Методическая статья

Методология изучения взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и белка опсина с их лигандами в формировании белка ретинилидена

DOI:

10.3791/67036

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем два количественных метода изучения белок-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецепторного опсина с соответствующими физиологическими лигандами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распределение витамина А/полностью транс-ретинола (ROL) в организме имеет решающее значение для поддержания функции ретиноидов в периферических тканях и выработки белка ретинилидена для зрительной функции. RBP4-ROL представляет собой комплекс ROL с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4), который присутствует в крови. Два мембранных рецептора, рецептор 2 ретинола, связывающий белок 4 (RBPR2) в печени и ретинол ретиноевой кислоты 6 (STRA6) в глазу, связываются с циркуляторным RBP4, и этот механизм имеет решающее значение для интернализации ROL в клетки. Разработка методов исследования кинетики рецептор-лиганд имеет важное значение для понимания физиологической функции рецепторов витамина А для ретиноидного гомеостаза. Используя анализы поверхностного плазмонного резонанса (SPR), мы можем проанализировать аффинность связывания и кинетические параметры мембранных рецепторов витамина А с его физиологическим лигандом RBP4.

Эти методологии могут раскрыть новую структурную и биохимическую информацию о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, что имеет решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А. В глазу интернализованный ROL метаболизируется в 11-цис-ретиналь, зрительный хромофор, который связывается с опсином в фоторецепторах с образованием белка ретинилидена, родопсина. Поглощение света вызывает цис-в-транс-изомеризацию 11-цис-сетчатки, индуцируя конформационные изменения родопсина и последующую активацию каскада фототрансдукции. Снижение концентраций сывороточного и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, может вызвать неправильную локализацию родопсина, накопление апопротеинов опсина, куриную слепоту и дегенерацию внешних сегментов фоторецепторов, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера.

Таким образом, спектрофотометрические методики для количественного определения комплекса сетчатки, связанного с G-белком опсин-11-цис, в сетчатке имеют решающее значение для понимания механизмов дегенерации клеток сетчатки при вышеупомянутых патологических состояниях. С помощью этих всеобъемлющих методологий исследователи смогут лучше оценить поступление витамина А с пищей в поддержание системного и глазного ретиноидного гомеостаза, который имеет решающее значение для генерации и поддержания концентрации белка ретинилидена в фоторецепторах, что имеет решающее значение для поддержания зрительной функции у человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полученный с пищей витамин А/полностью транс-ретинол/ROL является важным компонентом, играющим роль в зрительной функции 1,2. Хромофор 11-цисного сетчатки, метаболит пищевого витамина А, связывается с опсином, связанным с G-белком (GPCR), для выработки ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах. Когда свет попадает на глаз, конфигурация родопсина претерпевает фундаментальные изменения за счет преобразования его 11-цис-ретинального компонента в полностью транс-ретинальный. Это изменение конфигурации запускает каскад фототрансдукции внутри палочковых фоторецепторов, преобразуя свет в электрический сигнал, который передается в зрительную кору головного мозга через зрительный нерв 3,4,5,6,7,8,9,10 . Снижение концентрации ROL в сыворотке крови и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, вызывает неправильную локализацию опсина, накопление апопротеина опсина, куриную слепоту и дегенерацию фоторецепторных OS, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера, что может привести кслепоте 3,10.

Полностью транс-ретинол является основной транспортной формой пищевого витамина А и источником, из которого получают все функциональные ретиноиды и пищевые метаболиты витамина А. Печень служит основным органом для накопления витамина А с пищей. Ретинол печени транспортируется через сыворотку крови в виде комплекса с ретинолсвязывающим белком 4 (RBP4). RBP4, экспрессируясь в первую очередь в печени, образует голокомплекс с субстратом ретинола и транстиретином (TTR), который поступает в кровоток 11,12,13,14,15,16,17. Сообщение о рецепторе клеточной поверхности для RBP4 в 1970-х годах привело к гипотезе о мембранных транспортных белках, способствующих транспортировке ретиноидов внутрь и из клеток. Рецептор клеточной поверхности для RBP4-связанного ретинола (RBP4-ROL) был идентифицирован как STimulated ретиноевой кислотой 6 ретинолом (STRA6) в пигментном эпителии сетчатки (RPE) глаза. STRA6 связывается с циркуляторным голо-RBP4-комплексом и перемещает RBP4-связанный ретинол через РПЭ для использования фоторецепторами18,19. Мутации в STRA6 могут привести к множеству заболеваний и фенотипов, связанных со снижением концентрации ROL в глазах. Мутации STRA6 во время развития могут привести к анофтальмии, микрофтальмии и другим неглазным симптомам, которые перекрываются с фенотипами, связанными с синдромом Мэтью-Вуда 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 экспрессируется в различных органах и тканях, таких как РПЭ в глазу, но не во всех тканях26,27. Хотя основным местом хранения ретиноидов является печень, STRA6 не экспрессируется в печени.

Алапатт и его коллеги обнаружили, что рецептор 2 ретинолсвязывающего белка 4 (RBPR2) связывает RBP4 с высоким сродством и отвечает за поглощение RBP4-связанного ретинола в печени, подобно STRA6 в RPE28. Сообщалось, что RBPR2 имеет общую структурную гомологию с STRA6 29,30,31. Предполагается, что RBP4 связывается с остатками S294, Y295 и L296 на RBPR2, аминокислот-связывающем домене, частично консервативном между RBPR2 и STRA6, а также 29,30,31. В этих исследованиях было установлено, что мембранные рецепторы витамина А, такие как STRA6 и RBPR2, которые содержат один или несколько внеклеточных связывающих остатков/доменов, взаимодействуют с циркуляторным RBP4-ROL. Таким образом, мембранные рецепторы играют важную роль в связывании рецептора с циркуляторным RBP4 для интернализации ROL в ткани-мишени, такие как печень и глаз.

В первой части этого исследования мы использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR) для изучения взаимодействия двух мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP431. Аффинность связывания и кинетику ассоциации/диссоциации белка к комплексам лигандов можно измерить в режиме реального времени с помощью SPR. Эта методология была направлена на получение критически важной кинетической, структурной и биохимической информации о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, которые имеют решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А 31,32. Как упоминалось выше, циркуляторный ROL интернализуется в RPE через STRA6 для генерации хромофора 11-цисного сетчатки, который связывается с опсином для генерации ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах33. Мы использовали методологии спектрофотометрии для количественной оценки GPCR-опсина и его лиганда 11-цис-комплекса сетчатки в лизатах сетчатки мышей, что имеет решающее значение для понимания механизмов восстановленного белка ретинилидена, родопсина, при пигментном ретините или врожденном амаврозе Лебера при патологических состояниях глаза34. В целом, эти протоколы могут быть применены для изучения in vitro физиологических последствий мутантных RBP4, STRA6 или RBPR2 во влиянии на системный и глазной гомеостаз витамина А или влияния мутантного родопсина или белков ретиноидного цикла на зрительную функцию35,36.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Методология поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

  1. Приготовление и очистка мышиного белка RBP4
    1. Разработка праймеров для генерации полноразмерной кДНК мыши RBP4 (msRBP4) (референсная последовательность NCBI: NM_001159487.1). Клонировать кДНК msRBP4 в вектор экспрессии pET28a His-tag Kanamycin-resistant и экспрессировать в клетках BL-21 DE3 (Таблица материалов).
    2. Компетентные клетки BL-21 DE3 (в соответствии с протоколом производителя) трансформируют с помощью лигированного вектораRBP4-pET28a и затем наносят на агаровые планшеты бульона Лурии-Бертани (LB), содержащие канамицин 50 мкг/мл30,37. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе и проведите скрининг на положительные колонии на следующий день.
    3. Выберите одну колонию и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в 5 мл бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл.
    4. Для вторичной культуры в 500 мл LB бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл, используют 1% объем первичной культуры (с шага 1.1.3.) и инкубируют при 37 °C в течение 3-4 ч; Проверьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра. В идеале, если значение OD составляет от 0,6 до 1, следует приступать к стимуляции белка с помощью 0,5 мМ IPTG при 24 °C в течение ночи.
    5. Используйте несколько концентраций IPTG в диапазоне 0,1–1 мМ и 16–30 °C для оптимизации экспрессии и стабильности msRBP4.
    6. Центрифугируйте культуру (начиная с шага 1.1.5.) при 16 000 × г в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и держите гранулу на льду.
    7. Гомогенизируйте гранулу буфером для лизиса (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% глицерина, 0,5 мМ PMSF и ингибиторами протеазы [pH 8,0]). Ультразвуком обрабатывайте лизат в течение 15 с ON и 30 s OFF с помощью гомогенизатора с выходной мощностью 250 Вт и выходной частотой 40-50% 20 кГц. Повторите 5 раз.
    8. Удалите остатки клеток и нелизированные клетки центрифугированием при 16 000 × г в течение 20 минут. Пропустите надосадочную жидкость лизата через буферно-уравновешенную колонку никелевого NTA.
    9. Промыть колонку буфером для лизиса (с шага 1.1.8), содержащим 30 мМ имидазола.
    10. Во фракциях элюируют связанный белок msRBP4 с помощью буфера, содержащего 250 мМ имидазола. Запустите элюированные фракции и визуально контролируйте количество белка с помощью 12% полиакриламидного геля SDS, окрашенного Coomassie Brilliant Blue R-250 в растворе метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10) и удалите пятна раствором без окрашивания Coomassie метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10).
    11. Объедините неиспользованные фракции и диализуйте объединенные фракции с помощью диализной кассеты 10K емкостью 10 кДа MWCO.
    12. Оцените качество диализованной фракции на 12% геле SDS-PAGE и количественно определите концентрацию белка.
      Примечание: В анализе SPR использовался белок Apo-RBP4. Для получения голо-RBP4 (RBP4-ретинола) см. подробные протоколы, опубликованные в других местах36,37.
  2. Первичная валидация пептидов RBPR2 и STRA6 с RBP4 на структуру и взаимодействие с помощью флуоресцентного анализа триптофана и спектроскопии кругового дихроизма (CD)
    1. Флуоресцентный анализ триптофана
      1. Используйте онлайн-инструмент для анализа состава белка (https://web.expasy.org/protparam/) и вставьте аминокислотную последовательность в однобуквенный код, чтобы оценить структурный состав рекомбинантного белка RBP4 и отдельных пептидов RBPR2 и STRA6, чтобы определить остатки аминокислот триптофана в отдельных пептидах и белке (Таблица материалов).
      2. Нажмите кнопку «Вычислить параметры» и оцените аминокислотный состав для остатков триптофана (Trp).
        Примечание: Остатки триптофана должны присутствовать в отдельных анализируемых пептидах или белках.
      3. Отдельные пептиды RBPR2 и STRA6 разбавляют в различных микромолярных концентрациях и инкубируют по отдельности с 3 мкг мс RBP4в 96-луночном планшете при комнатной температуре в течение 5 минут. Возбуждайте микс на длине волны 290 нм и сканируйте излучение в диапазоне от 300 нм до 400 нм.
      4. Нормализуйте данные с помощью Blank (только буфер, без пептида и белка) и условия контроля пептида (без белка) и построите график.
        Примечание: Увеличение флуоресценции триптофана при воздействии низкой или высокой концентрации пептидов предполагает положительное взаимодействие между двумя отдельными пептидами и белком RBP4.
    2. Спектроскопия кругового дихроизма (CD)
      1. Разбавьте отдельные пептиды и рекомбинантный белок RBP4 в 1x PBS буфере, pH 7,0. Используйте различные концентрации пептидов RBPR2 и STRA6 и белка RBP4 от 0,1 до 10 мкг/мл для проверки качества, как описано ниже.
      2. Добавьте отдельные разведенные пептиды и белок в кювету длиной 0,1 см и измерьте абсорбцию/эллиптичность CD с помощью CD-спектрофотометра (195-250 нм). Используйте приведенную ниже формулу для расчета средней эллиптичности остатков (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S представляет сигнал CD в mθ; mRw представляет собой среднюю массу остатка; c представляет собой концентрацию белка в мг/мл; а l представляет длину пути в см.
      3. Рассчитайте процентное изменение структуры молекулы с помощью анализа вторичной структуры BeStSel для прогнозирования сворачивания белка с помощью CD-спектроскопии (https://bestsel.elte.hu).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичная структура указывает на правильную сворачиваемость и сохранение подтверждений, имеющих решающее значение для исследования взаимодействия и результата взаимодействий. Изучите предсказанную структуру домена и перейдите к дальнейшему исследованию взаимодействия.

2. Анализ SPR для определения аффинности связывания и кинетических параметров мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP4

  1. Для иммобилизации RBP4 на настройке поверхности чипа CM5 мы используем чип датчика SPR, который несет удлиненный до размера ~100 нм карбоксиметилдекстран, ковалентно прикрепленный к золотой поверхности. В присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS) превращает карбоксильные группы на поверхности чипа в эфиры N-гидроксисукцинимида, которые спонтанно реагируют с аминогруппами аминокислот и белков, заставляя лиганд ковалентно связываться с поверхностью чипа (Таблица материалов).
    1. Иммобилизуйте очищенный белок msRBP4 на сенсорном чипе (рис. 1 и рис. 2). В меню «Выполнить» выберите «Мастер» и перейдите к опции иммобилизации. Разведите лиганд (белок msRBP4, полученный на стадии 1.1) в иммобилизационном буфере (10 мМ буфера ацетата натрия, pH 5,0) до 10 мкг/мл (4 мкл лиганда + 396 мкл буфера) и аликвотируйте связывающие реагенты во флаконах. Откройте окно мастера настройки иммобилизации из программного управления, выберите CM5 Chip и опцию Immobilize flow cell 2 and target level 1,200 Response Unit (RU) для достижения Rmax 30 RU в кинетическом исследовании и растворе Wash: Ethanolamine. Введите имя RBP4 и нажмите Далее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: Диалоговое окно «Подготовка системы » для параметра «Подготовка к запуску » не требуется, если ранее была выполнена грунтовка с помощью буфера PBST (фосфатно-буферный солевой раствор с 0,05% раствором моющего средства Tween 20).
    2. В диалоговом окне Положение стойки нажмите кнопку Извлечь стойку. Возьмите штатив и поместите флаконы с назначенными объемами для каждого реагента: 156 мкл msRBP4, 177 μл этаноламина, 89 μL EDC, 89 μL NHS и пустой флакон. Вставьте штатив с флаконами с образцами и нажмите OK и Next.
    3. В диалоговом окне "Подготовка протокола выполнения " нажмите кнопку "Пуск" и "Сохранить".
  2. Установка для кинетического анализа пептидов RBPR2 и STRA6
    1. Последовательно разбавляют мышиные пептиды RBPR2, мутантные RBPR2 и STRA6 (химически синтезированные ранее31 и перечисленные в таблице материалов) в рабочем буфере в диапазоне 0,8-26,6 мкМ.
    2. Откройте управляющее программное обеспечение и выберите мастер Kinetics/Affinity. Нажмите «Файл» | Откройте шаблон и выберите Kinetics/Affinity. Введите в диалоговое окно последовательности впрыска путь потока 2-1 (активная ячейка потока 2 и ячейка потока 1 как эталонная), проверьте тип микросхемы CM5 и нажмите кнопку Далее. В диалоговом окне настройки установите флажок Запускать циклы запуска, введите Решение: буфер и циклы: и нажмите Далее.
    3. В диалоговом окне параметров впрыска введите значения параметров образца : время контакта: 120 с, расход 30 мкл/мин, время диссоциации 300 с; для параметров регенерации : введите название раствора для регенерации: Glycine-HCl (pH 2,5), время контакта: 30 с, расход: 30 мкл/мин и нажмите Далее.
    4. В диалоговом окне образцов введите название пептидов, молекулярную массу и концентрацию, а затем нажмите кнопку «Далее». В диалоговом окне «Положение штатива» назначьте разведенные пептиды в виде отдельных образцов объемом ~120 мкл различных концентраций от 1 до 100 мкМ и ~230 мкл буфера, ~120 мкл буфера и ~1 000 мкл глицина с pH 2,5 к позициям на штативе. Нажмите «Извлечь штатив» и вставьте все флаконы. Нажмите кнопку Next и в диалоговом окне Prepare Run Protocol нажмите кнопку Start, введите имя файла и нажмите кнопку Save (рисунок 2).
    5. В программном обеспечении щелкните меню «Пуск » и выберите «Оценка». Откройте файл в программном обеспечении и в выпадающем меню выберите Fc2-1 для анализа сенсорной граммы Reference cell Blank-subtracted Active на наличие фаз ассоциации и диссоциации пептидов msRBP4 и мутантных msRBPR2 и msSTRA6.
    6. Нажмите на выпадающую кнопку Kinetics/Affinity и выберите Surface bound; чтобы открыть диалоговое окно «Выбрать кривые », отметьте галочкой столбец «Включить» в таблице и нажмите «Далее». Выберите диалоговое окно «Данные », чтобы отобразить пустые и вычтенные сенсорные граммы; нажмите Кинетика и сходство, оставьте параметры по умолчанию, а затем нажмите Опция подгонки для подгонки кривой. Проверьте вкладку Отчет на наличие константы равновесной диссоциации Kd и Ka или Kпо скорости ассоциации и скорости диссоциации Kd или Koff . Сохраните сенсорную диаграмму данных Kinetics в формате с разделителями.txt табуляторами и используйте значения для построения графиков (рис. 3).
    7. Чтобы определить константу кинетики сродства Kd (концентрация лиганда, которая связывается с половиной рецепторов в равновесии), скопируйте и вставьте столбцы данных в файл формата .txt, сгенерированный на основе графика Evaluation to XY, используемого в программном обеспечении. Нажмите кнопку Анализ и нелинейная регрессия (аппроксимация кривой), проверьте столбец данных и нажмите кнопку ОК. В диалоговом окне параметров нажмите Насыщенность привязки и Модель подгонки привязки для одного сайта с формулой:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Где Bmax — максимальное количество сайтов связывания (единица ответа), X — концентрация пептидов, а Y — единица связывания (единица ответа) (рис. 3).

3. Методология спектрофотометрии для количественного определения комплекса белка сетчатки GPCR-11-цис (ретинилиденбелка родопсина) в лизатах сетчатки

  1. Транспортировка заранее определенной группы мышей, состоящей из взрослых мышей WT-C57BL/6J, в темную комнату.
  2. В темноте адаптируйте мышей на ночь в течение 12-16 часов, а при красном свете поместите мышь в камеру эвтаназии и откройте газовый клапан CO2 на регуляторе до 5 л/мин на ~5 минут. Обеспечить смерть путем надавливания на отведенную назад шею и хвост (шейный вывих).
  3. Энуклеируйте глазные шарики и гомогенизируйте глаза в ледяном буфере, содержащем 20 мМ бис-трис пропана (1,3-бис (трис(гидроксиметил)метиламино)пропана; BTP) pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы (Таблица материалов).
  4. Центрифугируйте гомогенат в течение 15 мин при 16000 x g при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, содержащую водорастворимые цитозольные белки. Ресуспендировать и солюбилизировать гранулированные мембранные и мембранные белки в буфере, содержащем 20 мМ n-додецил-β-d-мальтозид (ДДМ), 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы в течение 1 ч при 4 °С на вращающейся платформе.
  5. Центрифугирование резолюбилизированной мембранной фракции в течение 1 ч при 16000 x g, 4 °C. Смешайте надосадочную жидкость с 30 мкл гранул антител Rho 1D4 и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C на вращающейся платформе.
  6. С помощью магнитной подставки отделите пулдаун с помощью шариков, выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 500 мМ NaCl и 2 мМ ДДМ.
  7. Разбавляют белок родопсина путем инкубации в течение 5-10 мин при комнатной температуре с буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 2 мМ DDM, содержащего 0,2 мг/мл пептида 1D4 (-TETSQVAPA) (рис. 4 и рис. 5).
  8. Проанализируйте элюирование на поглощение от 200 нм до 800 нм с помощью прямоугольной, субмикромикро, кварцевой, апертуры 2 мм, длины пути 10 мм, кюветы 50 мкл в условиях быстрого сканирования с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только высококачественные кюветы из кварца (Рисунок 4).
  9. Чтобы проверить и определить качество, проверьте и подвергните элюирование воздействию яркого света в течение 1 минуты, затем повторите шаг 3.8.
  10. Вычтите абсорбцию Бланка и рассчитайте отношение анализируемых спектров поглощения с абсорбцией при 500 нм для 11-цисцис-связанного опсина сетчатки, 380 нм для полностью транс связанного с ретиналью опсина и 280 нм для безлигандного белка Apo-Opsin (рис. 6). Свободный опсин без лиганда ретиналь дает базовую абсорбцию при длине волны 500 нм.
  11. Чтобы количественно определить концентрацию родопсина, используйте закон Бера-Ламберта:
    А=ε· C·l или C=A/ε·l
    Где A — поглощение, ε коэффициент молярного угасания (родопсин ε500 = 40 600 M−1 см−1 для свободного Apo Opsin ε280 = 81 200 M−1 см−1), C — концентрация, а длина пути l — длинна.
  12. Для количественного определения лигандид-опсина в процентах используйте соотношение A280/A500.
  13. Построим график спектров поглощения с вычитанием из пустого поля и вычислим значение свободного опсина32.
  14. Рассчитайте концентрацию родопсина с использованием коэффициента экстинкции ε500 = 40600 М−1 см−1. Концентрация безлигандного опсина рассчитывается с помощью закона Бера-Ламберта с использованием коэффициента экстинкции ε280 = 81 200 М−1 см−1.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны количественные методы изучения белково-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецептора опсина с соответствующими физиологическими лигандами. Рекомбинантный мышиный RBP4 должен экспрессироваться в E. coli и очищенном белке, используемом в качестве конъюгированного лиганда на чипе SPR. Химически синтезированный RBPR2, STRA6 и мутантный S294A RBPR2 «SYL мотив RBP4 взаимодействующий внеклеточный сайт» пептида аминокислоты с содержанием ~40 используется в качестве аналита в различных концентрациях для измерения кинетики связывания и равновесного насыщения Kd взаимодействия (рис. 1 и рис. 2).

Рекомбинантный белок RBP4, являющийся лигандом для RBPR2 и STRA6, показал аффинность связывания по отношению к взаимодействующим сайтам в этих пептидах, измеренную при Kd ~22,38 мкМ и ~26,73 мкМ соответственно. Аминокислотный мотив "SYL" играет важную роль в стабилизации этих взаимодействий как в RBPR2, так и в STRA6, и, как и предполагалось, мутантный пептид S294A имел повышенный Kd на ~114,9 мкМ, что указывает на повышенное число копий мутантного пептида RBPR2 для достижения насыщения связывания (рис. 3). Поглощение ретинола в глазу через STRA6 и превращение в различные ретиноиды с конечным превращением 11-цис-сетчатки в хромофор со связыванием с остатком родопсина 296 образует функциональный рецептор для восприятия фотонов и зрения. 11-цис-ковалентное связывание сетчатки с белком опсином с образованием родопсина проявляет определенные характерные абсорбционные особенности. Абсорбция белка происходит на длине волны 280 нм, а абсорбция свободного ретинола — на длине волны ~325 нм. Тем не менее, холо-опсин с абсорбцией 11-цис-ретинала или родопсина происходит на длине волны 500 нм.

Любой дефект этого сложного образования из-за низкого системного ретинола или дефекта поглощения ретинола мутацией в RBPR2 или STRA6 приводит к накоплению свободного опсина или апопротеина опсина, лишенного хромофора 11-цисного сетчатки, изменяя характерные сдвиги абсорбции на низкую абсорбцию при 500 нм. Количественно оценив поглощение и используя соотношение поглощения 280 нм и длины волны 500 нм, можно оценить лигандированные опсины или родопсин. С помощью кратковременного воздействия света можно перепроверить фотоизомеризацию абсорбции 11-цис-ретинального связанного опсина на длине волны 500 нм с полностью транс-ретинально-связанной абсорбции опсина (родопсина Meta II) на длине волны 380 нм (рис. 4, рис. 5 и рис. 6). В экспериментальной установке вероятность появления артефактов и загрязняющих веществ высока; двумя основными источниками обнаруженных артефактов являются непреднамеренное воздействие света от инструментов и промывка солями в низкой концентрации, при которой молекулы загрязняющих веществ не удаляются из РПЭ или хрусталика (рис. 7).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочее пространство поверхностного плазмонного резонанса. Необходимые материалы и обзор контрольно-измерительных приборов SPR. (A) Погрузочная площадка SPR Chip. (А') CM5 Чип с ковалентно присоединенной поверхностью из карбоксиметилированного декстрана золота для иммобилизации через группы -NH2, -SH, -CHO, -OH или -COOH. (B) Роботизированная инжекторная стойка для загрузки проб. (B') резиновые колпачки типа 3. (B'') пластиковые флаконы 7 мм для аликвот для образцов. (К,Г) Уравновешивающий/работающий буферный резервуар и резервуар для сбора отходов. (E) Программная панель управления Biacore. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематический обзор поверхностного плазмонного резонанса и этапы получения сенсорных диаграмм. Шаг 1: Поверхность чипа CM5 иммобилизуется белком RBP4 с целью 1200 единиц отклика. Шаг 2: Пептиды RBPR2 в различных концентрациях используются в качестве аналитов, и это биомолекулярное взаимодействие изменяет плотность заряда электронов на поверхности золотого чипа, что приводит к изменению/уменьшению отражения света под определенным углом или резонансным углом. Шаг 3: Промывка обращает вспять явление поверхностного плазмона, что приводит к изменению интенсивности отражения и падению сенсорной граммы до базовой линии. Кинетика этих взаимодействий в дальнейшем использовалась для определения констант диссоциации ассоциаций и силы взаимодействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Исследования поверхностного плазмонного резонанса отдельных пептидов рецептор-связывающего домена витамина А с его физиологическим лигандом RBP4. (A) Программная подсказка, показывающая достигнутую иммобилизацию RBP4 на поверхности чипа CM5. (Б,В,Г) Сенсограммы взаимодействий пептид-лиганд RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 и мутантного S294A RBPR2-RBP4 в различных концентрациях. (B',C',D') Определение кинетики связывания и равновесия Kd , показывающее различие и близость характера связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Иллюстрация 4: Рабочее пространство для поглощения сетчатки Opsin-11-cis и обзор приборов. (A) Охлаждаемая настольная центрифуга, все светодиодные индикаторы покрыты красной лентой; (Б) спектрофотометр УФ-видимого диапазона, один светодиодный индикатор, обтянутый красной лентой; (В') Прямоугольная ультрамикроячейка, кварцевая кювета и магнитная подставка. (C) Сканирование прикладного программного обеспечения; (D) Крышка отсека спектрофотометра открывается, держатель кюветы для анализа и крышка отсека закрывается. (E) Настройка выключения света с выключенным монитором для подготовки образцов при использовании одного источника красного света. (F) Охлаждаемый ротатор для пробоподготовки и солюбилизации. (G) Настройка выключения света с включенным монитором для измерения поглощения образца. (H) Анализ поглощения в XY-графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Обзор рабочего процесса методики абсорбции сетчатки Opsin-11-cis. Шаг 1: Сетчатка мышей, адаптированных к темноте, под одним источником красного света изолируется, гомогенизируется и солюбилизируется для получения фракций мембраны сетчатки. Шаги 2-4: В последовательности центрифугирования гранулы растворяются в отсутствие моющего средства и в присутствии буфера моющего средства ДДМ. Шаги 5-6: Солюбилизированная гранула, содержащая фоторецепторы сетчатки и другие мембранные белки, готова к удалению и очистке антител. Шаг 7: Элюированный опсин с использованием пептида VAPA 1D4 готов к анализу абсорбции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Спектры поглощения родопсина. (A) Темный адаптированный экстракт сетчатки мышей с использованием 1D4 очищенного родопсина с пиковой абсорбцией 500 нм, и (B) Экстракт сетчатки под воздействием света с использованием 1D4 очищенного родопсина с пиковой абсорбцией 380 нм. (В) Вестерн-блоттинг с использованием антител к родопсину 1D4, показывающий качество очистки родопсина и распределение по размерам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Артефакт спектров поглощения родопсина. (A) Артефакт в спектрах поглощения адаптированного к темноте экстракта глаз показан с пиком поглощения на 380 нм; Непреднамеренное воздействие света от светодиодных индикаторов прибора или выход из строя блокиратора света темной двери комнаты приводит к обесцвечиванию белка родопсина. (B) Недостаточное количество промывок с высоким содержанием солевых буферов приводит к накоплению загрязняющих веществ из СИЗОД, хрусталиков или других источников из глазного экстракта, что приводит к высокому распространению спектра поглощения и артефактам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Схематическое изображение взаимодействия между мембранными рецепторами витамина А (RBPR2 и STRA6) и белком опсина с их соответствующими лигандами (RBP4 и 11-цис-ретиналь), критически важными для генерации белка ретинилидена в фоторецепторах зрительной функции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Интенсивность флуоресценции собственного триптофана. Предварительные данные о взаимодействии и изменении ориентации собственных триптофановых остатков RBP4 при взаимодействии с различными концентрациями пептидов RBPR2 и STRA6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: RBPR2 и RBP4 белок-белковая стыковка и взаимодействие. Остатки на границе раздела визуализируются в PyMOL, а ориентация RBPR2 в мембране визуализируется с помощью серверного инструмента https://opm.phar.umich.edu/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Конвейер для анализа in silico белок-белкового стыковочного взаимодействия и возможных контактных сайтов. Конвейер анализа демонстрирует последовательность выполнения скрипта Python и использования командной строки PyMOL с шагов 1 по 6, обеспечивая надежность получения сайтов взаимодействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Анализ вторичной структуры с помощью CD-спектроскопии, показывающий состав пептидов RBP4, RBPR2 и STRA6. Круговая диаграмма показывает доли вторичных структур, присутствующих в молекуле. С помощью инструмента BeStSel Secondary Structure был проведен анализ прогнозирования белковых складок с помощью спектроскопии кругового дихроизма (https://bestsel.elte.hu). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в протоколе
Методология SPR
Моделирование in silico и анализ докинга: Для исследования стыковки29,31 следует использовать предсказанную структуру RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) и STRA6, а также известную структуру базы данных PDB MSRBP4 (RSCB PDB ID: 2wqa). Кроме того, методы in vitro (клеточная культура) должны быть использованы для подтверждения взаимодействия предполагаемых сайтов связывания на рецепторах витамина А (RBPR2 и STRA6) с его лигандом (RBP4)29,31 (дополнительный рисунок S1, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3). Определяют качество пептидов с помощью CD-спектроскопии. Ранее для спектра ДК в дальнем УФ-диапазоне использовали прямоугольную ячейку размером 1 мм 0,1 мкг/мкл ~200 мкл (3-4 мкг белка RBP4, 32 мкм RBPR2 и 32 мкМ пептидов STRA6)31 (дополнительный рисунок S4). Поток газообразного азота должен использоваться для предотвращения вредного озонообразования при воздействии ксеноновых ламп и снижения фонового поглощения на длине волны 200-300 нм. Используя параметр по умолчанию, спектр был измерен от 185 нм до 300 нм. Базовая линия должна быть скорректирована путем вычитания с помощью Blank. Содержание альфа-спирали и бета-листа рассчитывается на основе свойства поглощения, такого как отрицательные пики альфа-спирали на длине волны 222 нм.

Проанализируйте данные о белках RBPR2 и STRA6 и топологических доменах в базе данных (https://www.uniprot.org), подтвердите ранее известные возможные сайты взаимодействия из внеклеточных областей и используйте последовательность ~40-50 аминокислот для химического синтеза пептидов. Для изучения рецептор-лигандных взаимодействий 18,19,29,31 требуется очищенный рекомбинантный мышиный белок RBP4 (ms RBP4) и химически синтезированные пептиды RBPR2 и STRA6, охватывающие предполагаемые остатки связывания RBP4. Перед включением пептидов в короткий список необходимо определить внеклеточную пептидную последовательность взаимодействующих белков рецептора витамина А с помощью анализа in silico (компьютерный докинг белков-лигандов)31. Анализ SPR проводится для понимания кинетики рецептор-лигандных взаимодействий. Крайне важно знать прогнозируемые места взаимодействия с помощью компьютерных анализов in silico или анализа in vitro. В этом исследовании разработанный пептид отсылает к внеклеточной области мембранных белков RBPR2 и STRA6, которые, как известно, взаимодействуют с RBP4. Чтобы обеспечить точные результаты и предотвратить потенциальные артефакты и отрицательные сенсорные граммы SPR, крайне важно стандартизировать буферы, концентрации пептидов и растворимость. Для исследований абсорбции родопсина выделение лизата сетчатки требует строгих условий темноты и этапов промывки, чтобы избежать артефактов и нежелательных пиков абсорбции (Рисунок 7).

Чтобы понять важность мотива SYL на транспортерах витамина А в связывании RBP4, RBPR2, STRA6 и мутантного S294A-RBPR2, пептиды31 были химически синтезированы с использованием реакции конденсации карбоксильных и аминогрупп между двумя аминокислотами. Протокол следовал за точным ступенчатым добавлением последовательных аминокислот в якорную смолу. В процессе синтеза аминокислот происходит химическая модификация защиты и снятия защиты N-концевого аминокислотного звена, что позволяет осуществлять синтез и образование пептидного полимера. После завершения пептид извлекается из смолы и очищается. Первоначальная валидация взаимодействия белка RBP4 и пептидов рецептора витамина А должна быть подтверждена с помощью внутреннего флуоресцентного анализа триптофана и проверена с помощью CD-спектрометра (дополнительный рисунок S1). Исходное качество взаимодействия рекомбинантного белка RBP4 с мышиным STRA6 (msSTRA6), мышиным RBPR2 (msRBPR2) и контрольными пептидами должно быть подтверждено с помощью внутреннего флуоресцентного анализа триптофана (дополнительный рисунок S1). Анализ собственной флуоресценции триптофана является важнейшей экспериментальной процедурой для оценки гашения или усиления остатков аминокислот триптофана в белках для флуоресценции при связывании рецептора и лиганда. Измеренная флуоресценция является прямым показателем изменения локальной среды в результате взаимодействия.

Модификации и устранение неполадок в методах
Оптимизируйте SPR с помощью работающих буферов: 1x фосфатно-солевой буфер (Tween 20) или 1x HEPES (P20). Чтобы избежать образования осадка, разведенные пептиды перед использованием следует центрифугировать и отфильтровать. Стандартизируйте абсорбцию родопсина с помощью различных буферов с высоким содержанием солей (300-500 мМ NaCl). Чтобы подтвердить пики поглощения родопсина в темноте на длине волны 500 нм, подвергните образцы воздействию света в течение 30 с и повторите измерение, чтобы убедиться в качестве сдвига пика поглощения до 380 нм и эффективности вытягивания.

Ограничения методов
SPR может предоставить специфическую информацию о взаимодействии двух белков; Однако, если для взаимодействия требуется третий неизвестный компонент, данные могут стать сложными для понимания. Изменение конформации молекулы останется неизвестным во взаимодействии. Поскольку белок RBP4 получают в отсутствие ретинола (apo-RBP4), измеряется связывание apo-RBP4 с его рецепторами. Таким образом, RBP4, загруженный ретинолом (holo-RBP4), может иметь измененное сродство к рецепторам RBPR2 и STRA6 по сравнению с apo-RBP435,36. Интересно, что сродство к апо- и голо-RBP4 к STRA6 ранее было показано в обоих микромолярных диапазонах, и статистической разницы между связываниями апо- и голо-RBP4 с рецептором STRA635 не наблюдалось. Методология абсорбции родопсина позволяет определить наличие нелигандированного опсина (апопротеина опсина) в глазу, но не может определить причинный механизм.

Спектры поглощения родопсина
КРИТИЧЕСКАЯ КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА: Фотоизомеризация 11-цис-сетчатки в полностью транс-ретиналь является высокочувствительной и мгновенной32. Количественное определение родопсина (холо-опсина) следует проводить в строгих условиях темноты для измерения надлежащего содержания опсина и 11-цис-сетчатки в темноте (500 нм) или в условиях, адаптированных к освещению, как Мета II Родопсин (380 нм)32. Поэтому мышей следует адаптировать к темноте в темном помещении в течение 12-16 часов, чтобы измерить неотбеленный родопсин32. Для этого темная комната должна быть полностью темной, входная дверь должна быть закрыта светонепроницаемой тканью, а внешние светодиодные источники света на всем оборудовании покрыты красной лентой. Накройте экран ноутбука красной пластиковой пленкой и держите закрытым до тех пор, пока не потребуется. Также требуется верхний источник красного света.

КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Стандартизируйте этапы промывки при различных высоких концентрациях солей, чтобы удалить белки хрусталика или RPE или молекулы, которые имеют поглощение на длине волны 300–500 нм и потенциально могут мешать измерению поглощения опсина.

Значение методов по отношению к существующим/альтернативным методам
Не существует осуществимого подхода к изучению системного использования ретиноидов, вклада нескольких тканей и влияния мутаций в рецепторах ретинол-связывающего белка на механизмы распределения ретинола. В этом протоколе используются два основных метода для понимания и восполнения недостающих связей в истощении ретинола в фоторецепторах с помощью Apo-Opsin и использования ретиноидов печени через взаимодействия рецептор-лиганд RBPR2-RBP4 (рис. 3, рис. 6 и рис. 8).

Важность и потенциальные возможности применения метода в конкретных областях исследований
SPR и спектроскопии родопсина на основе абсорбции обеспечивают значимую стратегию для изучения механизмов системного и глазного гомеостаза витамина А для производства белка ретинилидена (родопсина). Таким образом, эти методы и экспериментальные подходы могут пролить свет на кинетику мембранно-рецептор-зависимого транспорта пищевых ретиноидов через печень и в глаз, способствуя выработке родопсина (рис. 8). Они также помогают понять механизмы и глазные последствия мутаций в рецепторах витамина А и белках опсина, особенно в связывании с их соответствующими лигандами. Эти взаимодействия могут влиять на выработку белка ретинилидена, который имеет решающее значение для зрительной функции.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; при сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи или при принятии решения о публикации результатов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктора Беату Ястшебску, доктора философии (факультет фармакологии, Университет Кейс Вестерн Резерв, штат Огайо) за ее советы по протоколу абсорбции родопсина. Эта работа была поддержана грантом NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и, частично, стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-D Quant KitCytiva80648356
Комплект аминных соединенийCytivaBR100050
Программное обеспечение для оценки BiacoreBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris пропанSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 компетентные элементыThermo Научныйспектрофотометр EC0114
CDJascoJ-815 Спектрополяриметр
Глицин HCLБиореагентыФишера BP381-1
GraphPad Prism Моделирование подгонки, анализ данных
LB бульонFisher BioreagentsBP1426-500
n-додецил-&бета;-d-мальтозид (ДДМ)EMD Millipore324355-1GM2-20 мМ
pET28a His-tag Kanamycin-resistant вектор экспрессии Addgene69864-3
Набор для очистки плазмидQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K кассета для диализаThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000,05%
УФ по сравнению со спектрофотометромAgilent Cary 60 UV-Vis
Пептид названиеPeptide sequenceHPLC-purity>Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Соответствует
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Соответствует
мышиному Rbpr2 мутантному S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Соответствует

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи