Фотобиомодуляция под электроэнцефалографическим контролем сна для стимуляции лимфатического выведения токсинов из мозга мышей

Краткое содержание

В данном исследовании представлена неинвазивная и портативная технология транскраниальной фотобиомодуляции под электроэнцефалографическим контролем для стимуляции лимфатического удаления токсинов (например, растворимого бета-амилоида) из мозга старых и не подвергавшихся анестезии самцов мышей BALB/c во время естественного глубокого сна.

Аннотация

Менингеальные лимфатические сосуды (MLV) играют важную роль в выведении токсинов из головного мозга. Разработка инновационных технологий стимуляции функций МЖВ является перспективным направлением в прогрессе лечения различных заболеваний головного мозга, связанных с аномалиями МЖВ, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, опухоли головного мозга, черепно-мозговые травмы, внутричерепные кровоизлияния. Сон – это естественное состояние, при котором процессы дренажа мозга наиболее активны. Поэтому стимуляция дренажа мозга и MLV во время сна может иметь наиболее выраженный терапевтический эффект. Однако таких коммерческих технологий в настоящее время не существует.

В данном исследовании представлена новая портативная технология транскраниальной фотобиомодуляции (tPBM) под электроэнцефалографическим (ЭЭГ) контролем сна, предназначенная для фотостимуляции выведения токсинов (например, растворимого бета-амилоида (Aβ)) из головного мозга стареющих мышей BALB/c с возможностью сравнения терапевтической эффективности различных оптических ресурсов. Технологию можно использовать в естественном состоянии домашней клетки без анестезии, сохраняя двигательную активность мышей. Эти данные открывают новые перспективы для разработки неинвазивных и клинически перспективных фототехнологий для коррекции возрастных изменений функций МЖВ и процессов дренирования мозга, а также для эффективного очищения тканей мозга от метаболитов и токсинов. Эта технология предназначена как для доклинических исследований функций спящего мозга, так и для разработки клинически значимых методов лечения заболеваний мозга, связанных со сном.

Введение

Менингеальные лимфатические сосуды (МЖВ) играют важную роль в выведении токсинов и метаболитов из тканей головного мозга ^1,2,3. Поражение МЖВ при различных заболеваниях головного мозга, включая опухоли, черепно-мозговые травмы, кровоизлияния, нейродегенеративные процессы, сопровождается снижением функций МЖВ, приводящим к прогрессированию этих патологий 1,2,3,4,5,6 . Таким образом, разработка методов стимуляции МЖВ открывает новые горизонты в появлении эффективных технологий лечения заболеваний головного мозга. Недавно была предложена неинвазивная технология эффективной транскраниальной фотобиомодуляции (tPBM) для стимуляции MLV и удаления токсинов, таких как кровь и Aβ из мозга 5,7,8,9,10,11,12. Интересно отметить, что глубокий сон является естественным фактором для активации лимфодренажных процессов в головном мозге^13,14. Исходя из этого факта, логично предположить, что tPBM MLV во время сна может оказывать более эффективные терапевтические эффекты, чем во время бодрствования 9,11,12,15. Тем не менее, в настоящее время не существует коммерческих технологий для tPBM во время сна¹⁶. Кроме того, эксперименты на животных для изучения терапевтических эффектов tPBM проводятся под наркозом, который необходим для точной доставки света в мозг. Однако анестезия существенно влияет на дренаж мозга, что снижает качество результатов исследований¹⁷.

Aβ является продуктом метаболизма нормальной нервной активности¹⁸. Как установлено в культивируемых корковых нейронах крыс, Aβ высвобождается из них с высокой скоростью во внеклеточное пространство (2-4 молекулы/нейрон/с для Aβ)¹⁹. Имеются данные о том, что растворенная форма Aβ, расположенная во внеклеточном и периваскулярном пространствах, наиболее токсична для нейронов и синапсов²⁰. Растворимый Aβ быстро выводится из головного мозга человека в течение 1-2,5 ч²¹. MLV представляют собой туннели для удаления растворимого Aβ из мозга ^1,7, который уменьшается с возрастом, что приводит к накоплению Aβ в старом мозге ^1,22. Существуют доказательства того, что внеклеточные аномалии уровня Aβ в мозге коррелируют с когнитивными способностями при старении и связаны с развитием болезни Альцгеймера (БА)^23,24. Поэтому старыми и старыми грызунами считаются альтернативы трансгенным моделям для изучения амилоидоза, в том числе AD^25,26.

В данном исследовании представлена оригинальная и портативная технология tPBM под электроэнцефалографическим (ЭЭГ) контролем глубокого или небыстрого сна (NREM) у мышей BALB/c без анестезии для стимуляции лимфатического клиренса Aβ из головного мозга в периферическую лимфатическую систему (глубокие шейные лимфатические узлы, dcLNs).

Протокол

Все процедуры проводились в соответствии с «Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию», Директивой 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях, и методическими указаниями Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (No 742 от 13.11.1984 г.), утвержденными Комиссией по биоэтике Саратовского государственного университета (протокол No 7, 22.09.2022).

1. Сборка метизов

1. Отрежьте кусок фольги текстолита толщиной 1,5 мм до размеров 1,5 мм х 2 мм. Эта деталь будет называться печатной платой (ПХД) на светодиодах (СИД) (рис. 1C).
2. Припаяйте светодиод к печатной плате, как показано на рисунке 1.
3. Припаяйте два многожильных медных провода к контактам светодиода, а затем накройте их гильзой.
4. Распечатать 3D модель рамы (Рисунок 1А); поместите светодиод (Рисунок 1B) и магниты (Рисунок 1D) на раму; Поместите шайбу (рисунок 1E) на голову мыши.
5. Чтобы собрать схему (рисунок 2), выполните следующие действия.
   1. Сначала подключите резистор (Рисунок 2; R1) между светодиодным анодом и портом 5 В на Arduino.
   2. Затем подключите светодиодный катод к металл-оксид-полупроводниковому полевому транзистору (МОП-транзистору) (рис. 2; Q1) слив. Затем подключите источник MOSFET к земле.
   3. Подключите понижающий резистор (Рисунок 2; R2) между затвором MOSFET и землей. Наконец, подключите затвор MOSFET к контакту 3 на Arduino.
6. Подключите к Arduino экран клавиатуры с жидкокристаллическим дисплеем (ЖК-дисплеем).
7. Распечатайте 3D-модели корпуса, крышки и кнопок. Вставьте плату Arduino с экраном ЖК-клавиатуры, MOSFET и разъемом для светодиодов в корпус, как показано на рисунке 3.

2. Руководство по программному обеспечению (Рисунок 4)

1. Загрузите скетч Arduino (файл .ino) и откройте его через интегрированную среду разработки Arduino (IDE) (Supplementary Coding File 1).
2. Выберите правильный коммуникационный порт (COM) и прошейте прошивку.
3. Интерфейс включает в себя две колонки. Используйте кнопки «Влево » и «Вправо » для навигации между этими столбцами. Индикатор выбора расположен слева от столбца.
4. В левом столбце на экране отображается поле выбора коэффициента заполнения для широтно-импульсной модуляции (ШИМ). С помощью кнопок «Вверх » и «Вниз » отрегулируйте рабочий цикл. Добейтесь 10/20/30 Dj/^см2 дозы PBM с соответствующим рабочим циклом 2%/4%/6% ШИМ за 17-минутный сеанс.
5. Правый столбец на экране — это поле RUN/Off. Чтобы выбрать этот столбец, нажмите правую кнопку на клавиатуре, а затем нажмите кнопку Выбрать. Когда процесс запущен, индикатор активности будет мигать, а текст на кнопке RUN изменится на OFF.
   ЗАМЕТКА. Мышей готовят к экспериментам в течение 10 дней, включая имплантацию электродов ЭЭГ, имплантацию хронического катетера в правый боковой желудочек для инъекции флуоресцентного Aβ и установку пластины для ПБМ.

3. Имплантация системы регистрации ЭЭГ (Рисунок 5)

1. Взвесьте мышь и обезболите ее смесью Золетила 100 и Ксиланита (100 мг/кг; 10 мг/кг соответственно) путем внутримышечного введения в бедро.
2. Когда рефлексы отвода задней ноги и реакция на щипки хвоста прекратятся, поместите мышь в стереотаксическую рамку над грелкой (рис. 5A).
3. Нанесите офтальмологическую мазь на веки, чтобы предотвратить пересыхание глазных яблок во время операции. Повторяйте эту процедуру при необходимости.
4. Выбрейте голову в области от носовых костей до затылочных костей с помощью бритвенного станка и сначала простерилизуйте открытые участки кожи спиртом.
5. С помощью прямых препарирующих ножниц срежьте кожу головы, проведите ее микрощипцами, очистите череп от фасции, высушите ватными палочками. При необходимости используйте кровоостанавливающие средства.
6. С помощью дрели диаметром 1,3 мм сделайте по 2 отверстия в височных костях с каждой стороны по координатам: AP = -1 мм для первой пары винтов и AP = -3 мм для второй пары винтов.
7. Поместите винты ЭЭГ с проводами в спирт на 5 минут. После этого поместите винты ЭЭГ в солевой раствор.
8. Поместите четыре посеребренных винта с электродами в отверстия на глубину 1 мм (рисунок 5Б).
9. Зафиксируйте винты на поверхности черепа с помощью стоматологического акрила так, чтобы выходящие из них электроды располагались по направлению к носу животного (рисунок 5С). Дайте стоматологическому акрилу застыть в течение 15 минут.
10. Прикрепите к носу животного датчик записи ЭЭГ с помощью стоматологического акрила. Дайте стоматологическому акрилу застыть в течение 30 минут (Рисунок 5D).
11. Поместите электроды ЭМГ на заднюю часть круговой мышцы глаза с помощью изогнутого пинцета и зафиксируйте их стоматологическим акрилом. Дайте стоматологическому акрилу застыть в течение 15 минут (Рисунок 5E).
12. Подключите электроды ЭЭГ к посеребренной выемке датчика и припаяйте их с помощью паяльной станции. После этого зафиксируйте электроды ЭЭГ с помощью стоматологического акрила (Рисунок 5F).
13. После операции поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела до тех пор, пока животное полностью не оправится от анестезии.
14. После этого поместите мышь в индивидуальную домашнюю клетку со свободным доступом к пище и воде с ибупрофеном (40 мг/кг в 200 мл воды) для обезболивания после операции на 10 дней.

4. Имплантация пластины для ПБМ

1. Взвесьте мышь и обезболите ее смесью Золетил 100 и Ксиланита (100 мг/кг; 10 мг/кг соответственно) путем внутримышечной инъекции в бедро через 7 дней после имплантации системы регистрации ЭЭГ.
2. Когда рефлексы отвода задней лапы и реакция на щипывание хвоста прекращаются, зафиксируйте мышь в стереотаксической системе.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на веки, чтобы предотвратить пересыхание глазных яблок во время операции. Повторяйте эту процедуру при необходимости.
4. Закрепить металлическую пластину диаметром 5 мм на затылочной кости черепа с помощью стоматологического акрила и щипцов Дюмона. Дайте стоматологическому акрилу застыть в течение 15 минут (Рисунок 6).

5. Подготовка хронического катетера

1. Отметьте на игле инсулина отрезок в 2 см от скошенного конца.
2. Зафиксируйте иглу инсулина в иглодержателе со стороны скошенного кончика к отмеченному сегменту.
3. Поместите полиэтиленовый катетер PE-10 диаметром 2 см по всей оставшейся длине иглы.
4. Заполните катетер физиологическим раствором и накройте его пластиковым колпачком, чтобы закрыть его.

6. Имплантация хронического катетера в правый боковой желудочек

1. После имплантации пластины для ПБМ с помощью дрели сделайте трепанационное отверстие с координатами AP = -0,5 мм и ML = 1,2 мм, диаметром 1,5 мм.
2. Поместите полиэтиленовый катетер PE-10 в стереотаксический держатель и вставьте его в череп мыши (DV = 2 мм). После этого зафиксируйте его с помощью стоматологического акрила. Дайте стоматологическому акрилу застыть в течение 15 минут (Рисунок 7).
3. После операции поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела до тех пор, пока животное полностью не оправится от анестезии.
4. После этого поместите мышь в индивидуальную домашнюю клетку со свободным доступом к пище и воде с ибупрофеном (40 мг/кг в 200 мл воды) для обезболивания после операции на 10 дней.

7. tPBM под контролем ЭЭГ NREM сна

1. Подключите любую коммерческую систему регистрации ЭЭГ к разъему на головке мыши и установите требуемое значение рабочего цикла ШИМ.
2. Следите за сигналом ЭЭГ и дождитесь активности дельта-ритма. Если наблюдается быстрый сон, запустите процесс PBM и остановите его, если NREM-сон переходит в быстрый сон или бодрствование. Доза увеличивается с каждым взаимодействием, пока не достигнет необходимого значения.
3. Когда необходимая доза PBM получена, сеанс заканчивается.

8. Конфокальная визуализация лимфатического удаления Aβ из мозга мыши

1. Подсоедините катетер длиной 10 см к инсулиновой игле.
2. С помощью шприца Гамильтона с иглой 29 G приготовьте инфузию флуоресцентного бета-амилоида (FAβ) в объеме 5 мкл в катетер. Оставьте катетер на шприце Гамильтона.
3. Зафиксируйте руку мыши и подсоедините катетер через иглу к имплантированному хроническому катетеру.
4. Подсоедините катетер к микроинъектору. После этого поместите мышь в отдельную коробку;
5. Выберите в меню микроинъектора скорость впрыска 0,1 μл/мин и нажмите кнопку «Пуск».
6. Сделайте инъекцию FAβ в правый боковой желудочек.
7. После введения FAβ необходимо провести ПБМ с помощью светодиода в течение 61 мин по алгоритму: 17 мин - свет и 5 мин - пауза в течение 61 мин.
8. После ПБМ внутривенно вводите любой индикатор для маркировки сосудов головного мозга через хвост.
9. После инъекции усыпить мышей с помощью камеры эвтаназии CO₂ .
10. С помощью острых прямых ножниц сделайте небольшой поперечный разрез на коже вдоль трахеи, придерживая кожу прямым неострым пинцетом.
11. Сделайте продольный разрез по всей длине шеи с помощью прямых ножниц.
12. С помощью изогнутого пинцета возьмите на себя слюнные железы и аккуратно отделите их от соединительной ткани. Поместите раневой ретрактор на открытый участок разреза и зафиксируйте его таким образом, чтобы отодвинуть окружающие ткани.
13. Осмотрите область между трахеей и клейдомосцевидной мышцей с помощью двух изогнутых пинцетов с обеих сторон шеи.
14. Когда с каждой стороны обнаружен глубокий шейный лимфатический узел (dcLN), снимите dcLN с помощью прямого пинцета с тупыми концами и вырежьте его из соединительной ткани.
15. Поместите dcLN в чашку Петри с солевым раствором и накройте их горизонтально ориентированным покровным стеклом (25 мм × 50 мм × 0,17 мм).
16. Используйте любой коммерческий конфокальный микроскоп для получения изображений целых dcLN.

9. Анализ Aβ в лизатах тканей головного мозга

1. Подготовьте образцы для проведения анализа.
   1. Усыпляйте мышей с помощью камеры эвтаназии CO₂ .
   2. Обезглавите мышь, снимите кожу с ее головы и удалите мышцы с черепа.
   3. Острыми прямыми ножницами сделайте два разреза от большого затылочного отверстия к слуховому проходу.
   4. С помощью прямого пинцета отделите вентральную часть черепа, затылочную кость и кости, образующие полости среднего уха.
   5. С помощью пинцета отделите мозг от теменной и лобной костей.
   6. С помощью прямых ножниц удалите верхнюю челюсть и срежьте обонятельные луковицы.
   7. Поместите мозг в физиологический раствор.
   8. Промойте мозг в холодном фосфатно-солевом буфере, чтобы тщательно удалить лишнюю кровь и взвесьте перед гомогенизацией.
   9. Приготовьте лизирующий буфер pH 7,2, содержащий 1,5 мм KH₂PO₄, 8 мм Na₂HPO₄, 3 мм KCl, 137 мм NaCl и 0,1% Tween20, 10 mM EDTA со свежеприготовленной смесью ингибиторов протеазы.
   10. Гомогенизируйте мозг в свежем буфере для лизиса (1 мл буфера для лизиса на образец ткани 200-500 мг) с помощью стеклянного гомогенизатора на льду.
   11. Полученную суспензию ультразвуком произведите с помощью ультразвукового дизраптора ячеек до тех пор, пока раствор не станет осветленным.
   12. Центрифугируйте гомогенаты при 10 000 × г в течение 5 минут.
   13. Соберите надосадочную жидкость с помощью одноканальной механической пипетки (100-1000 μл) и немедленно проанализируйте или аликвоту и храните при температуре ≤-20 °C.
2. Подготовьте следующие материалы: микропланшетный ридер с 450 нм ± фильтром 10 нм; микроцентрифужные пробирки; одноканальные или многоканальные пипетки с высокой точностью и одноразовыми наконечниками; абсорбирующая бумага для промокательной бумаги микропланшета; емкость для моющего раствора; 0,01 моль/л (или 1x) фосфатного буферного раствора (PBS); и деионизированная или дистиллированная вода.
3. Подготовьте реагенты.
   1. Перед использованием доведите компоненты набора и образцы до комнатной температуры (RT; 18-25 °C).
   2. Восстановите стандарт с помощью 1,0 мл стандартного разбавителя, подержите 10 минут при температурной терапии и осторожно встряхните (не до образования пены). Стандартный исходный раствор составляет 300 пг/мл. Приготовьте 5 пробирок, содержащих объем 0,6 мл стандартного разбавителя и сделайте тройной ряд разведения.
   3. Установите 5 точек (300 пг/мл, 100 пг/мл, 33,33 пг/мл, 11,11 пг/мл и 3,70 пг/мл) разбавленного стандарта, а последние пробирки с заготовкой, содержащей только стандартный разбавитель (0 пг/мл).
   4. Перед использованием быстро раскрутите исходные растворы реагента Detect A и реагента Detect B. Разбавьте их в 100 раз разбавлением разбавителя А и В для приготовления рабочей концентрации.
   5. Разбавьте 20 мл концентрированного раствора для промывки (30x) с 580 мл деионизированной или дистиллированной воды, чтобы получить 600 мл раствора для промывки (1x).
   6. Отсадите необходимую дозировку раствора с помощью стерилизованных наконечников, и не выливайте остатки раствора в флакон снова.
4. Проведите анализ.
   1. Определите лунки для разбавленного стандарта, бланка и пробы.
   2. Подготовьте 5 лунок для стандартных точек и одну лунку для заготовки.
      1. Добавьте по 50 мкл стандартного, бланкового и пробного разведений в соответствующие лунки соответственно. Затем сразу же добавьте 50 мкл реагента A в каждую лунку.
      2. Осторожно встряхните тарелку (рекомендуется использовать шейкер для микропланшетов) и накройте ее запечатывателем для тарелок. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 1 часа. Реагент обнаружения А может выглядеть мутным. Подогрейте раствор до температуры и аккуратно перемешайте до однородности.
   3. Отсадите раствор и промойте каждую лунку 350 μл 1x моющего раствора с помощью пульверизатора, многоканальной пипетки, дозатора коллектора или автоматической мойки. Оставьте тарелку в покое на 1-2 минуты. Прикрепите пластину к абсорбирующей бумаге, чтобы полностью удалить остатки жидкости из всех лунок. Повторите эту процедуру 3 раза.
   4. После последней промывки отоберите или сцедите остатки буфера для стирки. Обеспечьте полное удаление моющего раствора, перевернув пластину и промокнув ее на впитывающей бумаге.
   5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора реагента Б и инкубируйте планшет в течение 30 минут при температуре 37 °C, предварительно накрыв его герметиком для планшетов.
   6. Повторяйте этапы аспирации/промывки в общей сложности 5 минут.
   7. Добавьте 90 мкл раствора субстрата в каждую лунку и накройте пластину новым герметиком для планшетов. Инкубировать в течение 10-20 минут при температуре 37 °C (не более 30 минут) в защищенном от света месте. После добавления раствора субстрата жидкость станет синей.
   8. Добавьте по 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку, чтобы завершить реакцию. Добавление стоп-раствора сделает жидкость желтой. Постучите по тарелке на бок, чтобы перемешать жидкость. Если изменение цвета происходит неравномерно, осторожно постучите по пластине, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
   9. Обеспечьте полное удаление воды и отпечатков пальцев с нижней части пластины и отсутствие образования пузырьков на поверхности жидкости. Затем немедленно считайте показания пластины в считывателе микропланшетов на длине волны 450 нм.
5. Подсчитайте результаты.
   1. Определите среднее значение повторяющихся показаний для каждого стандарта, контроля и образца. Постройте стандартную кривую с логарифмической концентрацией Aβ 1-42 по оси y и поглощением по оси x.
   2. Нарисуйте кривую наилучшего вписывания через точки, которые можно определить с помощью регрессионного анализа.
   3. Если использовались разбавленные пробы, концентрацию, полученную по стандартной кривой, умножьте на коэффициент разбавления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения ИФА в данном исследовании использовался набор для определения Aβ 1-42.

Результаты

На первом этапе исследование было сосредоточено на установлении эффективной световой дозы (светодиод с длиной волны 1050 нм) для стимуляции лимфатического удаления флуоресцентного Aβ из мозга к dcLNs у бодрствующих взрослых (2-3 месяца, 26-29 г) самцов мышей BALB/c. Световые дозы были выбраны случайным образом как 10 Дж/^см2, 20 Дж/^{см2 и} 30 Дж/^см2 на основе наших предыдущих исследований влияния tPBM на удаление различных красителей и эритроцитов из мозга ^{7,8,9,10,11,12}. Результаты конфокальной визуализации, представленные на рисунке 8A-E, ясно демонстрируют дозозависимое влияние tPBM на лимфатическое удаление флуоресцентного Aβ из мозга в dcLNs. Установлено, что световая доза 30 Дж/^см2 является наиболее эффективной по сравнению со световыми дозами 10 Дж/^см2 и 20 Дж/^см2 из-за более высокой интенсивности флуоресцентного сигнала от Aβ в dcLN.

На втором этапе исследование было направлено на поиск длин волн, наиболее эффективных для лимфатической элиминации флуоресцентного Aβ из мозга взрослых (2-3 месяца, 26-29 г) бодрствующих мышей-самцов BALB/c с использованием портативных фотоплатформ с различными длинами световых волн (880 нм, 1050 нм, 1300 нм) и режимами (1050 нм в непрерывном и импульсном режимах) с одинаковой дозой (30 Дж/^см2). На рисунке 9A-E представлены результаты конфокальной визуализации dcLNs в испытуемых группах. Полученные данные показали, что длина волны света 1050 нм в импульсном режиме по сравнению с другими исследуемыми длинами волн (880 нм и 1300 нм) и длиной волны 1050 нм в непрерывном режиме обусловливают достоверно более высокую степень удаления флуоресцентного Aβ из мозга в dcLNs.

На заключительном этапе было изучено влияние светодиода с длиной волны 1050 нм в импульсном режиме на уровень растворимого Aβ в мозге старых мышей до и после 10-дневного курса tPBM под контролем ЭЭГ NREM и бодрствования. Иммуноферментный анализ показал, что содержание растворимого Aβ в мозге было достоверно выше у пожилых самцов мышей BALB/c (16-18 месяцев, 30-33 г) по сравнению со взрослыми самцами мышей BALB/c (2-3 месяца, 26-29 г). 10-дневный курс tPBM во время глубокого сна, но не во время бодрствования, эффективно снизил уровень растворимого Aβ в мозге старых мышей до уровня растворимого Aβ в мозге взрослых мышей (рис. 10).

Рисунок 1: Процесс сборки оборудования. (A) 3D-печатная рамка, (B) светодиод, (C) светодиодная печатная плата, (D) магниты, (E) металлическая шайба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Схема управления светодиодами. R1 - резистор регулирования тока, R2 - понижающий резистор для затвора МОП-транзистора, Q1 - n-канальный МОП-транзистор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: 3D-вид корпуса. (A) 3D-печатная накладка, (B) напечатанные на 3D-принтере кнопки, (C) экран ЖК-клавиатуры для Arduino, (D) Arduino, (E) 3D-печатный корпус, (F) разъем для светодиодов, (G) канал MOSFET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Программное обеспечение. (A) Кнопка выбора, (B) Левая кнопка, (C) Кнопка Вверх/Вниз , (D) Правая кнопка, (E) Индикатор выбора, (F) Поле выбора коэффициента заполнения ШИМ, (G) Поле RUN/OFF . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Имплантация системы регистрации ЭЭГ. (А) Подготовка черепа; (B) Имплантация винтов; (В) Фиксация винтов стоматологическим акрилом; (D) Фиксация датчика регистрации ЭЭГ; (E) Имплантация и фиксация электродов ЭМГ на задней части круговой мышцы глаза; (F) Припаянные электроды к посеребренной выемке датчика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Фиксация пластины для ПБМ на затылочной кости черепа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Имплантация хронического катетера в правый боковой желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Влияние различных доз светодиодов с длиной волны 1050 нм на лимфатическое удаление флуоресцентного Aβ из головного мозга в dcLNs. (A-D) Репрезентативные изображения dcLNs из контрольной группы (A) и группы PBM с (B) 10 Дж/см², (C) 20 Дж/см² и (D) 30 Дж/см²; (E) Количественный анализ накопления флуоресцентных Aβ в dcLNs из испытуемых групп (n = 8, односторонний ANOVA с апостериорным тестом Дункана, **p < 0,01, *p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Влияние различных длин волн светодиодов на лимфатическое удаление флуоресцентного Aβ из мозга в dcLNs. (A-D) Репрезентативные изображения dcLNs из группы PBM с импульсной модой 1050 нм (ImpMode_1050, A), 880 нм (ImpMode_880, B), 1300 нм (ImpMode_1300, C) и непрерывной модой 1050 нм (ContMode_1050 нм, D); (E) Количественный анализ накопления флуоресцентного Aβ в dcLNs из испытуемых групп (n = 8, односторонний ANOVA с апостериорным критерием Дункана, **p < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10: Эффекты PBM (светодиод 1050 нм в импульсном режиме, 30 Дж/^см2) во время NREM и в бодрствующем состоянии на уровне растворимого Aβ (пг/мл) в мозге мышей взрослых и старых мышей. Односторонняя ANOVA с апостериорным тестом Дункана, **p < 0,01, *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Файл дополнительного кодирования 1: lcd1key.ino Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

MLV являются важной мишенью для разработки инновационных технологий модуляции дренажа мозга и удаления клеточного мусора и отходов жизнедеятельности из мозга, особенно у пожилых людей, у которых функция MLV снижается ^1,22. В гомеостатическом состоянии глубокий сон связан с естественной активацией очищения тканей мозга ^13,14. Поэтому очевидно ожидать, что стимуляция MLV во время глубокого сна будет более эффективной, чем во время бодрствования^15,16. Представлена новая неинвазивная и портативная технология tPBM под контролем ЭЭГ сна для стимуляции лимфатического удаления растворимого Aβ из мозга старых мышей-самцов.

Небольшие размеры фотоплатформы (7 мм х 11 мм) и ее небольшой вес (1 г) позволяют прочно и надежно закрепить ее на головах мышей, сохраняя их естественную двигательную активность. Это также исключает необходимость использования анестезии во время tPBM. ТПБМ во время глубокого сна может быть выполнена с помощью любого коммерческого устройства для ЭЭГ-контроля стадий сна. Таким образом, наша технология позволяет проводить исследование в домашней клетке, сохраняя максимально естественные условия для животных.

На первом этапе был случайным образом выбран светодиод с длиной волны 1050 нм для изучения эффективной дозы фотоэффектов на лимфатическое удаление флуоресцентного Aβ из мозга к dcLNs у бодрствующих взрослых мышей (в возрасте 2-3 месяцев). Выбор этой длины волны связан с предыдущими данными об эффективной стимуляции MLV лазером с длиной волны 1267 нм 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34. Эта длина волны способствует прямому образованию синглетного кислорода в небольших количествах в тканях мозга и в его мозговых оболочках, что является одним из механизмов, лежащих в основе PBM MLV ^8,28,34. Тем не менее, биологические эффекты как лазера с длиной волны 1267 нм, так и светодиода с длиной волны 1050 нм связаны с генерацией синглетного возбуждения кислорода³⁵. Действительно, полосы лазера с длиной волны 1267 нм ± 20 нм и светодиода с длиной волны 1065 нм ± 15 нм связаны с образованием синглетного кислорода из основного состояния молекулы кислорода. Полоса лазера с длиной волны 1267 нм закачивает молекулу кислорода непосредственно в первое возбужденное синглетное состояние, в то время как полоса светодиода с длиной волны 1065 нм соответствует дополнительной вибрационной энергии, которая очень быстро затухает, выделяя тепло в окружающую среду. Более того, водопоглощение на длине волны 1065 нм в десятки раз меньше, чем на длине волны 1267 нм, что делает ее более благоприятной для биологических исследований³⁵. Кроме того, светодиод с длиной волны 1050 нм коммерчески доступен на рынке и намного дешевле по сравнению с редким и дорогим лазером с длиной волны 1267 нм. Обратите внимание, что полоса излучения используемого светодиода с длиной волны 1050 нм в этом исследовании была шириной 40 нм, и она лишь частично перекрывается с синглетной кислородной полосой. Тем не менее, мы продемонстрировали значительное влияние tPBM на лимфатическое удаление флуоресцентного Aβ из мозга в dcLNs с использованием светодиода с длиной волны 1050 нм (30 Дж/^см2). Световая доза 30 Дж/^см2 была определена как наиболее эффективная по сравнению со световыми дозами 10 Дж/^см2 и 20 Дж/^см2 на основании более высокой интенсивности флуоресцентного сигнала от Aβ в dcLN. Таким образом, светодиод с длиной волны 1050 нм может быть очень полезен для применения метода tPBM к человеку, что согласуется с общей тенденцией использования светодиодов вместо лазеров для PBM^36,37.

На втором этапе исследование было направлено на то, чтобы ответить на вопрос о том, какие длины световых волн наиболее эффективны для лимфатической элиминации флуоресцентного Aβ из мозга взрослых бодрствующих мышей. Данный этап исследования выполнен с использованием портативной фотоплатформы с различными длинами волн света (880 нм, 1050 нм, 1300 нм) и режимами (1050 нм в непрерывном и импульсном режимах) с одинаковой дозой (30 Дж/^см2). Эти длины волн были выбраны в связи с широким использованием в клинической практике tPBM (880 нм) и новых дорогостоящих светодиодов (1300 нм), которые потенциально могут быть клинически значимыми. Кроме того, сравнивались импульсный и непрерывный режимы только для светодиода с длиной волны 1050 нм в качестве светового ресурса. Эти данные ясно демонстрируют, что только светодиод с длиной волны 1050 нм в импульсном режиме по сравнению с другими длинами волн и 1050 нм в непрерывном режиме вызывает значительное лимфатическое удаление Aβ из мозга в dcLNs. Эти результаты согласуются с выводами других исследователей, которые также указывают на преимущество использования импульсного PBM для эффективного достижения биологических эффектов 38,39,40.

На заключительном этапе, когда были выбраны эффективная длина волны, доза и режим, было проведено исследование влияния светодиода с длиной волны 1050 нм в импульсном режиме на уровень растворимого Aβ в мозге старых мышей до и после 10-дневного курса tPBM под контролем ЭЭГ NREM и бодрствования. Иммуноферментный анализ показал, что содержание растворимого Aβ в мозге было достоверно выше у старых мышей (16-18 месяцев) по сравнению со взрослыми мышами (2-3 месяца). Интересно отметить, что 10-дневный курс tPBM во время глубокого сна, но не во время бодрствования, эффективно снижал уровень растворимого Aβ в мозге старых мышей до уровня растворимого Aβ в мозге взрослых мышей. Увеличение содержания Aβ в тканях мозга здоровых мышей и крыс с возрастом отмечено и в других исследованиях^25,26, что может быть связано с возрастным снижением функций MLV, приводящим к неэффективному очищению мозговой ткани от этого токсичного белка ^1,22. Более эффективное tPBM удаления растворимого Aβ из ткани мозга у спящих мышей по сравнению с бодрствующими можно объяснить естественной активацией дренажа мозговой ткани во время сна. Морфология MLV значительно меняется с возрастом, что приводит к снижению лимфатического удаления метаболитов из стареющего мозга²². Тем не менее, tPBM во время сна помогает восстановить лимфатическое удаление растворимого Aβ из мозговой ткани стареющих мышей до уровня взрослых животных.

Учитывая рассеяние световой энергии при прохождении через череп, tPBM ограничивает свое воздействие только на MLV, не проникая глубоко в ткани мозга. Однако, несмотря на то, что лимфатические сосуды до сих пор не обнаружены непосредственно в тканях мозга человека и животных, появляется все больше данных, указывающих на наличие лимфатической системы головного мозга 41,42,43,44. Это объясняет результаты, показывающие выведение токсинов (крови и Aβ) из глубинных структур мозга (желудочковой системы, гиппокампа) в MLV и далее на периферию (dcLNs)^5,7. В течение столетия накапливались знания, указывающие на тесную связь между дренажем мозга и периферической лимфатической системой⁴⁵. Даже при отсутствии общепризнанной лимфатической сети в центральной нервной системе существуют факты, указывающие на лимфатическое удаление макромолекул из глубоких отделов мозга на периферию ^{1,2,3,4,5,6,7} Это также объясняет, почему tPBM, действуя только на MLV, стимулирует выведение крови и Aβ из мозга^{5, 7}.

Таким образом, в данном исследовании представлена портативная технология tPBM под контролем ЭЭГ сна, предназначенная для фотостимуляции выведения токсинов на примере растворимого Aβ из мозга старых мышей с возможностью сравнения терапевтической эффективности различных оптических ресурсов. Технологию можно использовать в естественном состоянии домашней клетки без анестезии, сохраняя естественную двигательную активность мышей. Эти данные открывают новые перспективы для развития неинвазивных и клинически перспективных фототехнологий для коррекции возрастных изменений функций MLV и процессов дренирования мозга, а также для эффективного очищения тканей мозга от метаболитов и токсинов. Предложенная технология фотостимуляции дренажа мозга и лимфатического выведения токсинов из мозга имеет ограниченное воздействие на MLV из-за рассеяния световой энергии при прохождении через череп. Таким образом, технология может быть использована для разработки новых методов лечения заболеваний головного мозга, связанных с дисфункцией MLV. Наиболее выраженные стимулирующие фотоэффекты на MLV наблюдаются при глубоком (NREM) сне, который требует использования PBM под контролем ЭЭГ. Это создает определенные трудности (технические, программные) для одновременного контроля наступления глубокого сна и подачи светового воздействия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,1% Tween20	Helicon,  Россия	SB-G2009-100ML
Катетер	Scientific Commodities Inc., США	PE-10, 0,28 мм ID & раз; 0,61 мм OD
CO2 камера	Binder, Германия	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon,	Япония A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Польша-Россия	Villacryl S, V130V4Z05
Дрель	Фордом, Россия	SR W-0016
Пинцет Dumont	Stoelting, США	52100-07
Эванс Синий краситель	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США 206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Швейцария	29 G игла
Ибупрофен	Синтез ОАО, Россия	N/A	Обезболивающий препарат
Инсулин игла	INSUPEN, Италия	31 г, 0,25 мм х 6 мм
Левомеколь антибактериальная мазь	Нижфарм	D06C	Для наружного применения в дозе 40 мг/г, 1 раз в сутки
Микрощипцы	Stoelting, США	52102-02P
Микроцентрифуга	Gyrozen, Южная Корея	GZ-1312
Микроинъектор	Stoelting, США	53311
Неострый пинцет	Stoelting, США	52108-83P
Система PINNACLE	Pinnacle Technology, США	8400-K3-SL	Система для записи ЭЭГ (2 канала) и ЭМГ (1 канал)
мышей Бритвенный аппарат	Braun	Series 3310s
Одноканальные и многоканальные пипетки	Eppendorf, Австрия	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Хлорид натрия	Красфарма, Россия	Н/Д
Паяльная станция	AOYUE, Китай	Н/Д
Стереотаксическая рама	Stoelting, США	51500
Прямые ножницы для пресечения	Stoelting, США	52132-10P
Тетрациклин	АО Татхимфармпрепараты, Россия	Н/Д	Глазная мазь
Пинцет	Stoelting, США	52100-03
Ультразвуковой клеточный разрушитель	Biobase, Китай	USD-500
Раневой ретрактор	Stoelting, США	52125
Xylanit	Nita-Farm, Россия	Н/Д	Миорелаксант
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, Франция	Н/Д	Общая анестезия