Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Минископ регистрирует сигналы кальция в гиппокампе мышей, ориентирующихся по шлейфу запаха

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67039

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Neurotechnology Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 4Civil, Environmental & Architectural Engineering, University of Colorado, 5Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол исследует взаимосвязь между мозгом и поведением в гиппокампе CA1 у мышей, ориентирующихся по шлейфу запаха. Мы предоставляем пошаговый протокол, включающий хирургическое вмешательство для доступа к визуализации гиппокампа, поведенческую тренировку, запись и обработку мозга с помощью минископа GCaMP6f, а также поведенческие данные для декодирования положения мыши по нейронной активности ROI.

Аннотация

Мыши ориентируются в шлейфе запаха со сложной пространственно-временной структурой в темноте, чтобы найти источник пахучих веществ. В данной статье описан протокол мониторинга поведения и регистрации переходных процессов Ca2+ в дорсальных нейронах пирамидального слоя CA1 в гиппокампе (dCA1) у мышей, перемещающихся по шлейфу запаха на арене запаха размером 50 см x 50 см x 25 см. Эпифлуоресцентный минископ, сфокусированный через линзу с градиентным индексом (GRIN), визуализировал транзиентыCa2+ в нейронах dCA1, экспрессирующих кальциевый сенсор GCaMP6f у мышей Thy1-GCaMP6f. В статье описан поведенческий протокол для обучения мышей выполнению этой задачи навигации по запаховому шлейфу на автоматизированной арене запахов. Методы включают в себя пошаговую процедуру операции по имплантации линзы GRIN и установку опорной пластины для визуализации GCaMP6f в CA1. В статье представлена информация об отслеживании положения мыши в режиме реального времени для автоматизации начала испытаний и выдачи водного вознаграждения. Кроме того, протокол включает информацию об использовании интерфейсной платы для синхронизации метаданных, описывающую автоматизацию задачи навигации по запахам и время кадра для минископа и цифровой камеры, отслеживающей положение мыши. Кроме того, эти методы очерчивают конвейер, используемый для обработки флуоресцентных фильмов GCaMP6f, путем коррекции движения с использованием алгоритма NorMCorre с последующей идентификацией интересующих областей с помощью EXTRACT. Наконец, в статье описывается подход искусственной нейронной сети к декодированию пространственных путей из активности нейронного ансамбля CA1 для прогнозирования навигации мыши по шлейфу запаха.

Введение

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании нейронных цепей, участвующих в обонятельной навигации у мышей с фиксированной головой 1,2,3 и стратегий навигации у свободно движущихся мышей 4,5,6,7,8, роль нейронных цепей в этологически значимой свободно движущейся навигации турбулентных запаховых шлейфов до сих пор неизвестна. В данной статье описывается мониторинг нейронной активности путем визуализации транзиентовCa2+ в клетках, экспрессирующих генетически кодируемый кальциевый сенсор GCaMP6f у мышей Thy1-GCaMP6f9 с целью изучения того, играет ли роль последовательная нейронная динамика дорсальных нейронов пирамидального слоя CA1 в гиппокампе (dCA1) в навигации по шлейфу запаха. Методы позволяют получить информацию о флуоресценции, полученной с помощью миниатюрного эпифлуоресцентного микроскопа, сфокусированного через линзу GRIN на dCA1 10,11,12. Методы объясняют, как одновременно контролировать пространственную навигацию и переходные процессы кальция dCA1-нейрона GCaMP6f у мышей, выполняющих навигационную задачу по запаху-шлейфу, где они получали водное вознаграждение, когда достигали носика, доставляя одорант на пахотную арену с фоновым ламинарным потоком воздуха13,14. В данной статье описаны методы, необходимые для решения этой задачи (рис. 1), включая стереотаксическую хирургию для имплантации линз с градиентным индексом (GRIN), размещение опорной пластины для крепления минископа к черепу в свободно движущейся мыши, визуализацию с помощью миниатюрного микроскопа и мониторинг движения мыши с помощью высокоскоростной цифровой камеры, предварительную обработку данных для удаления артефактов движения и поиска областей интереса (ROIs). а также подготовка наборов данных и обучение и прогнозирование искусственных нейронных сетей для декодирования положений мыши по X и Y на арене запаха по изменениям флуоресценции в ROI dCA17.

Запись сигналов кальция в области CA1 гиппокампа мышей, ориентирующихся по запаховому шлейфу, имеет отношение к пониманию вычислений нейронных цепей, связанных с обонянием и пространственной информацией в сложной поведенческой задаче навигации по запаху-шлейфу 2,14,15,16. Область CA1 гиппокампа играет роль в пространственной навигации и имеет решающее значение для создания когнитивной карты окружающей среды для эффективной навигации17,18. Запись сигналов кальция с помощью минископа является ценным способом исследования нейронов CA1, которые кодируют пространственную информацию во время навигации по запаховому шлейфу.

Этот метод сочетает в себе преимущества технологии минископа для регистрации кальциевых сигналов GCaMP с хорошо известной ролью гиппокампа CA1 в пространственной навигации для лучшего понимания того, как нейронные цепи управляют сложным поведением. В качестве альтернативы, подходы с использованием двухфотонной микроскопии могут регистрировать нейроны CA1 9,20, что требует фиксации головы мыши и ограничивает возможность свободного перемещения для навигации по пахучему шлейфу21. Электрофизиологические записи нейронов CA1 в локальном поле позволяют исследовать свободно движущихся мышей, ориентирующихся по запаховым шлейфам22. Тем не менее, локальные полевые электрические сигналы накладывают ограничения на оценку внутриклеточного возбуждения путем выделения единичных сигналов с помощью методов сортировки спайков. Сигналы минископа позволяют надежно идентифицировать ROI, непосредственно связанные с внутриклеточными сигналами кальция10,11 для точного исследования нейронных вычислений с разрешением одной клетки. Технология минископа предоставляет уникальную возможность лучше понять, как область CA1 кодирует пространственную информацию на основе сигналов запаха.

Кроме того, этот метод исследует, как конкретные нейронные популяции обрабатывают информацию о запахе для навигации, а также взаимосвязь между паттернами активности нейронов и принятием решений во время отслеживания запахового шлейфа. Этот метод может способствовать лучшему пониманию того, как мозг обрабатывает запах и пространственную информацию. Несмотря на то, что минископы обеспечивают одноклеточное разрешение для записи свободно движущегося мозга мыши, они требуют специализированной хирургии и опыта анализа данных. В этой статье мы предоставляем всеобъемлющий протокол, который помогает исследователям пройти через каждый шаг для изучения нейронных механизмов навигации по запаху и шлейфу.

Задача навигации по запахам является многообещающей основой для изучения нейронного кодирования и пространственной памяти сигналов обоняния у мышей. Результаты работы указывают на то, что можно расшифровать траекторию движения мыши по пахучему шлейфу на основе сигналов кальция нейронного ансамбля в dCA1. Понимание роли сигналов кальция dCA1 в навигации по запаховому шлейфу является важным шагом на пути к разрушению нейронной сети для навигации по запахам в реалистичных условиях13,14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования проводились на 3-6-месячных самцах и самках трансгенных мышей Thy1-GCaMP6f23. Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского кампуса Аншутц Университета Колорадо в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения. Хирургические процедуры по имплантации линзы GRIN (раздел 1) и установке опорной пластины (раздел 2) были адаптированы из предыдущих работ 9,24,25,26,27,28,29.

1. Стереотаксическая хирургия по имплантации линзы GRIN в гиппокамп

  1. Наденьте стерильные перчатки, головной убор, хирургическую маску и лабораторный халат.
  2. Используйте стерильные условия во время всех операций по выживанию. Стерилизуйте все хирургическое оборудование методом автоклавирования.
  3. Наложите стерильные простыни вокруг операционной области.
  4. Обезболите мышь, поместив ее в индукционную камеру с 3% изофлураном на 10 мин. Введите подкожно основание бупренорфина в полимере в дозе 0,001 мг/г во время индукции анестетика.
  5. Проверьте, не перестает ли мышь двигаться и находится ли она под глубоким наркозом, подтверждается щипком задней лапы, чтобы проверить рефлекс задней лапы.
  6. Переключите поток изофлурана на носовой конус (Дополнительный файл 1).
  7. Убедитесь, что в системе анестезии с низким потоком изофлурана для мышей (Таблица материалов) температурная площадка настроена на гомеотермические настройки, а источник пара настроен на внешнее сжатие.
  8. Поместите мышь под наркозом в цифровой стереотаксический инструмент (Таблица материалов). Поместите передние зубы мыши в прикусочную планку и поместите носовой конус перед носом, чтобы обеспечить поток изофлурана и зафиксировать голову на месте. Отрегулируйте уровень анестезии до 2%-3% в зависимости от рефлекса лапы после защемления (Рисунок 2A).
  9. Поместите ушные планки мыши в уши и затяните их. Убедитесь, что головка мыши расположена горизонтально и не перемещается из стороны в сторону или вверх и вниз. Когда голова надежно закреплена, убедитесь, что легкое нажатие на череп не приведет к тому, что череп выскользнет из-под перекладины.
  10. Поместите температурный зонд в прямую кишку и примотайте провод к хвосту мыши, чтобы избежать движения. Установите температуру прокладки так, чтобы ректальная температура поддерживалась на уровне 37 °C.
  11. Добавляйте офтальмологическую мазь в глаза, чтобы предотвратить вредное пересыхание воздуха.
  12. Брейте волосы, когда голова зафиксирована и находится под потоком изофлурана, обеспечиваемым носовым конусом, чтобы предотвратить движение. Сбрейте волосы над головой с помощью электробритвы, затем удалите оставшиеся волосы с помощью средства для удаления волос и стерильных аппликаторов с хлопчатобумажным наконечником (Рисунок 2B).
  13. Сделайте операционное поле стерильным, протерев кожу головы стерильным аппликатором из дерева с ватным наконечником этанол и бетадин по три раза каждый.
  14. Введите 0,1 мл местного анестетика лидокаина подкожно (S.Q.) под кожу между глазами и ушами с помощью иглы 29 G. В результате образуется пузырь. Подождите несколько минут, прежде чем срезать кожу ножницами.
  15. Используя технику «только кончики», осторожно подтяните кожу вверх с помощью щипцов и с помощью маленьких ножниц удалите круглую часть кожи. Всасьте любую кровь стерильным ватным тампоном.
  16. Как только кровотечение остановится, очистите череп перекисью водорода (5%) с помощью стерильного ватного тампона. Убедитесь, что костные ориентиры, включая сагиттальный шов и пересечение брегматических швов для обозначения брегмы, легко идентифицируются после этой процедуры.
  17. Убедитесь, что череп плоский относительно стереотаксического аппарата, убедившись, что брегма и лямбда находятся точно в одной и той же координате Z. Выполните это, поместив иглу в руку манипулятора и проверив, находится ли кончик иглы в одной и той же координате Z при прикосновении к обоим швам. В противном случае отрегулируйте угол наклона головки, переместив планку прикуса в Z-пластине и повторяя процедуру до тех пор, пока навык не окажется в плоском положении.
  18. Приложите пипетку к микроманипулятору, держа иглу, для нанесения чернил на татуировку. Сделайте отметку на верхней части брегмы.
  19. Обнулите координаты микроманипулятора на брегме и переместитесь к координате выше CA1 в правом гиппокампе (средне-латеральный +1,8 мм от брегмы, передне-задний -2,4 мм от брегмы)2. Именно это место выбрали Радванский и Домбек для изучения виртуальной навигации по градиенту запахов у мышей18,30. Осторожно просверлите небольшую постоянную вмятину диаметром 1 мм с помощью сверла (Таблица материалов) на 10000 оборотов, чтобы сделать постоянную вмятину в верхней части целевого места (Рисунок 2C).
  20. С помощью бормашины откройте круглую перфорацию диаметром 1,5 мм, чтобы можно было вживить линзу GRIN диаметром 1 мм и длиной 4 мм в мозг (Таблица материалов) (Рисунок 2D).
  21. Проколите твердую мозговую оболочку и кору головного мозга, вставив иглу 23 G в середину отверстия и медленно перемещая иглу в мозг (~0,1 мм/мин), пока она не достигнет глубины 1,25 мм ниже твердой мозговой оболочки. Медленно извлеките иглу из мозга (~0,1 мм/мин). Используйте стерильные ватные палочки и физраствор для очистки крови.
  22. Используйте изготовленный по индивидуальному заказу держатель линз GRIN от Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, состоящий из двух наконечников микропипеток объемом 1 мл, обрезанных по размеру друг в друга (держатель линз GRIN, Таблица материалов) (рис. 2E, F).
    1. Подключите держатель линзы GRIN к микроманипулятору и включите аспиратор, подключенный к пипетке, чтобы удерживать линзу GRIN. Давление воздуха, создаваемое всасыванием воздуха, удерживает линзу GRIN на месте.
    2. Используйте линзу GRIN длиной 4 мм и диаметром 1 мм. Медленно имплантируйте линзу GRIN в кору головного мозга, пока она не достигнет глубины -1,25 мм ниже твердой мозговой оболочки.
  23. Поместите каплю жидкого тканевого клея (Таблица материалов) в круглую перфорацию черепа, чтобы запечатать отверстие. Подождите несколько минут, чтобы высохнуть.
  24. Приготовьте быстродействующий адгезивный цемент - биосовместимую метакрилатную смолу - (Таблица материалов) на основании линзы GRIN, чтобы навсегда запечатать ее на черепе. Подождите несколько минут и дайте ему высохнуть.
  25. Выключите аспиратор, чтобы отпустить, и медленно снимите держатель линзы GRIN с верхней части линзы GRIN, которая в этот момент постоянно прикреплена к черепу.
  26. Поместите перекладину для головы на верхнюю часть черепа, центрируя отверстие на линзе GRIN (Рисунок 2G-I) (Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).
  27. Осторожно нанесите быстросохнущий клейкий цемент (Таблица материалов) вокруг основания линзы GRIN, чтобы закрыть черепное окно и прикрепить перекладину для головы к черепу. Поместите высыхающий клейкий цемент (Таблица материалов) в середину перекладины для головы и по бокам, чтобы он плотно фиксировался на черепе. Убедитесь, что он полностью высох. Убедитесь, что на верхнюю часть линзы GRIN не нанесен клейкий цемент; В противном случае это приведет к необратимому ухудшению оптического пути и блокировке изображения.
  28. Нанесите каплю низкотоксичного силиконового клея (Таблица материалов) на верхнюю часть линзы GRIN для защиты от физических повреждений.
  29. Выключите прием изофлурана
  30. Осуществляйте немедленное послеоперационное наблюдение до тех пор, пока животное не придет в себя после анестезии.
    1. Принимайте послеоперационный уход до полного восстановления после операции, наблюдая за мышами на предмет признаков боли. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных.
    2. Кратковременно наблюдайте за передвижением по клетке, едой и питьем, а также за нормальными реакциями на обращение, чтобы убедиться, что они не испытывают боли или стресса.
    3. Если у животных проявляются признаки серьезного неврологического или тканевого повреждения, немедленно гуманно усыпьте их.

2. Размещение опорной пластины для минископа

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры по фиксации головы мыши начинаются через 2 недели после того, как животное полностью восстановится после операции. Процедура визуализации dCA1 начинается через 3 недели после операции после того, как животное полностью выздоровеет и сигнал GCaMP6f станет хорошо различимым. В верхней части линзы GRIN закреплена опорная пластина для оптического доступа флуоресценции dCA1 GCaMP6f через линзу GRIN с помощью минископа. В этом протоколе использовался miniscope версии 4 -V4 (Miniscope V4; Таблица материалов).

  1. Начните фиксировать голову мыши в течение 10 минут, закрепив головную планку зажимами, чтобы приспособить мышь к фиксации головы через 2 недели после операции.
  2. Головка мыши фиксируется через 3 недели после операции для установки опорной пластины.
  3. Прикрепите минископ к напечатанному на 3D-принтере держателю, прикрепленному к микроманипулятору (Таблица материалов), прикрепленному к микроманипулятору (рис. 3A, B).
  4. Осторожно удалите силиконовый клей (Таблица материалов) с верхней части линзы с помощью тонкого пинцета и очистите поверхность линзы GRIN салфеткой для линз.
  5. Закрепите опорную пластину, прикрепленную к минископу, затянув установочный винт сбоку от опорной пластины (Таблица материалов) (Рисунок 3C, D).
  6. Переместите конец минископа до тех пор, пока он не достигнет 100 μм над линзой GRIN.
  7. Используйте ползунки для настройки параметров минископа в программном обеспечении минископа (Таблица материалов), следуя шагам с 2.8 по 2.10.
  8. Нажмите на ползунок « Мощность» в программном обеспечении, чтобы контролировать мощность и поддерживать ее на уровне около 10%.
  9. Нажмите на ползунок «Скорость захвата » и удерживайте его в районе 10 Гц.
  10. Минископ v4 имеет линзу с электросмачиванием, которую можно использовать для точной фокусировки. Нажмите на ползунок «Фокус», чтобы установить его на 50%, чтобы электросмачивающий объектив оставался в середине диапазона фокусных расстояний.
  11. Используйте программное обеспечение для просмотра верхней части линзы GRIN. На экране можно увидеть круглую форму линзы GRIN.
  12. Приблизьте минископ к объективу ГРИН, отрегулировав осевое положение с помощью микроманипулятора, и контролируйте изображение с помощью компьютера.
    1. Как только верхняя часть линзы GRIN станет видимой, используйте тонкую фокусировку вверх и вниз на микроманипуляторе, чтобы достичь наилучшей фокальной плоскости для визуализации ячеечных вспышек. Используйте настройку псевдо δF/F0 в программном обеспечении, чтобы перепроверить качество мигания ячеек.
    2. Установите фокус таким образом, чтобы в поле зрения оставалось максимальное количество ячеек с максимально достижимой интенсивностью флуоресценции. На этом этапе убедитесь, что кровеносные сосуды находятся в фокусе.
  13. Может случиться так, что у мыши отсутствуют переходные кальциевые сигналы-вспышки. В этом случае избегайте следующих шагов (14-16) и проверьте мышь снова в течение следующих недель, чтобы перепроверить, возникают ли переходные сигналы кальция.
    Примечание: Решение об эвтаназии мыши может быть принято, если транзиторные кальциевые сигналы никогда не проявляются в течение 2 месяцев после операции.
  14. После того, как фокус будет оптимизирован, осторожно соорудите стену из быстродействующего клеевого цемента между черепом и нижней частью опорной пластины. Будьте осторожны, чтобы не закрепить минископ на опорной пластине, и будьте очень осторожны, чтобы цемент не попал на верхнюю часть линзы GRIN.
  15. Как только цемент высохнет, снимите установочный винт и осторожно снимите минископ с опорной плиты с помощью микроманипулятора.
  16. Используйте крышку опорной пластины для защиты линзы GRIN.

3. Строительство пахучей арены

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод очерчивает автоматизированную арену запаха, основанную на проектах Connor et al.13 и Gumaste et al.14. Полную сборку можно найти по ссылке в Таблице материалов (Дополнительный файл 4).

  1. Постройте камеру размером 50 см (Д) x 50 см (Ш) x 25 см (В) с 2 акриловыми стенами, акриловым потолком, белым полом из пенополивинилхлорида (ПВХ) и 2 уникальными стенами спереди и сзади, которые способствуют потоку воздуха (Рисунок 4A).
  2. Установите всасывающий узел в задней части арены с конической конструкцией и прикрепленным компьютерным вентилятором для вытягивания воздуха из камеры. Используйте физическую ручку для установки широтно-импульсной модуляции вентилятора (ШИМ) для регулирования скорости потока воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напечатанная на 3D-принтере сотовая структура включает в себя стенки спереди и сзади зоны для защиты от запаха, чтобы облегчить ламинарный поток воздуха, сохраняя при этом мышь внутри10. Сотовая стена в передней части арены имеет внешний расширитель для приема больших объемов воздуха без прерывания работы.
  3. Настройте систему подачи воды для доставки воды с помощью простых приспособлений с шаговым двигателем Nema 17, соединенным со шприцем. Микрошаговый драйвер A4988 позволяет точно контролировать выдаваемый объем (https://github.com/dougollerenshaw/syringe_pump, Рисунок 4B).
  4. Установите воздухозаборник с 4 комплектами источников запаха в паре с водоотводными трубами, каждый из которых расположен на расстоянии 10 см друг от друга по оси X, чтобы определить «дорожки», по которым животное будет перемещаться в поисках водного вознаграждения (рис. 4C, D).
  5. Установите систему доставки запаха, управляемую электромагнитными клапанами, подключенными к трубкам и бутылкам с запахом (рис. 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клапаны питаются от релейной платы в компоновке, которая гарантирует, что чистый воздух или одорированный воздух поступает постоянно, и что либо одна, либо нулевая полоса могут получать одорированный воздух в любой момент времени. Комплект из пяти электромагнитных клапанов 12 В управляется с помощью релейной платы, содержащей 4 реле. Когда все 4 реле установлены в положение «выключено», клапан чистого воздуха по умолчанию открыт. Когда открывается любой клапан с одним запахом, клапан чистого воздуха автоматически закрывается. Управление состоянием релейной платы осуществляется с помощью цифровых выходов от основного контроллера Arduino. Аквариумный воздушный насос потребительского класса подает воздух, который ограничен до 20 мл/мин с помощью ручного регулятора расхода воздуха. Используя ряд трубок и сплиттеров внутреннего диаметра 1/16 дюйма, подающая линия подает чистый воздух на каждый из электромагнитных клапанов. Обратные клапаны до и после одоранта гарантируют направление потока воздуха. Линия чистого воздуха сливается с линиями одоранта перед подачей на арену, чтобы гарантировать продувку одорированного воздуха при закрытии линий запаха.
  6. Установите над ареной быструю цифровую камеру для наблюдения за поведением животных (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение животных контролируется с частотой 60 Гц с помощью одной быстрой цифровой камеры, установленной над ареной (Таблица материалов). Объектив с фиксированным фокусным расстоянием 3,5 мм серии C был установлен с помощью адаптера крепления C/CS, способного захватывать всю арену (Focal Lens, Table of Materials).
  7. Используйте пользовательский код Python для управления оборудованием арены с запахом (Таблица материалов). Программное обеспечение объединяет камеру и все оборудование, необходимое для настройки экспериментальных параметров и получения экспериментальных данных (Таблица материалов).
  8. Настройте ПК, подключенный к плате разработки Teensy 4.0, чтобы обеспечить средства для компьютерной доставки запахов и воды (Odor Arena Hardware and Software, Table of Materials).
  9. Настройте цифровую камеру для экспорта тактового сигнала при записи видеокадров. Сигнал используется для последующей синхронизации с минископом с помощью интерфейсной платы USB (Table of Materials), которая записывает сигналы синхронизации от обеих систем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента программное обеспечение для сбора данных также создает файл событий, содержащий важные события эксперимента и кадр камеры, на котором произошло событие. Файл временных меток также создается для идентификации любых пропущенных кадров, что является редким событием (Odor Arena Software, Table of Materials).

4. Измерение скорости воздуха шлейфа с помощью фотоионизационного детектора (ПИД) ( Рисунок 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод определяет временной ход шлейфа запаха с помощью ПИД, который подвергает газообразный одорант воздействию ультрафиолетового света высокой интенсивности, ионизирующего молекулы одоранта. На выходе устройства обнаруживаются молекулы одоранта в шлейфе запаха. Этот метод позволяет оценить скорость воздуха в области запаха путем сравнения задержки для обнаружения присутствия одорантов, проходящих через два места, с помощью PID.

  1. Разместите быстродействующий миниатюрный ПИД на двух разных расстояниях. Одно место находится близко, а другое - далеко -10 см друг от друга- от источника запаха.
  2. Переведите переключатель GAIN на передней панели ПИД-регулятора в положение x5.
  3. Переведите переключатель PUMP на передней панели ПИД-регулятора в положение Высоко.
  4. Проверьте индикатор состояния светодиодов (LED), показывающий выход датчика (напряжения) на передней панели контроллера при отсутствии одорантов.
  5. Переключите потенциометр OFFSET для обнуления выходного напряжения при отсутствии одорантов.
  6. Откройте клапан запаха на арене запаха.
  7. Измерьте задержку в обнаружении шлейфа запаха с помощью ПИД в каждом месте после открытия клапана. Эта процедура может быть выполнена в автономном режиме путем одновременной записи выходного сигнала ПИД и выхода клапана, зарегистрированного на арене запаха (запах включен) с помощью интерфейсной платы (Table of Materials).
  8. Разделите разницу в задержках в каждом месте на разницу в расстоянии между двумя PID, чтобы рассчитать воздушную скорость шлейфа.

5. Поведенческая тренировка мыши в области запаха ( Рисунок 6)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается поведенческая задача, адаптированная из Findley et al.4. Мышь ограничивают в воде накануне, чтобы мотивировать ее к поиску водной награды. Мышь направляет шлейф запаха (рис. 6B) к водяному носику, расположенному в источнике выделения запаха, для получения водного подкрепления (3 капли по 10 мкл с частотой 1 Гц). В период обучения мышь находится под ограничением воды, имея доступ к 2 мл в день. Масса тела мыши контролируется в период ограничения потребления воды и не должна быть ниже 85% от исходной массы тела. Мышь получает примерно 1 мл воды в день во время тренировки на арене запаха и дополняется дополнительным 1 мл воды в день в клетке после тренировки. Мышь остается под водой в течение максимум 72 часов. Специальное программное обеспечение (Table of Materials) определяет местоположение мыши в режиме реального времени (60 Гц) с помощью простого метода вычитания фона и локализации блобов. Пользователь вручную задает границы полосы движения, домашнюю границу (начальное местоположение для мыши в задней части арены) и целевую границу (рядом с источником запаха спереди). Кроме того, пользователь может решить, как программное обеспечение использует эти границы. Например, пользователь может издавать запахи только тогда, когда мышь находится за границей дома. Чтобы мышь получила награду, пользователь может потребовать, чтобы она оставалась в пределах одорированной полосы, пока она движется к цели (источнику запаха). Как только мышь пересечет целевую границу, она может получить награду. Однако во время обучения любое из этих требований корректируется путем простого редактирования файла 'yaml', разработанного так, чтобы он был понятен и удобен для пользователя.

  1. Во-первых, научите мышь начинать испытания, перемещаясь в заднюю часть арены (определяемую как часть арены, которая находится на расстоянии 40 см от стороны, где воздух поступает в камеру). Подождите, пока мышь уйдет в заднюю часть арены, а затем вручную доставляйте запах и воду по одной случайной полосе. Дайте мышке найти источник и выпить воды.
    1. Повторите эту процедуру много раз, чтобы создать ассоциацию между запахом и водой (рис. 6А, В). Как только мышь научится начинать пробные испытания, используйте автоматизированное программное обеспечение для доставки запахов.
  2. Обучите мышь выполнять задачу навигации по двум полосам запаха с помощью автоматизированного пользовательского программного обеспечения. В этой задаче случайным образом выберите один из двух отверстий для подачи запаха и укрепления мыши водой, когда она достигнет носика, куда подается одорант. В этом протоколе использовался одорант изоамилацетат, разведенный в дозе 1% в минеральном масле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь завершает сеанс из примерно 20 попыток навигации по запаховому шлейфу примерно за 40 минут. Мышь выполняет один сеанс в день. Обученная мышь достигает процента правильной навигации выше случайного выбора в конце сеанса (> 65% правильных выборов). Мышь должна достичь критерия > 65% правильных выборов в задаче двухполосной навигации по запаху после 3-5 сеансов обучения.

6. Эпифлуоресцентная запись свободно движущейся мыши на арене запаха

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод описывает регистрацию нейронной активности клеток пирамидального слоя (SP) в дорсальном CA1 путем визуализации генетически кодируемого кальциевого сенсора GCaMP6f, экспрессируемого у мышей Thy19 , с помощью широкопольной визуализации в минископе во время задачи навигации по шлейфу запаха с двумя носиками (дополнительный фильм 1 и дополнительный фильм 2). Типичный сеанс визуализации занимает 40 минут, что позволяет мыши выполнить около 20 попыток навигации по запахам. Эта методика записывает мышь в течение нескольких месяцев.

  1. Головкой закрепите мышку, поместите минископ на верхнюю часть опорной пластины с помощью микроманипулятора и закрутите установочный винт.
  2. Отрегулируйте линзу для электросмачивания для поиска оптимальной фокальной плоскости с наибольшим количеством ячеек с наибольшей интенсивностью флуоресценции.
  3. Отрегулируйте мощность минископа для получения оптимального динамического диапазона с высоким соотношением сигнал/шум без насыщения. Это можно сделать с помощью визуализации дорсального CA1 у мышей Thy1-GCaMP6f с мощностью минископа, установленной на уровне около 30% при частоте регистрации 30 Гц.
  4. Отпустите мышь внутрь арены запаха, а минископ прикреплен к опорной пластине.
  5. Начните сбор данных с интерфейсной платы для записи транзисторно-транзисторного логического выхода (TTL) цифровой камеры, расположенной в верхней части арены, и сигнала TTL с минископа для последующей синхронизации между поведенческими кадрами и видеокадрами GCaMP6f. Цифровая камера записывает с частотой 60 Гц, а минископ — с частотой 30 Гц.
  6. Начните запись минископа и поведенческих фильмов и включите автоматизированное программное обеспечение для двух задач навигации по запаху носика.

7. Предварительная обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод использует конвейер MATLAB для обработки данных. Код доступен на GitHub (Synchronization Software, Table of Materials). NoRMCorre31 используется для коррекции движения, а EXTRACT32 используется для поиска ROI с изменяющимися во времени флуоресцентными сигналами, сообщаемыми как изменения флуоресценции, нормализованные флуоресценцией между кальциевыми переходными процессами (δF/F0).

  1. Синхронизируйте метаданные арены запахов, кадры цифровых камер и кадры минископа с помощью сигналов синхронизации, записанных интерфейсной платой, выполнив код MATLAB Synchronize_Files_JOVE.m, доступный на GitHub.
  2. Выполняйте коррекцию движения синхронизированных рамок минископа с помощью NoRMCorre (Motion Correction Software, Table of Materials).
  3. Найдите ROI с изменяющимися во времени сигналами δF/F0 с помощью EXTRACT (ROI Extraction Software, Table of Materials).
  4. Разделите данные на испытания (программное обеспечение для синхронизации, таблица материалов).
  5. Помечайте каждую попытку как попадание или промах в зависимости от правильного или неправильного навигационного поведения мыши.
  6. Используйте Behavior Ensemble и Neural Trajectory Observatory (BENTO)33 для визуализации поведения и ROI каждого отдельного испытания (рис. 7A, B и дополнительный фильм 3).

8. Анализ данных - Расшифровка пространственного положения по сигналам мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод использует машинное обучение для декодирования положений мыши по осям X и Y на арене из ROI dCA17. Код MATLAB (Decoding Brain Signals Software, Table of Materials) доступен по адресу https://github.com/restrepd/drgMiniscope.

  1. Введите выходной файл EXTRACT.mat и файл метаданных odor arena в программное обеспечение drgDecodeOdorArenav2.m. Репозиторий GitHub предоставляет эти два файла для примера (Synchronization Software, Table of Materials):
    dFF_file='20220804_FCM22_withodor_miniscope_sync
    _L1andL4_ncorre_ext.mat';
    arena_file='20220804_FCM22withodor_odorarena_L1
    andL4_sync.mat';
    ПРИМЕЧАНИЕ: drgDecodeOdorArenav2.m создает набор данных, разделенный на данные внутри испытания, содержащий сигналы ROI и метаданные (положения мыши по осям X и Y, расположение носика запаха, подача воды и т. д.) для каждого испытания. Код также анализирует декодирование данных между испытаниями. Код использует fitrnet для обучения искусственной нейронной сети с данными δF/F0 для всех ROI для всех испытаний, кроме одного, для прогнозирования позиций X и Y и прогнозирования положения пропущенного испытания с помощью процедуры leave one out.
  2. Нейронная сеть возвращает позиции X и Y в качестве выходных данных. Используйте обученную нейронную сеть для составления прогнозов. Входные данные не учитывали испытания, которые не использовались для обучения сети прогнозированию положений мыши по осям X и Y на арене на основе ROI (рис. 8A, B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование этой процедуры позволяет визуализировать и регистрировать переходные процессы флуоресценции dCA1 GCaMP6f у мышей, перемещающихся по области запахов для поиска источника запахов (Рисунок 6A, B, Дополнительный фильм 1 и Дополнительный фильм 2). Флуоресцентные изображения корректируются с помощью NoRMCorre, а для извлечения ROI используется EXTRACT. Кроме того, запись с помощью интерфейсной платы позволяет синхронизировать сигналы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны шаги по регистрации клеток места и чувствительных к запаху клеток в области dCA1 гиппокампа мышей, ориентирующихся по шлейфу запаха. Важнейшие этапы протокола включают стереотаксическую хирургию, установку опорной пластины минископа, построение области запаха, проверку шлейфа в области запаха, поведенческую тренировку, запись свободно движущейся мыши с помощью минископа, предварительную обработку данных и анализ данных. Кроме того, протокол объясняет про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения США (NIH UF1 NS116241 и NIH R01 DC000566) и Национальным научным фондом (NSF BCS-1926676). Авторы благодарят Эндрю Скаллона за помощь в создании камеры Odor Arena.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Arduino MicroArduinoMicro
Биосовместимая метакрилатная смолаParkellS380C& B-Metabond Клей Фиксация Цемент
Декодирование сигналов мозга Программное обеспечениеCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Стоматологическая бормашинаOsadaLHP-6AZ210015
Коробка для стоматологической бормашиныOsadaXL-23030000 оборотов в минуту
Цифровой стереотаксический инструментStoelting51730DМышь Стереотаксический Инструкт, #51904 Рука цифрового манипулятора, 3 оси, Аддон, ЛЕВЫЙ 
СверлоFST Fine Science Tools19007-05Диаметр наконечника 0,5 мм
Быстрый цифровой фотоаппаратEdmund OpticsBFS-U3-63S4CFLIR Blackfly S
Фокусный объективEdmund OpticsC-Series3,5 мм
Объектив GRINInscopix1050-004595диаметр 1 мм и длина 4 мм
Держатель объектива GRINUCLAhttp://miniscope.org/index.php/Surgery_Protocol
Жидкий тканевый клей3M1469CVetbond Тканевый адгезив
Низкопоточная система анестезии для мышейKent Scientific CorporationSomnoSuitehttps://www.kentscientific.com/products/somnosuite/
Силиконовый клей низкой токсичностиWPI – World Precision InstrumentsKwik-sil
miniPID контроллерASI – Аврора Сайентиал Инк.Быстродействующий миниатюрный фотоионизационный детектормодели 200B
Держатель Miniscope V4 ДержательUCLANAhttps://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-v4/tree/master/Miniscope-v4-Holder
Miniscope V4LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4
Опорная пластина минископа V2LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4-base-plates-variant-2-pack-of-10
Программное обеспечение для минископа DAQ-QTUCLAhttps://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software/wiki
Программное обеспечение для коррекции движенияCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Odor Arena HardwareИндивидуальная3D-модельhttps://www.dropbox.com/scl/fo/lwtpqysnpzis32mhrx3cd/ADomsxyhxu42sqDmTBl2O6k?rlkey=b3l4809eradundt5l3iz0gq74&
dl=0
Программное обеспечение Odor ArenaCUAnschutzhttps://github.com/wryanw/odorarena
Одорант изоамилацетатAldrich Chemical Co06422AXРазбавленный на 1% в минеральном масле без запаха
RHD USB Interface BoardIntan TechnologiesC3100Продукт снят с производства. В качестве альтернативы можно использовать другую аналогичную плату.
Программное обеспечение для извлечения ROICu Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Sutter MicromanipulatorSutter Instrument CompanyMP-285
Программное обеспечение для синхронизацииCU Anschutzhttps://github.com/fsimoesdesouza/Synchronization
мышей Thy1-GCaMP6fJackson LaboratoryIMSR_JAX 028281C57BL/6J-Tg (Thy1-GCaMP6f)GP5.12Dkim/J)

Ссылки

  1. Adoff, M. D., Climer, J. R., Davoudi, H., Marvin, J. S., Looger, L. L., Dombeck, D. A. The functional organization of excitatory synaptic input to place cells. Nat Commun. 12 (1), 3558(2021).
  2. Radvansky, B. A., Oh, J. Y., Climer, J. R., Dombeck, D. A. Behavior determines the hippocampal spatial mapping of a multisensory environment. Cell Rep. 36 (5), 109444(2021).
  3. Lewis, S. M., et al. Plume dynamics structure the spatiotemporal activity of mitral/tufted cell networks in the mouse olfactory bulb. Front Cell Neurosci. 15, 633757(2021).
  4. Findley, T. M., et al. Sniff-synchronized, gradient-guided olfactory search by freely moving mice. ELife. 10, e58523(2021).
  5. Gire, D. H., Kapoor, V., Arrighi-Allisan, A., Seminara, A., Murthy, V. N. Mice develop efficient strategies for foraging and navigation using complex natural stimuli. Curr Biol. 26 (10), 1261-1273 (2016).
  6. Liu, A., Papale, A. E., Hengenius, J., Patel, K., Ermentrout, B., Urban, N. N. Mouse navigation strategies for odor source localization. Front Neurosci. 14, 218(2020).
  7. Tariq, M. F., et al. Using head-mounted ethanol sensors to monitor olfactory information and determine behavioral changes associated with ethanol-plume contact during mouse odor-guided navigation. eNeuro. 8 (1), (2021).
  8. Rigolli, N., Reddy, G., Seminara, A., Vergassola, M. Alternation emerges as a multi-modal strategy for turbulent odor navigation. ELife. (11), e76989(2022).
  9. Ma, M., et al. Sequential activity of CA1 hippocampal cells constitutes a temporal memory map for associative learning in mice. Curr Biol. 34 (4), 841-854 (2024).
  10. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nat Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  11. Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: Past, present and future. Front Cell Neurosci. 13, 141(2019).
  12. Flusberg, B. A., et al. High-speed, miniaturized fluorescence microscopy in freely moving mice. Nat Methods. 5 (11), 935-938 (2008).
  13. Connor, E. G., McHugh, M. K., Crimaldi, J. P. Quantification of airborne odor plumes using planar laser-induced fluorescence. Exp Fluids. 59 (9), 137(2018).
  14. Gumaste, A., et al. A Comparison between mouse, in silico, and robot odor plume navigation reveals advantages of mouse odor tracking. eNeuro. 7 (1), (2020).
  15. Gumaste, A., et al. Behavioral discrimination and olfactory bulb encoding of odor plume intermittency. ELife. 13, e85303(2024).
  16. Marin, A. C., Schaefer, A. T., Ackels, T. Spatial information from the odour environment in mammalian olfaction. Cell Tissue Res. 383 (1), 473-483 (2021).
  17. Eichenbaum, H. The role of the hippocampus in navigation is memory. J Neurophysiol. 117 (4), 1785-1796 (2017).
  18. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  19. Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. In vivo multi-day calcium imaging of CA1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields. J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).
  20. Mizuta, K., Sato, M. Multiphoton imaging of hippocampal neural circuits: techniques and biological insights into region-, cell-type-, and pathway-specific functions. Neurophotonics. 11 (3), 033406(2024).
  21. Radvansky, B. A., Dombeck, D. A. An olfactory virtual reality system for mice. Nat Commun. 9 (1), 839(2018).
  22. Almeida-Santos, A. F., et al. Social isolation impairs the persistence of social recognition memory by disturbing the glutamatergic tonus and the olfactory bulb-dorsal hippocampus coupling. Sci Rep. 9 (1), 473(2019).
  23. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), e108697(2014).
  24. Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging. J Vis Exp. (176), e63049(2021).
  25. Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice. J Vis Exp. (172), e62611(2021).
  26. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Curr Protoc Neurosci. 86 (1), e56(2019).
  27. Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. In vivo calcium imaging in mouse inferior olive. J Vis Exp. (172), e62222(2021).
  28. Yun, M., Shin, J., Jung, M. W. Protocol for calcium imaging of dorsal and ventral CA1 neurons in head-fixed mice. STAR Protoc. 4 (3), 102439(2023).
  29. Yun, M., Hwang, J. Y., Jung, M. W. Septotemporal variations in hippocampal value and outcome processing. Cell Rep. 42 (2), 112094(2023).
  30. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  31. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).
  32. Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. bioRxiv. , (2021).
  33. Segalin, C., et al. The mouse action recognition system (MARS) software pipeline for automated analysis of social behaviors in mice. ELife. 10, e63720(2021).
  34. Chen, Z., et al. A hardware system for real-time decoding of in vivo calcium imaging data. ELife. (12), e78344(2023).
  35. Xue, F., et al. Multi-region calcium imaging in freely behaving mice with ultra-compact head-mounted fluorescence microscopes. Natl Sci Rev. 11 (1), nwad294(2024).
  36. Tabourin, L., Bretzner, F., Galstian, T. Towards a mini-endoscope design with spatially selective excitation and imaging. Biomed Opt Express. 15 (3), 1750-1760 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Кальциевый имиджинггиппокамп CA1навигация в шлейфе запахамыши GCaMP6fимиджинг с использованием GRIN-линзкоррекция движенияактивность нейронных ансамблейфотоионизационный детектордекодирование пространственной траектории
Минископ регистрирует сигналы кальция в гиппокампе мышей, ориентирующихся по шлейфу запаха
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.