Методическая статья

Радиосинтез, контроль качества и позитронно-эмиссионная томография 68меченных Ga-меченными наномолекул мелких животных

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67048

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описывается радиосинтез, рецептура, контроль качества нового радиоактивно меченного зонда (т.е. нанотела NM-02 с меченым 68Ga) и его использование для визуализации ПЭТ/КТ мелких животных в модели ксенотрансплантата.

Аннотация

Методы визуализации позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) мелких животных и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) имеют решающее значение в доклинических исследованиях рака, требуя тщательного внимания к синтезу радиоактивных индикаторов, обеспечению качества и протоколам инъекций in vivo . В этом исследовании представлен комплексный рабочий процесс, разработанный для повышения надежности и воспроизводимости экспериментов с ПЭТ мелких животных. Процесс синтеза в радиохимической лаборатории с использованием 68млрд лет подробно описан с акцентом на строгие протоколы контроля качества и обеспечения качества для каждого производства радиоиндикаторов. Такие параметры, как концентрация, молярная активность, pH и чистота, тщательно контролируются в соответствии со стандартами, применимыми к исследованиям на людях. Эта методология включает в себя оптимизированную подготовку шприца и специально разработанную канюлю 30G для точных внутривенных инъекций мышам. Мониторинг состояния здоровья животных во время сканирования, включая температуру и частоту сердечных сокращений, обеспечивает их благополучие на протяжении всей процедуры. Дозировки для сканирования с помощью ПЭТ и ОФЭКТ заранее определены, чтобы сбалансировать сбор данных с минимизацией радиационного воздействия на животных и исследователей. Аналогичным образом, при компьютерной томографии используются заранее запрограммированные настройки для ограничения лучевой нагрузки, что особенно актуально в долгосрочных исследованиях по оценке эффектов лечения. Оптимизируя эти этапы, рабочий процесс направлен на стандартизацию процедур, снижение вариативности и повышение качества визуализации мелких животных с помощью ПЭТ/ОФЭКТ/КТ. Этот ресурс предоставляет ценную информацию для исследователей, стремящихся повысить точность и надежность доклинических исследований в области молекулярной визуализации, что в конечном итоге приведет к прогрессу в этой области.

Введение

Одной из тем, которая имеет первостепенное значение, являются исследования в области рака молочной железы. Рак молочной железы остается часто встречающимся видом рака, составляя примерно 1/3всех случаев рака у женщин. Лечение подбирается с учетом биологических и гистологических особенностей опухоли и стадии заболевания. Шансы на выживание, как правило, высокие, если опухоль уже не метастазировала, в этом случае 5-летняя выживаемость составляет всего около 30%1. Другие гинекологические онкологические заболевания страдают от аналогичной участи, например, рак яичников показывает > 95% 5-летней выживаемости для опухолей 1 стадии и только 15% для метастазирующих опухолей 4 стадии.

Неинвазивная визуализация, в частности позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), преобразовала исследования рака, поскольку она предлагает беспрецедентное понимание молекулярных аспектов опухоли, таких как метаболизм, экспрессия рецепторов и терапевтический ответ 4,5,6. Он позволяет как визуализировать, так и количественно оценивать конкретные метаболические области, что позволяет не только точно диагностировать, но и контролировать эффект (новых) методов лечения в очень короткие моменты времени. Действительно, ПЭТ позволяет оценить ответ в сравнении с отсутствием ответа после 1-3 циклов терапии и делает это лучше и быстрее по сравнению с морфологическими изменениями, наблюдаемыми при классической компьютерной томографии (КТ)7. Неинвазивный характер ПЭТ также позволяет проводить лонгитюдные исследования.

Любая животная модель требует максимальной стандартизации для тщательной оценки терапевтических возможностей новых (радиоактивных) фармацевтических препаратов, поэтому акцент должен быть сделан на этом - как при создании модели опухоли, так и при визуализации/анализе данных ПЭТ мелких животных. Можно спорить о лучшей модели опухоли у животных (подкожная инокуляция или ортотопическая имплантация, опухоли мышей, человека или сингенные опухоли, сопровождающиеся или не сопровождающиеся рутинной клинической помощью), но это выходит за рамки цели данной публикации. Для изучения рака мы используем несколько моделей, и описанная здесь является относительно простой подкожной моделью.

Контроль качества в радиохимии имеет первостепенное значение для безопасности животных и эффективности лечения. Это влияет не только на сам радиофармпрепарат, но и на рецептуру продукта. Существует обширное законодательство о производстве радиофармацевтических препаратов для клинического применения 8,9 (см. 10 для обширного обзора действующего законодательства и руководящих принципов), а также несколько руководств по свойствам радиофармацевтических препаратов для доклинических исследований (см. 11 для подробного обзора). Мы производим радиофармацевтические препараты как для клинического, так и для доклинического применения, упрощая переход от высококачественного контроля качества, как при синтезе для клинического применения, к контролю за доклиническим применением.

Наши исследования сосредоточены на направленной тераностике, особенно на эпидермальном факторе роста 2 (HER2)-положительном раке человека. Поэтому мы разрабатываем новые радиофармацевтические препараты для диагностики и мониторинга рака во время лечения. Успешные диагностические радиофармпрепараты также оцениваются как терапевтические соединения с использованием различных радиоизотопов. Оценка этих радиофармпрепаратов проводится сначала на животных моделях, стремящихся к клинической трансляции после получения многообещающих доклинических результатов. В этой статье мы представим протоколы, используемые на примере одного радиофармпрепарата, для обеспечения контроля и обеспечения качества, а также стандартную практику внутривенного введения мышей и сканирования ПЭТ/КТ с целью повышения точности и надежности доклинических исследований в молекулярной визуализации. Протокол разделен на три различных раздела: радиохимия (синтез индикаторов и контроль качества), создание животных моделей (модель подкожной опухоли) и визуализация.

Протокол

Протокол исследований соответствует самым высоким стандартам благополучия животных и находится в строгом соответствии с Рекомендациями по уходу за животными Университетской клиники Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена. Мы обязуемся обеспечить этичное и гуманное обращение со всеми животными, участвующими в исследованиях, а процедуры рассматриваются и утверждаются местным комитетом по этике животных. Все эксперименты на животных были одобрены немецким компетентным органом (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) на соответствие Закону о защите животных, в сочетании с регламентом по защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.

ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список оборудования, материалов и реагентов, использованных в этом исследовании, представлен в Таблице материалов. Важно отметить, что работа с 68Ga, по возможности, должна производиться с помощью пипетки и, безусловно, избегать использования металла, так как железо может значительно снизить выход маркировки. Это означает, что следует избегать игл до тех пор, пока не будут завершены радиохимические процедуры.

1. Радиохимия

  1. Радиомечение NM-02-DOTA-GA с 68млрд лет
    ВНИМАНИЕ: Протокол включает в себя обращение с радиоактивными материалами и манипуляции с ними. Исследователи должны соблюдать местное законодательство по обращению с радиоактивными материалами, практику ALARA (настолько низкая, насколько это возможно), работать со свинцовой защитой, свести к минимуму время прямого контакта и соблюдать максимальную дистанцию на каждом этапе радиационного облучения. Экспериментальные процедуры должны контролироваться с помощью устройств для обнаружения радиоактивности.
    1. Разбавьте 68Ge/68Ga-Generator вручную или автоматически в 10 мл 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 мл). Захватите 68Ga на картридже PS-H+ (размер M - 0,8 мл), пропустив элюат через картридж. Разбавьте картридж PS-H+ SPE в общей сложности 1 мл 4 М NaCl ступенчато и медленно в микроцентрифужную пробирку.
    2. Выбросьте первые 0,3 мл элюата и соберите оставшиеся 0,7 мл в другую микроцентрифужную пробирку.
    3. Возьмите новую микроцентрифужную пробирку и приступайте к радиомаркировке NM-02-DOTA-GA, как указано в протоколе производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгат нанотело-хелатор (NM-02-DOTA-GA) был предварительно приготовлен в соответствии с протоколом поставщика. Конъюгат может храниться в аликвотах при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
    4. Отрегулируйте pH продукта до 7, используя до 5 мкл 3 M NH4OAc.
  2. Контроль качества
    1. Измерьте активность концентрированного образца в микроцентрифужной пробирке с помощью измерителя активности при правильной настройке (68Ga в качестве изотопа; 1 мл шприца, 0,1 мл для геометрии). Радиохимический выход (с коррекцией распада) должен составлять не менее 40%.
    2. Определите pH с помощью тест-полоски pH (0-14), выделив достаточное количество на тест-полоске pH (10-15 μL).
    3. Тонкослойная хроматография (ТСХ)
      1. Нанесите 1 мкл реакционной смеси радиоактивного мечения на полоску TLC, пропитанную диоксидом кремния. Дайте аликвоте высохнуть около 1 минуты. Запустите ТСХ, используя лимонную кислоту в качестве подвижной фазы, предварительно заполненную примерно на 2-3 мм, в закрытой камере ТСХ. Извлеките полоску TLC из камеры, когда жидкость достигнет верхней части полосы.
      2. Поместите полоску TLC на радиосканер TLC и измерьте ее в соответствии с протоколом производителя. Продукт должен появиться в начале координат (Rf < 0,2), в то время как свободные катионы 68Ga будут элюироваться с фронтом растворителя (Rf > 0,9).
      3. Рассчитайте выход реакции радиоактивного мечения с помощью радиохроматограммы, разделив интегрированную площадь под кривой (AUC) от Rf 0,0-0,2 на общую AUC (Rf 0,0-1,0 ) и умножив на 100.
    4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
      1. Убедитесь, что ВЭЖХ работает не менее 10 минут с использованием правильного растворителя, чтобы все линии были затоплены, и отрегулируйте настройку для измерения. Используйте изократический поток смеси ацетонитрила (растворитель А) и смеси 0,9% раствора NaCl (980 мл) в соотношении 50:50 в сочетании с трифторуксусной кислотой (1 мл) и раствором цитрата (20 мл) в качестве растворителя В. Измерьте поглощение ультрафиолета при длине волны 280 нм.
      2. Возьмите 5 μL продукта и разбавьте его 15 μL 0,9% NaCl. Введите 15 μL смеси в аналитическую радио-ВЭЖХ (5 μм SEC-s2000 154 Å колонка; расход: 2 мл/мин).
      3. Используйте изократический поток смеси ацетонитрила (растворитель А) и смеси 0,9% раствора NaCl (980 мл) в соотношении 50:50 в сочетании с трифторуксусной кислотой (1 мл) и раствором цитрата (20 мл) в качестве растворителя В. Измерьте поглощение ультрафиолета при длине волны 280 нм. Существует незначительный сдвиг во времени удержания между УФ- и гамма-каналами; это связано с конструкцией ВЭЖХ (гамма-сигнал устанавливается последовательно после УФ-детектора).
      4. Определение радиохимической чистоты путем интегрирования пиков в гамма-канале. Продукт должен находиться в диапазоне интеграции, который был определен ранее путем измерения нерадиоактивно меченного нанотела. Кроме того, интегрируем все остальные пики в гамма-канале и оцениваем их как примеси. Чистота должна составлять >95%.
    5. Эндотоксин
      1. Приготовьте разбавление продукта в соотношении 1:20 общим объемом 150 мкл с использованием (сертифицированной) воды, не содержащей эндотоксинов, для разбавления.
      2. Вставьте одноразовый картридж с эндотоксинами, который предварительно заполнен всеми необходимыми реагентами, в считыватель для тестирования эндотоксинов и загрузите 25 мкл разведенного продукта в каждую патронную камеру.
      3. Нажмите кнопку воспроизведения. ВТС имеет внутренний позитивный и негативный контроль и будет включен в итоговый отчет. Тест занимает около 15 минут. Продукт считается безэндотоксинным, если содержание эндотоксина составляет < 8,7 ЕД/мл при Vmax = 20 мл.
    6. Ретроспективная стерильность
      1. После инъекции и сбора качественного образца радиофармпрепарат хранить в стерильном флаконе в холодильнике при температуре 4 °C.
      2. Передайте образец сертифицированному институту для анализа стерильности (внутреннему или стороннему органу), если предел исключения в 10,5 Бк или 10 Бк/г не превышен для проведения испытания на стерильность в соответствии с12.
  3. Препарат из шприца (один на животное)
    1. Измерьте активность продукта с помощью измерителя активности при правильной настройке (68Ga в качестве изотопа; 1 мл шприца, 0,1 мл для геометрии).
    2. Возьмите 15 МБк продукта (около 25 μл) в микроцентрифужную пробирку и заполните объем 0,9% NaCl до 75 μл.
    3. Добавьте в шприц 50 μЛ и измерьте его с помощью измерителя активности при правильной настройке (68Га в качестве изотопа; 1 мл шприца, 0,1 мл для геометрии). Шприц должен содержать 10 МБк продукта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только образуется нанотело NM-02, меченное 68Ga, пластиковые наконечники для пипеток больше не нужны при работе с 68Ga. С этого момента, когда в протоколе упоминается обращение с жидкостью, используйте соответствующий шприц (1 мл) и иглу (27-30 г).

2. Генерация животных моделей

  1. Содержание животных
    1. Используйте самок с иммунодефицитом Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu мышей в возрасте 6-8 недель (от коммерческого поставщика) для развития подкожных опухолей. По прибытии разместите всех мышей непосредственно в комнате для животных и дайте транспорт не менее 1 недели после транспортировки для акклиматизации.
    2. Содержание животных в режиме 12 часов свет/12 часов в темное время суток и обеспечение свободного доступа к еде и воде. Поддерживайте комнатную температуру и относительную влажность в диапазоне от 20-25 °C до 45%-65% соответственно.
  2. Подготовка клеток к имплантации
    1. Начните культивирование клеток с 1 x 106 клеток SKOV-3 и добавьте 25 мл предварительно подогретой среды DMEM/F12, обогащенной 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицином, в колбу для клеточной культуры T175.
    2. Культивируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 и заменяйте полную среду не реже 2 раз в неделю.
    3. За 1 неделю или не позднее чем за 1 день до имплантации клеток возьмите 20 мкл среды из колбы для клеточной культуры для исследования на микоплазму13. Используйте только микоплазмоотрицательные клетки для клеточной инъекции.
    4. В день инъекции клеток аспирируйте всю среду и пипеткой введите 5 мл PBS во флакон. Покрутите флакон взад и вперед несколько раз, чтобы смыть остатки среды.
    5. Добавьте в колбу 3 мл трипсина и инкубируйте ее в течение 4 мин в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2 для диссоциации клеток. Проверьте под микроскопом с 40-кратным увеличением, отделились ли клетки от колбы с клеточной культурой.
    6. Добавьте 7 мл среды для нейтрализации активности трипсина и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
    7. Центрифугируйте клетки при давлении 150 x g в течение 5 минут (при комнатной температуре), чтобы получить клеточную гранулу. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл среды для ресуспендирования клеток.
    8. Возьмите 12 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку и добавьте равное количество трипанового синего. Загрузите в камеру гемоцитометра 10 мкл тщательно перемешанной клеточной суспензии.
    9. Подсчитайте неокрашенные, жизнеспособные клетки в пределах определенной области и рассчитайте количество клеток. Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 x 107 клеток /мл среды и тщательно перемешайте клеточную суспензию с 1 мл матрицы базальной мембраны.
    10. Возьмите 5 x 106 клеток в 0,2 мл клеточной среды с 50% матрицей базальной мембраны в 1 мл инсулинового шприца для каждой мыши. Держите шприц на льду до момента инъекции, чтобы предотвратить затвердевание матрицы базальной мембраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь весит менее 20 г, вводите только 150 мкл (для 15-20 г) или 100 мкл (для 10-15 г) смеси. При подкожном применении следует следить за тем, чтобы максимальный объем в 10 мл/кг массы тела, рекомендованный GV-SOLAS, не превышал14.
  3. Инокуляция и последующее наблюдение
    1. Вводите клеточную суспензию подкожно в бок бодрствующего животного, фиксируя шею и хвост одной рукой. Обычно мы предпочитаем инъекции в левый фланг.
    2. Подождите 10−15 с, чтобы матрица базальной мембраны застыла, затем удалите иглу.
    3. Контролируйте рост опухоли ежедневно после имплантации с помощью цифрового штангенциркуля для измерения двух перпендикулярных осей опухоли.
    4. Используя эти измерения, оцените рост опухоли с помощью объема опухоли, рассчитанного по формуле:
      VT = L × B2 × π / 6
      где V T — объем опухоли вмм3, L — длина опухоли в мм (т. е. большая из двух перпендикулярных осей), а B — ширина опухоли в мм (т. е. меньшая из двух перпендикулярных осей15). Этот метод имеет тенденцию завышать объем опухоли, так как он также включает в себя кожу.
    5. Масса опухоли влияет на вес мыши при измерении на электронных весах. Чтобы рассчитать вес животного с поправкой на массу опухоли, воспользуйтесь следующей формулой:
      mмышь-T = mмышь - 0,82 ×В Т
      где mmouse-T — масса мыши без учета массы опухоли в г, mmouse — масса мыши по электронным весам в г, а VT — рассчитанный объем опухоли вмм3. Число 0,82 г/мм3 является результатом среднего значения серии опухолей, выделенных в предыдущих экспериментах на животных, взвешенных и определенных по приведенной формуле. Он представляет собой среднюю плотность опухоли.
    6. Кроме того, определите, насколько велика опухоль по сравнению с мышью, и контролируйте опухолевую нагрузку с помощью следующей формулы:
      Опухолевая нагрузка [%] = (0,82 × ВТл) / ммышь × 100
      где опухолевая нагрузка выражается в процентах, 0,82 × V T соответствует массе опухоли в г (т.е. VT, расчетный объем опухоли вмм3, умноженный на среднюю плотность опухоли), а mмышь — масса мыши по шкале в г.
    7. Когда объем опухоли у животных превысит 200мм3, запишите им неинвазивную ПЭТ/КТ или ОФЭКТ/КТ, в зависимости от эксперимента.

3. Визуализация

  1. Подготовка шприца (по индивидуальному заказу)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиный хвост маленький; поэтому требуется использование канюли 27G или меньше (большие цифры соответствуют меньшим иглам). В случае самок мышей единственными доступными венами для болюсных инъекций являются три хвостовые вены. Анатомически спинная хвостовая вена находится ближе к позвоночному столбу по сравнению с двумя боковыми венами; Не делайте инъекции в эту вену, чтобы избежать ятрогенного царапания костей. Исходя из опыта, использование канюли 30G обеспечивает наилучшие результаты, так как также можно получить доступ к более мелким венам. Поскольку катетеры 30G недоступны для покупки, этот тип должен быть изготовлен исследователем с осторожностью.
    1. Подготовьте шприц с радиоактивным индикатором в зависимости от планируемого пути введения. При внутривенных инъекциях убедитесь, что максимальный объем ввода составляет 5 мл/кг массы тела для мыши весом 25 г; это означает, что максимальный объем впрыскиваемого материала составляет 125 μл.
    2. Чтобы приготовить катетер 30G, во-первых, используйте любую иглу 30G и удалите металлический стержень иглы либо металлическими ножницами, либо отогнув его от пластика.
    3. Вручную вставьте трубку PE10 диаметром 0,3 мм в ту часть вала, которая была снята со ступицы. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить перфорации трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать и другие виды пластика; тем не менее, PE10 предлагает наилучший баланс между жесткостью и гибкостью стены.
  2. Внутривенная инъекция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутривенные инъекции также могут быть сделаны животным в сознании; Однако, если это не требуется, животным необходимо вводить препараты под действием изофлурановой седации, чтобы снизить нагрузку на исследуемое животное.
    1. Заполните катетер 30G 0,9% буфером NaCl или любым другим желаемым буфером.
    2. Поместите мышь в индукционную камеру и непрерывно заполняйте ее смесью кислорода (или воздуха под давлением медицинского класса) и газообразного изофлурана до тех пор, пока животное не потеряет рефлекс выпрямления. Для индукции используйте 3,5%-5% изофлуран с потоком кислорода или воздуха 0,8 л/мин.
    3. Немедленно поместите мышь под действием седативных препаратов в исходное вентральное положение на нагревательный коврик (37-38 °C), сохраняя при этом седативный эффект изофлурана через носовой конус. Часто проверяйте мышей на наличие признаков перегрева (например, чрезмерное растяжение, учащенное дыхание, покраснение кожи). Для поддержания анестезии используют 1,8%-2,5% изофлуран с потоком кислорода или воздуха 0,8 л/мин.
    4. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание во время седации. Осмотрите обе боковые хвостовые вены и выберите лучшую для инъекции. Необходимо учитывать видимость и диаметр вены. Для достижения наилучших результатов слегка поверните хвост так, чтобы выбранная вена соприкасалась с нагревательным ковриком, и дайте вене расшириться в течение 1 минуты.
    5. Поверните всю мышь в боковое положение так, чтобы выбранная вена вышла вверх. Зафиксируйте кончик и основание хвоста скотчем.
    6. Возьмите катетер 30G доминирующей рукой и аккуратно поместите указательный палец недоминантной руки на выбранную вену, чтобы создать резервную копию крови внутри. На месте подпорки жилка будет расширяться, образуя небольшой горб.
    7. Доминирующей рукой поместите катетер 30G параллельно хвосту лицом к горбу на вене. Переместите доминирующую руку вперед. В большинстве случаев эта техника обеспечивает прямое венепункцию.
    8. Попав внутрь вены, в пластиковой трубке становится виден рефлюкс крови. Зафиксируйте пластиковую трубку так, чтобы игла не двигалась внутри вены во время инъекции. На свободный конец трубки вставьте шприц-индикатор, подключенный к игле 30G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда необходимо оценить динамическое распределение индикатора, необходимо выполнить следующие действия после того, как животное помещено на кровать сканера ПЭТ и инициировано ПЭТ.
    9. Медленно вводите содержимое трассирующего шприца в течение не менее 10 с. Не снимая иглу 30G с катетерной системой 30G, извлеките только индикаторный шприц и подсоедините шприц с 0,9% буфером NaCl (или любым другим желаемым буфером) для промывания катетера. Непрерывно контролируйте дыхание во время процедуры инъекции и регулируйте концентрацию изофлурана, чтобы поддерживать примерно 1 вдох в секунду.
    10. Извлеките катетер 30G из хвостовой вены и используйте стерильный ватный компресс, чтобы остановить кровотечение.
    11. Чтобы измерить остаточную активность, измерьте катетер 30G, буферный шприц, пустой шприц с индикатором и ватный компресс, так как все они содержат небольшое количество индикатора, которое не достигло животного.
  3. Сбор данных ПЭТ/КТ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для нанотел NM-02, меченного 68Ga, все животные визуализируются с помощью системы ПЭТ/КТ мелких животных.
    1. Приобретение ПЭТ
      1. Поместите мышь под действием седативных препаратов в брюшное положение на подстилку животного и прикрепите ее к сканеру ПЭТ. Переключите поток изофлурана на носовой конус на ПЭТ и поддерживайте его на уровне 1,5%-2,5% изофлурана в медицинском воздухе со скоростью 0,8 л/мин так, чтобы частота дыхания животного во время сканирования составляла от 75 до 50 вдохов в минуту.
      2. Закрепите мышь за ее шеей к лежанке животного с помощью медицинского скотча. При необходимости нанесите офтальмологическую мазь еще раз на глаза мыши, чтобы предотвратить пересыхание во время седации.
      3. Включите грелку в лежанке животного примерно на 80% мощности, что эквивалентно примерно 30 °C.
      4. Установите время сбора данных на 45 минут и выберите интересующую область, которая будет сканироваться. Выберите 68Ga в качестве исследуемого изотопа и начните сканирование. Введите количество введенной активности, время инъекции и время измерения пустого шприца. Одно положение кровати из ПЭТ составляет 160 мм, что достаточно для сканирования всего тела мыши.
      5. Когда необходимо оценить динамическое распределение индикатора, сначала запустите сканирование ПЭТ, подождите 30 секунд для сбора данных и только после этого приступайте к шагам 3.2.9-3.2.10. Оставьте катетер в мыши с прикрепленным буферным шприцем, чтобы избежать дальнейшей кровопотери. Катетер может быть отсоединен в конце ПЭТ, перед получением КТ, чтобы избежать артефактов.
    2. Регистрация КТ
      1. Отсоедините лежанку животного от ПЭТ-сканера и сразу же подключите ее к компьютерному томографу. При необходимости также отсоедините канюлю от хвостовой вены. По крайней мере, через 30 минут после венепункции место инъекции уже коагулируется, поэтому кровотечения больше не будет.
      2. Переключите поток изофлурана на носовой конус в компьютерном томографе.
      3. Выберите ту же область интереса для сканирования для ПЭТ-изображения. Выберите стандартный протокол регистрации: 440 мкА, 50 кВпик, время экспозиции 32 мс и вращение на 1080° в спиральном режиме с 960 экспозициями/360°; Продолжительность компьютерной томографии составляет примерно 7 минут для сканирования всего тела мыши.
      4. Контролируйте частоту дыхания и включите грелку в лежанку животного. Непрерывно контролируйте дыхание во время сканирования и регулируйте концентрацию изофлурана, чтобы поддерживать частоту дыхания от 75 до 50 вдохов в минуту.

4. Уход за животными после визуализации

  1. По окончании сканирования животному требуется не менее 15 минут, чтобы проснуться. Чтобы избежать агрессии однопометника, держите животное в клетке в одиночестве примерно на 15 минут или до тех пор, пока оно не сможет ходить самостоятельно, пока его не вернут в исходную клетку. В течение этого времени используйте инфракрасный свет, чтобы избежать переохлаждения.
  2. Первоначально положите животное на левый бок (безопасное положение), чтобы избежать гемодинамического удара. Пусть офтальмологическая мазь останется, так как она будет удалена самим животным, как только оно придет в себя.

5. Реконструкция ПЭТ/КТ

  1. Выполните реконструкцию ПЭТ с использованием трехмерной максимизации ожидания упорядоченного подмножества (т.е. OSEM-3D с 30 итерациями) с энергетическим окном ± 15% от пика 511 кэВ до размера изометрического вокселя 0,4 мм в матрице 192 × 192 × 384. Примените поправки на основе компьютерной томографии (т. е. коррекцию затухания, коррекцию рассеяния, мертвое время и случайные события) к реконструкции ПЭТ.
  2. В случае, если необходимо оценить динамическое распределение трассера, примените многокадровую реконструкцию. Например, для сканирования продолжительностью 45 минут можно использовать следующие кадры: 4 x 30 с, 3 x 1 мин, 5 x 2 мин, 2 x 5 мин и 2 x 10 мин.
  3. Реконструируйте стандартные протоколы сбора данных КТ с помощью итерационного алгоритма реконструкции (т.е. ISRA) до размера изометрического вокселя 0,2 мм в матрице 200 × 200 × 425. Используя программное обеспечение поставщика, преобразуйте значения CT в единицы Хаунсфилда (HU) по формуле:
    figure-protocol-1
    где μw — линейный коэффициент затухания воды, μa — линейный коэффициент затухания воздуха и μt — линейный коэффициент затухания ткани.
  4. Изображения ПЭТ и КТ были автоматически выровнены после реконструкции с использованием матрицы, сгенерированной в результате капиллярного фантомного сканирования. Архивируйте все восстановленные данные, а также передавайте их на сервер базы данных с помощью программного обеспечения для анализа изображений по мере необходимости.

6. Обработка и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Совместно зарегистрированные изображения ПЭТ/КТ в дальнейшем используются для количественной оценки на сервере базы данных программного обеспечения для анализа изображений, где каждое гибридное сканирование сохраняется в качестве объекта.

  1. Определите опухоль на основе компьютерной томографии и выберите ее в качестве области интереса. Вручную замаскируйте основание опухоли на КТ.
  2. Чтобы добиться независимой от пользователя сегментации, установите порог для вновь сформированной маски опухоли на ПЭТ или ОФЭКТ. Для ПЭТ используйте минимальный порог 1,0 стандартизированного значения поглощения (SUV). Для ОФЭКТ используйте минимальный порог, превышающий среднее поглощение пула крови, измеренное в сердце или терминальной абдоминальной аорте.
  3. Запишите среднее, максимум, среднее значение самых горячих 10 вокселей (т.е. горячее среднее 10) и общее поглощение вновь сгенерированных интересующих объемов.
  4. Используйте эти значения для создания значений SUV и целевого фона (TBR), которые в дальнейшем будут использоваться для статистического анализа.

Результаты

Одним из наиболее важных аспектов контроля качества радиофармацевтического препарата является использование ВЭЖХ, так как это показывает не только химическую и радиохимическую чистоту (в данном случае 98,2%), но и позволяет доказать идентичность радиофармпрепарата путем сравнения времени элюирования и формы пика с таковыми у нерадиоактивного эталонного соединения. Это эталонное соединение, в данном случае, представляет собой немеченное нанотело, правильность которого доказана классическими методами, такими как масс-спектрометрия или ядерный магнитный резонанс. Эти методы не могут быть применены непосредственно к радиоактивному соединению (его масса недостаточна для генерации сигнала), но при сравнении радиоактивного соединения с его эталоном можно получить достаточно доказательств того, что правильное соединение действительно было помечено и не было изменено во время синтеза. Обратите внимание на незначительную разницу во времени удержания между радиоактивным продуктом и эталоном на рисунке 1, соответствующую последовательному измерению потока ВЭЖХ (сначала измеряется ультрафиолетовое излучение; затем потоку требуется примерно 0,2 минуты, чтобы достичь детектора радиоактивности в типичной конфигурации).

figure-results-1
Рисунок 1: Типичная аналитическая ВЭЖХ-хроматограмма для контроля качества нанотел NM-02, меченных 68Ga-02 (GLNM-02). Поглощение ультрафиолета холодного соединения (т.е. верхняя панель) измеряется на длине волны 280 нм и показывает пик через 4,18 мин со сдвигом на 0,22 мин. Пик продукта, меченного 68Ga, можно увидеть в гамма-детекторе (т.е. на нижней панели). Радиохимический выход составляет 98,2%. mAU = миллиединицы поглощения, NM-02 = наш продукт, UV = ультрафиолетовый световой канал, nm = нанометр, min = минута, CPS = количество в секунду, GLMN-02 = 68Ga-меченое нанотело NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = гамма-канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

При отсутствии ВЭЖХ или в дополнение к ней, ТСХ может использоваться для определения выхода маркировки и чистоты конечного продукта (но не идентичности, и не такой детализированной, как ВЭЖХ). Благодаря своей низкой сложности, ТСХ идеально подходит для тех случаев, когда путь радиосинтеза все еще оптимизируется. На рисунке 2 представлена хроматограмма TLC нанотела NM-02, меченного Ga, 68Ga-02 (кажущаяся радиохимическая чистота 99,9%).

figure-results-2
Рисунок 2: Типичная аналитическая ТСХ-хроматограмма для контроля качества нанотела, меченного 68Ga, NM-02 (GLNM-02). Количество площадей строится в зависимости от расстояния, пройденного растворителем (цитратом) на пластине TLC. Rf составляет 0,2, а радиохимическая чистота – 99,9%. C = Количество, мм = миллиметр, GLNM-02 = 68Ga-меченое нанотело NM-02, TLC = тонкослойная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В процессе подготовки данных визуализации к публикации стандартной практикой является показ по крайней мере одного отдельного изображения КТ и ПЭТ. Такой подход позволяет проводить всестороннюю оценку биораспределения индикаторов. Стандартное масштабирование КТ составляет от -1000 HU до 1000 HU, что позволяет визуализировать все мягкие ткани в одном окне. Как показано на рисунке 3А, этот метод позволяет четко разграничить почки мыши, одновременно позволяя оценить костную ткань.

Для шкалы ПЭТ установите нижний порог для внедорожника на уровне 0,0 при сохранении минимального верхнего порога 1,0 (рисунок 3B), предпочтительно с использованием нормализации массы тела при расчете внедорожника (т. е.внедорожника bw). Кроме того, для количественной оценки SUVmean является предпочтительным по сравнению с SUVmax; Если используется SUVmax, то используйте среднее значение самых горячих 10 вокселей вместо значения самого горячего одиночного вокселя при расчетеразмера внедорожника. Подготовьте слияние признаков изображений ПЭТ/КТ путем объединения срезов КТ и ПЭТ (рис. 3C).

Для того, чтобы читатели могли независимо друг от друга оценить биораспределение индикаторов по всему телу, максимальная проекция интенсивности одного и того же ПЭТ-сканирования может быть представлена с использованием той же шкалы, что и срез ПЭТ (рис. 3D).

figure-results-3
Рисунок 3: Изображения ПЭТ/КТ in vivo подкожной мыши с опухолью SKOV-3. Изображение получено через 3 ч после внутривенного введения нанотела NM-02 (GLNM-02) с массой 5 MBq 68Ga. (A) Изображение КТ масштабируется в диапазоне от -1000 HU до 1000 HU, в то время как (B) изображение ПЭТ имеет значение от 0,0 до 5,0 SUV. (C) При слиянии ПЭТ/КТ используется та же шкала. (D) Проекционное изображение максимальной интенсивности (MIP) ПЭТ также масштабируется с использованием SUV 0,0 и 5,0. Все снимки ПЭТ показывают хорошее поглощение опухоли GLNM-02, и хорошо виден почечный клиренс. CT = компьютерная томография, ПЭТ = позитронно-эмиссионная томография, MIP = проекция максимальной интенсивности, HU = единица Хаунсфилда, SUV = стандартизированное значение поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В конкретном случае нанотела NM-02, меченного 68Ga, заметное поглощение опухоли может наблюдаться на левом фланге мыши. Кроме того, также очевиден почочный клиренс индикатора. При представлении проекции максимальной интенсивности ПЭТ также становится видимой активность мочевого пузыря, усиливая почечный клиренс индикатора. В данном конкретном случае стоит упомянуть, что почка, опухоль и мочевой пузырь не могут быть показаны в одном и том же 2D-срезе. Благодаря включению проекции максимальной интенсивности в публикации, все биораспределение индикатора представлено на одном и том же изображении.

Обсуждение

Радиосинтез
Описанный здесь радиосинтез типичен для нового соединения, меченного 68Ga: короткое время синтеза, с акцентом на подходящий pH и избегание металлов, когда это возможно. Для этого важно строго следовать порядку, в котором добавляются компоненты. В любом случае, значение pH раствора 68Ga должно быть сначала скорректировано до pH 4 с помощью 3 M NH4OAc; в противном случае нанотело может деградировать, если pH будет слишком кислым. Общие понятия 68Ga-синтеза были описаны ранее16, поэтому мы не будем здесь вдаваться в подробности. Модуль автоматизированного синтеза требует дальнейшей оптимизации в части снижения дозы облучения. Это требует значительных усилий, которые выходят за рамки поисковых исследований в типичном доклиническом эксперименте, как описано здесь. Более того, автоматизированный синтез вряд ли даст те небольшие объемы, которые мы можем получить с помощью текущего метода (< 1 мл), что позволяет получить более высокие концентрации 68Ga и более высокую удельную активность.

Контроль качества все равно должен выполняться и регистрироваться в мельчайших подробностях. Исключением из этой детали является pH: в то время как измерения pH для клинических синтезов часто выполняются очень точно с помощью pH-метров, здесь достаточно измерить pH с помощью простой pH-полоски, поскольку требования к внутривенным инъекциям позволяют это (любой pH от 6 до 8 допустим14). Этот простой метод снижает стоимость и вероятность загрязнения оборудования радиоактивными материалами.

Рецептуры для животных моделей
Окончательная формулировка индикатора является важнейшим аспектом индикатора, аспектом, который часто плохо описывается в доклинических исследованиях. Несмотря на то, что существует четкое законодательство в отношении разработки фармацевтических препаратов для испытаний на людях, включая радиофармацевтические препараты, на доклинической стадии, существуют только рекомендации17,18, в которых конкретно не обсуждаются растворители или составы. Эти руководящие принципы часто используются при составлении или оценке юридически обязательных протоколов для утверждения комитетами по этике (животных) (в Германии: LANUV19), но в этих документах недостаточно подчеркивается важность формулировки. Вполне вероятно, что плохие формулировки могут привести к ложным (отрицательным) результатам, но такое утверждение трудно проверить, учитывая стойкую предвзятость публикаций, которая все еще существует, в том числе и в областионкологии 20.

В дополнение к рекомендациям ARRIVE, мы решили в максимально возможной степени следовать законодательству, разработанному для применения на людях, предполагая, что составы, подходящие для человека, как правило, также подходят для грызунов. Основное различие заключается в размере объекта и, следовательно, в объеме, который можно безопасно вводить. Для этой цели мы решили по возможности очищать соединение с помощью фильтров с отсечкой по молекулярной массе (MWCO), поскольку они доказали свою эффективность при очистке крупных соединений21. Они позволяют в конечном итоге растворить типичный индикатор, меченный 68Ga, в растворе по выбору и в небольшом объеме, подходящем для мышей (типичный максимальный объем внутривенного введения 100 - 150 мкл).

В Германии GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde: Ассоциация лабораторных животных) выступает в качестве посредника между защитой животных и исследованиями, принося пользу как людям, так и животным. Поэтому эта ассоциация разработала рекомендации по различным аспектам исследований на животных, особенно в области онкологии и анестезии, чтобы стандартизировать уход за животными на национальном уровне. Отныне большинство компетентных органов и национальных этических комитетов следят за соблюдением протоколов по животным этих рекомендаций. В GV-SOLAS есть рекомендации по максимальным объемам большинства маршрутов нанесения. Для внутривенного введения рекомендуется максимум 5 мл/кг массы тела; для мыши массой 25 г это равно 150 μл. По этой причине максимальный объем впрыска радиоактивных индикаторов составляет 150 μл на одно животное. Превышение этого порога при внутривенном введении повышает риск развития острой сердечной недостаточности, вызванной гиперволемией. Повторные внутривенные инъекции, превышающие этот порог, приводят к повышенному риску развития легочного фиброза, так как каждая инъекция, в зависимости от скорости потока, вызывает незначительный отек легких. Человеческим эквивалентом мышиного внутривенного введения, представленного в данной статье, является внутривенное введение болюсно (в течение 10 с) общего объема 375 мл для человека весом 75 кг. При стандартной клинической помощи 500 мл 0,9% раствора NaCl вводят в течение 1 ч; это означает, что 375 мл будет вводиться в течение 45 минут, чтобы избежать каких-либо осложнений.

GV-SOLAS рекомендует, чтобы опухолевая нагрузка не достигала более 5%; В случае, если животное находится на лечении, нагрузка может быть увеличена до 10%22. Эта разница между группами, получавшими и не получавшими лечение, может привести к систематической ошибке в исследованиях, особенно в случае выживания, поскольку мыши, получавшие лечение опухолей, могут иметь более высокую опухолевую нагрузку, чем афферентная контрольная группа. Чтобы избежать таких случаев, либо 5% опухолевая нагрузка должна быть зафиксирована и для лечебных животных; Тем не менее, это может привести к этическим дилеммам за убийство исследовательских животных до достижения так называемой гуманной конечной точки, или (предпочтительно) утверждать, что увеличение до 10% в случае афферентных контрольных групп является этически обоснованным во избежание предвзятости.

Поскольку опухолевую нагрузку необходимо рассчитывать каждый день неинвазивным способом, мы применяем поправочный коэффициент (т.е. 0,82) для преобразования ежедневно рассчитанного объема опухоли в массу опухоли. Мы рассчитали этот коэффициент, измерив диаметр опухоли с помощью цифрового штангенциркуля до того, как животные были убиты в соответствии с протоколом, а затем фактический вес опухоли с помощью весов. Этот поправочный фактор отличается от плотности опухолевой ткани, так как измеряемый объем опухоли включает в себя и кожу. Следовательно, этот фактор, вероятно, < 1,0, так как измеренный объем опухоли больше реального объема опухоли. Поскольку опухоли, которые мы взвешивали, были относительно большими, поскольку оценка проводилась в последний день эксперимента, этот фактор действительно переоценивает вес небольших опухолей. Его следует использовать только при оценке опухолевой нагрузки.

Еще одним аспектом рекомендаций GV-SOLAS является то, что для мышей фиксированный диаметр опухоли 15 мм установлен в качестве гуманной конечной точки17. Часто опухоль имеет тенденцию к быстрому росту вдоль игольчатого канала, образованного подкожной инъекцией, если после раствора, содержащего опухолевые клетки, не вводится воздух или пробка. Таким образом, 15 мм достигаются быстрее при определенных путях нанесения. Поскольку, с точки зрения опыта, некоторые опухоли растут в эллиптической форме, мы адаптировали и использовали вышеупомянутую формулу объема опухоли для проведения объективного сравнения различных способов применения.

Используемые нами животные модели разработаны в соответствии с рекомендациямиARRIVE17 и PREPARE18 , что позволяет легко воспроизводить их в экспериментах. Модель подвержена определенной степени вариаций, поскольку скорость роста опухоли варьируется у разных мышей, что затрудняет стандартизацию и интерпретацию. Тем не менее, эти вариации отражают внутри- и межопухолевую гетерогенность, присутствующую у онкологических больных23.

Этот протокол не лишен своих ограничений. Животные должны быть усыплены во время инъекции, особенно во время ПЭТ/КТ. Седативный эффект, особенно с изофлураном, влияет на кровоток, и животные могут переохладиться, что требует использования нагревательного коврика и контроля глубины седации. Этой проблемы можно избежать, сканируя бодрствующих животных; Однако для этого требуется специализированное программное обеспечение и экспертные знания, которые часто недоступны.

Еще одним ограничением является доза облучения. Хотя доза, получаемая животными, незначительна для одного сканирования, выполнение нескольких сканирований (т.е. особенно если их более 10) может привести к значительной кумулятивной дозе, потенциально влияющей на рост опухоли. Когда рост опухоли является считываемым параметром, важно, чтобы все животные получали одинаковое количество сканирований и доз, чтобы обеспечить сопоставимые группы, что увеличивает рабочую нагрузку всего проекта. Использование системы ПЭТ/МРТ вместо системы ПЭТ/КТ может снизить лучевую нагрузку. Однако такой подход предполагает более длительное время сканирования, дополнительные затраты и другой метод получения анатомической информации.

Придерживаясь рекомендаций благотворительных организаций, таких как GV-SOLAS в Германии, и следуя установленным руководящим принципам, таким как ARRIVAL and PREPARE, мы стремимся стандартизировать модели животных и свести к минимуму изменчивость в экспериментальных протоколах. Эти усилия имеют решающее значение для обеспечения надежности и воспроизводимости доклинических исследований, что в конечном итоге способствует переводу перспективных радиофармацевтических препаратов из лабораторных областей в прикроватные больные.

Раскрытие информации

FMM является медицинским консультантом для NanoMab Technology Ltd. и Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Недавно он получил институциональные гранты от NanoMab Technology Ltd., Siemens и GE Precision Healthcare LLC. Кроме того, у него есть контракт на интервенционные исследования с CURIUM.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Сюзанне Аллекотт за техническую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
Activity meter ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Центрифуга MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Тестирование эндотоксинов Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Heating
block NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
Система ВЭЖХ, включая радиодетекторKnauer & Raytest-Программа
для анализа изображений Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-Система
ПЭТ/КТ для мелких животных β-CUBE и X-CUBEMolecubesNV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materials
0,3 мм диаметр PE10 tubefisher scientific22-204008
30G иглаB|Braun4656300
Центробежный фильтр; 10 кДа MWCO, 0,5 млМиллипороваяUFC501008
Хроматографическая бумажная полоска iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
картриджем с эндотоксином, чувствительность 0,05 EU/мл Charles RiverPTS-2005
Колонка ВЭЖХ Biosep SEC-s2000Phenomenex-Микроцентрифуга
пробирка (1,5 мл)Eppendorf0030125150
полоска pH 0,0 - 6,0Merck KGaA109531
полоска pH 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ картридж SPEMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
Стерильный флакон 10 млALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Ammoniumacetate
Merck KGaA101116
лимонная кислотаMerck KGaA
Соляная кислотаMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
Трифторуксусная кислотаMerck KGaAT6508
Сверхчистая водаMerck KGaA
100241101262

Ссылки

  1. American Cancer Society. Cancer facts & figures 2024. , https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2024-cancer-facts-figures.html (2024).
  2. Cancer Research UK. Ovarian cancer survival. , https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/ovarian-cancer/survival (2021).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Altunay, B., et al. Her2-directed antibodies, affibodies and nanobodies as drug-delivery vehicles in breast cancer with a specific focus on radioimmunotherapy and radioimmunoimaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 48 (5), 1371-1389 (2021).
  5. Altunay, B., Morgenroth, A., Mottaghy, F. M. Use of radionuclide-based imaging methods in breast cancer. Semin Nucl Med. 52 (5), 561-573 (2022).
  6. Mcgale, J., et al. Pet/ct and spect/ct imaging of her2-positive breast cancer. J Clin Med. 12 (15), 4882(2023).
  7. Zhang-Yin, J. State of the art in 2022 pet/ct in breast cancer: A review. J Clin Med. 12 (3), 968(2023).
  8. USFD Administration. Pet drug products - current good manufacturing practice (cgmp). , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pet-drug-products-current-good-manufacturing-practice-cgmp (2018).
  9. Official Journal of the European Union, L238. 60, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2017:238:TOC (2017).
  10. Korde, A., et al. Position paper to facilitate patient access to radiopharmaceuticals: Considerations for a suitable pharmaceutical regulatory framework. EJNMMI Radiopharm Chem. 9 (1), 2(2024).
  11. Korde, A., et al. Practical considerations for navigating the regulatory landscape of non-clinical studies for clinical translation of radiopharmaceuticals. EJNMMI Radiopharm Chem. 7 (1), 18(2022).
  12. European Pharmacopeia. , (2023).
  13. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Brorson, K. A., Chizhikov, V. E. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25 (2-3), 69-77 (2011).
  14. Dülsner, A., et al. Technical information from the Committee for Animal Welfare Officers (GV-SOLAS) and Working Group 4 in the TVT Recommendation on substance administration to laboratory animals. GV-SOLAS. , (2017).
  15. derived xenograft (pdx) protocols at the jackson laboratory. , Available from: https://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/live/www/html/SOCHelp.html (2020).
  16. Velikyan, I. 68ga-based radiopharmaceuticals: Production and application relationship. Molecules. 20 (7), 12913-12943 (2015).
  17. Percie Du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the arrive guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  18. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. Prepare: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  19. Landesamt Für Natur UUVN. Tierversuche. , https://www.lanuv.nrw.de/verbraucherschutz/tierversuche (2024).
  20. Herrmann, D., et al. Statistical controversies in clinical research: Publication bias evaluations are not routinely conducted in clinical oncology systematic reviews. Ann Oncol. 28 (5), 931-937 (2017).
  21. Johnsen, E., et al. A critical evaluation of amicon ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples. J Pharm Biomed Anal. 120, 106-111 (2016).
  22. TVT-Veröffentlichungen zum Download. , Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). Available from: https://www.tierschutz-tvt.de/alle-merkblaetter-und-stellungnahmen/ (2024).
  23. Bedard, P. L., Hansen, A. R., Ratain, M. J., Siu, L. L. Tumour heterogeneity in the clinic. Nature. 501 (7467), 355-364 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

68Ga

Похожие статьи