Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение характеристик прокоагулянтных тромбоцитов путем измерения экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул из очищенных тромбоцитов человека

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

В этой статье

Краткое содержание

Образование прокоагулянтных тромбоцитов коррелирует с повышенным риском тромбоза. Представлен точный протокол выделения отмытых тромбоцитов из крови человека, предназначенный для количественной оценки экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул, которые являются отличительными особенностями прокоагулянтных тромбоцитов.

Аннотация

Активированные тромбоциты способствуют коагуляции в первую очередь за счет воздействия прокоагулянта фосфолипида фосфатидилсерина (ФС) на поверхности своих наружных мембран и высвобождения ПС-экспрессирующих микровезикул, которые сохраняют исходную архитектуру мембраны и цитоплазматические компоненты исходных клеток. Доступность фосфатидилсерина способствует связыванию основных факторов свертывания, значительно усиливая каталитическую эффективность ферментов свертывания, в то время как высвобождение микровезикул действует как ключевой медиатор межклеточной сигнализации. Прокоагулянтные тромбоциты играют решающую роль в стабилизации тромба во время гемостаза, а их повышенная доля в кровотоке коррелирует с повышенным риском тромбоза. Также было показано, что тромбоцитарные микровезикулы богаты факторами роста, которые способствуют заживлению ран и модуляции воспаления. Анализ экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с помощью проточной цитометрии представляет значительные трудности из-за их небольшого размера и ограниченного числа положительных событий для маркеров, представляющих интерес. Несмотря на значительные успехи, достигнутые за последнее десятилетие, методы оценки воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул все еще находятся в стадии разработки. К сожалению, не существует единого универсально применимого протокола, и необходимо оценить несколько факторов, чтобы определить наиболее подходящую методологию для каждого конкретного применения. Здесь мы описываем подробный протокол выделения отмытых тромбоцитов из крови человека с последующей активацией коллагена и/или тромбина для измерения экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул, которые характеризуют прокоагулянтные тромбоциты. Этот протокол предназначен для облегчения начальной подготовки обогащенной тромбоцитами плазмы и выделения отмытых тромбоцитов. Наконец, воздействие фосфатидилсерина и высвобождение микровезикул количественно оцениваются с помощью проточной цитометрии, что позволяет идентифицировать прокоагулянтные тромбоциты.

Введение

Образование прокоагулянтов тромбоцитов имеет решающее значение для поддержания гемостаза 1,2,3. Этот процесс включает индуцированную агонистами экспрессию фосфолипидов на мембране тромбоцитов, что имеет важное значение для сборки комплексов теназы и протромбиназы 1,3,4. После активации тромбоцитов микровезикулы тромбоцитов также непрерывно высвобождаются 5,6. Микровезикулы (от 50 нм до более 1 мкм в диаметре) инкапсулируют как мембранную структуру, так и цитоплазматические составляющие исходных клеток 7,8. Микровезикулы являются важными медиаторами межклеточной сигнализации 9,10, а также хранилищами факторов роста, способствующих заживлению ран и модуляции воспаления11,12. Также было высказано предположение, что микровезикулы содержат в 50-100 раз больше прокоагулянта, чем активированные тромбоциты. Примечательно, что последние данные свидетельствуют о том, что накопленные тромбоциты активируются, что приводит к образованию микровезикул, что имеет потенциальные последствия для практики трансфузионной терапии тромбоцитами. Увеличенная продолжительность хранения микровезикул и повышенная прокоагулянтная активность делают их перспективной заменой тромбоцитам при переливании крови14.

Методологические инновации были внесены для прямой и косвенной оценки образования тромбоцитарных прокоагулянтов как в здоровых, так и в патологических состояниях 4,14,15. Оценки воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с использованием очищенных тромбоцитов позволили получить новые данные о том, как нарушаются реакции тромбоцитов на прокоагулянт при различных заболеваниях человека 1,4. Эта растущая область исследований также открывает возможности для терапевтических вмешательств 1,4. Тем не менее, выделение и анализ очищенных тромбоцитов из крови занимает много времени, требует специализированного лабораторного оборудования и, таким образом, в настоящее время не может быть адаптирован для рутинной клинической диагностики 16,17. Анализ воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул также является сложной задачей из-за их небольшого размера и количества положительных событий по интересующим нас маркерам18,19.

Проточная цитометрия, использующая флуоресцентное связывание аннексина-V, является краеугольным камнем в оценке экспрессии PS на тромбоцитах и микровезикулах с момента ее создания два десятилетия назад. Он получил широкое признание при исследовании прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул 21,22. Таким образом, здесь представлен оптимизированный протокол, который может быть использован для выделения очищенных тромбоцитов из образцов крови с использованием методики, разработанной группой23 Казенава, и последующей характеристики экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с помощью проточной цитометрии после активации тромбоцитов24. Этот протокол будет способствовать дальнейшему изучению и углубленной характеристике прокоагулянтных тромбоцитов в клинических популяциях, представляющих интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований человека Университетской больницы Бордо. Образцы крови были получены от здоровых добровольцев, которые дали информированное согласие, и эти образцы были обработаны в соответствии с институциональными протоколами. Доноры, которые принимали какие-либо вещества, которые могли повлиять на функцию тромбоцитов, были исключены, если такие вещества были приняты в течение 10 дней до экспериментов. От здоровых добровольцев было получено информированное согласие на сбор их крови и публикацию данных. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Забор крови и подготовка промытых тромбоцитов

  1. Соберите периферическую венозную кровь в пробирки для сбора, содержащие активный антикоагулянт три-натрия цитрат с лимонной кислотой и декстрозой (АХД) после отбрасывания первых 3 мл.
  2. После сбора осторожно переверните пробирку, чтобы смешать кровь с ACD, и дайте смеси отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут перед центрифугированием.
  3. Подсчитайте количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика клеток перед центрифугированием, чтобы определить правильную скорость центрифугирования (Таблица 1). Приготовьте обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) путем центрифугирования при 250 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) без применения тормоза для оптимизации восстановления тромбоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в образце образуются три слоя: верхний слой, содержащий плазму, тромбоциты и небольшую фракцию белых кровяных телец; средний слой, обогащенный лейкоцитами; и нижний слой, состоящий из эритроцитов. Осторожно перенесите PRP из верхнего слоя в новую коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы избежать загрязнения эритроцитами и лейкоцитами.
  4. К PRP добавляют 1 мл ACD-A (см. таблицу 2) и 6,25 мкл апиразы на 9 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Апираза в концентрации 0,02 Ед/мл разрушает следы АТФ или АДФ, секретируемые тромбоцитами, тем самым предотвращая десенсибилизацию рецепторов АДФ тромбоцитов и поддерживая форму тромбоцитов. Ингибитор простациклина PGI2 (0,5 мкМ) также может быть включен в апиразу для предотвращения активации тромбоцитов.
  5. Приготовьте тромбоцитарную гранулу путем центрифугирования в RT при 1100 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую бедную тромбоцитами плазму (PPP), щадящим методом, таким как пипетка Пастера, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл промывочного буфера (см. Таблицу 3 и Таблицу 4). Аккуратно гомогенизируйте с помощью пипетки, затем добавьте еще 3-4 мл моющего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень кальция снижается для предотвращения свертывания с факторами свертывания, присутствующими в плазме. На этом этапе бедная тромбоцитами плазма была полностью удалена, что предотвратило образование тромбов и активацию тромбоцитов за счет выработки тромбина.
  6. Снова центрифугируйте при RT при 1100 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл моющего буфера. Перенесите 150 мкл тромбоцитарной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Затем повторно суспендируйте гранулу с 3-4 мл промывочного буфера.
  7. Выполните окончательное центрифугирование при 1100 x g в течение 10 мин (при RT). Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в объеме реакционного буфера (см. Таблицу 5 и Таблицу 6) до достижения конечной концентрации 5 x10 11 тромбоцитов/л.
  8. Дайте отмытым тромбоцитам отдохнуть не менее 30 минут перед экспериментом, чтобы остатки ингибиторов закончились и тромбоциты акклиматизировались к буферу.

2. Подготовка к анализу

  1. Подготовьте все агонисты и флуорохромы в реакционном буфере. Добавьте 5 л тромбина к 45 мкл буфера (разведение 1:10) и 5 л ионофора к 495 мкл буфера (разведение 1:500).
    1. Для внутренних анализов сравнивайте неактивированные тромбоциты с теми, которые получали одинарные и двойные агонисты. Добавить в различных аликвотах 100 мкл промытых тромбоцитов в соотношении 50 x10 9 тромбоцитов/л к: (i) 10 мкл реакционного буфера, (ii) 3 мкл неразбавленного коллагена (конечная концентрация 30 мкг/мл), (iii) 10 мкл предварительно разведенного тромбина (0,5 МЕ/мл), (iv) 3 мкл неразбавленного коллагена + 10 мкл предварительно разведенного тромбина и (v) 10 мкл предварительно разведенного ионофора (конечная концентрация 2 мкМ), который, как известно, непосредственно повышает внутриклеточный уровень кальция, как отмечалось ранее26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение ионофором кальция, таким как A23187 или иономицин, имеет решающее значение, поскольку он вызывает обширное скремблирование фосфолипидных мембран и усиленную экстернализацию PS.
    2. Осторожно встряхните каждую аликвоту рукой и выдерживайте при 37 °C в течение 5 минут.
      Примечание: Более длительная инкубация агонистов (30 минут) может обеспечить лучшую дифференциацию между популяциями тромбоцитов в процессе анализа проточной цитометрии.
  2. Добавьте 5 мкл неразбавленного Аннексина-V FITC в каждую микропробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
    Примечание: Моноклональное антитело против одного из специфических для тромбоцитов рецепторов, GPIX (CD42b) или интегрин αIIb (CD41, GPIIb), также может быть включено для лучшей идентификации тромбоцитарных клеток.
  3. Добавьте 500 мкл реакционного буфера, чтобы остановить процесс, и приступайте к анализу образца с помощью проточного цитометра.

3. Характеристика прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул методом проточной цитометрии (ФК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного анализа функции тромбоцитов используйте прибор для проточной цитометрии (ФК), сконфигурированный в соответствии с установленнымистандартами 27. Прибор должен быть способен обнаруживать прямое рассеяние (FSC) и по крайней мере один сигнал флуоресценции. Установите детекторы рассеяния света и флуоресценции на логарифмическое усиление. Разбавьте образцы в соответствии с требованиями ФК, чтобы обеспечить подсчет только отдельных тромбоцитов с пониженной скоростью сбора данных.

  1. Установите проточный цитометр на «медленную» скорость потока с пороговым значением не менее 10 000 тромбоцитарных событий. Контролируйте флуоресцентное излучение с помощью проходного фильтра для FITC.
  2. Затвор популяции тромбоцитов с помощью прямого рассеяния (FSC). Исследуйте тромбоциты и высвободившиеся микровезикулы в соответствии с их размерами. Используйте графики плотности для идентификации тромбоцитов и высвобожденных микровезикул как для покоящихся, так и для стимулированных тромбоцитов; Анализируйте каждую закрытую популяцию независимо.
  3. Различают прокоагулянтные тромбоциты по оси FL1. Поместите отрицательный порог в крайнюю правую часть популяции тромбоцитов в состоянии покоя (т.е. в присутствии реакционного буфера). После активации тромбоцитов классифицировать все события, локализованные справа от этого порога, как тромбоциты, экспонирующие фосфатидилсерин.
  4. Дифференцируйте микровезикулы, которые меньше тромбоцитов, по их уникальным характеристикам светорассеяния. Установите пороговое значение на самом низком значении FSC, наблюдаемом в популяции тромбоцитов в состоянии покоя. После активации классифицируйте любые фосфатидилсерин-положительные события, падающие ниже этого порога, как микровезикулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте индивидуальные различия в размере тромбоцитов, при необходимости корректируя отсечку. Убедитесь, что менее 1% микровезикул присутствуют в состоянии покоя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Количественное определение прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул достигается с помощью окрашивания Аннексином-V, при этом регистрируется не менее 50 000 событий на образец. Как указано на шаге 2.2, исходные измерения тромбоцитов проводились из образцов, инкубированных с реакционным буфером, как показано на рисунке 1A. Размеры тромбоцитов оценивали с использованием медианного значения прямого рассеяния (FSC). Несмотря на то, что на FSC влияют различные факторы, он остается распространенн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавние исследования прокоагулянтных тромбоцитов выявили их изменения при нескольких заболеваниях 1,28,29, подчеркнув важность их детального анализа и характеристики 30,31,32. Несмотря на то, что текущие клинические испытания для оценки образования прокоагулянтов тромбоцитов ограничены, за последние дв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A пробирки для сбора кровиBD Vacutainer366645
Аннексин-V FITCBD Pharmingen560931
Апираза Grade VIISigma-AldrichA6410
Бычья сыворотка Альбумин 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Моногидрат лимонной кислотыMerck5949-29-1
Коллаген Стаго86924
Глюкоза Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
ИонофорCalbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Гидрокарбонат натрияMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A Дигидрат
цитрата тринатрия Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2
Oα IIb интегрин (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Ссылки

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Прокоагулянтные тромбоцитыактивация тромбоцитовпроточная цитометрияпромытые тромбоцитыобогащенная тромбоцитами плазмаизоляция тромбоцитовколлаген-индуцированная активациятромбин-индуцированная активация
Определение характеристик прокоагулянтных тромбоцитов путем измерения экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул из очищенных тромбоцитов человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.