Методическая статья

Определение характеристик прокоагулянтных тромбоцитов путем измерения экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул из очищенных тромбоцитов человека

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

В этой статье

Краткое содержание

Образование прокоагулянтных тромбоцитов коррелирует с повышенным риском тромбоза. Представлен точный протокол выделения отмытых тромбоцитов из крови человека, предназначенный для количественной оценки экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул, которые являются отличительными особенностями прокоагулянтных тромбоцитов.

Аннотация

Активированные тромбоциты способствуют коагуляции в первую очередь за счет воздействия прокоагулянта фосфолипида фосфатидилсерина (ФС) на поверхности своих наружных мембран и высвобождения ПС-экспрессирующих микровезикул, которые сохраняют исходную архитектуру мембраны и цитоплазматические компоненты исходных клеток. Доступность фосфатидилсерина способствует связыванию основных факторов свертывания, значительно усиливая каталитическую эффективность ферментов свертывания, в то время как высвобождение микровезикул действует как ключевой медиатор межклеточной сигнализации. Прокоагулянтные тромбоциты играют решающую роль в стабилизации тромба во время гемостаза, а их повышенная доля в кровотоке коррелирует с повышенным риском тромбоза. Также было показано, что тромбоцитарные микровезикулы богаты факторами роста, которые способствуют заживлению ран и модуляции воспаления. Анализ экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с помощью проточной цитометрии представляет значительные трудности из-за их небольшого размера и ограниченного числа положительных событий для маркеров, представляющих интерес. Несмотря на значительные успехи, достигнутые за последнее десятилетие, методы оценки воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул все еще находятся в стадии разработки. К сожалению, не существует единого универсально применимого протокола, и необходимо оценить несколько факторов, чтобы определить наиболее подходящую методологию для каждого конкретного применения. Здесь мы описываем подробный протокол выделения отмытых тромбоцитов из крови человека с последующей активацией коллагена и/или тромбина для измерения экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул, которые характеризуют прокоагулянтные тромбоциты. Этот протокол предназначен для облегчения начальной подготовки обогащенной тромбоцитами плазмы и выделения отмытых тромбоцитов. Наконец, воздействие фосфатидилсерина и высвобождение микровезикул количественно оцениваются с помощью проточной цитометрии, что позволяет идентифицировать прокоагулянтные тромбоциты.

Введение

Образование прокоагулянтов тромбоцитов имеет решающее значение для поддержания гемостаза 1,2,3. Этот процесс включает индуцированную агонистами экспрессию фосфолипидов на мембране тромбоцитов, что имеет важное значение для сборки комплексов теназы и протромбиназы 1,3,4. После активации тромбоцитов микровезикулы тромбоцитов также непрерывно высвобождаются 5,6. Микровезикулы (от 50 нм до более 1 мкм в диаметре) инкапсулируют как мембранную структуру, так и цитоплазматические составляющие исходных клеток 7,8. Микровезикулы являются важными медиаторами межклеточной сигнализации 9,10, а также хранилищами факторов роста, способствующих заживлению ран и модуляции воспаления11,12. Также было высказано предположение, что микровезикулы содержат в 50-100 раз больше прокоагулянта, чем активированные тромбоциты. Примечательно, что последние данные свидетельствуют о том, что накопленные тромбоциты активируются, что приводит к образованию микровезикул, что имеет потенциальные последствия для практики трансфузионной терапии тромбоцитами. Увеличенная продолжительность хранения микровезикул и повышенная прокоагулянтная активность делают их перспективной заменой тромбоцитам при переливании крови14.

Методологические инновации были внесены для прямой и косвенной оценки образования тромбоцитарных прокоагулянтов как в здоровых, так и в патологических состояниях 4,14,15. Оценки воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с использованием очищенных тромбоцитов позволили получить новые данные о том, как нарушаются реакции тромбоцитов на прокоагулянт при различных заболеваниях человека 1,4. Эта растущая область исследований также открывает возможности для терапевтических вмешательств 1,4. Тем не менее, выделение и анализ очищенных тромбоцитов из крови занимает много времени, требует специализированного лабораторного оборудования и, таким образом, в настоящее время не может быть адаптирован для рутинной клинической диагностики 16,17. Анализ воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул также является сложной задачей из-за их небольшого размера и количества положительных событий по интересующим нас маркерам18,19.

Проточная цитометрия, использующая флуоресцентное связывание аннексина-V, является краеугольным камнем в оценке экспрессии PS на тромбоцитах и микровезикулах с момента ее создания два десятилетия назад. Он получил широкое признание при исследовании прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул 21,22. Таким образом, здесь представлен оптимизированный протокол, который может быть использован для выделения очищенных тромбоцитов из образцов крови с использованием методики, разработанной группой23 Казенава, и последующей характеристики экспозиции фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул с помощью проточной цитометрии после активации тромбоцитов24. Этот протокол будет способствовать дальнейшему изучению и углубленной характеристике прокоагулянтных тромбоцитов в клинических популяциях, представляющих интерес.

Протокол

Протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований человека Университетской больницы Бордо. Образцы крови были получены от здоровых добровольцев, которые дали информированное согласие, и эти образцы были обработаны в соответствии с институциональными протоколами. Доноры, которые принимали какие-либо вещества, которые могли повлиять на функцию тромбоцитов, были исключены, если такие вещества были приняты в течение 10 дней до экспериментов. От здоровых добровольцев было получено информированное согласие на сбор их крови и публикацию данных. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Забор крови и подготовка промытых тромбоцитов

  1. Соберите периферическую венозную кровь в пробирки для сбора, содержащие активный антикоагулянт три-натрия цитрат с лимонной кислотой и декстрозой (АХД) после отбрасывания первых 3 мл.
  2. После сбора осторожно переверните пробирку, чтобы смешать кровь с ACD, и дайте смеси отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут перед центрифугированием.
  3. Подсчитайте количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика клеток перед центрифугированием, чтобы определить правильную скорость центрифугирования (Таблица 1). Приготовьте обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) путем центрифугирования при 250 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) без применения тормоза для оптимизации восстановления тромбоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в образце образуются три слоя: верхний слой, содержащий плазму, тромбоциты и небольшую фракцию белых кровяных телец; средний слой, обогащенный лейкоцитами; и нижний слой, состоящий из эритроцитов. Осторожно перенесите PRP из верхнего слоя в новую коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы избежать загрязнения эритроцитами и лейкоцитами.
  4. К PRP добавляют 1 мл ACD-A (см. таблицу 2) и 6,25 мкл апиразы на 9 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Апираза в концентрации 0,02 Ед/мл разрушает следы АТФ или АДФ, секретируемые тромбоцитами, тем самым предотвращая десенсибилизацию рецепторов АДФ тромбоцитов и поддерживая форму тромбоцитов. Ингибитор простациклина PGI2 (0,5 мкМ) также может быть включен в апиразу для предотвращения активации тромбоцитов.
  5. Приготовьте тромбоцитарную гранулу путем центрифугирования в RT при 1100 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую бедную тромбоцитами плазму (PPP), щадящим методом, таким как пипетка Пастера, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл промывочного буфера (см. Таблицу 3 и Таблицу 4). Аккуратно гомогенизируйте с помощью пипетки, затем добавьте еще 3-4 мл моющего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень кальция снижается для предотвращения свертывания с факторами свертывания, присутствующими в плазме. На этом этапе бедная тромбоцитами плазма была полностью удалена, что предотвратило образование тромбов и активацию тромбоцитов за счет выработки тромбина.
  6. Снова центрифугируйте при RT при 1100 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл моющего буфера. Перенесите 150 мкл тромбоцитарной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Затем повторно суспендируйте гранулу с 3-4 мл промывочного буфера.
  7. Выполните окончательное центрифугирование при 1100 x g в течение 10 мин (при RT). Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в объеме реакционного буфера (см. Таблицу 5 и Таблицу 6) до достижения конечной концентрации 5 x10 11 тромбоцитов/л.
  8. Дайте отмытым тромбоцитам отдохнуть не менее 30 минут перед экспериментом, чтобы остатки ингибиторов закончились и тромбоциты акклиматизировались к буферу.

2. Подготовка к анализу

  1. Подготовьте все агонисты и флуорохромы в реакционном буфере. Добавьте 5 л тромбина к 45 мкл буфера (разведение 1:10) и 5 л ионофора к 495 мкл буфера (разведение 1:500).
    1. Для внутренних анализов сравнивайте неактивированные тромбоциты с теми, которые получали одинарные и двойные агонисты. Добавить в различных аликвотах 100 мкл промытых тромбоцитов в соотношении 50 x10 9 тромбоцитов/л к: (i) 10 мкл реакционного буфера, (ii) 3 мкл неразбавленного коллагена (конечная концентрация 30 мкг/мл), (iii) 10 мкл предварительно разведенного тромбина (0,5 МЕ/мл), (iv) 3 мкл неразбавленного коллагена + 10 мкл предварительно разведенного тромбина и (v) 10 мкл предварительно разведенного ионофора (конечная концентрация 2 мкМ), который, как известно, непосредственно повышает внутриклеточный уровень кальция, как отмечалось ранее26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение ионофором кальция, таким как A23187 или иономицин, имеет решающее значение, поскольку он вызывает обширное скремблирование фосфолипидных мембран и усиленную экстернализацию PS.
    2. Осторожно встряхните каждую аликвоту рукой и выдерживайте при 37 °C в течение 5 минут.
      Примечание: Более длительная инкубация агонистов (30 минут) может обеспечить лучшую дифференциацию между популяциями тромбоцитов в процессе анализа проточной цитометрии.
  2. Добавьте 5 мкл неразбавленного Аннексина-V FITC в каждую микропробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
    Примечание: Моноклональное антитело против одного из специфических для тромбоцитов рецепторов, GPIX (CD42b) или интегрин αIIb (CD41, GPIIb), также может быть включено для лучшей идентификации тромбоцитарных клеток.
  3. Добавьте 500 мкл реакционного буфера, чтобы остановить процесс, и приступайте к анализу образца с помощью проточного цитометра.

3. Характеристика прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул методом проточной цитометрии (ФК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного анализа функции тромбоцитов используйте прибор для проточной цитометрии (ФК), сконфигурированный в соответствии с установленнымистандартами 27. Прибор должен быть способен обнаруживать прямое рассеяние (FSC) и по крайней мере один сигнал флуоресценции. Установите детекторы рассеяния света и флуоресценции на логарифмическое усиление. Разбавьте образцы в соответствии с требованиями ФК, чтобы обеспечить подсчет только отдельных тромбоцитов с пониженной скоростью сбора данных.

  1. Установите проточный цитометр на «медленную» скорость потока с пороговым значением не менее 10 000 тромбоцитарных событий. Контролируйте флуоресцентное излучение с помощью проходного фильтра для FITC.
  2. Затвор популяции тромбоцитов с помощью прямого рассеяния (FSC). Исследуйте тромбоциты и высвободившиеся микровезикулы в соответствии с их размерами. Используйте графики плотности для идентификации тромбоцитов и высвобожденных микровезикул как для покоящихся, так и для стимулированных тромбоцитов; Анализируйте каждую закрытую популяцию независимо.
  3. Различают прокоагулянтные тромбоциты по оси FL1. Поместите отрицательный порог в крайнюю правую часть популяции тромбоцитов в состоянии покоя (т.е. в присутствии реакционного буфера). После активации тромбоцитов классифицировать все события, локализованные справа от этого порога, как тромбоциты, экспонирующие фосфатидилсерин.
  4. Дифференцируйте микровезикулы, которые меньше тромбоцитов, по их уникальным характеристикам светорассеяния. Установите пороговое значение на самом низком значении FSC, наблюдаемом в популяции тромбоцитов в состоянии покоя. После активации классифицируйте любые фосфатидилсерин-положительные события, падающие ниже этого порога, как микровезикулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте индивидуальные различия в размере тромбоцитов, при необходимости корректируя отсечку. Убедитесь, что менее 1% микровезикул присутствуют в состоянии покоя.

Результаты

Количественное определение прокоагулянтных тромбоцитов и микровезикул достигается с помощью окрашивания Аннексином-V, при этом регистрируется не менее 50 000 событий на образец. Как указано на шаге 2.2, исходные измерения тромбоцитов проводились из образцов, инкубированных с реакционным буфером, как показано на рисунке 1A. Размеры тромбоцитов оценивали с использованием медианного значения прямого рассеяния (FSC). Несмотря на то, что на FSC влияют различные факторы, он остается распространенным косвенным показателем для оценки размера клеток, в том числе тромбоцитов. Плотностные графики площади (рис. 1A) были использованы для идентификации и гейтирования покоящихся тромбоцитов и высвобожденных микровезикул.

В случае неактивированных тромбоцитов менее 2,9% отображали фосфатидилсерин (ПС) по данным окрашивания Аннексином-V. При активации отмытых тромбоцитов либо только коллагеном, либо в сочетании с тромбином или ионофором кальция, наблюдалось заметное увеличение воздействия PS. Один только коллаген вызвал увеличение PS-положительных тромбоцитов на 26,7%. Тромбин оказывал минимальное влияние на воздействие PS (9,1%), но при сочетании с коллагеном он увеличивал процент тромбоцитов, подверженных воздействию PS, до 36,2%. Для справки, лечение ионофором 2 мкМ привело к тому, что 49,6% тромбоцитов стали прокоагулянтами.

На рисунке 1 показано, что исходная доля микровезикул из отмытых тромбоцитов у здорового человека была минимальной (0,3%). В то время как тромбин и коллаген минимально увеличивали образование микровезикул, образование микровезикул значительно увеличивалось только при комбинации коллагена и тромбина (рис. 1D; 11,4%). Добавление ионофора 2 мкМ приводило к тому, что 44,0% микровезикул, образованных контрольными тромбоцитами, подвергались воздействию PS.

На рисунке 2 представлена информация об изменениях, повторяемости и воспроизводимости, которые можно ожидать от этого процесса.

figure-results-1
Рисунок 1: Воздействие ФС и образование микровезикул в покоящихся и активированных контрольных тромбоцитах. Тромбоциты были либо активированы, либо неактивированы (в состоянии покоя) (А), с 30 мкг/мл коллагена (В), с 0,5 Ед/мл тромбина (С), с комбинациями коллагена и тромбина (D) с 2 мкМ ионофором. Репрезентативные точечные диаграммы отображают размер тромбоцитов (прямое рассеяние (FSC log)) в зависимости от связывания Annexin-V. Горизонтальные и вертикальные линии (E) обозначают тромбоцитарно-отрицательную популяцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Повторяемость и воспроизводимость воздействия ФС и образования микровезикул после инкубации с ионофором. Анализ воздействия ФС и образования микровезикул после инкубации с ионофором 2 мкМ или 5 мкМ в промытых тромбоцитах, обработанных или необработанных цитратом (хелатором кальция): (А) из 4 различных здоровых контрольных групп; (В) из одного здорового контроля повторить 5 раз; и (C) из двух здоровых контрольных приборов, подготовленных двумя разными техниками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Количество тромбоцитов в цельной крови (10,9 на мл)Относительные центробежные силы (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
> 600340

Таблица 1: Относительные центробежные силы для препарата обогащенной тромбоцитами плазмы по отношению к количеству тромбоцитов в цельной крови.

РеагентКоличество
Моногидрат лимонной кислоты (C6H8O7. H2O, 38 мМ)8 г
Дигидрат цитрата тринатрия (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 мМ)180 г
Глюкоза (C6H12O6, 136 мМ)24,6 г
pH раствора регулировать не следует. Держите раствор при температуре 4 °C.

Таблица 2: Приготовление 1 л водного раствора кислоты-цитрат-декстрозы (АКД).

РеагентКоличество
Моногидрат лимонной кислоты (C6H8O7. H2O, 36 мМ)7,56 г
NaCl (103 мМ)6 г
НаОХ4 г
MgCl2,6H 2O (1 мМ)0,203 г
Отрегулируйте pH на уровне 6,5. Держите раствор при температуре 4 °C.

Таблица 3: Приготовление стокового раствора промывочного буфера.

РеагентКоличество
30% бычий сывороточный альбумин (BSA)583 μЛ
CaCl2, 0,25 м400 мкл
Глюкоза40 мг
Апираза31,5 мкл

Таблица 4: Приготовление 50 мл импровизированного раствора промывочного буфера из исходного раствора.

РеагентКоличество
NaCl (137 мМ)8 г
KCl (2,7 мМ)0,2 г
MgCl2,6H 2O (1 мМ)0,203 г
ГЕПЕС (5 мМ)1,19 г
NaHCO3 (12 мМ)1 г
2PO4.2H 2O; 0,3 мМ0,05 г
Отрегулируйте pH на уровне 7,4. Держите раствор при температуре 4 °C.

Таблица 5: Приготовление стокового раствора реакционного буфера.

РеагентКоличество
30% бычий сывороточный альбумин (BSA)167 мкл
CaCl2, 0,25 м400 мкл
Глюкоза50 мг

Таблица 6: Приготовление 50 мл импровизированного раствора реакционного буфера из исходного раствора.

Обсуждение

Недавние исследования прокоагулянтных тромбоцитов выявили их изменения при нескольких заболеваниях 1,28,29, подчеркнув важность их детального анализа и характеристики 30,31,32. Несмотря на то, что текущие клинические испытания для оценки образования прокоагулянтов тромбоцитов ограничены, за последние два десятилетия наблюдается значительный рост клинического интереса. Например, кальций-зависимая скрамблаза TMEM16F (ANO6) участвует в воздействии прокоагулянта фосфатидилсерина (ФС)33. Варианты TMEM16F связаны с синдромом Скотта 33,34,35, редким нарушением свертываемости крови, характеризующимся нарушением скремблирования фосфолипидов и снижением выработки тромбина в активированных тромбоцитах36. Кроме того, повышенный уровень прокоагулянтных тромбоцитов связан с тромботическими инсультами и ишемической болезнью сердца, что вызывает интерес к терапии для ограничения активности прокоагулянтовтромбоцитов 37. Из доступных в настоящее время методов оценки образования прокоагулянтных тромбоцитов оценка экспозиции PS при связывании аннексина-V и высвобождении микровезикул является одной из наиболее часто используемых38,39.

Описанный здесь протокол позволяет выделять очищенные от человека тромбоциты и характеризовать прокоагулянтные тромбоциты путем измерения экспозиции PS и высвобождения микровезикул с помощью проточной цитометрии. Крайне важно рекомендовать здоровым добровольцам воздерживаться от приема лекарств, которые могут повлиять на функцию тромбоцитов, по крайней мере, за 10 дней до забора крови. Забор крови требует осторожности, чтобы избежать травмирования вен или чрезмерно медленного потока, так как они могут вызвать выработку тромбина и активацию тромбоцитов. Цитрат-антикоагулянтная кровь натрия не рекомендуется для приготовления промытых тромбоцитов, так как остаточный кальций может способствовать образованию тромбина и активации тромбоцитов во время центрифугирования17. ACD-антикоагулянтная кровь имеет pH 6,5 и более высокую концентрацию цитрата 22 ммоль/л по сравнению с pH цитрат-антикоагулянтной крови 7,5 и концентрацией цитрата 13 ммоль/л17. Кислый pH и пониженная внеклеточная концентрация кальция в ACD-антикоагулянтной крови препятствуют агрегации тромбоцитов24. Минимизация образования тромбина в процессе сбора имеет важное значение. Нетравматичная венепункция с использованием иглы не менее 21 G рекомендуется для предотвращения венозного застоя или чрезмерного давления. Кроме того, следует отбросить первые несколько миллилитров крови, чтобы избежать загрязнения тканевыми факторами и следовыми количествами тромбина17. Также важно свести к минимуму время между венепункцией и обработкой образца, так как длительное хранение крови может привести к активации тромбоцитов, тем самым увеличивая экспозицию PS и высвобождение микровезикул40. Особое внимание должно быть уделено в течение всей процедуры подготовки тромбоцитов для предотвращения спонтанной предварительной активации тромбоцитов, которая может произойти в самом процессе подготовки41,17. Кроме того, выделение очищенных тромбоцитов требует тщательного избегания контаминации другими клетками крови17. Это включает в себя тщательную аспирацию надосадочной жидкости после центрифугирования тромбоцитов для обеспечения чистоты препарата. Поскольку гранула обычно видна и прочно прикреплена к стенке трубки, надосадочная жидкость может быть легко аспирирована с помощью наконечника для дозатора.

На этапах промывки центрифугированием тромбоциты ресуспендируются в буфере, который имитирует физиологические условия. Использование отмытых тромбоцитов в физиологическом буфере изолирует их от антикоагулянтов и плазмы, тем самым предотвращая тромбин-опосредованные артефакты. В то время как обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) является быстрым методом получения высоких концентраций тромбоцитов, ее использование для функциональных исследований ограничено вызванными антикоагулянтами изменениями pH и содержанием внеклеточного кальция и белка в плазме, которые могут влиятьна активацию тромбоцитов. Кроме того, высокие уровни PS, образующиеся во время активации тромбоцитов, были бы достаточными для того, чтобы способствовать сборке плазменных коагуляционных комплексов, последующему взрыву тромбина и образованию тромбов в PRP, что делает экспериментальные результаты неинтерпретируемыми. Напротив, ресуспендирование в буфере, содержащем апиразу, рекомендуется для поддержания функциональности тромбоцитов путем предотвращения десенсибилизации пуринергических рецепторов за счет деградации АТФ и АДФ42,43. Несмотря на то, что повторные этапы центрифугирования и промывки требуют больше времени, суспензии промытых тромбоцитов, приготовленные этим методом, имеют преимущество в виде большей стабильности (5-8 ч) по сравнению с цитратными препаратами PRP, которые стабильны не более 1-3 ч23.

Это исследование демонстрирует возможность и простоту количественного определения микровезикул с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, производство микровезикул может затеряться в мусоре и шуме машины. Поэтому крайне важно убедиться в том, что проточный цитометр прошел тщательную очистку и что используемые буферы не содержат загрязняющих частиц, которые могут привести к высокому фону во время анализа проточной цитометрии. В качестве альтернативы для выявления образования микровезикул можно использовать специализированные проточные цитометры с возможностями обнаружения мелких частиц. Также было изучено связывание меченного флуоресцеином аннексина-V в зависимости от содержания PS в мембране, что подчеркивает критическую роль достаточных концентраций кальция в буфере для связывания аннексина-V и прокоагулянтного тромбоцитарного ответа44.

Данные, подтверждающие стабильность образцов тромбоцитов с течением времени, в настоящее время скудны. Несколько лабораторий решили эту проблему путем стабилизации образцов путем добавления фиксирующего раствора, такого как буфер, содержащий формальдегид. Добавление фиксатора к свежесобранным образцам тромбоцитов имеет преимущество в сохранении образцов для последующего анализа. Тем не менее, фиксация формальдегида может вызвать искусственно увеличенное связывание аннексина-V. Rochat et al. продемонстрировали, что фиксация тромбоцитов раствором формальдегида в низкой концентрации, не содержащим кальция, не изменяет долю положительных пластинок Аннексина-V45. Тем не менее, исследователи, которым требуется фиксация, должны оптимизировать свой конкретный протокол, чтобы гарантировать, что она не приведет к искусственно измененным результатам. В противном случае образцы должны быть немедленно обработаны.

Другой путь, который также может привести к воздействию PS, включает внутренний апоптоз, процесс, который, как известно, регулирует продолжительность жизни тромбоцитовв циркуляции. Активация проапоптотических белков BAK и BAX приводит к активации каспаз, что способствует экстернализации PS, что приводит к клиренсу тромбоцитов in vivo . Недавно было предложено использовать другой маркер поверхности тромбоцитов, P-селектин/CD62P, в дополнение к Аннексину-V, для отличия прокоагулянтов от апоптотических тромбоцитов47. Ожидается, что прокоагулянтные тромбоциты будут положительными как на маркеры PS, так и на P-селектин, в то время как апоптотические тромбоциты положительны на аннексин-V, но отрицательны на P-селектин. Тем не менее, время также является дифференцирующим фактором между прокоагулянтными и апоптотическими тромбоцитами47. Получение прокоагулянтных тромбоцитов in vitro является быстрым процессом, в то время как внутренний апоптоз является более медленным процессом, занимающим48 часов. В этом контексте использование дополнительных маркеров для оценки прокоагулянтных тромбоцитов не является необходимым, что упрощает метод. Устойчивое увеличение внутриклеточного образованияCa2+ и прокоагулянтных тромбоцитов происходит в течение нескольких минут с очень сильными агонистами, такими как ионофор или комбинированная активация с коллагеном и тромбином, в то время как ингибитор BCL-XL (или миметик BH3) запускает образование апоптотических тромбоцитов, активируя проапоптотические BAK и BAX, вызывая пермеабилизацию митохондриальной наружной мембраны, высвобождение цитохрома С. и активация каспазы49.

В заключение следует отметить, что описанный здесь протокол облегчает выделение очищенных тромбоцитов и их последующую характеристику на прокоагулянтную активность с использованием стандартного лабораторного оборудования и проточной цитометрии. Эта процедура открывает путь для будущих исследований прокоагулянтных тромбоцитов в образцах крови пациентов с потенциальными применениями в клинической практике, например, для диагностики редкого синдрома Скотта50.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A пробирки для сбора кровиBD Vacutainer366645
Аннексин-V FITCBD Pharmingen560931
Апираза Grade VIISigma-AldrichA6410
Бычья сыворотка Альбумин 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Моногидрат лимонной кислотыMerck5949-29-1
Коллаген Стаго86924
Глюкоза Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
ИонофорCalbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Гидрокарбонат натрияMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A Дигидрат
цитрата тринатрия Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2
Oα IIb интегрин (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Ссылки

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи