В данной работе описан метод нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения критических ретиноидов, участвующих в облегчении зрительной функции как в глазной, так и в системной ткани, в контексте системного поступления витамина А для получения эссенциального светочувствительного родопсинового хромофора 11-цис-ретиналь.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественный анализ пищевых метаболитов витамина А в глазных и неглазных тканях мышей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCRs) — это суперсемейство трансмембранных белков, которые инициируют сигнальные каскады путем активации своего G-белка при ассоциации с его лигандом. В зрении всех млекопитающих родопсин является GPCR, ответственным за инициацию каскада фототрансдукции. В фоторецепторах родопсин связывается с его хромофором 11-цис-ретиналь и активируется посредством светочувствительной изомеризации 11-цис-ретиналь в полностью транс-ретиналь, который активирует белок трансдуцина G, что приводит к каскаду фототрансдукции.
В то время как фототрансдукция хорошо изучена, процессы, которые участвуют в поступлении в глаз пищевых предшественников витамина А для 11-цис-ретинального поколения, а также заболевания, приводящие к нарушению этого снабжения, еще не до конца изучены. Как только предшественники витамина А всасываются в кишечнике, они хранятся в печени в виде ретиниловых эфиров и высвобождаются в кровоток в виде транс-ретинола, связанного с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4). Этот циркуляторный RBP4-ретинол будет абсорбироваться системными органами, такими как печень, легкие, почки и глаза. Следовательно, метод количественной оценки различных метаболитов витамина А в глазах и системных органах имеет решающее значение для изучения правильной функции родопсина GPCR.
В этом методе мы представляем комплексный метод экстракции и анализа для анализа витамина А в мышиной ткани. С помощью высокопроизводительного жидкостного хроматографического анализа в нормальной фазе все соответствующие изомеры ретинальдегидов, ретинолов и ретиниловых эфиров могут быть обнаружены одновременно в течение одного прогона, что позволяет эффективно использовать экспериментальные образцы и повышает внутреннюю надежность различных метаболитов витамина А в одном образце. С помощью этого комплексного метода исследователи смогут лучше оценить системное снабжение витамином А в функции родопсина GPCR.
Введение
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются одним из наиболее изученных и охарактеризованных суперсемейств известных белков. Выполняя свою наиболее известную функцию, GPCR служат рецептором клеточной поверхности при передаче сигнала, инициализируя внутриклеточные реакции при связывании с определенным лигандом. GPCR характеризуются семью трансмембранными (TM) спиральными доменами и шестью полными петлевыми доменами. Из шести петель три петли ориентированы внеклеточно, чтобы облегчить связывание лиганда, в то время как остальные три внутриклеточные петли связаны с гетеротримерным G-белком, состоящим из Gα, Gβ и Gγ субъединиц
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты (протокол # 2312-41637A) и проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Выполняйте все вытяжки в темное время суток, под тусклым красным светом для освещения. Помните об остаточном свете, излучаемом дисплеями приборов и светодиодами аксессуаров.
1. Генерация спектрофотометрических стандартных ретиноидов и генерация внешних стандартных кривых
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы использовали описанный выше метод для обнаружения и количественного определения ретиноидов в глазной и системной ткани мышей и создали репрезентативные хроматограммы. Мы дополнительно дадим краткое описание типичных ретиноидов, которые могут быть обнаружены в этих тканях.
В возрасте 6 месяцев мышей усыпляли с помощью удушенияСО2 . Для поддержания содержания глазных ретиноидов мыши были адаптированы к темноте в течение 2 дней до эвтаназии и экстракции. Два глаза, 0,2 г печен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом методе ВЭЖХ нормальной фазы используется для обнаружения и количественного определения соответствующих ретиноидов, включая ретиниловые эфиры, ретинальдегиды и ретинолы. Учитывая важность 11-цис-ретинала как важнейшего хромофора в активации родопсина GPCR, метод, который может обнаружить метаболиты, связанные с производством 11-цис-ретиналь, имеет решающее значение для изучения общей зрительной функции. Основное преимущество этого метода заключается в том, что все.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и частично стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L. Мы также хотели бы поблагодарить Национальный институт глаза за предоставление нам стандарта 11-цис-сетчатки, используемого в этой рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>реагент | |||
| 1-октанол, подходит для ВЭЖХ, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 203-917-6 | |
| 1,4-Диоксан, подходит для ВЭЖХ, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 204-661-8 | |
| 11-цис-ретинол | Национальный институт глаза | N/A | |
| 11-цис-ретинол | Toronto Research Chemicals | TRC-R252105 | |
| 13-цис-ретинол | Toronto Research Chemicals | TRC-R239900 | |
| 13-цис-ретинол | Toronto Research Chemicals | TRC-R252110 | |
| Полностью транс-ретинальный | Toronto Research Chemicals | TRC-R240000 | |
| полностью транс-ретинол | Toronto Research Chemicals | TRC-R252002 | |
| этилацетат, подходящий для ВЭЖХ, > 99,7% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 205-500-4 | |
| Гексан, класс ВЭЖХ | Fisher Scientific, Spectrum Chemical | 18-610-808 | |
| Метанол (ВЭЖХ) | Fisher Scienctific | A452SK-4 | |
| Ретинилпальмитат | Toronto Research Chemicals | TRC-R275450 | |
| Хлорид натрия (кристаллический/сертифицированный ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Instruments | |||
| 1260 Аналитический коллектор фракций Infinity II | Agilent | G1364F | |
| 1260 Двоичный насос Infinity II | Agilent | G7112B | |
| 1260 Детектор диодной матрицы Infinity II | Agilent | G7115A | |
| 1260 Многоколонный термостат Infinity II Agilent | G7116A | ||
| 1260 Флаконити II Пробоотборник | Agilent | G7129A | |
| ST40R Охлаждаемая центрифуга | Thermo Scientific | TSST40R | |
| Vacufuge Plus концентратор центрифуг | Eppendorf | 22820168 | |
| Расходные материалы | |||
| 2 мл Янтарные флаконы с завинчивающейся крышкой | Agilent | 5188-6535 | |
| Обжимной колпачок с перегородками из ПТФЭ/красной резины, 11 мм | Agilent | 5183-4498 | |
| Одноразовые стеклянные конические центрифужные пробирки | Millipore Sigma | CLS9950215 | |
| Пробирка с завинчивающейся крышкой, 15 мл | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Вкладыш для флаконов, 150 &; L, стекло с полимерными ножками | Agilent | 5183-2088 |
Ссылки
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459 (7245), 356-363 (2009).....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
