Методическая статья

Построение ольфактометра для изучения обонятельного поведения грызунов

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67049

⸱

11 апреля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Mechanical Engineer/NeuroTechnology Center / Machine Shop, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Neurosurgery Department, University of Colorado Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает построение ольфактометра для экспериментов по обонятельному поведению. Пошаговая инструкция вместе с изображениями предоставляется для обеспечения успешного построения ольфактометра. Также включена информация об устранении неполадок, возникающих во время процесса.

Аннотация

Использование ольфактометров для изучения поведения грызунов и активности мозга во время выполнения обонятельных задач имеет решающее значение для понимания мозговых цепей. Эти сложные устройства позволяют исследователям точно контролировать и доставлять ароматические стимулы, что позволяет исследовать сложные обонятельные процессы у грызунов. Несмотря на то, что коммерчески доступные ольфактометры удобны, они создают проблемы при возникновении технических проблем, часто требующих дорогостоящей помощи и потенциально нарушающих сроки исследований. В этой статье подробно описывается создание специального ольфактометра, специально разработанного для экспериментов по обонятельному поведению мышей, а также приводится полный список деталей и пошаговые инструкции. Управление ольфактометром осуществляется через MATLAB, что обеспечивает удобный интерфейс для исследователей. Важно отметить, что открытый исходный код позволяет пользователям модифицировать и адаптировать систему, адаптируя поведенческие задачи под конкретные экспериментальные потребности. Создание индивидуального ольфактометра дает пользователям знания и возможности для самостоятельного выполнения индивидуального экспериментального проектирования и устранения неполадок, экономя время и ресурсы. Такой подход не только повышает гибкость исследований, но и способствует более глубокому пониманию функциональности оборудования, что в конечном итоге приводит к более надежным и надежным обонятельным исследованиям на грызунах.

Введение

Сложные механизмы, лежащие в основе принятия обонятельных решений, позволяют получить удивительное представление о поразительной сложности системы обработки сенсорной информации мозга 1,2,3. В обонятельной луковице мышей огромное количество обонятельных сенсорных нейронов сходятся примерно на 2200 клубочках, каждый из которых иннервируется нейронами, экспрессирующими один и тот же обонятельный рецептор4. Примечательно, что даже один синтетический ароматизатор может стимулировать значительную часть из примерно 1100 обонятельных рецепторов у мышей 5,6. Однако проблема выходит за рамки первоначального обнаружения одоранта. Временная динамика поступления запаха, на которую влияет ритмичный акт вдыхания, еще больше обогащает сенсорный ландшафт, добавляя слои информации для расшифровки мозгом. В сочетании со сложностью естественных стимулов, таких как специфическая моча, которая содержит сотни пахучих веществ, обонятельная система сталкивается с огромной задачей распутывания сложных паттернов активации клубочков для дифференциации различныхзапахов.

Чтобы решить эту проблему, мозг координирует нейронную активность в нескольких областях, включая грушевидную кору, латеральную энторинальную кору, гиппокамп, обонятельный бугорок, префронтальную кору и даже мозжечок 9,10,11,12,13,14. В этих цепях пирамидальные клетки грушевидной коры интегрируют и модулируют информацию, передаваемую митральными клетками, в то время как другие области мозга играют уникальную роль в формировании обонятельного восприятия 15,16,17. Более того, на обработку мозгом обонятельных стимулов динамически влияют контекстуальные факторы, что подчеркивает адаптивность и сложность процесса принятия обонятельных решений.

В этой статье описывается создание пользовательского ольфактометра, который позволяет с помощью компьютера оценивать поведенческие показатели свободно движущихся мышей, занятых в задаче «годен/не идет». В этой задаче ассоциативного обучения мышь, лишенная воды, начинает испытание, облизывая носик подачи воды, расположенный в носовом конусе подачи запаха. Один из двух одорантов вводится через 1-1,5 с после того, как животное начинает испытание. Если одорант является вознаграждаемым (S+) одорантом, мышь получает вознаграждение водой, если она облизывает хотя бы один раз в каждом из четырех 0,5-секундных временных окон (A Hit). В противном случае мышь не получает вознаграждения (Miss). Если животное получает одорант без вознаграждения (S-), вознаграждение не выдается, а если мышь облизывается в каждом из четырех временных окон (ложная тревога, FA), то перед началом следующего испытания устанавливается временная задержка. Если животное не может облизываться в течение одного из временных окон, испытание засчитывается как правильное отбраковка (CR), и временная задержка не применяется. Процент правильной работы рассчитывается как процент попыток, в которых мышь набирает Hit или CR в окне из двадцати попыток:

Процент правильных ответов = 100 ((Хит + CR) / 20)

Существует два ключевых вопроса для обеспечения надлежащего функционирования ольфактометров, предназначенных для оценки обонятельного поведения. Во-первых, ольфактометр должен отслеживать реакцию мыши в режиме реального времени, чтобы получать соответствующие награды от запаха и воды. Этот ольфактометр достигается путем контроля слизывания либо путем измерения сопротивления между водяным изливом и дном камеры, либо путем измерения емкости18. Затем программа MATLAB использует эту информацию для принятия решений о доставке одоранта и вознаграждении водой. Вторая проблема заключается в необходимости надежной, воспроизводимой доставки одоранта. Этот ольфактометр достигается за счет приведения в действие клапанов, которые уравновешивают насыщенный одорантом воздух с воздухом-носителем, который затем подается к носовому обтекателю. Воздух уравновешивается с одорантом путем его барботирования через раствор одоранта, разбавленный минеральным маслом. Концентрация одоранта измеряется с помощью фотоионизационного детектора и может быть рассчитана на основе давления пара и коэффициента активности в соответствии с процедурами, описанными Williams and Dewan18,19.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию в медицинском кампусе Аншутц Университета Колорадо. В этом исследовании использовались животные мужского пола CaMKIIα WT в возрасте двух месяцев на момент имплантации тетрода. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Плата и пайка однополюсных, одноходовых (SPST) кнопок мгновенного действия

  1. Приобретите изготовленный на заказ белый плинтус с отверстиями для крепления стоек для клапанов запаха, расходомеров, платы SSR48 и других компонентов, показанных на рисунке 1A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белый плинтус, использованный в этом исследовании, был изготовлен в механическом цехе Центра нейротехнологий в медицинском кампусе Аншутца Университета Колорадо (Рисунок 1A). Файлы дизайна доступны по адресу
  2. Добавьте 1-дюймовые винты и 3/4-дюймовые прокладки для размещения SSR48-RACK. Винты расположены в правом верхнем углу задней части доски (рисунок 1A).
  3. Установите SSR48-RACK. SSR48-RACK будет расположен в верхней левой части задней части доски (рис. 1C).
  4. Сделайте отверстия (0,4 см) для размещения винтовых клеммных колодок на обратной стороне доски. Винтовые клеммные колодки будут расположены в середине правой части задней части доски (рис. 1D).
  5. Сверху вниз: Первая клеммная колодка на 4 винта будет использоваться для подключения проводов на 24 В. Следующая винтовая клеммная колодка будет использоваться для проводов 5 В. Оставьте одну колодку винтовой клеммной колодки пустой, а последние 4 винтовые клеммные колодки будут использоваться для подключения проводов заземления.
  6. Просверлите отверстия (0,8 см) в блоке управления для размещения мгновенных кнопочных переключателей SPST. Блок управления будет расположен в передней нижней части доски (рис. 1E).
  7. Настройте кнопочные переключатели мгновенного действия SPST. Припаяйте два провода к кнопочному переключателю мгновенного действия SPST. Предпочтительно использовать два разных цвета, например, красный и черный или зеленый (Рисунок 1F).
  8. Прикрепите кнопочный переключатель мгновенного действия SPST к блоку управления. Кнопки поставляются с гайкой, которая используется для крепления к черному ящику управления (рис. 1G).
  9. Закрепите провода, скрутив или закрепив их скотчем, чтобы они были вместе и организованы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение питания 24 В используется для питания пережимных клапанов и клапанов запаха, а напряжение 5 В используется для цепи облизывания.
  10. Поместите клапаны для удаления запаха в пазы решетки для клапанов запаха, расположенной в центре доски (рисунок 2A).
    1. Отклейте провода, которые отходят от клапанов, и припаяйте по одному проводу от каждого клапана к более толстому проводу. Поместите один провод в землю на винтовую клеммную колодку на обратной стороне доски, а второй провод в соответствующий контакт в SSR48-RACK. Например, клапан запаха 1 идет к штифту 1, клапан запаха 2 идет к штифту 2 и т.д. (рис. 2B).
    2. Подсоедините контакты с 1 по 8 в SSR48-RACK к двум пережимным клапанам каждый (входные и выходные клапаны для флаконов для балансировки минерального масла). Для каждого клапана подключите один провод от кнопки к сети 24 В, а другой провод — к контакту в SSR48-RACK, подключенному к клапану. Другой провод идет от клапана к земле. Обратитесь к рисунку 2B, C для размещения проводов на своих местах.
    3. Поместите водяной клапан и конечный клапан в соответствующие прорези на пластине клапана. Слот расположен в центре доски. Посмотрите на пластину клапана на рисунке 1 и расположение клапанов на рисунке 3A.
    4. Подсоедините водяной клапан и конечный клапан к земле и контактам 17 и 18 соответственно в SSR48-RACK. Подключите кнопки к сети 24 В и контактам 17 и 18 (рис. 2B).

2. Электроснабжение

  1. Купите блок питания и удлинитель. Информацию о конкретном типе блока питания можно найти в Таблице материалов. Источник питания будет подавать выходы 24 В (V3) и 5 В (V1) и заземление на ольфактометр.
  2. Отрежьте вилку шнура питания от блока питания. В частности, женскую часть удлинителя. Как только он перерезан, можно увидеть три провода. Зеленый провод подключен к G (заземлению) на блоке питания, а два других провода (белый и черный) подключены к L и N соответственно входного напряжения переменного тока 120 В к источнику питания (рисунок 3B).
    ВНИМАНИЕ: Провода питания 120 В подвергаются воздействию, и существует риск получения травмы в результате поражения электрическим током. Лучше всего накрыть его изолятором.
  3. Отрежьте один конец провода, питающего SSR48-RACK. Подсоедините один из проводов к винту G в блоке питания, а второй — к V1 блока питания (рисунок 3C).
  4. На блоке питания подключите один провод от G2 к массе на винтовой клеммной колодке (рисунок 2C).
  5. На блоке питания подключите один провод от V1 к винтовым клеммным колодкам 5 В (рис. 2C).
  6. На блоке питания подключите один провод от V3 к винтовым клеммным колодкам 24 В (рисунок 2C).

3. Сенсорная плата Lick

  1. Получите макетную плату с 400 связующими точками и проложите провод, соединяющий соединительные точки B7 и B15 (рис. 3D).
  2. Подсоедините один конец провода к стяжной точке 6+, а другой конец к стяжной точке C22 макетной платы (рис. 3D).
  3. Соедините один конец в точке D16, а второй конец — в точке G22 макетной платы (рис. 3D).
  4. Подсоедините один конец провода к гнезду I22, а второй конец к гнезду 29- макетной платы (рис. 3D).
  5. Подключите один конец провода к гнезду 20А, а второй конец — к гнезду 29А макетной платы (рис. 3D).
  6. Подключите один конец провода к 21B и второй конец к 28B макетной платы (рис. 3D).
  7. Подключите один конец провода к гнезду 1+ макетной платы, а второй конец к 5 В винтовых клеммных колодок (рисунок 3D).
  8. Подсоедините один конец провода к гнезду 1- макетной платы, а второй конец к заземлению винтовых клеммных колодок (рисунок 3D).
  9. Подсоедините один конец провода к гнезду C7 макетной платы, а второй конец — к контакту 27 на SSR-48RACK (рис. 3D).
  10. Подключите один конец провода к слоту 28C макетной платы, а ко второму концу будет прикреплен зажим типа «крокодил», который будет соединяться с металлической частью водяного смерча (рисунок 3D).
  11. Подсоедините один конец провода к гнезду 20B макетной платы, а другой конец — к средней клемме потенциометра (рисунок 3D). Две клеммы, подключенные к резистивным элементам потенциометра, подключены к заземлению и напряжению 5 В. Средняя клемма подключена к макетной плате.
  12. Получите резисторы 21 мОм. Для первого подключите один конец к 19A, а второй конец к 20D. Для второго соедините один конец с 22C, а другой конец с 21D. Подключите к потенциометру (рисунок 3D).
  13. Получите один резистор кОм. Подключите один конец к 14С, а второй конец к 19С. Подключите к потенциометру (рисунок 3D).
  14. Приобретите один резистор 120 Ω. Подключите один конец к 7D, а второй конец к 7H (Рисунок 3D).
  15. Приобретите светодиодный фонарь. Цвет не имеет значения. Подключите один провод светодиода к 7J, а второй провод к 6- (Рисунок 3D).
  16. Приобретите два операционных усилителя (ОУ). Соединения для первого — E10 — E16, F10-F16 (рис. 3D).

4. Снабжение воздухом и водой

  1. Поместите два расходомера (2 л/мин и 50 куб. см/мин) в держатели расходомера. На рисунке 4A показана общая система воздушного потока, а на рисунке 4B показано увеличенное изображение расходомеров.
  2. Приобретите аквариумный насос для обеспечения потока воздуха 2 л/мин. Используемая здесь модель аквариумного насоса имеет два выхода (см. Таблицу материалов). Подсоедините небольшой кусок трубки от каждого из двух выходов аквариумного насоса к двум входам Т-образного разъема (рис. 4B).
  3. Подсоедините кусок трубки от выхода Т-образного разъема к входу фильтра с активированным углем (рис. 4B).
  4. Подсоедините трубку от выхода угольного фильтра к Т-образному разъему и подсоедините два выхода разъема к шаровому крану для регулировки расхода воздуха (Рисунок 4C).
  5. Подключите выход каждого шарового крана к входу расходомеров (рисунок 4D).
  6. Подсоедините выход расходомера со скоростью 50 см/мин к верхнему коллектору, подавая воздух в флаконы для уравновешивания запаха объемом 40 мл с одорантами, разведенными в минеральном масле (рис. 4E).
  7. Подключите выход из каждого флакона с запахом к соответствующему входу в нижнем коллекторе.
  8. Трубки, соединяющие флаконы с запахом к коллекторам, представляют собой трубки с пережимными клапанами, которые открываются двумя отдельными пережимными клапанами. Поместите трубку в пережимные клапаны.
  9. Подключите выход расходомера 2 л/мин к входу бокового входа нижнего коллектора.
  10. Подсоедините выход нижнего коллектора к входу конечного (отводящего) клапана (рисунок 4F).
    1. Подсоедините стандартный выход конечного клапана к трубке подачи запаха в камере хода/без хода. Подсоедините стандартный выход выключения конечного клапана к выпускной трубе (Рисунок 4G). Это приводит к непрерывному потоку воздуха без запаха 2 л/мин при выключенном конечном клапане.
    2. Для каждого испытания убедитесь, что последний клапан включается, когда животное лижет, забирая воздух на выпуск, и одновременно включается клапан запаха. Это приводит к уравновешиванию запаха в фоновом воздушном потоке.
    3. Через 1-1,5 с следите за тем, чтобы окончательный клапан выключился, отводя воздух обратно в камеру. Это приводит к резкому увеличению концентрации одоранта. Через 2,5 с клапан запаха отключается, и концентрация запаха возвращается к 0.
    4. Подсоедините иглу 18 G к кончику шприца объемом 5 мл, который будет использоваться для подачи воды (рисунок 4H).
    5. Подсоедините одну трубку (диаметром 2 мм) к кончику иглы (рисунок 4H).
    6. Подсоедините другой конец трубки к входу водяного клапана. Возможно, потребуется вырезать трубку другого диаметра, чтобы она соответствовала входу водяного клапана (рис. 4I).
    7. Подсоедините трубку от выхода водяного клапана к носику для облизывания (рисунок 5A).

5. Подключение ольфактометра к компьютеру и установка программного обеспечения

  1. Подключите SSR48-RACK к DIO96H/50 с помощью 100-контактного разъема «папа-гнездо». Подключите USB-кабель от DIO96/H50 к компьютеру (рис. 5B).
  2. Загрузите последнюю версию программного обеспечения и драйверов mccdaq, а также InstaCal.
    ПРИМЕЧАНИЕ: InstaCal - это программа, которая проверяет связь между компьютером и DIO96/H50. Загрузите последнее программное обеспечение и драйверы здесь: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx.
  3. Запустите InstaCal. Убедитесь, что в "Universal Serial Bus" указана плата # как правильный номер, обычно #1 = плата #1 USB-DIO96H/50.
  4. Скачать MATLAB.
  5. Скачайте программы MATLAB для запуска ольфактометра из https://github.com/restrepd/dropc.
  6. Откройте MATLAB в качестве администратора и установите путь таким образом, чтобы MATLAB распознавал программы. На вкладке «Главная» в среде MATLAB нажмите « Задать путь » в разделе «Среда». Откроется диалоговое окно, в котором вы можете добавить папки в путь поиска.
  7. Запустите daqregister('mcc'). Измените номер платы в dropcInitializePortsNow.m.
    ПРИМЕЧАНИЕ: handles.dio = digitalio('mcc',1); %(1 или 0 в зависимости от компьютера).
  8. Протестируйте dropcspm.m, выполнив пробный прогон, в котором пользователь «реагирует» на каждую попытку, подключая электрическую петлю между носиком для облизывания и металлическим полом заземленной камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь ольфактометр готов к использованию. Информацию о том, как тренировать мышь, можно найти в Nicole Arevalo et al.20.

6. Эксперименты на животных

  1. Тщательно подготовьте животных к началу экспериментального процесса. Взвесьте каждую мышь по отдельности с помощью откалиброванных весов и запишите вес в лабораторный журнал. Отслеживайте эти важные данные на протяжении всего исследования, чтобы отслеживать состояние здоровья животных и оперативно реагировать на любые изменения веса.
  2. После взвешивания аккуратно поместите мышей в специально предназначенную мышиную камеру. Активируйте датчики и системы доставки стимулов для выполнения задачи обонятельной дискриминации. Убедитесь, что камера сводит к минимуму стресс для животных, сохраняя при этом точный контроль условий эксперимента.
  3. Позаботьтесь о том, чтобы животному было комфортно в камере. Запустите программу MATLAB для управления экспериментальными параметрами, такими как подача стимулов запаха (2,5 с), подача воды и запись ответов. Анализируйте данные в режиме реального времени, чтобы получить немедленную обратную связь о производительности животного.
  4. Постоянно контролируйте и анализируйте производительность животного. Посмотрите на рассчитанный балл владения языком на основе процента правильных ответов. Стремитесь к тому, чтобы каждое животное достигло показателя производительности 80 или выше, который обозначает порог мастерства выполнения задачи.
  5. Начинайте новую фазу эксперимента после того, как животное стабильно достигает оценки мастерства 80 или выше, что указывает на владение начальным различением пар запахов. Поменяйте пару запахов местами, оставив ранее вознагражденный аромат без вознаграждения, и наоборот.
    1. Проверьте когнитивную гибкость животного и его способность отучиваться от ассоциаций и переучиваться, тем самым получая ценную информацию о пластичности обонятельного обучения у мышей.

Результаты

Следуя описанному здесь протоколу, ольфактометр может быть настроен для проверки поведения мышей в зависимости от запахов. На рисунке 6A показано поведение мыши в течение первого дня обучения в задаче «годен/не годен» с использованием этилацетата в качестве одоранта S+ и комбинации этилацетата и пропилацетата в качестве S-. Процент правильных ошибок рассчитывается как процент попыток, в которых мышь получает попадание или правильное отклонение. Изначально мышь начинала с 50% правильности, потому что она облизывалась в ответ на оба запаха. Однако после нескольких попыток он научился лизать только для S+ и перестал лизать для S-. На рисунке 6B показан процент правильных действий для последнего дня выполнения задания «годен/не годен» в прямом направлении, где животное достигло мастерства с производительностью 80% или выше. На этом этапе одоранты были обращены в обратном порядке (REV), причем этилацетат стал S-одорантом, а комбинация этилацетата и пропилацетата — S+. На рисунке 6C показан процент правильных ошибок в первый день выполнения задачи «годен/не годен» в обратном направлении, когда производительность мыши упала до 10%. F показывает производительность мыши в последний день реверса, когда она снова достигла мастерства.

figure-results-1
Иллюстрация 1: Передняя сторона ольфактометра и проводка. (A) Размеры ольфактометра составляют 22 дюйма (Ш) x 16 дюймов (В) x 8,5 дюйма (Г), показаны без проводки или интерфейсных плат / плат для облизывания, доставленных из машинного цеха. Предварительно просверлены отверстия для клапанов запаха, термометров, водяных и конечных клапанов, водяного шприца, штатива для бутылок с запахом, штатива для клапанов запаха и мышиной камеры. (B) Ольфактометр подготовлен с помощью 8 болтов, необходимых для крепления SSR48-RACK с задней левой стороны. (C) Ольфактометр с установленным SSR48-RACK, включая подключенные реле. (D) Винтовые клеммные колодки, добавленные к ольфактометру, с назначенными секциями для 12 В, 5 В и заземления. (E) Черный ящик управления с просверленными отверстиями для мгновенных кнопочных переключателей SPST, с маркировкой каждой кнопки лентой по управлению клапаном. (F) Кнопочный переключатель мгновенного действия SPST с двумя цветными проводами с термоусадочными трубками, припаянными для защиты открытых участков. (G) Кнопочный переключатель мгновенного действия SPST, установленный на черном ящике управления и закрепленный прилагаемой шестигранной гайкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Клапаны запаха и схемы. (A) Клапаны запаха надежно установлены в пазах и закреплены винтами. (B) Схема проводки клапана с запахом к SSR48-RACK и колодкам винтовых клемм. (C) Схема электропроводки черного ящика управления, блока питания, SSR48-RACK и винтовых клеммных колодок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Настройка воды и конечного клапана с источником питания. (A) Водяной и конечный клапаны добавлены в предназначенные для этого пазы в ольфактометре и закреплены винтами. (B) Проводка источника питания, подключенная к питанию ольфактометра. (C) Силовая проводка для SSR48-RACK. (D) Датчик Lick с подключенными компонентами, включая резисторы, провода, светодиод и операционный усилитель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Система подачи воздуха с расходомерами и трубками. (A) Расходомеры прикреплены к стойке с помощью винтов. (B) Аквариумный насос соединен с трубкой, соединенной с Т-образным шарниром. (C) Угольный фильтр с трубками, прикрепленными на выходе, с подключениями к отдельным регуляторам. (D) Трубки от регуляторов, подключенные к входам расходомера. (E) Трубки, прикрепленные к выходам расходомера. (F) Трубки от коллектора до конечного входа клапана. (G) Конечный клапан с трубкой, подключенной к отверстию запаха ольфактометра. (H) Шприц объемом 5 мл, наполненный водой, трубка прикреплена к игле 18 G. (I) Трубка подсоединена к входу водяного клапана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Иллюстрация 5: Окончательные соединения водяного клапана и обзор системы. (А) Трубка от выхода водяного клапана к ликситу в ольфактометре. (B) Подключение ольфактометра к DIO96H/50 с помощью кабеля «мама-мама». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Пример поведенческой производительности в задаче «идти/не идти» для мыши. Процент правильных ответов на каждом сеансе отображается для: (A) Первого дня прямого кондиционирования (S+: 1% изоамилацетата, S-: минеральное масло). (В) Последний день форвардной подготовки. (C) В первые сутки после отмены (S+: минеральное масло, S-: 1% изоамилацетата). (D) Последний день обратного кондиционирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Временной ход концентрации изоамилацетата в порту запаха. Измеряли концентрацию 10% изоамилацетата (разведенного в минеральном масле) в порту запаха, с помощью фотоионизационного устройства (ПИД). Вертикальными линиями обозначены начало и окончание доставки запаха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Подробное пошаговое руководство по созданию ольфактометра, предназначенного для задач ассоциации запахов, можно найти в литературе. Исследователи могут столкнуться с различными проблемами во время сборки и эксплуатации устройства, но, к счастью, существуют устоявшиеся методы устранения неполадок для решения этих проблем. После правильной конструкции и калибровки ольфактометр служит бесценным инструментом для ученых, проводящих эксперименты, связанные с обонянием, обеспечивая точный контроль и доставку запаховых стимулов.

Критические шаги
Загруженная версия MATLAB должна быть 2015, так как написанный код совместим с этой версией, и использование любой другой версии может привести к проблемам. Важно убедиться, что в instacall выбрана правильная доска. Установка mcc.dill может быть выполнена путем запуска daqregister('mcc') при входе в систему как администратор MATLAB.

Устранение неполадок
В начале каждой учебной недели запускайте программное обеспечение для калибровки (InstaCal), чтобы убедиться, что ПК и ольфактометр взаимодействуют правильно. Откройте эту программу, нажмите на доску и нажмите « Цифровая калибровка». Необходимо проверить скорость воздушного потока. Фоновый расход воздуха должен составлять 2 л/мин, а расход к флаконам для уравновешивания запаха должен составлять 50 мл/мин. Крайне важно регулярно проверять скорость воздушного потока на выходе ольфактометра.

Перед установкой мыши важно убедиться, что проверены следующие параметры: (1) Клапаны запаха: клапаны запаха следует щелкать при нажатии кнопки на черном ящике. Воздушные трубки должны пузыриться в минеральном масле, при этом минеральное масло не должно попадать в трубку. (2) Трубка с запахом: Если запахи не вызывают образования пузырьков, трубка может быть заблокирована там, где она обычно защемляется рядом с клапаном. Может потребоваться замена трубки. (3) Конечный клапан и водяной клапан: Конечный клапан должен открыться правильно, а трубка должна быть проверена на правильность работы. Для водяного клапана любой воздух, блокирующий поток воды, должен быть очищен, что позволит воде поступать в ликсит. (4) Воздушный поток: расходомеры должны выглядеть откалиброванными и расположенными соответствующим образом. (5) Огни реле: Убедитесь, что «огни» на реле правильно активируются во время эксперимента. (6) Реле вознаграждения за воду: Когда выдается вознаграждение за воду, реле над водой должно мигать, когда оно выдает вознаграждение. (7) Реле вознаграждения за запах и воду: Когда запах сочетается с вознаграждением за воду, красное реле над соответствующим номером клапана должно мигать красным во время вознаграждения.

Ограничения
Задание «Годен/не годится» проверяет способность мыши тестировать 2 запаха. Для того, чтобы выполнить задачу, животное должно пройти через несколько сеансов. Это не высокопроизводительный метод для тестирования распознавания запахов. Ольфактометр предназначен для проверки обонятельных раздражителей. Это не мультисенсорный испытательный аппарат. Тем не менее, могут быть внесены изменения для тестирования других сенсорных входов.

В данной статье описан ольфактометр разбавления жидкости, в котором воздух, проходящий через одорант, разведенный в минеральном масле со скоростью 50 мл/мин, предварительно уравновешивается с фоновым потоком воздуха со скоростью 2 л/мин. Для данной конструкции подачи одоранта кинетика разбавления запаха в несущем воздушном потоке определяет скорость увеличения концентрации запаха в фоновом воздушном потоке. Как показано на рисунке 7, в то время как концентрация увеличивается в течение 200 мс до половины конечной концентрации, скорость изменения концентрации замедляется более чем на полсекунды. Хотя эта конфигурация не приводит к квадратному ступенчатому изменению концентрации запаха, она была успешно использована для изучения различения и обнаружения запахов21. Если протокол эксперимента требует ступенчатого изменения концентрации запаха, то конструкция подачи одоранта должна быть изменена на три канала фонового воздушного потока со скоростью 2 л/мин, в которых одоранты непрерывно подаются в фоновый воздушный поток двух каналов фонового воздушного потока. Третий канал доставки будет доставлять воздух, сбалансированный с минеральным маслом. В этом случае отводные клапаны будут использоваться для отвода одного из двух одорантов или воздуха без запаха в отверстие для запаха. Это приведет к ступенчатому увеличению концентрации одоранта в порту запаха (также предыдущие отчеты19,22). В любом случае, очень важно задокументировать временной ход изменения концентрации запаха с помощью фотоионизационного детектора.

Описанный здесь ольфактометр предназначен для экспериментов на мышах, однако в прошлом эта конструкция использовалась для крыс. Основное отличие заключается в том, что необходимо увеличить размер камеры для исследований с23 крысами. Наконец, этот ольфактометр оценивает обонятельное поведение одной мыши. Был описан высокопроизводительный автоматический ольфактометр для тестирования нескольких мышей24.

Значение
Этот протокол описывает изготовленный на заказ ольфактометр, который снижает затраты по сравнению с другими доступными методами.

Будущие приложения
Ольфактометр разработан специально для использования с мышами и требует модификации для использования с другими животными, например, с крысами. Также могут быть включены дополнительные функции, такие как многоэлектродная записывающая система (например, многоэлектродная записывающая плата), плата Arduino Uno или камера.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать, и конкурирующих финансовых интересов нет.

Благодарности

Данное исследование было поддержано грантами NIH K01 NS127850-01, R25 NS080685, R01 NS081248 и DC000566. Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Рестрепо и лабораторию Рамиреса-Гордильо за их поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 1/8' ’ Модульный гнездо для макетной платы ИСНайдено: amazon.comASIN ‏: B004MCSOQYВключает свет и лижет цензор
500 штук Ассорти углеродных пленочных резисторов 1/4 ВтНайдено на amazon.com
Бренд:bojack		Резисторы будут идти на гнездо Макетной платы
Потенциометр с линейным конусом 50 кОмБренд:TWTADE
Найдено: Amazon.com		Позволяет компонентам ольфактометра

Источник питания: Ac 220v-6A
Диаметр сдвига: 6 мм/0,2"
Длина стержня: 15 мм / 0,59 дюйма Монтажная резьба.

Размер ручки 15/17мм/0.6 x 0.67" (d*H)
регулировка мощности 
Красный светодиод 5 ммНайдено на: Amazon.com
Бренд:EDGELEC		Предварительно подключен со встроенным резистором; Лампочка с круглым верхом 5 мм и проводные светодиоды - простое подключение с 3-6 В постоянного тока Приводите его, провода длиной 7,9 дюйма.< чел/> <бр/> Мощность: 1 Вт
6-позиционная двухрядная полоса BrrierНайдено: Digikey.comБазовый номер продукта
1546306		Используется для питания и заземления в зависимости от способа подключения< бр/> Номинальное напряжение: 300 В< бр/> Номинальный ток (амперы): 20 А< бр/> Калибр провода: 12-22 AWG
96 сильноточный 50-контактный разъем с гнезда на гнездоНайдено на: Amazon.com
Бренд: ‎ IIVVERR		Номер детали:‎ f5c953ee65a980dВес: 109 г<бр/> Шаг: 2,54 мм<бр/> Общий размер: 50x6,4 см/2x2,5 дюйма
Аквариумный насос -AAPA7.8L 125 GPH, 2 ВЫХОДА 3 ВТНайдено on:Amazon.com
Бренд: Магазин Hydrofarm		Он будет подключен к двойному открытому корпусу холодной воды и будет использоваться для подачи воздуха на машину
Колючий тройник соединитель полиэтиленовый 1/4"Найдено: Uplastic.comНомер позиции:62200Соединяет различные воздушные шланги друг с другом
Колючий тройник соединитель полиэтиленовый 3/16"Найдено: Uplastic.comНомер позиции:62063Соединяет различные воздушные шланги друг с другом
BD общего назначения прецизионная скользящая игла для подкожных инъекций 18 G ½Найдено: Medneedles.comНомер позиции: BD 305195Используется для системы водоснабжения
Черный ящик/блок ручного управленияБренд:Otdorpatio
Найдено на: Amazon		н/дИспользуется в качестве блока управления<чел/> Размеры: 3,94x2,68x1,97
Кабель, блок питания ПК внутренние подключения 10 футовНайдено: Amazon.comПодключается к источнику питания

40 Вт
Трубки Cflex, белые ¼ ” Внутренний диаметр x 3/8" OD Найдено on:uplastic.comНомер позиции:54033Трубки, используемые в воздушной системе
изготовленная на заказ белая базовая доска с отверстиями для крепления стоек для клапанов запаха, расходомеров, платы SSR48Механический цех Центра нейротехнологий в медицинском кампусе CU Anschutz 
Отводной клапан— миниатюрный клапан для инертной жидкости, 3-х ходовойНайдено on:Radwell.comНомер для заказа: 003-0258-9001/8-й БАРБ<бр/> 24 В постоянного тока<бр/> ДО 1500 SCCM<бр/> 4,2 ВТ
Двойной открытый корпус для холодной воды с синим картеромНайдено on:GRAINGER.COM
БрендPENTAIR/PENTEK		Совместимый номер модели Mfr150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687
Стеклянные флаконы Fisherbrand EPAНайдено: fishersci.comКаталожный No 02-912-379Используется для устранения запахов
Фитинговый редуктор 1/4" х 1/8"Найдено: uplastic.comНомер позиции: 64370Адаптер используется в воздушной системе шлангов.
Жесткие трубки, интрамедик полиэтилен,  0.045 (ID) 1 x 100
Сильный инфракрасный светодиодНайдено на amazon.com
Бренд: gikfun		Тактовая частота памяти 1 МГц
Микросхема операционного усилителя gp 4 цепь 14dipНайдено на: Amazon.com
Бренд:BOJACK		Рабочее напряжение 50 вольт<бр/> максимальное напряжение 50 вольт
Комплект перемычекНайдено на: Amazon.com
Бренд: Elegoo		Размеры изделия ДхШхВ: 0.04 x 8.27 x 0.04 дюйма
Мгновенный переключатель Mini spstБренд:Radioshack
Найдено: Amazon.com		B000TLWZM6Используется для клапанов запаха<бр/> Рабочий объем: 250 В<бр/> Номинальный ток: 1 Ампер
МультиметрНайдено на Amazon.com
Бренд:AstroAl		Точное измерение переменного/постоянного тока, переменного/постоянного напряжения, емкости, частоты, коэффициента заполнения, сопротивления, диода, целостности и температуры
Игольчатый носНайдено on:amazon.com
Бренд:WorkPro		Будет использоваться для сгибания проводов
Клапаны запахаНайдено on:Radwell.comАртикул: 192833415
Номер детали: 225T031		Перекачивает запахи из флаконов с запахом.<бр/> 30 PSIG<бр/> 12 В постоянного тока
ФототранзисторНайдено на: Amazon.com
Бренд:HILETGO		Напряжение: 1,3-1,5 В<бр/> Диапазон приема: (НМ) 400-1000<бр/> Размер головки: 5 мм x 5 мм / 0,2 " x 0,2 " (Г * Д)
Фототранзистор и светодиод в паре
Адаптер для труб 3/4" х 1/4"Найдено: uplastic.comНомер позиции: 64807Адаптер используется в воздушной системе шлангов.
Переходник для водяного корпуса насоса - m ¾ x1/4"Usplastic.comНомер позиции: 64807Диапазон температур от -50F до 275F<бр/> Максимальное давление: 150psi
Вес: 0,0015 фунта
Источник питания 12 В 30 А 360 ВтНайдено на: Amazon.com
Бренд:ALITOVE		Основной источник питания машины.
  Входное напряжение: 220 В<бр/> Выход: 12 В постоянного тока 30 А макс.
Трубки из ПТФЭНайдено на Amazon.com
РАСХОДОМЕРЫ RITEFLOW С ГЛАДКИМИ КОНЦАМИ (БЕЗ МОНТАЖА)Найдено on:Globalindustrial.com
Номер модели:t9FB3075514		Номер позиции: H40407-0075Контролирует расход воздуха в ольфактометре<бр/> шкале 150 мм, размер 2<бр/> Номер детали производителя: H40407-0075
ОтверткиНайдено на: Amazon.com
Бренд:Sharden		Используется для винтов на ольфактометре
Обертка / трубка для креветок (различные размеры для проволоки 18-22 калибраНайдено на: Amazon.com
Бренд:eventronic		Материал: Изготовлен из полиолефина, коэффициент усадки: 2:1 (уменьшится до 1/2 от прилагаемого диаметра)
Силиконовая трубка 0,030 x 0,065Найдено on:Amazon.com
Бренд:Научные товары		Трубки для флаконов с запахом
Припой - со свинцомНайдено on:Uline.comС-25294Будет использоваться с паяльником
ПаяльникНайдено on:Uline.comМодель H-10799Будет использоваться для пайки боттонов на блоке управления и других соединениях
Модуль твердотельного реле с четырьмя выходами – КрасныйНайдено: https://www.sealevel.com/Часть: OB5Q    Модель: Модуль QSSR с выходом постоянного токаЕмкость: 8 пФ<бр/> Размеры: 2,4" (Д) x 1,1" (Ш) x 3,1" (В)<бр/> # ввода/вывода: 4 выхода<бр/> Максимальное напряжение сети: 60 В постоянного тока<бр/> Максимальный ток во включенном состоянии: 3 А<бр/> Минимальное напряжение сети: 3 В постоянного тока<бр/> Рабочая температура: -30&d; С до 80°С; C (-22° F до 176° f)
Выходная изоляция: 4000 Vrms
Температура хранения: -40°°; С до 100°С; С (-40°С; F до 212° F)
Кнопочный переключатель SPSTБренд:Apiele
Найдено: Amazon.com		н/дИспользуется внутри блока управления водяным клапаном управления и конечным клапаном.< бр/> Рабочее напряжение 250 В<бр/> Номинальный ток: 1 А, 3 А
SSR-стойка 48Найдено on:Radwell.comАртикул: 83105002Обрабатывает все соединения ольфактометра и работает с реле соидного состояния четырехугольного типа.
Подающие трубки из нержавеющей стали
Очиститель и очиститель наконечниковНайдено на: Amazon.com
Бренд:Thermaltronics		Номер модели: FBA-TMT-TC-2
Клапан шаровой ПВХ 1/4" Барб БунаНайдено: uplastic.comНомер позиции:62281
водяной кранНайдено: Ph.parker.comЧасть #: 003-0257-900Закачивает воду в камеру< бр/> Максимальный расход: 1500 куб<бр/> Напряжение (В постоянного тока): 24<бр/> Максимальное рабочее давление: 50 фунтов на квадратный дюйм, 3,44 бар
Провод 22awgБренд:tuofeng
Найдено: Amazon.com		Н/дИспользуется для подключения различных компонентов ольфактометра
Материал: медь
Калибр 30.0
Проволочные ножницыНайдено on:Amazon.com
Бренд:Billbotk		Будет использоваться для обрезки проводов
Торговая марка: PTFEЧасть #036663601452Используйте для доставки одорантов.
https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop

Ссылки

  1. Yeshurun, Y., Sobel, N. An odor is not worth a thousand words: from multidimensional odors to unidimensional odor objects. Annu Rev Psychol. 61, 219-241 (2010).
  2. Buck, L. B. Unraveling the sense of smell (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 44, 6128-6140 (2005).
  3. Spors, H., Wachowiak, M., Cohen, L. B., Friedrich, R. W. Temporal dynamics and latency patterns of receptor neuron input to the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (4), 1247-1259 (2006).
  4. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A., Mombaerts, P. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
  5. Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb. Nat Neurosci. 12, 210-220 (2009).
  6. Spors, H., et al. Illuminating vertebrate olfactory processing. J Neurosci. 32, 14102-14108 (2012).
  7. Kwak, J., Willse, A., Preti, G., Yamazaki, K., Beauchamp, G. K. In search of the chemical basis for MHC odourtypes. Proc Biol Sci. 277 (1693), 2417-2425 (2010).
  8. Schaefer, M. L., Yamazaki, K., Osada, K., Restrepo, D., Beauchamp, G. K. Olfactory fingerprints for major histocompatibility complex-determined body odors II: relationship among odor maps, genetics, odor composition, and behavior. J Neurosci. 22 (21), 9513-9521 (2002).
  9. Li, Y., et al. A distinct entorhinal cortex to hippocampal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. Nat Neurosci. 20 (4), 559-570 (2017).
  10. Gadziola, M. A., et al. A neural system that represents the association of odors with rewarded outcomes and promotes behavioral engagement. Cell Rep. 32 (3), 107919(2020).
  11. Carlson, K. S., Gadziola, M. A., Dauster, E. S., Wesson, D. W. Selective attention controls olfactory decisions and the neural encoding of odors. Curr Biol. 28 (14), 2195-2205.e4 (2018).
  12. Moberly, A. H., et al. Olfactory inputs modulate respiration-related rhythmic activity in the prefrontal cortex and freezing behavior. Nat Commun. 9, 1528(2018).
  13. Gire, D. H., et al. Information for decision-making and stimulus identification is multiplexed in sensory cortex. Nat Neurosci. 16 (8), 991-993 (2013).
  14. Ma, M., et al. Molecular layer interneurons in the cerebellum encode for valence in associative learning. Nat Commun. 11 (1), 4217(2020).
  15. Bolding, K. A., et al. Robust odor coding across states in piriform cortex requires recurrent circuitry: evidence for pattern completion in an associative network. bioRxiv. , 694331(2019).
  16. Bolding, K. A., Franks, K. M. Recurrent cortical circuits implement concentration-invariant odor coding. Science. 361 (6407), eaat6904(2018).
  17. Bolding, K. A., Franks, K. M. Complementary codes for odor identity and intensity in olfactory cortex. Elife. 6, e22630(2017).
  18. Bodyak, N., Slotnick, B. Performance of mice in an automated olfactometer: odor detection, discrimination and odor memory. Chem Senses. 24 (6), 637-645 (1999).
  19. Slotnick, B., Restrepo, D. Olfactometry with mice. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8.20), (2005).
  20. Williams, E., Dewan, A. Olfactory detection thresholds for primary aliphatic alcohols in mice. Chem Senses. 45 (7), 513-521 (2020).
  21. Villanueva, J. A., Restrepo, D., Ramirez-Gordillo, D. Closed-Loop Optogenetic Stimulation of the Olfactory Circuit at Different Phases of Theta Oscillations of the Local Field Potential. Methods Mol Biol. 2915, 179-187 (2025).
  22. Arevalo, N., et al. Open-source JL olfactometer for awake behaving recording of brain activity for mice engaged in olfactory tasks. Animal Models of Reproductive Behavior. Neuromethods. 200, (2023).
  23. Slotnick, B., Bodyak, N. Odor discrimination and odor quality perception in rats with disruption of connections between the olfactory epithelium and olfactory bulbs. J Neurosci. 22 (10), 4205-4216 (2002).
  24. Burton, S. D., et al. A novel olfactometer for efficient and flexible odorant delivery. Chem Senses. 44 (3), 173-188 (2019).
  25. Slotnick, B., Cockerham, R., Pickett, E. Olfaction in olfactory bulbectomized rats. J Neurosci. 24 (41), 9195-9200 (2004).
  26. Reinert, J. K., Schaefer, A. T., Kuner, T. High-throughput automated olfactory phenotyping of group-housed mice. Front Behav Neurosci. 13, 267(2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

Ольфактометр для грызуновподача запаховповедение мышейольфакторная дискриминациязадача «выбор-отказ» (Go No-Go)управление MATLABзапаховые стимулыспециализированное оборудованиекогнитивная гибкость
Построение ольфактометра для изучения обонятельного поведения грызунов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.