Методическая статья

Методология изучения взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и белка опсина с их лигандами в формировании белка ретинилидена

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67036

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы описываем два количественных метода изучения белок-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецепторного опсина с соответствующими физиологическими лигандами.

Аннотация

Распределение витамина А/полностью транс-ретинола (ROL) в организме имеет решающее значение для поддержания функции ретиноидов в периферических тканях и выработки белка ретинилидена для зрительной функции. RBP4-ROL представляет собой комплекс ROL с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4), который присутствует в крови. Два мембранных рецептора, рецептор 2 ретинола, связывающий белок 4 (RBPR2) в печени и ретинол ретиноевой кислоты 6 (STRA6) в глазу, связываются с циркуляторным RBP4, и этот механизм имеет решающее значение для интернализации ROL в клетки. Разработка методов исследования кинетики рецептор-лиганд имеет важное значение для понимания физиологической функции рецепторов витамина А для ретиноидного гомеостаза. Используя анализы поверхностного плазмонного резонанса (SPR), мы можем проанализировать аффинность связывания и кинетические параметры мембранных рецепторов витамина А с его физиологическим лигандом RBP4.

Эти методологии могут раскрыть новую структурную и биохимическую информацию о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, что имеет решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А. В глазу интернализованный ROL метаболизируется в 11-цис-ретиналь, зрительный хромофор, который связывается с опсином в фоторецепторах с образованием белка ретинилидена, родопсина. Поглощение света вызывает цис-в-транс-изомеризацию 11-цис-сетчатки, индуцируя конформационные изменения родопсина и последующую активацию каскада фототрансдукции. Снижение концентраций сывороточного и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, может вызвать неправильную локализацию родопсина, накопление апопротеинов опсина, куриную слепоту и дегенерацию внешних сегментов фоторецепторов, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера.

Таким образом, спектрофотометрические методики для количественного определения комплекса сетчатки, связанного с G-белком опсин-11-цис, в сетчатке имеют решающее значение для понимания механизмов дегенерации клеток сетчатки при вышеупомянутых патологических состояниях. С помощью этих всеобъемлющих методологий исследователи смогут лучше оценить поступление витамина А с пищей в поддержание системного и глазного ретиноидного гомеостаза, который имеет решающее значение для генерации и поддержания концентрации белка ретинилидена в фоторецепторах, что имеет решающее значение для поддержания зрительной функции у человека.

Введение

Полученный с пищей витамин А/полностью транс-ретинол/ROL является важным компонентом, играющим роль в зрительной функции 1,2. Хромофор 11-цисного сетчатки, метаболит пищевого витамина А, связывается с опсином, связанным с G-белком (GPCR), для выработки ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах. Когда свет попадает на глаз, конфигурация родопсина претерпевает фундаментальные изменения за счет преобразования его 11-цис-ретинального компонента в полностью транс-ретинальный. Это изменение конфигурации запускает каскад фототрансдукции внутри палочковых фоторецепторов, преобразуя свет в электрический сигнал, который передается в зрительную кору головного мозга через зрительный нерв 3,4,5,6,7,8,9,10 . Снижение концентрации ROL в сыворотке крови и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, вызывает неправильную локализацию опсина, накопление апопротеина опсина, куриную слепоту и дегенерацию фоторецепторных OS, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера, что может привести кслепоте 3,10.

Полностью транс-ретинол является основной транспортной формой пищевого витамина А и источником, из которого получают все функциональные ретиноиды и пищевые метаболиты витамина А. Печень служит основным органом для накопления витамина А с пищей. Ретинол печени транспортируется через сыворотку крови в виде комплекса с ретинолсвязывающим белком 4 (RBP4). RBP4, экспрессируясь в первую очередь в печени, образует голокомплекс с субстратом ретинола и транстиретином (TTR), который поступает в кровоток 11,12,13,14,15,16,17. Сообщение о рецепторе клеточной поверхности для RBP4 в 1970-х годах привело к гипотезе о мембранных транспортных белках, способствующих транспортировке ретиноидов внутрь и из клеток. Рецептор клеточной поверхности для RBP4-связанного ретинола (RBP4-ROL) был идентифицирован как STimulated ретиноевой кислотой 6 ретинолом (STRA6) в пигментном эпителии сетчатки (RPE) глаза. STRA6 связывается с циркуляторным голо-RBP4-комплексом и перемещает RBP4-связанный ретинол через РПЭ для использования фоторецепторами18,19. Мутации в STRA6 могут привести к множеству заболеваний и фенотипов, связанных со снижением концентрации ROL в глазах. Мутации STRA6 во время развития могут привести к анофтальмии, микрофтальмии и другим неглазным симптомам, которые перекрываются с фенотипами, связанными с синдромом Мэтью-Вуда 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 экспрессируется в различных органах и тканях, таких как РПЭ в глазу, но не во всех тканях26,27. Хотя основным местом хранения ретиноидов является печень, STRA6 не экспрессируется в печени.

Алапатт и его коллеги обнаружили, что рецептор 2 ретинолсвязывающего белка 4 (RBPR2) связывает RBP4 с высоким сродством и отвечает за поглощение RBP4-связанного ретинола в печени, подобно STRA6 в RPE28. Сообщалось, что RBPR2 имеет общую структурную гомологию с STRA6 29,30,31. Предполагается, что RBP4 связывается с остатками S294, Y295 и L296 на RBPR2, аминокислот-связывающем домене, частично консервативном между RBPR2 и STRA6, а также 29,30,31. В этих исследованиях было установлено, что мембранные рецепторы витамина А, такие как STRA6 и RBPR2, которые содержат один или несколько внеклеточных связывающих остатков/доменов, взаимодействуют с циркуляторным RBP4-ROL. Таким образом, мембранные рецепторы играют важную роль в связывании рецептора с циркуляторным RBP4 для интернализации ROL в ткани-мишени, такие как печень и глаз.

В первой части этого исследования мы использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR) для изучения взаимодействия двух мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP431. Аффинность связывания и кинетику ассоциации/диссоциации белка к комплексам лигандов можно измерить в режиме реального времени с помощью SPR. Эта методология была направлена на получение критически важной кинетической, структурной и биохимической информации о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, которые имеют решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А 31,32. Как упоминалось выше, циркуляторный ROL интернализуется в RPE через STRA6 для генерации хромофора 11-цисного сетчатки, который связывается с опсином для генерации ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах33. Мы использовали методологии спектрофотометрии для количественной оценки GPCR-опсина и его лиганда 11-цис-комплекса сетчатки в лизатах сетчатки мышей, что имеет решающее значение для понимания механизмов восстановленного белка ретинилидена, родопсина, при пигментном ретините или врожденном амаврозе Лебера при патологических состояниях глаза34. В целом, эти протоколы могут быть применены для изучения in vitro физиологических последствий мутантных RBP4, STRA6 или RBPR2 во влиянии на системный и глазной гомеостаз витамина А или влияния мутантного родопсина или белков ретиноидного цикла на зрительную функцию35,36.

Протокол

1. Методология поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

  1. Приготовление и очистка мышиного белка RBP4
    1. Разработка праймеров для генерации полноразмерной кДНК мыши RBP4 (msRBP4) (референсная последовательность NCBI: NM_001159487.1). Клонировать кДНК msRBP4 в вектор экспрессии pET28a His-tag Kanamycin-resistant и экспрессировать в клетках BL-21 DE3 (Таблица материалов).
    2. Компетентные клетки BL-21 DE3 (в соответствии с протоколом производителя) трансформируют с помощью лигированного вектораRBP4-pET28a и затем наносят на агаровые планшеты бульона Лурии-Бертани (LB), содержащие канамицин 50 мкг/мл30,37. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе и проведите скрининг на положительные колонии на следующий день.
    3. Выберите одну колонию и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в 5 мл бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл.
    4. Для вторичной культуры в 500 мл LB бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл, используют 1% объем первичной культуры (с шага 1.1.3.) и инкубируют при 37 °C в течение 3-4 ч; Проверьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра. В идеале, если значение OD составляет от 0,6 до 1, следует приступать к стимуляции белка с помощью 0,5 мМ IPTG при 24 °C в течение ночи.
    5. Используйте несколько концентраций IPTG в диапазоне 0,1–1 мМ и 16–30 °C для оптимизации экспрессии и стабильности msRBP4.
    6. Центрифугируйте культуру (начиная с шага 1.1.5.) при 16 000 × г в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и держите гранулу на льду.
    7. Гомогенизируйте гранулу буфером для лизиса (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% глицерина, 0,5 мМ PMSF и ингибиторами протеазы [pH 8,0]). Ультразвуком обрабатывайте лизат в течение 15 с ON и 30 s OFF с помощью гомогенизатора с выходной мощностью 250 Вт и выходной частотой 40-50% 20 кГц. Повторите 5 раз.
    8. Удалите остатки клеток и нелизированные клетки центрифугированием при 16 000 × г в течение 20 минут. Пропустите надосадочную жидкость лизата через буферно-уравновешенную колонку никелевого NTA.
    9. Промыть колонку буфером для лизиса (с шага 1.1.8), содержащим 30 мМ имидазола.
    10. Во фракциях элюируют связанный белок msRBP4 с помощью буфера, содержащего 250 мМ имидазола. Запустите элюированные фракции и визуально контролируйте количество белка с помощью 12% полиакриламидного геля SDS, окрашенного Coomassie Brilliant Blue R-250 в растворе метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10) и удалите пятна раствором без окрашивания Coomassie метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10).
    11. Объедините неиспользованные фракции и диализуйте объединенные фракции с помощью диализной кассеты 10K емкостью 10 кДа MWCO.
    12. Оцените качество диализованной фракции на 12% геле SDS-PAGE и количественно определите концентрацию белка.
      Примечание: В анализе SPR использовался белок Apo-RBP4. Для получения голо-RBP4 (RBP4-ретинола) см. подробные протоколы, опубликованные в других местах36,37.
  2. Первичная валидация пептидов RBPR2 и STRA6 с RBP4 на структуру и взаимодействие с помощью флуоресцентного анализа триптофана и спектроскопии кругового дихроизма (CD)
    1. Флуоресцентный анализ триптофана
      1. Используйте онлайн-инструмент для анализа состава белка (https://web.expasy.org/protparam/) и вставьте аминокислотную последовательность в однобуквенный код, чтобы оценить структурный состав рекомбинантного белка RBP4 и отдельных пептидов RBPR2 и STRA6, чтобы определить остатки аминокислот триптофана в отдельных пептидах и белке (Таблица материалов).
      2. Нажмите кнопку «Вычислить параметры» и оцените аминокислотный состав для остатков триптофана (Trp).
        Примечание: Остатки триптофана должны присутствовать в отдельных анализируемых пептидах или белках.
      3. Отдельные пептиды RBPR2 и STRA6 разбавляют в различных микромолярных концентрациях и инкубируют по отдельности с 3 мкг мс RBP4в 96-луночном планшете при комнатной температуре в течение 5 минут. Возбуждайте микс на длине волны 290 нм и сканируйте излучение в диапазоне от 300 нм до 400 нм.
      4. Нормализуйте данные с помощью Blank (только буфер, без пептида и белка) и условия контроля пептида (без белка) и построите график.
        Примечание: Увеличение флуоресценции триптофана при воздействии низкой или высокой концентрации пептидов предполагает положительное взаимодействие между двумя отдельными пептидами и белком RBP4.
    2. Спектроскопия кругового дихроизма (CD)
      1. Разбавьте отдельные пептиды и рекомбинантный белок RBP4 в 1x PBS буфере, pH 7,0. Используйте различные концентрации пептидов RBPR2 и STRA6 и белка RBP4 от 0,1 до 10 мкг/мл для проверки качества, как описано ниже.
      2. Добавьте отдельные разведенные пептиды и белок в кювету длиной 0,1 см и измерьте абсорбцию/эллиптичность CD с помощью CD-спектрофотометра (195-250 нм). Используйте приведенную ниже формулу для расчета средней эллиптичности остатков (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S представляет сигнал CD в mθ; mRw представляет собой среднюю массу остатка; c представляет собой концентрацию белка в мг/мл; а l представляет длину пути в см.
      3. Рассчитайте процентное изменение структуры молекулы с помощью анализа вторичной структуры BeStSel для прогнозирования сворачивания белка с помощью CD-спектроскопии (https://bestsel.elte.hu).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичная структура указывает на правильную сворачиваемость и сохранение подтверждений, имеющих решающее значение для исследования взаимодействия и результата взаимодействий. Изучите предсказанную структуру домена и перейдите к дальнейшему исследованию взаимодействия.

2. Анализ SPR для определения аффинности связывания и кинетических параметров мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP4

  1. Для иммобилизации RBP4 на настройке поверхности чипа CM5 мы используем чип датчика SPR, который несет удлиненный до размера ~100 нм карбоксиметилдекстран, ковалентно прикрепленный к золотой поверхности. В присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS) превращает карбоксильные группы на поверхности чипа в эфиры N-гидроксисукцинимида, которые спонтанно реагируют с аминогруппами аминокислот и белков, заставляя лиганд ковалентно связываться с поверхностью чипа (Таблица материалов).
    1. Иммобилизуйте очищенный белок msRBP4 на сенсорном чипе (рис. 1 и рис. 2). В меню «Выполнить» выберите «Мастер» и перейдите к опции иммобилизации. Разведите лиганд (белок msRBP4, полученный на стадии 1.1) в иммобилизационном буфере (10 мМ буфера ацетата натрия, pH 5,0) до 10 мкг/мл (4 мкл лиганда + 396 мкл буфера) и аликвотируйте связывающие реагенты во флаконах. Откройте окно мастера настройки иммобилизации из программного управления, выберите CM5 Chip и опцию Immobilize flow cell 2 and target level 1,200 Response Unit (RU) для достижения Rmax 30 RU в кинетическом исследовании и растворе Wash: Ethanolamine. Введите имя RBP4 и нажмите Далее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: Диалоговое окно «Подготовка системы » для параметра «Подготовка к запуску » не требуется, если ранее была выполнена грунтовка с помощью буфера PBST (фосфатно-буферный солевой раствор с 0,05% раствором моющего средства Tween 20).
    2. В диалоговом окне Положение стойки нажмите кнопку Извлечь стойку. Возьмите штатив и поместите флаконы с назначенными объемами для каждого реагента: 156 мкл msRBP4, 177 μл этаноламина, 89 μL EDC, 89 μL NHS и пустой флакон. Вставьте штатив с флаконами с образцами и нажмите OK и Next.
    3. В диалоговом окне "Подготовка протокола выполнения " нажмите кнопку "Пуск" и "Сохранить".
  2. Установка для кинетического анализа пептидов RBPR2 и STRA6
    1. Последовательно разбавляют мышиные пептиды RBPR2, мутантные RBPR2 и STRA6 (химически синтезированные ранее31 и перечисленные в таблице материалов) в рабочем буфере в диапазоне 0,8-26,6 мкМ.
    2. Откройте управляющее программное обеспечение и выберите мастер Kinetics/Affinity. Нажмите «Файл» | Откройте шаблон и выберите Kinetics/Affinity. Введите в диалоговое окно последовательности впрыска путь потока 2-1 (активная ячейка потока 2 и ячейка потока 1 как эталонная), проверьте тип микросхемы CM5 и нажмите кнопку Далее. В диалоговом окне настройки установите флажок Запускать циклы запуска, введите Решение: буфер и циклы: и нажмите Далее.
    3. В диалоговом окне параметров впрыска введите значения параметров образца : время контакта: 120 с, расход 30 мкл/мин, время диссоциации 300 с; для параметров регенерации : введите название раствора для регенерации: Glycine-HCl (pH 2,5), время контакта: 30 с, расход: 30 мкл/мин и нажмите Далее.
    4. В диалоговом окне образцов введите название пептидов, молекулярную массу и концентрацию, а затем нажмите кнопку «Далее». В диалоговом окне «Положение штатива» назначьте разведенные пептиды в виде отдельных образцов объемом ~120 мкл различных концентраций от 1 до 100 мкМ и ~230 мкл буфера, ~120 мкл буфера и ~1 000 мкл глицина с pH 2,5 к позициям на штативе. Нажмите «Извлечь штатив» и вставьте все флаконы. Нажмите кнопку Next и в диалоговом окне Prepare Run Protocol нажмите кнопку Start, введите имя файла и нажмите кнопку Save (рисунок 2).
    5. В программном обеспечении щелкните меню «Пуск » и выберите «Оценка». Откройте файл в программном обеспечении и в выпадающем меню выберите Fc2-1 для анализа сенсорной граммы Reference cell Blank-subtracted Active на наличие фаз ассоциации и диссоциации пептидов msRBP4 и мутантных msRBPR2 и msSTRA6.
    6. Нажмите на выпадающую кнопку Kinetics/Affinity и выберите Surface bound; чтобы открыть диалоговое окно «Выбрать кривые », отметьте галочкой столбец «Включить» в таблице и нажмите «Далее». Выберите диалоговое окно «Данные », чтобы отобразить пустые и вычтенные сенсорные граммы; нажмите Кинетика и сходство, оставьте параметры по умолчанию, а затем нажмите Опция подгонки для подгонки кривой. Проверьте вкладку Отчет на наличие константы равновесной диссоциации Kd и Ka или Kпо скорости ассоциации и скорости диссоциации Kd или Koff . Сохраните сенсорную диаграмму данных Kinetics в формате с разделителями.txt табуляторами и используйте значения для построения графиков (рис. 3).
    7. Чтобы определить константу кинетики сродства Kd (концентрация лиганда, которая связывается с половиной рецепторов в равновесии), скопируйте и вставьте столбцы данных в файл формата .txt, сгенерированный на основе графика Evaluation to XY, используемого в программном обеспечении. Нажмите кнопку Анализ и нелинейная регрессия (аппроксимация кривой), проверьте столбец данных и нажмите кнопку ОК. В диалоговом окне параметров нажмите Насыщенность привязки и Модель подгонки привязки для одного сайта с формулой:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Где Bmax — максимальное количество сайтов связывания (единица ответа), X — концентрация пептидов, а Y — единица связывания (единица ответа) (рис. 3).

3. Методология спектрофотометрии для количественного определения комплекса белка сетчатки GPCR-11-цис (ретинилиденбелка родопсина) в лизатах сетчатки

  1. Транспортировка заранее определенной группы мышей, состоящей из взрослых мышей WT-C57BL/6J, в темную комнату.
  2. В темноте адаптируйте мышей на ночь в течение 12-16 часов, а при красном свете поместите мышь в камеру эвтаназии и откройте газовый клапан CO2 на регуляторе до 5 л/мин на ~5 минут. Обеспечить смерть путем надавливания на отведенную назад шею и хвост (шейный вывих).
  3. Энуклеируйте глазные шарики и гомогенизируйте глаза в ледяном буфере, содержащем 20 мМ бис-трис пропана (1,3-бис (трис(гидроксиметил)метиламино)пропана; BTP) pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы (Таблица материалов).
  4. Центрифугируйте гомогенат в течение 15 мин при 16000 x g при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, содержащую водорастворимые цитозольные белки. Ресуспендировать и солюбилизировать гранулированные мембранные и мембранные белки в буфере, содержащем 20 мМ n-додецил-β-d-мальтозид (ДДМ), 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы в течение 1 ч при 4 °С на вращающейся платформе.
  5. Центрифугирование резолюбилизированной мембранной фракции в течение 1 ч при 16000 x g, 4 °C. Смешайте надосадочную жидкость с 30 мкл гранул антител Rho 1D4 и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C на вращающейся платформе.
  6. С помощью магнитной подставки отделите пулдаун с помощью шариков, выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 500 мМ NaCl и 2 мМ ДДМ.
  7. Разбавляют белок родопсина путем инкубации в течение 5-10 мин при комнатной температуре с буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 2 мМ DDM, содержащего 0,2 мг/мл пептида 1D4 (-TETSQVAPA) (рис. 4 и рис. 5).
  8. Проанализируйте элюирование на поглощение от 200 нм до 800 нм с помощью прямоугольной, субмикромикро, кварцевой, апертуры 2 мм, длины пути 10 мм, кюветы 50 мкл в условиях быстрого сканирования с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только высококачественные кюветы из кварца (Рисунок 4).
  9. Чтобы проверить и определить качество, проверьте и подвергните элюирование воздействию яркого света в течение 1 минуты, затем повторите шаг 3.8.
  10. Вычтите абсорбцию Бланка и рассчитайте отношение анализируемых спектров поглощения с абсорбцией при 500 нм для 11-цисцис-связанного опсина сетчатки, 380 нм для полностью транс связанного с ретиналью опсина и 280 нм для безлигандного белка Apo-Opsin (рис. 6). Свободный опсин без лиганда ретиналь дает базовую абсорбцию при длине волны 500 нм.
  11. Чтобы количественно определить концентрацию родопсина, используйте закон Бера-Ламберта:
    А=ε· C·l или C=A/ε·l
    Где A — поглощение, ε коэффициент молярного угасания (родопсин ε500 = 40 600 M−1 см−1 для свободного Apo Opsin ε280 = 81 200 M−1 см−1), C — концентрация, а длина пути l — длинна.
  12. Для количественного определения лигандид-опсина в процентах используйте соотношение A280/A500.
  13. Построим график спектров поглощения с вычитанием из пустого поля и вычислим значение свободного опсина32.
  14. Рассчитайте концентрацию родопсина с использованием коэффициента экстинкции ε500 = 40600 М−1 см−1. Концентрация безлигандного опсина рассчитывается с помощью закона Бера-Ламберта с использованием коэффициента экстинкции ε280 = 81 200 М−1 см−1.

Результаты

Описаны количественные методы изучения белково-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецептора опсина с соответствующими физиологическими лигандами. Рекомбинантный мышиный RBP4 должен экспрессироваться в E. coli и очищенном белке, используемом в качестве конъюгированного лиганда на чипе SPR. Химически синтезированный RBPR2, STRA6 и мутантный S294A RBPR2 «SYL мотив RBP4 взаимодействующий внеклеточный сайт» пептида аминокислоты с содержанием ~40 используется в качестве аналита в различных концентрациях для измерения кинетики связывания и равновесного насыщения Kd взаимодействия (рис. 1 и рис. 2).

Рекомбинантный белок RBP4, являющийся лигандом для RBPR2 и STRA6, показал аффинность связывания по отношению к взаимодействующим сайтам в этих пептидах, измеренную при Kd ~22,38 мкМ и ~26,73 мкМ соответственно. Аминокислотный мотив "SYL" играет важную роль в стабилизации этих взаимодействий как в RBPR2, так и в STRA6, и, как и предполагалось, мутантный пептид S294A имел повышенный Kd на ~114,9 мкМ, что указывает на повышенное число копий мутантного пептида RBPR2 для достижения насыщения связывания (рис. 3). Поглощение ретинола в глазу через STRA6 и превращение в различные ретиноиды с конечным превращением 11-цис-сетчатки в хромофор со связыванием с остатком родопсина 296 образует функциональный рецептор для восприятия фотонов и зрения. 11-цис-ковалентное связывание сетчатки с белком опсином с образованием родопсина проявляет определенные характерные абсорбционные особенности. Абсорбция белка происходит на длине волны 280 нм, а абсорбция свободного ретинола — на длине волны ~325 нм. Тем не менее, холо-опсин с абсорбцией 11-цис-ретинала или родопсина происходит на длине волны 500 нм.

Любой дефект этого сложного образования из-за низкого системного ретинола или дефекта поглощения ретинола мутацией в RBPR2 или STRA6 приводит к накоплению свободного опсина или апопротеина опсина, лишенного хромофора 11-цисного сетчатки, изменяя характерные сдвиги абсорбции на низкую абсорбцию при 500 нм. Количественно оценив поглощение и используя соотношение поглощения 280 нм и длины волны 500 нм, можно оценить лигандированные опсины или родопсин. С помощью кратковременного воздействия света можно перепроверить фотоизомеризацию абсорбции 11-цис-ретинального связанного опсина на длине волны 500 нм с полностью транс-ретинально-связанной абсорбции опсина (родопсина Meta II) на длине волны 380 нм (рис. 4, рис. 5 и рис. 6). В экспериментальной установке вероятность появления артефактов и загрязняющих веществ высока; двумя основными источниками обнаруженных артефактов являются непреднамеренное воздействие света от инструментов и промывка солями в низкой концентрации, при которой молекулы загрязняющих веществ не удаляются из РПЭ или хрусталика (рис. 7).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочее пространство поверхностного плазмонного резонанса. Необходимые материалы и обзор контрольно-измерительных приборов SPR. (A) Погрузочная площадка SPR Chip. (А') CM5 Чип с ковалентно присоединенной поверхностью из карбоксиметилированного декстрана золота для иммобилизации через группы -NH2, -SH, -CHO, -OH или -COOH. (B) Роботизированная инжекторная стойка для загрузки проб. (B') резиновые колпачки типа 3. (B'') пластиковые флаконы 7 мм для аликвот для образцов. (К,Г) Уравновешивающий/работающий буферный резервуар и резервуар для сбора отходов. (E) Программная панель управления Biacore. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематический обзор поверхностного плазмонного резонанса и этапы получения сенсорных диаграмм. Шаг 1: Поверхность чипа CM5 иммобилизуется белком RBP4 с целью 1200 единиц отклика. Шаг 2: Пептиды RBPR2 в различных концентрациях используются в качестве аналитов, и это биомолекулярное взаимодействие изменяет плотность заряда электронов на поверхности золотого чипа, что приводит к изменению/уменьшению отражения света под определенным углом или резонансным углом. Шаг 3: Промывка обращает вспять явление поверхностного плазмона, что приводит к изменению интенсивности отражения и падению сенсорной граммы до базовой линии. Кинетика этих взаимодействий в дальнейшем использовалась для определения констант диссоциации ассоциаций и силы взаимодействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Исследования поверхностного плазмонного резонанса отдельных пептидов рецептор-связывающего домена витамина А с его физиологическим лигандом RBP4. (A) Программная подсказка, показывающая достигнутую иммобилизацию RBP4 на поверхности чипа CM5. (Б,В,Г) Сенсограммы взаимодействий пептид-лиганд RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 и мутантного S294A RBPR2-RBP4 в различных концентрациях. (B',C',D') Определение кинетики связывания и равновесия Kd , показывающее различие и близость характера связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Иллюстрация 4: Рабочее пространство для поглощения сетчатки Opsin-11-cis и обзор приборов. (A) Охлаждаемая настольная центрифуга, все светодиодные индикаторы покрыты красной лентой; (Б) спектрофотометр УФ-видимого диапазона, один светодиодный индикатор, обтянутый красной лентой; (В') Прямоугольная ультрамикроячейка, кварцевая кювета и магнитная подставка. (C) Сканирование прикладного программного обеспечения; (D) Крышка отсека спектрофотометра открывается, держатель кюветы для анализа и крышка отсека закрывается. (E) Настройка выключения света с выключенным монитором для подготовки образцов при использовании одного источника красного света. (F) Охлаждаемый ротатор для пробоподготовки и солюбилизации. (G) Настройка выключения света с включенным монитором для измерения поглощения образца. (H) Анализ поглощения в XY-графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Обзор рабочего процесса методики абсорбции сетчатки Opsin-11-cis. Шаг 1: Сетчатка мышей, адаптированных к темноте, под одним источником красного света изолируется, гомогенизируется и солюбилизируется для получения фракций мембраны сетчатки. Шаги 2-4: В последовательности центрифугирования гранулы растворяются в отсутствие моющего средства и в присутствии буфера моющего средства ДДМ. Шаги 5-6: Солюбилизированная гранула, содержащая фоторецепторы сетчатки и другие мембранные белки, готова к удалению и очистке антител. Шаг 7: Элюированный опсин с использованием пептида VAPA 1D4 готов к анализу абсорбции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Спектры поглощения родопсина. (A) Темный адаптированный экстракт сетчатки мышей с использованием 1D4 очищенного родопсина с пиковой абсорбцией 500 нм, и (B) Экстракт сетчатки под воздействием света с использованием 1D4 очищенного родопсина с пиковой абсорбцией 380 нм. (В) Вестерн-блоттинг с использованием антител к родопсину 1D4, показывающий качество очистки родопсина и распределение по размерам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Артефакт спектров поглощения родопсина. (A) Артефакт в спектрах поглощения адаптированного к темноте экстракта глаз показан с пиком поглощения на 380 нм; Непреднамеренное воздействие света от светодиодных индикаторов прибора или выход из строя блокиратора света темной двери комнаты приводит к обесцвечиванию белка родопсина. (B) Недостаточное количество промывок с высоким содержанием солевых буферов приводит к накоплению загрязняющих веществ из СИЗОД, хрусталиков или других источников из глазного экстракта, что приводит к высокому распространению спектра поглощения и артефактам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Схематическое изображение взаимодействия между мембранными рецепторами витамина А (RBPR2 и STRA6) и белком опсина с их соответствующими лигандами (RBP4 и 11-цис-ретиналь), критически важными для генерации белка ретинилидена в фоторецепторах зрительной функции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Интенсивность флуоресценции собственного триптофана. Предварительные данные о взаимодействии и изменении ориентации собственных триптофановых остатков RBP4 при взаимодействии с различными концентрациями пептидов RBPR2 и STRA6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: RBPR2 и RBP4 белок-белковая стыковка и взаимодействие. Остатки на границе раздела визуализируются в PyMOL, а ориентация RBPR2 в мембране визуализируется с помощью серверного инструмента https://opm.phar.umich.edu/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Конвейер для анализа in silico белок-белкового стыковочного взаимодействия и возможных контактных сайтов. Конвейер анализа демонстрирует последовательность выполнения скрипта Python и использования командной строки PyMOL с шагов 1 по 6, обеспечивая надежность получения сайтов взаимодействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Анализ вторичной структуры с помощью CD-спектроскопии, показывающий состав пептидов RBP4, RBPR2 и STRA6. Круговая диаграмма показывает доли вторичных структур, присутствующих в молекуле. С помощью инструмента BeStSel Secondary Structure был проведен анализ прогнозирования белковых складок с помощью спектроскопии кругового дихроизма (https://bestsel.elte.hu). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Методология SPR
Моделирование in silico и анализ докинга: Для исследования стыковки29,31 следует использовать предсказанную структуру RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) и STRA6, а также известную структуру базы данных PDB MSRBP4 (RSCB PDB ID: 2wqa). Кроме того, методы in vitro (клеточная культура) должны быть использованы для подтверждения взаимодействия предполагаемых сайтов связывания на рецепторах витамина А (RBPR2 и STRA6) с его лигандом (RBP4)29,31 (дополнительный рисунок S1, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3). Определяют качество пептидов с помощью CD-спектроскопии. Ранее для спектра ДК в дальнем УФ-диапазоне использовали прямоугольную ячейку размером 1 мм 0,1 мкг/мкл ~200 мкл (3-4 мкг белка RBP4, 32 мкм RBPR2 и 32 мкМ пептидов STRA6)31 (дополнительный рисунок S4). Поток газообразного азота должен использоваться для предотвращения вредного озонообразования при воздействии ксеноновых ламп и снижения фонового поглощения на длине волны 200-300 нм. Используя параметр по умолчанию, спектр был измерен от 185 нм до 300 нм. Базовая линия должна быть скорректирована путем вычитания с помощью Blank. Содержание альфа-спирали и бета-листа рассчитывается на основе свойства поглощения, такого как отрицательные пики альфа-спирали на длине волны 222 нм.

Проанализируйте данные о белках RBPR2 и STRA6 и топологических доменах в базе данных (https://www.uniprot.org), подтвердите ранее известные возможные сайты взаимодействия из внеклеточных областей и используйте последовательность ~40-50 аминокислот для химического синтеза пептидов. Для изучения рецептор-лигандных взаимодействий 18,19,29,31 требуется очищенный рекомбинантный мышиный белок RBP4 (ms RBP4) и химически синтезированные пептиды RBPR2 и STRA6, охватывающие предполагаемые остатки связывания RBP4. Перед включением пептидов в короткий список необходимо определить внеклеточную пептидную последовательность взаимодействующих белков рецептора витамина А с помощью анализа in silico (компьютерный докинг белков-лигандов)31. Анализ SPR проводится для понимания кинетики рецептор-лигандных взаимодействий. Крайне важно знать прогнозируемые места взаимодействия с помощью компьютерных анализов in silico или анализа in vitro. В этом исследовании разработанный пептид отсылает к внеклеточной области мембранных белков RBPR2 и STRA6, которые, как известно, взаимодействуют с RBP4. Чтобы обеспечить точные результаты и предотвратить потенциальные артефакты и отрицательные сенсорные граммы SPR, крайне важно стандартизировать буферы, концентрации пептидов и растворимость. Для исследований абсорбции родопсина выделение лизата сетчатки требует строгих условий темноты и этапов промывки, чтобы избежать артефактов и нежелательных пиков абсорбции (Рисунок 7).

Чтобы понять важность мотива SYL на транспортерах витамина А в связывании RBP4, RBPR2, STRA6 и мутантного S294A-RBPR2, пептиды31 были химически синтезированы с использованием реакции конденсации карбоксильных и аминогрупп между двумя аминокислотами. Протокол следовал за точным ступенчатым добавлением последовательных аминокислот в якорную смолу. В процессе синтеза аминокислот происходит химическая модификация защиты и снятия защиты N-концевого аминокислотного звена, что позволяет осуществлять синтез и образование пептидного полимера. После завершения пептид извлекается из смолы и очищается. Первоначальная валидация взаимодействия белка RBP4 и пептидов рецептора витамина А должна быть подтверждена с помощью внутреннего флуоресцентного анализа триптофана и проверена с помощью CD-спектрометра (дополнительный рисунок S1). Исходное качество взаимодействия рекомбинантного белка RBP4 с мышиным STRA6 (msSTRA6), мышиным RBPR2 (msRBPR2) и контрольными пептидами должно быть подтверждено с помощью внутреннего флуоресцентного анализа триптофана (дополнительный рисунок S1). Анализ собственной флуоресценции триптофана является важнейшей экспериментальной процедурой для оценки гашения или усиления остатков аминокислот триптофана в белках для флуоресценции при связывании рецептора и лиганда. Измеренная флуоресценция является прямым показателем изменения локальной среды в результате взаимодействия.

Модификации и устранение неполадок в методах
Оптимизируйте SPR с помощью работающих буферов: 1x фосфатно-солевой буфер (Tween 20) или 1x HEPES (P20). Чтобы избежать образования осадка, разведенные пептиды перед использованием следует центрифугировать и отфильтровать. Стандартизируйте абсорбцию родопсина с помощью различных буферов с высоким содержанием солей (300-500 мМ NaCl). Чтобы подтвердить пики поглощения родопсина в темноте на длине волны 500 нм, подвергните образцы воздействию света в течение 30 с и повторите измерение, чтобы убедиться в качестве сдвига пика поглощения до 380 нм и эффективности вытягивания.

Ограничения методов
SPR может предоставить специфическую информацию о взаимодействии двух белков; Однако, если для взаимодействия требуется третий неизвестный компонент, данные могут стать сложными для понимания. Изменение конформации молекулы останется неизвестным во взаимодействии. Поскольку белок RBP4 получают в отсутствие ретинола (apo-RBP4), измеряется связывание apo-RBP4 с его рецепторами. Таким образом, RBP4, загруженный ретинолом (holo-RBP4), может иметь измененное сродство к рецепторам RBPR2 и STRA6 по сравнению с apo-RBP435,36. Интересно, что сродство к апо- и голо-RBP4 к STRA6 ранее было показано в обоих микромолярных диапазонах, и статистической разницы между связываниями апо- и голо-RBP4 с рецептором STRA635 не наблюдалось. Методология абсорбции родопсина позволяет определить наличие нелигандированного опсина (апопротеина опсина) в глазу, но не может определить причинный механизм.

Спектры поглощения родопсина
КРИТИЧЕСКАЯ КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА: Фотоизомеризация 11-цис-сетчатки в полностью транс-ретиналь является высокочувствительной и мгновенной32. Количественное определение родопсина (холо-опсина) следует проводить в строгих условиях темноты для измерения надлежащего содержания опсина и 11-цис-сетчатки в темноте (500 нм) или в условиях, адаптированных к освещению, как Мета II Родопсин (380 нм)32. Поэтому мышей следует адаптировать к темноте в темном помещении в течение 12-16 часов, чтобы измерить неотбеленный родопсин32. Для этого темная комната должна быть полностью темной, входная дверь должна быть закрыта светонепроницаемой тканью, а внешние светодиодные источники света на всем оборудовании покрыты красной лентой. Накройте экран ноутбука красной пластиковой пленкой и держите закрытым до тех пор, пока не потребуется. Также требуется верхний источник красного света.

КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Стандартизируйте этапы промывки при различных высоких концентрациях солей, чтобы удалить белки хрусталика или RPE или молекулы, которые имеют поглощение на длине волны 300–500 нм и потенциально могут мешать измерению поглощения опсина.

Значение методов по отношению к существующим/альтернативным методам
Не существует осуществимого подхода к изучению системного использования ретиноидов, вклада нескольких тканей и влияния мутаций в рецепторах ретинол-связывающего белка на механизмы распределения ретинола. В этом протоколе используются два основных метода для понимания и восполнения недостающих связей в истощении ретинола в фоторецепторах с помощью Apo-Opsin и использования ретиноидов печени через взаимодействия рецептор-лиганд RBPR2-RBP4 (рис. 3, рис. 6 и рис. 8).

Важность и потенциальные возможности применения метода в конкретных областях исследований
SPR и спектроскопии родопсина на основе абсорбции обеспечивают значимую стратегию для изучения механизмов системного и глазного гомеостаза витамина А для производства белка ретинилидена (родопсина). Таким образом, эти методы и экспериментальные подходы могут пролить свет на кинетику мембранно-рецептор-зависимого транспорта пищевых ретиноидов через печень и в глаз, способствуя выработке родопсина (рис. 8). Они также помогают понять механизмы и глазные последствия мутаций в рецепторах витамина А и белках опсина, особенно в связывании с их соответствующими лигандами. Эти взаимодействия могут влиять на выработку белка ретинилидена, который имеет решающее значение для зрительной функции.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; при сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи или при принятии решения о публикации результатов.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Беату Ястшебску, доктора философии (факультет фармакологии, Университет Кейс Вестерн Резерв, штат Огайо) за ее советы по протоколу абсорбции родопсина. Эта работа была поддержана грантом NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и, частично, стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-D Quant KitCytiva80648356
Комплект аминных соединенийCytivaBR100050
Программное обеспечение для оценки BiacoreBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris пропанSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 компетентные элементыThermo Научныйспектрофотометр EC0114
CDJascoJ-815 Спектрополяриметр
Глицин HCLБиореагентыФишера BP381-1
GraphPad Prism Моделирование подгонки, анализ данных
LB бульонFisher BioreagentsBP1426-500
n-додецил-&бета;-d-мальтозид (ДДМ)EMD Millipore324355-1GM2-20 мМ
pET28a His-tag Kanamycin-resistant вектор экспрессии Addgene69864-3
Набор для очистки плазмидQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K кассета для диализаThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000,05%
УФ по сравнению со спектрофотометромAgilent Cary 60 UV-Vis
Пептид названиеPeptide sequenceHPLC-purity>Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Соответствует
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Соответствует
мышиному Rbpr2 мутантному S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Соответствует

Ссылки

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи