях переменного тока для фиктивных (C) и SD (D) животных верхние кривые показывают высокочастотную активность, а нижние — мощность (V²). Синие квадраты обозначают периоды анестезии изофлураном, в то время как красные прямоугольники обозначают период восстановления высокочастотной активности от изофлурана и SD. Длительная депрессия, вызванная SD, контрастирует с быстрым восстановлением активности после приема только изофлурана (симуляция). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Визуализация распространяющейся волны. Видеофайл ускоряется примерно до 8-кратной скорости, чтобы облегчить визуальную идентификацию распространяющейся волны. Изображение в оттенках серого было преобразовано в таблицу преобразования Fire и сохранено в виде файла .AVI в ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Список сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Распространяющаяся деполяризация имеет решающее значение в различных моделях заболеваний, включая черепно-мозговую травму (ЧМТ), инсульт и мигрень¹. Точное выявление СД имеет важное значение для понимания их роли в остром поведенческом дефиците и/или активации нейроиммунной системы после легких черепно-мозговых травм (ЧМТ)^23,24. Чтобы снизить риск пропуска SD при использовании одного метода, необходим многометодный подход для эффективной визуализации и записи SD.

Несмотря на то, что комбинирование методов позволяет подтвердить распространение деполяризаций (SD), каждый из них может иметь потенциальные подводные камни. Методы визуализации, описанные в этом протоколе, доступны для большинства лабораторий и подробно описаны Зепедой и коллегами²⁵. Подготовка черепного окна имеет решающее значение, так как непрозрачные окна могут привести к неубедительным изображениям²⁶. Эту проблему можно смягчить, сведя к минимуму воздействие воздуха на череп перед нанесением цианоакрилатного клея. Кроме того, прозрачность окна может быть улучшена с помощью капли минерального масла перед нанесением изображения. Артефакты движения также могут усложнить подтверждение SD, поэтому минимизация этих артефактов имеет важное значение для получения четкого видео. Чтобы решить эту проблему, важно держать животное под действием изофлурана на протяжении^{всего процесса} визуализации. Использование носового обтекателя способствует эффективному перемещению животного между ударным устройством и записывающей установкой. Очень важно быстро поместить животное обратно под носовой обтекатель после удара, чтобы захватить как можно больше распространения SD. В этой модели легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) записи в течение примерно 4 минут обычно достаточно для захвата всего SD. Однако при более тяжелых ЧМТ спонтанные СД могут генерироваться в результате повреждения тканей²⁸. Непрерывная визуализация может обнаружить эти спонтанные СД, но расширенная изофлурановая анестезия может затруднить наблюдение за высокочастотной депрессией. Спонтанные СД могут быть обнаружены с помощью электрофизиологии по дополнительным понижениям в высокочастотной активности, но подтвердить связь между депрессией и СД без визуализации сложно.

С развитием усилителей Open-Ephys и Intan электрофизиология in vivo теперь доступна многим лабораториям. Все электрофизиологические записи требуют имплантации черепных винтов и/или электродов. В этом протоколе существует двухдневный латентный период между имплантацией винтов черепа и записью для поддержки восстановления. Хотя этого периода может быть недостаточно для полного восстановления мозга после имплантации, повреждения должны быть минимальными, поскольку винты черепа не проникают в ткани мозга. Кроме того, прозрачность черепа, запечатанного цианоакрилатом, со временем снижается, поэтому визуализация должна быть выполнена как можно скорее для достижения оптимальной прозрачности. Для электрофизиологии крайне важно свести к минимуму шум с частотой 60 Гц. Убедитесь, что экспериментальная зона изолирована от сети переменного тока и правильно заземлена для подключения к усилителю Интана. Несмотря на то, что артефакты движения не могут быть полностью устранены, акселерометры на головном столике могут помочь определить и удалить периоды движения во время постобработки. В целом, эти методы могут дать ценную информацию о восстановлении СД и функционировании кортикальной сети после легких черепно-мозговых травм (ЧМТ).

Одним из ограничений этих методов является то, что животные находятся под анестезией во время визуализации. Тем не менее, большинство моделей ЧМТ требуют анестезии, и расширенная анестезия вряд ли существенно повлияет на план эксперимента. Изофлуран значительно снижает высокочастотную активность²⁷. Если экспозиция изофлурана выходит за рамки периода визуализации, это может затруднить обнаружение восстановления высокочастотной активности после SD. Таким образом, крайне важно включить в план эксперимента фиктивную или моноизофлуранную группу для сравнения восстановления высокочастотной активности, как показано на рисунке 2. Еще одним ограничением является то, что электрофизиологические записи не обнаруживают сдвиг постоянного тока. Амплитуда и продолжительность сдвига постоянного тока являются показателями здоровья тканей и восстановления после SD²⁸. Тем не менее, подтверждение SD с помощью этих методов все равно даст ценную информацию об исследованиях ЧМТ.

Все исследователи ЧМТ получат пользу от описанных здесь методов, поскольку весьма вероятно, что все модели ЧМТ вызывают распространяющуюся деполяризацию (СД). Область ЧМТ значительно выиграла бы от понимания роли СД в травме, прогрессировании травмы, нейроиммунной активации и восстановлении. Недавние исследования показывают, что СД способствуют поведенческому дефициту и могут быть основным механизмом неврологических нарушений ^5,7. Методы, изложенные в этом протоколе, помогут прояснить связь между ЧМТ и СД. Будущее применение этих методов может распространиться на другие области исследований, включая инсульт, эпилепсию и мигрень.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#00-90 x .118 Шуруп	US Micro Винт	00.90-118-M-SS-P, Amazon
диаметр 0.8 мм	сверло для печатных плат	WYTP21, Amazon
16-A	Headstage Intan	C3335
2,1 мм Микросверло с заусенцами	Fine Science Tools	19007-21
Усилитель переменного тока	Intan	RHD записывающая система
C57BL/6J мыши	Лаборатория Джексона	Jax#000664
CCD камера	Mightex	TCE-1304-U
Удлинительный объектив	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (бупренорфин с медленным высвобождением)	Midwest Veterinary Supply	Номер продукта 267.10000.3
Золотой соединительный штифт (женский)	A-M Systems	520100
Золотой соединительный штифт (мужской)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
Светодиодная панель Supon		L122t
MATLAB	MathWorks	Институциональный или индивидуальный код
Медицинский цианоакрилатный клей	MasterBond	MB287
Micro-Manager Камера Программное обеспечение	Изображение J	NA
Дрелка/полировка для ногтей	Makartt Дрель для ногтей Электрическая пилочка для ногтей	JD700
Omnetic connectors	Omnetics	A79014-001
RHX Программное обеспечение для сбора данных	Intan	NA
Нержавеющая сталь непокрытый провод (0,005")	A-M Systems	792800
Стереотаксическая рама	Kopf Intruments	1923-B
Соски 'холодного отверждения' стоматологический цемент	A-M системы	525000, 526000
XLR объектив камеры	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16