Методическая статья

Исследования противовоспалительного эффекта таблеток сяояо в лечении постменопаузального остеопороза у мышей

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67051

⸱

23 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

В этой статье

Краткое содержание

Постменопаузальный остеопороз стал глобальной проблемой общественного здравоохранения. Целью данного исследования является изучение терапевтических эффектов и связанных с ними механизмов применения таблеток Сяояо традиционной китайской медицины при этом состоянии.

Аннотация

Остеопороз является распространенным метаболическим заболеванием у женщин пожилого возраста и в постменопаузе, протекающим без явных симптомов на ранних стадиях. На последних стадиях этого состояния пациенты склонны к переломам, и это может серьезно повлиять на их здоровье и качество жизни. Увеличение продолжительности жизни во всем мире сделало остеопороз глобальной проблемой. Таблетки Сяояо ранее были
Используется при лечении депрессии. Кроме того, препарат, по-видимому, обладал эстрогеноподобной активностью, которая влияла на экспрессию ЩФ, раннего остеобласт-специфичного маркера, и COL-1, основного компонента костного внеклеточного матрикса. Таблетки Сяояо оценивали на предмет их влияния на постменопаузальный остеопороз (PMOM) у мышей. Целевая информация о каждом растительном компоненте таблеток Сяо Яо была доступна через базу данных Традиционной Китайской Медицины Фармакологии (TCMSP). Информация с веб-сайтов GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank и других веб-сайтов была использована для построения регуляторной сети травяного комплекса через сети Cytoscape и String для оценки белковых взаимодействий. Мышам проводили овариэктомию и лечили высокими и низкими дозами таблеток Сяояо, и их сравнивали с контрольной группой. Их симптомы оценивали с помощью иммуноцитохимии костных тканей. Результаты показали, что таблетки Сяояо обладают способностью облегчать симптомы PMOM у овариэктомированных мышей через сигнальный путь IL-17. Этот препарат может стать новым терапевтическим средством для лечения остеопороза.

Введение

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет остеопороз (ОП) как заболевание, характеризующееся снижением костной массы и ухудшением микроархитектуры костной ткани, что приводит к увеличению хрупкости костей и, следовательно, повышенному риску переломов1. Клиническое значение остеопороза заключается в том, что он может приводить к переломам, которые связаны с высокой смертностью, заболеваемостью и экономическими издержками2. Постменопаузальный остеопороз (ПМОП) обусловлен снижением уровня эстрогенов у женщин после менопаузы, что приводит к повышению активности остеокластов, что приводит к потере костной массы и разрушению микроструктуры костей. Это часто вызывает остеопороз с серьезным влиянием на здоровье3. Современные методы лечения ПМОП включают заместительную терапию эстрогенами, бисфосфонаты и паратиреоидный гормон, но они могут иметь различную степень побочных эффектов, недостаточную долгосрочную приверженность и высокую стоимость4. Таким образом, доступная фитотерапия является жизнеспособной альтернативой для большой части населения.

Таблетки Сяояо включены в Китайскую фармакопею5 и содержат восемь растительных компонентов, включая Чай Ху, Angelica sinensis, белую пеонию молочноцветковую, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, лакрицу и свежий имбирь. Известно, что все эти травы эффективны для детоксикации печени и укрепления селезенки, питания крови и регулирования менструального цикла, а также смесь использовалась для лечения депрессии6. Тем не менее, роль таблеток Сяояо при остеопорозе неясна.

Ранние исследования показали, что воспаление может привести к потере костной массы7, и что снижение плотности костной ткани, связанное с этим процессом, может быть ускорено менопаузой. Кроме того, существует тесная взаимосвязь между развитием остеопороза и воспалением. Воспалительный фактор, интерлейкин-17 (IL-17), является провоспалительным фактором, секретируемым клетками Th17, подмножеством CD4+ Т-лимфоцитов. Эти клетки связаны с несколькими хроническими воспалительными заболеваниями и играют важную роль в развитии разрушения костей при ревматоидном артрите. Кроме того, IL-17 стимулирует активатор рецептора ядерного фактора-κ В-лиганда (RANKL), который регулирует остеокластогенез, что приводит к большей резорбции кости, чем к формированию кости9. IL-17 стимулирует экспрессию других остеокластогенных цитокинов, таких как TNFα, IL-1, IL-6 и IL-8. Он обладает способностью синергировать с другими воспалительными факторами, что делает его важным воспалительным эффектором10.

Исследования также показали связь между таблетками сяояо и воспалением. Shi et al.11 и Fang et al.12 недавно подтвердили, что таблетки Xiaoyao могут снижать уровни IL-6 и TNF-α соответственно. В другом исследовании стеатогепатита, связанного с метаболизмом, сообщалось, что таблетки Сяояо могут повышать экспрессию пропионовой кислоты, которая, в свою очередь, ингибирует экспрессию TNF-α и оказывает противовоспалительное действие. Тем не менее, в настоящее время неизвестно, могут ли таблетки Сяояо регулировать развитие PMOM, опосредуя воспалительную реакцию через IL-17, что и было целью данного исследования.

В этом исследовании было предсказано пересечение мишеней таблеток Сяояо и генов, связанных с остеопорозом, с помощью сетевого фармакологического и биоинформатического анализа, а также проанализированы пересекающиеся гены белковых взаимодействий, GO и KEGG. Основываясь на прогнозируемых результатах,можно наблюдать экспрессию Act1 и IL-6, которые являются ключевыми белками в сигнальном пути IL-17, а также маркеры костного обмена щелочной фосфатазы (ЩФ) и коллагена I типа (COL-1), чтобы наблюдать терапевтическую эффективность таблеток Xiaoyao на мышах PMOM.

Протокол

Комитет по этике лабораторных животных Юцзянского медицинского университета по национальностям утвердил протокол исследования (номер утверждения: 2022101502). Самки мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель, класс SPF и масса тела (22 ± 2) г, были размещены в Экспериментальном центре на животных класса SPF Медицинского университета для национальностей Юцзянского медицинского университета. Подопытные животные содержались при температуре 24-26 °С и относительной влажности воздуха от 55% до 60%.

1. База данных и аналитическая платформа фармакологии систем традиционной китайской медицины

ПРИМЕЧАНИЕ: Фармакологическая база данных и аналитическая платформа систем традиционной китайской медицины (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) – это фармакологические платформы китайской медицины, которые содержат информацию об ингредиентах ТКМ, свойствах, связанных с ADME, мишенях и заболеваниях16,17.

  1. Получите доступ к веб-интерфейсу TCMSP. Найдите название Херба, введите название китайской медицины и нажмите «Поиск». Нажмите на латинское название в результатах поиска. Проводят скрининг по результатам ингредиентов с параметрами OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18.
  2. Скопируйте все результаты и сохраните их в формате TXT под названием Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
  3. В разделе Информация о целях на вкладке Связанные цели отфильтруйте Mol ID (т. е. результат на шаге 1.2).
  4. Скопируйте отфильтрованные результаты и сохраните их в формате TXT под названием Chinese Medicine Name_targets.txt.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью вышеуказанных шагов были получены все подходящие активные ингредиенты и соответствующая целевая информация традиционной китайской медицины (ТКМ).
  5. Поместите все вышеперечисленные файлы ingredients.txt и targets.txt файлы в одну папку, а скрипты Perl (Supplementary Coding File 1) поместите в эту папку.
  6. Откройте CMD, введите путь к папке cd, введите его и запустите скрипт Perl. Получите новый текстовый файл (allTargets.txt). Этот новый текстовый файл (allTargets.txt) содержит название травы, название ингредиента, идентификатор ингредиента и цель.

2. База данных ЮниПрот

ПРИМЕЧАНИЕ: База данных UniProt (https://www.uniprot.org/) содержит последовательности белков человека, аннотированные функциональной информацией, и используется для нормализации названий мишеней до ихофициальных названий.

  1. Перейдите в веб-интерфейс UniProt. Перейдите на вкладку Поиск , выберите UniProtKB и нажмите кнопку Поиск.
  2. Отфильтруйте на левой боковой панели, выберите «Проверено» (Swiss-Prot) для «Статуса» и «Человек » для популярных организмов. Нажмите кнопку Скачать, выберите Загрузить все, выберите TSV в поле Формат и нажмите кнопку Скачать , чтобы загрузить файл аннотации.
  3. Распакуйте загруженный файл в текущую папку, откройте распакованный файл, скопируйте и вставьте его в текстовый файл с именем ann.txt.

3. Конверсия идентификатора мишени препарата

  1. Поместите все файлы мишеней для лекарств, allTargets.txt полученные в разделе 1, и файл аннотаций UniProt, ann.txt полученный в разделе 2, в папку и поместите в нее скрипты Perl (Supplementary Coding File 2).
  2. Откройте CMD, введите cd + пробел + путь к папке, введите его и запустите скрипт Perl для получения нового текстового файла (allTargets.symbol.txt). Этот новый текстовый файл (allTargets.symbol.txt) содержит название травы, идентификатор ингредиента, название ингредиента и идентификатор гена.

4. Поиск по базе данных

  1. GeneCards: база данных генов человека (GeneCards)
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных GeneCards (https://www.genecards.org/) предоставляет информацию о прогнозировании и аннотации для генов человека. Он используется для доступа к целям заболевания 19,20.
    1. Перейдите в веб-интерфейс GeneCards. Введите в поле поиска слово «остеопороз» и нажмите кнопку «Поиск».
    2. Нажмите кнопку Экспорт и выберите Экспорт в Excel.
    3. Откройте загруженный файл, скопируйте гены с оценкой релевантности ≥ 1, вставьте и сохраните их в файл с именем GeneCards.txt.
  2. База данных OMIM
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных OMIM (https://omim.org) содержит человеческие гены, генетические заболевания и черты21.
    1. Перейдите в веб-интерфейс OIM. Нажмите на GENE Map, введите остеопороз в поле поиска и нажмите Поиск.
    2. Нажмите «Загрузить как» и выберите «Файл Excel».
    3. Откройте скачанный файл, скопируйте имя гена в столбец «Утвержденный символ», вставьте его и сохраните в файл с именем OMIM.txt.
  3. База данных PharmGkb
    ПРИМЕЧАНИЕ: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), база знаний по фармакогеномике, содержит аннотации к этикеткам лекарственных средств, лекарственные пути, фармакогенетические сводки и взаимосвязи между генами, лекарствами и болезнями22.
    1. Перейдите в интерфейс сайта PharmGkb. Введите остеопороз в поле поиска, нажмите «Поиск» и отметьте «Ген » на левой боковой панели.
    2. Введите все результаты вручную и сохраните их в файл с именем PharmGkb.txt.
  4. TTD: база данных терапевтических мишеней (TTD)
    База данных TTD (https://idrblab.org/ttd/) содержит информацию о мишенях белков и нуклеиновых кислот, целевых заболеваниях, информации о путях развития и соответствующих препаратах для каждой мишени23.
    1. Перейдите в веб-интерфейс TTD. Введите в поле поиска слово «остеопороз» и нажмите кнопку «Поиск».
    2. Нажмите «Информация о целевом объекте » в разделе «Идентификатор объекта» в результате, скопируйте имя целевого объекта, вставьте его и сохраните в файл с именем TTD.txt. Всего было получено 33 результата. Сохраняйте каждый результат таким же образом.
  5. База данных DrugBank Online (DrugBank)
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных DrugBank (https://go.drugbank.com) содержит информацию о лекарствах и мишенях для лекарств, взаимодействии лекарств, механизмах приема лекарств и метаболизме лекарств24.
    1. Перейдите в интерфейс сайта DrugBank. Выберите «Показания » на вкладке поиска, введите «остеопороз» в поле поиска и нажмите «Поиск».
    2. Нажмите на запись «Остеопороз » в результатах для получения дополнительной информации, перейдите на вкладку «ЛЕКАРСТВА И МИШЕНИ » и нажмите на соответствующую ссылку в столбце «ЦЕЛЬ» таблицы.
    3. Нажмите «Подробности» в белке, скопируйте имя гена, вставьте его и сохраните в файл с именем DrugBank.txt. Сохраняйте каждый результат таким же образом.

5. Диаграмма Венна

  1. Слияние генов, ассоциированных с заболеванием, и картирование Венна
    1. Поместите сохраненные текстовые файлы и скрипт в ту же папку.
    2. Откройте код R (Merge Disease-Related Genes), скопируйте и вставьте путь, по которому хранится вышеуказанный txt-файл, в строку, где находится setwd в коде R.
    3. Откройте программное обеспечение R, запустите измененный код R и сохраните его. Устанавливаем ген, называем файл Disease.txt.
    4. Откройте веб-сайт Draw Venn Diagram; В разделе ввода скопируйте и вставьте текстовое содержимое, сохраненное в разделах с 4 по 8, один за другим в список, назвав его соответствующей базой данных и нажав кнопку Отправить.
    5. Нажмите «Сохранить изображение в формате PNG» под изображением и сохраните текстовый результат в той же папке.
  2. Пересечение мишеней для лекарств и генов, ассоциированных с заболеванием
    1. Поместите файл allTargets.symbol.txt, полученный в разделе 3, и файл Disease.txt, полученный в шаге 5.1.3, в эту же папку.
    2. Откройте код R (мишень для лекарства и ген, связанный с заболеванием, пересекаются), скопируйте и вставьте путь, по которому хранится вышеуказанный txt-файл, в строку, где находится setwd в коде R.
    3. Откройте программное обеспечение R, запустите измененный код R и сохраните его. Установите ген, назовите файл Drug_Disease.txt.
    4. Откройте веб-сайт Нарисовать диаграмму Венна. В разделе ввода скопируйте и вставьте allTargets.symbol.txt и Disease.txt в список и назовите их в соответствии с соответствующими файлами.
    5. Нажмите «Сохранить изображение в формате PNG» под изображением и сохраните текстовые результаты в той же папке.

6. Построение регулирующей сети компаундирования ТКМ

  1. Поместите файл allTargets.symbol.txt, полученный в разделе 3, в ту же папку, что и файл Disease.txt и соответствующий Perl-скрипт (Supplementary Coding File 3).
  2. Откройте CMD, введите путь к файлу cd, нажмите Enter и запустите скрипт Perl. Получите четыре новых txt-файла: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt и net.type.txt. Файл network.txt содержит идентификатор ингредиента ТКМ, ген-мишень, отношение к мишени и название ингредиента. net.type.txt содержит имя узла, атрибуты и принадлежность. net.geneLists.txt — это список генов, а net.molLists.txt — список ингредиентов.
  3. Скопируйте вновь полученные текстовые файлы в ту же новую папку.
  4. Откройте программу Cytoscape 3.9.1, нажмите «Файл», нажмите «Импорт» и выберите «Файл сетевой формы». Выберите net.network.txt, поместите первый столбец идентификатора компонента в качестве исходного узла, второй столбец параметра Гены в качестве целевого узла и третий столбец целевого отношения в качестве типа взаимодействия и нажмите кнопку ОК.
  5. Импортируйте net.type.txt из окна Таблица узлов. Перейдите на вкладку Выбрать, выберите Узлы, выберите Из файла списка идентификаторов, выберите net.geneLists.txt и нажмите кнопку Открыть.
  6. Перейдите на вкладку Компоновка, выберите Компоновка круга с сортировкой по градусам и выберите Только выбранные узлы. Отрегулируйте высоту и ширину узлов на 70.
  7. Щелкните второе поле в поле Высота, выберите degree.layout в столбце, выберите Непрерывное отображение в поле Тип отображения и дважды щелкните окно настройки высоты в правой части поля Текущее сопоставление, чтобы настроить верхний и нижний пределы высоты до подходящего диапазона.
  8. Повторите операцию с параметром Ширина.
  9. Щелкните вкладку Компоновка еще раз и выберите Инструменты компоновки > Настроить масштаб, чтобы узлы не перекрывались.
  10. Нажмите на Верхнее правое окно программы, чтобы снять флажок с сети узлов, перейдите на вкладку Выбрать , выберите Узлы, выберите Из файла списка идентификаторов, выберите net.molLists.txt и нажмите Открыть.
  11. Перейдите на вкладку Компоновка, выберите Компоновка атрибутов группы, выберите Только выбранные узлы и нажмите кнопку Тип.
  12. Нажмите Размер шрифта метки в левом столбце и установите Значение по умолчанию на 12. Нажмите «Значение по умолчанию» на изображении/диаграмме 1 в левом столбце.
  13. Выберите «Диаграммы» во всплывающем окне, нажмите «Круговая диаграмма» и выберите элементы в столбце «Доступные столбцы», за исключением степени. Макет в столбце выбранных столбцов и нажмите кнопку Применить.
  14. Нажмите на кнопку Краска границ в левом столбце и установите значение по умолчанию на #003EF8. Нажмите на вкладку «Край» в нижней части левой боковой панели и установите «Ширину» на 0,8.
  15. Нажмите «Файл» на верхней панели инструментов, выберите «Экспорт», затем выберите «Сеть в образ».
  16. Во всплывающем окне выберите формат PNG для параметра «Формат», выберите каталог сохранения и назовите сеть изображений, отрегулируйте размер изображения до максимального значения 500%, выберите «Прозрачный фон» и нажмите «ОК», чтобы завершить сохранение изображения.

7. Конструкции сетей белок-белковых взаимодействий (ИПП)

  1. Откройте веб-сайт STRING (https://string-db.org/), нажмите «Множественный белок», нажмите «Обзор » в разделе «Загрузить файл», выберите файл Drug_Disease.txt , полученный на шаге 5.2.3, и выберите Homo sapiens в разделе «Организмы». Нажмите «Поиск» и нажмите «Продолжить».
  2. Нажмите «Настройки», установите минимальный требуемый показатель взаимодействия на наивысшую достоверность (0,900) и установите флажок «Скрыть отключенные узлы в сети» в параметрах отображения сети. Нажмите кнопку Обновить.
  3. Внесите коррективы в узлы на схеме сети, чтобы не было перекрытия или окклюзии.
  4. Нажмите кнопку Экспорт и нажмите кнопку Загрузить как растровое изображение с высоким разрешением, чтобы получить карту взаимодействующей сети белков в формате PNG. Кроме того, загрузите файл TSV в виде короткого табличного текста. Сохраните оба файла в одной папке. Файл TSV содержит имя гена, внутренний идентификатор STRING и баллы по различным атрибутам.

8. Построение ядра сети PPI

  1. Поместите файл TSV, полученный в разделе 7, и необходимые Perl-скрипты в новую папку.
  2. Откройте программу Cytoscape 3.9.1, нажмите «Файл», выберите «Импорт», нажмите «Сеть из файла», выберите файл TSV, укажите первый столбец node1 в качестве исходного узла и второй столбец node2 в качестве целевого узла и нажмите OK.
  3. Нажмите «Стиль » на левой боковой панели, нажмите «Значение по умолчанию » в поле «Ширина» и установите значение 60. Перетащите узлы так, чтобы в сети не было перекрытия и окклюзии.
  4. Нажмите APPs на верхней панели инструментов, нажмите CytoNCA и нажмите Открыть.
  5. В левом столбце выберите Без веса в разделах Между, Близость, Степень, Собственный вектор, Метод на основе локальной средней связности и Сеть и щелкните Анализировать.
  6. Когда анализ будет завершен, нажмите на «Таблицу узлов » в правом нижнем окне, нажмите « Экспорт», сохраните ее в папке и назовите «Оценка 1».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин CytoNCA должен быть установлен в программное обеспечение Cytoscape. Для этого нажмите «Приложения » на верхней панели инструментов, нажмите «Диспетчер приложений», введите CytoNCA в поле поиска, отметьте галочкой CytoNCA в среднем столбце возвращенных результатов и нажмите «Установить».
  7. Откройте score1, настройте столбец name на первый столбец, скопируйте информацию в таблицу, вставьте ее в новый текстовый файл, назовите его score1.txt и сохраните.
  8. Откройте код R, скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл score1.txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  9. Откройте программу R и запустите измененный код, чтобы получить два новых файла, score2.txt и score2.gene.txt. Файл score2.txt содержит гены, для которых все баллы программы были выше медианы, и конкретные баллы для каждой программы. score2.gene.txt содержит гены, которые набрали больше баллов, чем медиана по всем пунктам.
  10. Чтобы продолжить работу в Cytoscape, нажмите AnalysisPanel 1 в правом нижнем окне, нажмите Загрузить из файла в левой части окна, выберите score2.gene.txt, нажмите Открыть и нажмите OK во всплывающем окне.
  11. Нажмите «Выбрать узлы» внизу и нажмите «ОК» во всплывающем окне.
  12. Нажмите «Файл » на верхней панели инструментов, выберите «Экспорт», нажмите «Сеть в изображение», установите масштаб (%) в поле «Размер изображения» до максимального значения 500%, отметьте флажок «Прозрачный фон» и сохраните файл в той же папке, назовите его network1.
  13. Нажмите «Создать подсеть » на правой боковой панели нижнего окна, чтобы создать подсеть, проанализируйте подсеть, нажмите «ПРИЛОЖЕНИЯ» на панели инструментов вверху, нажмите «CytoNCA» и нажмите «Открыть».
  14. На левой боковой панели выберите «Без веса » в разделах «Между», «Близость», «Степень», «Собственный вектор», «Метод на основе локальной средней связности» и «Сеть» и нажмите «Анализировать».
  15. Когда анализ будет завершен, нажмите «Таблица узлов » в правом нижнем окне, нажмите «Экспорт» и сохраните его в новой папке с именем score2.
  16. Откройте score2, настройте столбец name на первый столбец, скопируйте информацию в таблице, вставьте ее в новый текстовый файл, назовите его score2.txt и сохраните.
  17. Откройте код R, скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл score2.txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  18. Откройте программу R и запустите измененный код, чтобы получить два новых файла: score3.txt и score3.gene.txt. Файл score3.txt содержит гены, которые набрали больше медианы для всех пунктов, а также конкретные баллы для каждого элемента. score3.gene.txt содержит гены, которые набрали больше среднего значения по всем элементам.
  19. Чтобы продолжить работу в Cytoscape, нажмите AnalysisPanel 1 в правом нижнем окне, нажмите Загрузить из файла в левой части окна, выберите score3.gene.txt, нажмите Открыть и нажмите OK во всплывающем окне.
  20. Нажмите «Выбрать узлы» внизу и нажмите «ОК» во всплывающем окне.
  21. Нажмите «Файл» на верхней панели инструментов, выберите «Экспорт», нажмите «Сеть в изображение», установите «Масштаб (%) в размере изображения до 500%, отметьте галочкой «Прозрачный фон» и сохраните файл в той же папке, которая использовалась на этом шаге, назвав его network2.
  22. Нажмите « Создать подсеть» на правой боковой панели окна ниже, чтобы создать подсеть.
  23. Нажмите «Файл » на панели инструментов вверху, выберите «Экспорт», нажмите «Сеть в изображение», установите масштаб (%) в размере изображения до максимума 500%, установите флажок «Прозрачный фон» и сохраните файл в той же папке, которая использовалась на этом шаге, и назовите его network3.

9. Преобразование Gene ID

  1. Поместите файл Drug_Disease.txt в ту же новую папку, что и требуемый файл кода.
  2. Откройте код R (Supplementary Coding File 4) и скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл Drug_Disease.txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  3. Откройте программу R, запустите измененный код с помощью org. Hs.eg.db пакет для преобразования идентификатора гена, и запускается после завершения создания нового файла id.txt. id.txt содержит символ гена и соответствующий идентификатор.

10. Анализ обогащения ГО

  1. Поместите файл id.txt из предыдущего шага в ту же папку, что и код анализа обогащения GO.
  2. Откройте код R (Supplementary Coding File 5) и установите в качестве рабочего каталога значение id.txt и путь, по которому хранится код Go.
  3. Откройте программное обеспечение R, запустите измененный код и используйте clusterProfiler, org. Hs.eg.db, обогатить график, график ggplot2, гистограммы анализа обогащения GO и пузырьковые графики. Получите три новых файла, GO.txt, barplot.pdf и bubble.pdf, после завершения прогона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: GO.txt представляет собой файл результатов обогащения, содержащий классификацию обогащения (BP, CC, MF), GO ID, GO, пропорцию гена, фоновую пропорцию, p-значение значимости обогащения, скорректированное p-значение (p.adjust, value), идентификатор гена (название) и количество генов, обогащенных на каждом GO. barplot.pdf – гистограмма, пузырь. PDF — это пузырьковый график.

11. Анализ обогащения KEGG

  1. Поместите файл id.txt в ту же папку, что и код анализа обогащения KEGG.
  2. Откройте код R (Supplementary Coding File 6) и установите рабочий каталог по пути, где хранятся id.txt и код KEGG.
  3. Откройте программное обеспечение R, запустите измененный код и используйте clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, пакет ggplot2 для построения гистограмм анализа обогащения GO, пузырьковых графиков и графиков путей. Прогон завершается созданием трех новых файлов: KEGG.txt, barplot.pdf и bubble.pdf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл KEGG.txt представляет собой файл результатов обогащения, содержащий идентификатор пути, описание пути, пропорцию гена, пропорцию фона, p-значение значимости обогащения, скорректированное p-значение (p.adjust, qvalue), идентификатор гена (имя) и количество генов, обогащенных в каждом пути. barplot.pdf — это линейчатая диаграмма, а bubble.pdf — пузырьковая диаграмма.
  4. Поиск Ил-17 в файле KEGG.txt; Результат показывает, что существует только один путь; скопируйте идентификатор пути.
  5. Откройте код R, вставьте идентификатор пути IL-17 в KEGGID и используйте пакет pathview для маркировки карты пути. Запустите измененный код R и получите два новых файла, hsa04657.pathview.png и hsa04657.png.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл hsa04657.png — это карта путей, hsa04657.pathview.png — помеченная карта путей, а те, что помечены красным цветом, — это гены, присутствующие в сети взаимодействий.

12. Приготовление таблеток Сяояо

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый метод приготовления см. в Китайской фармакопее5.

  1. Возьмите 100 г чая Ху, 100 г Angelica sinensis, 100 г White Paeonia lactiflora, 100 г жареных Atractylodes macrocephala, 100 г Poria cocos, 80 г Radix glycyrrhizae preparate и 20 г Menthae herba.
  2. С помощью каменной мельницы или порошкообразующей машины измельчите травы в мелкий порошок; Несколько трав соединяют в вышеуказанных пропорциях и измельчают в мелкий порошок для естественного смешивания. Используйте лекарственное сито с внутренним диаметром 80 меш от 180 μм ± 7,6 μм и процедите измельченный порошок. Тщательно перемешиваем.
  3. Возьмите 100 г имбиря, добавьте воду и каждый раз кипятите 2 раза по 20 минут. Процедите и отложите в сторону.
  4. Возьмите лечебный налет, окуните небольшой веник в имбирную воду, смажьте им бляшку, возьмите вышеуказанный порошок, посыпьте им имбирную воду, и переверните налет так, чтобы весь порошок был влажным и его можно было слепить в форму шара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образование лекарственного налета является важным этапом во время приготовления таблеток ТКМ. Большая часть бамбука мосо будет разделена на полоски и сплетена в скелет. Бамбуковая кожа, или тенгпи, вплетается в поверхность, и она приобретает округлую форму. Поверхность налета должна быть тонко покрыта тунговым маслом, а затем покрыта слоем лака. Его высушивают, чтобы он стал водонепроницаемым. Таблетки, изготовленные таким образом, будут круглыми и гладкими.
  5. Снова смажьте имбирь водой, посыпьте порошком, и поверните налет так, чтобы лекарство постепенно округлилось и увеличивалось. Поместите в прохладное место для просушки.

13. Создание животной модели

  1. После 7 дней акклиматизации случайным образом разделите подопытных мышей на 4 группы, а именно: фиктивную операционную группу (Sham, где был удален только жир вокруг яичников) и три группы овариэктомированных мышей, состоящих из модельной группы (OVX), а также групп приема таблеток Сяояо в низкой и высокой концентрации.
  2. Обезболите мышей 3% пентобарбиталом натрия (40 мг/кг), вводимым внутрибрюшинно. Убедитесь, что мыши входят в состояние анестезии, наблюдая за общим расслаблением мышц, глубоким и медленным дыханием и замедленными движениями. Нанесите глазную мазь на глаза мышей перед операцией.
  3. Поместите животных в положение лежа и побрейте почечную область спины с помощью бритвы для животных. Провести местную дезинфекцию 75% этанолом.
  4. Сделайте продольный разрез примерно на 1 см с обеих сторон, близко к дорсальной области почки, и надрежьте фасцию, чтобы отделить мышцы и брюшину.
  5. Найдите верхнюю часть маточного рога и маточные трубы для перевязки. Вставьте щипцы в разрез для исследования и найдите яичник, окруженный жировой тканью ярко-красного цвета цветной капусты, со спирально расположенными фаллопиевыми трубами ниже яичника, соединяющими яичник с маточным рогом25. Удалите яичники хирургическими ножницами и наложите шов.
  6. Удалите небольшое количество жировой ткани возле яичника в качестве контроля в группе фиктивной операции. Наблюдайте за животными до тех пор, пока они не придут в сознание. Поместите послеоперационных животных в отдельные клетки до полного выздоровления.
  7. Чтобы предотвратить заражение, обеспечьте мышей гентамицином в течение 3 дней после операции. После операции обеспечьте нормальное питание и хорошие условия для роста в соответствии с фактическим состоянием мышей. При возникновении каких-либо отклонений, таких как инфицирование раны или потеря аппетита, немедленно обратитесь к инструктору Центра лабораторных животных.

14. Применение лекарственных препаратов

ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с Фармакологической экспериментальной методологией26, пересчет используемых доз для человека и животных составлял 9 г таблеток Сяояо для взрослого человека весом 70 кг, что эквивалентно одной дозе (дозировка для однократного приема).

  1. Для групп с низкой и высокой дозой используйте 0,683 г/кг и 2,73 г/кг соответственно для группы из 8 животных. Используйте левую руку, чтобы обездвижить мышь так, чтобы рот мыши находился на прямой линии с пищеводом. Держа иглу для зонда в правой руке, аккуратно введите ее в пищевод по задней стенке глотки от уголка рта мыши.
  2. На этом этапе направление иглы для зонда может быть немного изменено для стимуляции индуцированного глотания. Введите препарат. Выполняйте это один раз в день в течение 12 недель.
  3. В фиктивных и модельных группах вводите физиологический раствор один раз в день в течение 12 недель в количестве, определяемом весом животного.
  4. Усыпляйте мышей при вывихе шейного отдела и обрезайте им задние конечности. Снимите кожу с конечностей, чтобы отделить мышцу от бедренной кости. Обрабатывайте бедренные кости мышей раствором для декальцинации ЭДТА в течение 1 месяца и ежедневно заменяйте свежим раствором.

15. Окрашивание гематоксилин-эозином (ПЭ)

  1. Депарафинизируйте бедренные ткани в течение 8 минут, а затем поместите в градиентный этанол на 3 минуты; Смыть проточной водой в течение 1 мин.
  2. Каплями нанесите окрашивающий раствор гематоксилина на участки, чтобы полностью покрыть ткань, запачкайте на 5 минут и промойте водопроводной водой
  3. Добавьте раствор для дифференцировки соляной кислоты в ткань на предметное стекло, следя за тем, чтобы он полностью покрывал ткань. Прекращают, когда наблюдается изменение цвета ткани. Промойте водой из-под крана.
  4. Добавьте раствор красителя Эозина по каплям и дайте полностью покрыть ткань, действуя от 30 с до 2 минут. Излишки красителя смойте проточной водой.
  5. Проведите градиентное обезвоживание этанола 75% безводным этанолом в течение 5 минут, а затем безводным этанолом в течение 5 минут и очистите с помощью раствора для депарафинизации в течение 3 минут.
  6. Капните на предметное стекло соответствующее количество нейтральной камеди в соответствии с размером ткани и осторожно опустите покровную резинку, избегая попадания пузырьков воздуха.

16. Микрокомпьютерная томография и иммуногистохимический анализ

  1. Удалите лишние мышцы и связки вокруг образцов бедренной кости у разных групп мышей и зафиксируйте образцы тканей в 4% параформальдегиде на 24 ч.
  2. Высушите костные ткани на воздухе и выполните микрокомпьютерную томографию с помощью сканирования костной ткани с целью получения трехмерных данных микрокомпьютерной томографии.
  3. Из законсервированных мышиных восковых блоков разрежьте их на непрерывные участки толщиной 6 мкм и запекайте ломтики при температуре 70 °C -72 °C в течение 30-60 минут.
  4. Депарафинизация в течение 8 минут, затем обработка 75% безводным этанолом в течение 5 минут, безводным этанолом в течение 5 минут и полоскание PBS в течение 5 минут в 3 раза.
  5. Выполните ремонт под высоким давлением EDTA в течение 15 минут, а затем промывку PBS в течение 5 минут в течение 3 раз.
  6. Добавьте 3% перекись водорода по каплям в ткань, инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут и промойте PBS в течение 5 минут в 3 раза.
  7. С помощью иммуногистохимического карандаша нарисуйте круг. Стирать с помощью PBS в течение 3 минут в 3 раза.
  8. Окрашивание первичных антител (pAb кролика против ALP (1:200), pAb кролика против COL-1 (1:200), pAb кролика против IL-17 (1:275), pAb против Act1 (1:500), pAb кролика против IL-6 (1:500)) в течение ночи, с последующим промыванием буфером PBS в течение 5 минут в течение 3 раз.
  9. По каплям добавьте вторичное антитело (HRP-конъюгированный Affinipure Goat Anti-rabbit IgG (H+L; 1:2000)) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут. Стирать с PBS буфером в течение 3 мин в 3 раза.
  10. Инкубируйте в готовом к использованию DAB в течение 3-5 минут, затем промойте PBS.
  11. Повторное окрашивание гематоксилином в течение 3 минут, затем полоскание PBS.
  12. Используйте дифференцированный раствор в течение примерно 10 секунд, после чего прополощите PBS.
  13. Добавьте обратный синий раствор в течение 10 секунд, после чего прополощите PBS.
  14. Проведите обработку 75% безводным этанолом в течение 5 минут, безводным этанолом в течение 5 минут и прозрачным в течение 3 минут. Используйте нейтральную смолу для герметизации слайдов.

Результаты

Активные ингредиенты и цели действия таблеток Сяояо
Путем поиска в базе данных TCMSP и скрининга в соответствии с критериями пероральной биодоступности (OB) ≥ 30% и лекарственных свойств (DL) ≥ 0,18, было обнаружено 125 активных ингредиентов в таблетках Xiaoyao. Среди них ингредиенты 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 и 2 были из белой Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, солодки и имбиря соответственно. Некоторые из активных ингредиентов приведены в таблице 1. Кроме того, из базы данных TCMSP было получено в общей сложности 879 мишеней эффективных активных ингредиентов, а 232 мишени остались после конвертации ID и удаления повторяющихся значений.

Сетевой анализ ТКМ - Активный ингредиент - Пересекающаяся мишень - Болезнь
В нескольких базах данных был проведен поиск генов, связанных с этим заболеванием, по ключевому слову остеопороз. В базе данных GeneCards было получено 1692 гена после фильтрации по шкале релевантности ≥1. Всего в базе данных OMIM было получено 35 генов. В базах данных PharmGkb, TTD и DrugBank было 3, 33 и 386 генов соответственно. Впоследствии пересечение результатов этих пяти баз данных было использовано для дальнейшего анализа (рисунок 1А). Одним из генов, который был представлен в четырех базах данных , был CALCR. В общей сложности 102 пересекающихся гена были получены после объединения генов, связанных с заболеванием, и пересечения с мишенью для лекарства (рис. 1B). Основываясь на взаимодействиях между мишенями заболевания и активными ингредиентами препарата, с помощью программного обеспечения Cytoscape была построена сеть, пересекающаяся с активными ингредиентами ТКМ. В результате были получены взаимосвязи между компонентами препарата и полиморфной регуляцией сканирования генов, связанных с заболеванием (рис. 2А).

В базе данных String белковые взаимодействия анализировались на пересечении генов болезней и мишеней лекарств для получения диаграмм их взаимодействия (рисунок 2B), а затем они были отсканированы на наличие наиболее центральных белков (рисунок 2C-D). Результаты показали наиболее сильное взаимодействие между FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 и STAT3 среди генов заболевания и мишеней для лекарств (рис. 2E).

Функция GO и анализ обогащения путей KEGG
Анализ обогащения GO показал в общей сложности 2177 записей, в том числе 1990 записей о биологических процессах (BP), 58 записей о клеточных компонентах (CC) и 129 записей о молекулярных функциях (MF). В АД гены в основном были сосредоточены на реакции на уровень питательных веществ, реакцию на окислительный стресс и клеточную реакцию на окислительный стресс. МФ фокусировалась на связывании ДНК-связывающего фактора транскрипции, связывании ДНК-связывающего фактора транскрипции РНК-полимеразы II, активности ядерных рецепторов, активности лиганд-активируемого фактора транскрипции и активности цитокинов (рис. 3A-B).

При анализе обогащения путей KEGG было получено в общей сложности 168 связанных сигнальных путей, наиболее значимыми из которых были сигнальный путь AGE-RAGE, сигнальный путь IL-17, сигнальный путь TNF, сигнальный путь HIF-1 и дифференцировка клеток Th17 (рисунок 3C-D). Предполагается, что таблетки Сяояо могут оказывать терапевтическое воздействие на PMOM несколькими способами. Воспаление тесно связано с остеопорозом и может ускоряться при наступлении менопаузы, а IL-17 является важным воспалительным фактором7. Таким образом, следующий план состоит в том, чтобы изучить, могут ли таблетки Сяояо лечить остеопороз с воспалительной точки зрения по отношению к IL-17.

Структурные изменения костной ткани до и после удаления ткани яичника
Окрашивание HE показало, что в бедренных костях мышей Фальш трабекулы были плотно расположены, с хорошей непрерывностью, небольшими промежутками между трабекулами, редкими переломами и нормальным размером полости костного мозга. По сравнению с группой Sham, бедренные кости группы OVX были расположены редко, с тяжелыми переломами трабекул, нарушенной непрерывностью и заметно увеличенной полостью костного мозга, демонстрируя типичные остеопоротические изменения (Рисунок 4A).

Сравнение микрокомпьютерной томографии между группами
Бедренные кости мышей в группе OVX показали неполную трабекулярную сеть, частично пустую полость костного мозга и истончение костной коры по сравнению с таковыми у мышей в группе Шама. В группе мышей Шам наблюдалось обилие трабекул, хорошая непрерывность и сужение костномозговой полости в бедренных костях (рис. 4B).

Поведенческие эффекты таблеток Сяояо на мышей
В течение периода исследования, за исключением группы OVX, все мыши в других группах имели лучшие жизненные привычки, нормальный цвет волос, высокую подвижность и хорошее здоровье. Моча и кал каждой мыши пришли в норму в течение 1 недели после лечения таблетками Сяояо. Не было укусов, раневых инфекций, желудочно-кишечной непроходимости, отслоения швов, некроза кожи в месте разреза или смерти кого-либо из мышей. Мыши в группе OVX были склонны к выпадению волос, потемнению цвета волос, снижению подвижности, более длинным рефлексам, увеличению выделения и уменьшению приема пищи и питья.

ПЭ окрашивание патологических срезов мышей после медикаментозного вмешательства
В группе Шама бедренная ткань была плотной, сетчатой и правильно расположенной. Размер и непрерывность полости костного мозга были нормальными, а расстояние между соседними костными трабекулами было относительно небольшим. По сравнению с группой Шама, в коре бедренной кости и губчатой кости в группе OVX наблюдались явные дефекты, уменьшение трабекул, увеличение разрывов, нарушение непрерывности, истончение структуры, расширение полости костного мозга и истончение коры кости. По сравнению с группой OVX, бедренные трабекулы мышей в группах, получавших лекарственные препараты (низкие и высокие дозы), выглядели структурно интактными, с уменьшенным расстоянием, увеличенной связностью, суженными полостями костного мозга и более плотными структурами (рисунок 5A).

Определение визуализирующих индексов у мышей после медикаментозного вмешательства
По сравнению с группой Sham, бедренные кости мышей в группе OVX имели редкие и сломанные костные трабекулы и истонченную костную кору. По сравнению с группой OVX, у мышей в группе высоких доз таблеток Сяояо было меньше переломов костных трабекул, восстановлена сетчатость и значительная степень частичного уменьшения полости костного мозга. Тем не менее, у мышей, получавших низкие дозы таблеток Сяояо, все еще были переломы костных трабекул, хотя наблюдалось увеличение костных трабекул и уменьшение полости костного мозга. Трабекулярная структура костных трабекул в группе, подвергшейся симуляции операции, показала большую непрерывность и полноту (рис. 5B).

Иммуногистохимические результаты исследований тканей в группах после медикаментозного вмешательства
Act1 и IL-6 являются ключевыми белками в сигнальном пути IL-17, а ALP и COL-1 являются остеогенными генами. Экспрессия белков ЩФ, COL-1, IL-6, IL-17 и Act1 приводит к образованию желтовато-коричневых или желтых гранул на костной ткани. Результаты иммуногистохимии показали, что средние значения оптической плотности ЩФ и COL-1 в группе препарата были выше, чем в группе OVX после лечения таблетками Сяояо, и разница была статистически значимой (p < 0,05). Средние значения оптической плотности IL-17, Act1 и IL-6 в группе препарата были ниже, чем в группе OVX, и разница была статистически значимой (p < 0,05; Рисунок 6). Таблетки Сяояо обратили вспять снижение ЩФ и COL-1, вызванное овариоэктомией, при одновременном снижении экспрессии нескольких ключевых белков IL-17, IL-6 и Act1 в сигнальном пути IL-17, что позволяет предположить, что препарат может оказывать свое терапевтическое действие через этот путь.

figure-results-1
Рисунок 1: Сетевой анализ пересечения активных ингредиентов китайской травяной медицины и генов, связанных с болезнями. (А) Пересечение генов, связанных с заболеванием, полученных из баз данных GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD и DrugBank. Они представлены синим, красным, зеленым, желтым и коричневым цветами с 1692, 35, 3, 33 и 386 генами соответственно. Пересечение — это гены, связанные с заболеванием, в пяти базах данных, а перекрывающаяся часть указывает на количество пересекающихся генов в каждой базе данных. (B) Показано пересечение мишеней лекарственных препаратов (синим цветом обозначает этот набор данных, т.е. набор генов-мишеней, действующих на лекарственные средства, собранных в базе данных TCMSP после преобразования идентификатора и удаления дубликатов) и генов, связанных с заболеванием (красным цветом обозначен этот набор данных, который содержит все гены из пяти вышеупомянутых баз данных). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Взаимодействие активных ингредиентов ТКМ с генными регуляторными сетями и основными белками, связанными с заболеванием. (А) Регуляторная сеть активных ингредиентов и генов, связанных с заболеванием, в ТКМ показывает генные регуляторные отношения, соответствующие каждому активному ингредиенту в таблетках Сяояо, причем каждый ингредиент связан с геном, который он регулирует. (B) Результаты анализа белок-белковых взаимодействий пересекающихся генов в STRING (узлы сети представляют белки, Edges представляют белок-белковые ассоциации, а множественные связи указывают на множественные взаимодействия между двумя белками). (К-Е) Белковые взаимодействия, полученные с помощью String, были проверены несколько раз. (В) Сеть взаимодействия белков была получена после первого скрининга, и выделенная часть является ее основной частью. (D) Результатом второго скрининга и выделенной частью является основная часть. (E) Самая центральная сеть взаимодействия белка в сети взаимодействия белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ обогащения GO и KEGG. (А-Б) Результаты анализа пересекающихся генов с помощью обогащения GO разделены на 3 записи: «Биологический процесс» (BP), «Клеточный компонент» (CC) и «Молекулярная функция» (MF), и каждая запись показывает только 10 наиболее значительно обогащенных генов. (К-Д) Результаты анализа обогащения пересекающихся генов с помощью KEGG (показывают топ-30 наиболее существенно обогащенных). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Создание и оценка модели овариэктомированных мышей. (А) Сравнение морфологии метафизарной кости между группами, подвергшимися симуляции операции, и группами овариэктомии (10x). В группе OVX трабекулярные переломы были тяжелыми, непрерывность была нарушена, а полость костного мозга была значительно увеличена, в то время как в группе симуляции трабекулярные переломы были редкими, а полость костного мозга была нормального размера. (B) Микрокомпьютерная томография бедренной кости в группах симуляции и овариэктомии. В группе OVX трабекулярная сетка была неполной, а полость костного мозга была частично пустой. В группе Шама трабекулы были обильными и непрерывными, а полость костного мозга была узкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: ПЭ и микрокомпьютерная томография после лечения таблетками Сяояо. (А) Окрашивание HE (10x) бедренных срезов мышей в каждой группе после лечения таблетками Сяояо. В группе OVX костные трабекулы были редуцированы, непрерывность прервана, структура разрежена, а полость костного мозга увеличена. В группе Шама костные трабекулы имели хорошую непрерывность, бедренная ткань была структурно плотной, а полость костного мозга была нормальной. По сравнению с группой OVX, костные трабекулы в группе препаратов оказались структурно неповрежденными, с повышенной связностью, уменьшенной полостью костного мозга и более плотной структурой, чем в модельной группе. (B) Сравнение микро-КТ бедренных костей мышей в каждой группе после лечения таблетками Сяояо. Костные трабекулы в бедренных костях мышей в группе овариэктомии были редкими и ломаными, в то время как в группе Шама трабекулы были более непрерывными и неповрежденными. По сравнению с овариоэктомированной группой, у мышей в группе, получавшей высокие дозы препарата, было меньше сломанных костных трабекул, восстановлена ретикулярная структура и частично уменьшена полость костного мозга, в то время как у животных в группе низких доз препарата было больше костных трабекул и уменьшена полость костного мозга, но сломанные костные трабекулы остались. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Иммуногистохимия для обнаружения влияния таблеток Сяояо на сигнальный путь IL-17 и экспрессию белка гена остеогенного маркера у остеопоротических мышей (40x). Положительные реакции на присутствие белков ЩФ, COL-1, IL-6, а также IL-17 и Act1 проявлялись появлением желтовато-коричневых или желтых гранул на костной ткани. Экспрессия ALP и COL-1 в группе препаратов была выше, чем в группе OVX (p < 0,05). Экспрессия IL-17, Act1 и IL-6 в группе препаратов была ниже, чем в группе OVX (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Название традиционной китайской медициныМолекулярная идентификацияНазвание молекулы
Белая пеония молочноцветковаяMOL001918пеонифлоргенон
Белая пеония молочноцветковаяMOL000211Майрин
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-ацетил-12-сенециоил-2Е,8Z,10Е-атрактилентриол
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-ацетоксиатрактилон
Menthae HerbaMOL000471Алоэ-эмодин
Menthae HerbaMOL005190Эриодиктиол
Чай ХуMOL000354Изорамнетин
Чай ХуMOL013187Куббин
Дягиль китайскийMOL000449Стигмастерол
Дягиль китайскийMOL000358бета-ситостерин
Пория кокосовая стружкаMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Пория кокосовая стружкаMOL000283Эргостерол пероксид
СолодкаMOL002311Глицирол
СолодкаMOL0049907,2',4'-тригидрокси - 5-метокси-3 - арилкумарин
Свежий имбирьMOL0061296-метилгингедиацетат2
Свежий имбирьMOL001771Порифераст-5-ен-3бета-ол

Таблица 1: Активные ингредиенты в некоторых китайских лекарствах. В первой колонке перечислены названия традиционных китайских лекарств, во второй колонке — идентификатор активного ингредиента китайской медицины, а в третьей колонке — название активного ингредиента в китайской медицине.

Файл дополнительного кодирования 1: Название травы, ингредиент и код объединения идентификатора цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 2: Преобразование идентификатора мишени препарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 3: Файлы для сетевого анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 4: Преобразование символа в ID гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 5: Анализ обогащения GO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 6: Анализ обогащения KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Согласно статистике, остеопороз ежегодно вызывает 1,5 миллиона переломов в Соединенных Штатах, и подавляющее большинство из них происходиту женщин в постменопаузе. Прогнозируется, что с увеличением численности стареющего населения большинство будущих переломов бедра в мире произойдет в Азии, а к 2050 году общее число переломов бедра во всем мире достигнет 8,2миллиона28. Затраты на профилактику переломов почти равны стоимости их лечения, а применение лекарств неизбежно будет иметь некоторыепобочные эффекты. Поэтому существует острая необходимость в более экономически эффективном способе решения этой проблемы в ответственном обществе.

Таблетки Сяояо состоят из восьми ингредиентов. Исследования влияния его ингредиентов на остеопороз продолжаются. Poria cocos ингибирует остеокластогенез и остеолитическую активность у мышиной модели, индуцированной овариэктомическим остеопорозом30. Комбинация двух компонентов, солодки и Shu-di-huang, может оказывать антиоксидантное действие, ингибируя сигнальный путь NF-κB31. Традиционный китайский травяной тоник, Danggui buxue tang, может быть полезен при лечении остеопороза благодаря своей способности ингибировать костный обмен и модулировать регуляцию гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси (HPG) и тем самым предотвращать потерю костной массы у овариэктомированных крыс32. Все эти результаты свидетельствуют о том, что таблетки Сяояо могут оказывать терапевтическое воздействие на остеопороз. Результаты этого исследования также свидетельствуют о том, что таблетки Сяояо могут оказывать антиостеопорозное действие, модулируя активность сигнального пути IL-17 противовоспалительным образом.

В общей сложности 168 соответствующих сигнальных путей были получены из регуляторной сети мишеней для лекарств и генов, связанных с остеопорозом, построенных в этом исследовании, и в этом исследовании был изучен сигнальный путь IL-17. Семейство Ил-17 состоит из шести членов, в том числе Ил-17А-Ф, из которых Ил-17А был первым и самым важным из обнаруженных33. В ранних исследованиях считалось, что IL-17 связан с воспалительными и аутоиммунными заболеваниями у людей. Позже исследования показали, что он играет роль в поддержании целостности барьера, и также было обнаружено, что он связан с раком15. Однако, хотя он не играет физиологической роли в ремоделировании костей, он ведет себя по-другому при аномальных состояниях костей. Кроме того, IL-17 может действовать как слабый активатор, и он синергирует с другими цитокинами для повышения выработки энергии. Об этом свидетельствует его коактивация с TNFα15,34.

Экспериментыin vitro показали, что IL-17 может индуцировать пролиферацию и дифференцировку остеобластических МСК35, а также может ингибировать BMP-2-индуцированную дифференцировку первичных остеобластов крыс36. IL-17 может стимулировать остеобласты к экспрессии RANKL, что, в свою очередь, способствует остеокластогенезу, но этот эффект, по-видимому, зависит от наличия остеобластов37,38. В этом исследовании различные концентрации таблеток Сяояо оказали терапевтический эффект на мышей модели PMOM, особенно при использовании в более высоких концентрациях. IL-17, Act1 и IL-6, которые коррелируют с сигнальным путем IL-17, были значительно снижены у этих мышей по сравнению с контрольной группой. Когда были оценены результаты анализа обогащения, они позволили предположить вовлечение пути IL-17, когда животных лечили таблетками Сяояо.

В этом исследовании также были проверены некоторые маркеры костной конверсии. ЩФ представляет собой тетрамерный мембраносвязанный фермент, который может секретироваться остеобластами и играет важную роль в формировании костей и минерализации, разрушая ингибитор минерализации, пирофосфат39. Около 90% органической фракции во внеклеточном матриксе костных тканей состоит из COL-1, и при минерализации костей ключевую роль в этом процессе играетколлаген40. В результате этого исследования уровни экспрессии белков ЩФ и COL-1, наблюдаемые с помощью иммуногистохимии мышей в группе препаратов, были выше, чем в модельной группе, что позволяет предположить, что эффект таблеток Сяояо в улучшении остеопороза может быть достигнут за счет повышения показателей остеогенных генов. Некоторые ученые продемонстрировали, что экспрессия и транскрипционная активность рецептора эстрогена гепатоцитов (ERα) могут быть повышены с помощью Xiaoyao san41. Было показано, что экстракты Angelica sinensis, White Paeonia lactiflora и солодки в Сяояо-сан обладают эстрогеноподобной активностью. Те же ингредиенты присутствуют и в таблетках Сяояо, используемых в этом исследовании, которые изготовлены по рецепту Сяояо Сан современными методами приготовления. Таким образом, можно предположить, что таблетки Сяояо могут также увеличивать экспрессию остеогенных генов, таких как ALP и COL-1 , оказывая эстрогеноподобное воздействие на остеобласты для повышения их активности и улучшения качества костей.

В этом исследовании была успешно создана модель PMOM у мышей путем удаления обоих яичников с помощью дорсальной овариэктомии. Животная модель является основой для всех последующих экспериментов в этом исследовании. При хирургическом удалении яичников мышей важно было убедиться, что яичники мышей в группах OVX и препаратов были полностью удалены, тогда как в фиктивной группе удалялся только жир возле яичников, а также важно было избежать раневых инфекций.

Количество костных трабекул и плотность соединений мышей улучшились после лечения овариэктомии таблетками Сяояо, что позволило предположить, что этот препарат оказывает терапевтическое действие на остеопороз. В этом исследовании для оценки эффективности лечения использовались иммуногистохимия и иммуноцитохимия; Время действия различных реагентов не является абсолютным, особенно в процессе развития цвета, что требует наблюдения в режиме реального времени и своевременной реакции для обеспечения наилучших результатов. Во время инкубации антител сначала задается градиент концентрации антитела, а после наблюдения и сравнения выбирается наиболее подходящая концентрация для последующих экспериментов.

Однако в этом исследовании были некоторые ограничения. Веб-фармакологические данные имели только один источник данных, а анализ в отношении состава лекарств проводился только из одной базы данных. Кроме того, эффективность таблеток Сяояо не сравнивалась с положительными препаратами в этом исследовании, и не было возможности оценить конкретные различия между таблетками Сяояо и современными методами лечения.

Для PMOM доступным вариантом обработки первой линии являются бисфосфонаты. Однако применение этих препаратов может привести к желудочно-кишечным противопоказаниям и еще более серьезным атипичным переломам бедренной кости и остеонекрозу челюстей42,43. Варианты лечения второй линии включают применение деносумаба и гормональную терапию. Было показано, что деносумаб уменьшает переломы бедра, позвонков и других переломов. Тем не менее, после прекращения приема препарата может произойти рикошет, и чем дольше продолжительность прекращения приема, тем больше потеря плотности костной ткани 42,44,45. Менопаузальная гормональная терапия снижает риск остеопоротических переломов позвоночника, но ее эффекты ограничены возрастом, и ее долгосрочные риски, по-видимому, перевешиваютпреимущества. Последовательная терапия является долгосрочным вариантом лечения ПМОМ, при котором использование костеобразующих препаратов с последующим приемом антирезорбтивных препаратов может достичь наибольшего увеличения костной массы. Конкретные лекарственные препараты обычно определяются для каждого пациента42.

В связи с этим можно предположить, что традиционные китайские травы могут иметь благоприятный потенциал в лечении остеопороза. Механизм действия фитотерапии является многопутным и многоцелевым, а не действует через один механизм47. Некоторые ученые оценили эффективность и безопасность некоторых китайских растительных препаратов и показали, что количество переломов при использовании комбинации китайских и западных лекарств по сравнению с применением только китайской медицины было ниже, чем в группе48 только западной медицины. По сравнению с химическими препаратами, китайские растительные средства имеют меньше побочных эффектов, относительно недороги и подходят для длительного использования. Китайские травяные средства не только восстанавливают микроструктуру костей и увеличивают их объем, но и уменьшают или устраняют симптомы слабости поясничного отдела позвоночникаи боли в спине. Текущее исследование может помочь обеспечить возможный подход к выявлению новых лекарств и методов лечения.

Применение таблеток Сяояо для лечения ПМОМ представляется многообещающим. В настоящем исследовании таблетки могут улучшить костную массу и качество костей в мышиной модели PMOM за счет подавления воспаления. Некоторые ученые даже предположили, что комбинация китайской медицины и иглоукалывания может быть эффективной в лечении PMOM50. В то же время доказана эффективность комбинации китайской и западной медицины51. Оба эти возможных средства являются действенными, хотя любое рекомендуемое лечение с использованием таблеток Сяояо в сочетании с иглоукалыванием и западной медициной должно быть подтверждено клиническими испытаниями. Клиническое значение остеопороза заключается в переломах костей, и будущие исследования также должны быть сосредоточены на их предотвращении.

Таким образом, это исследование показало с помощью сетевой фармакологии и экспериментов на животных, что у мышей PMOM наблюдалось значительное улучшение костного метаболизма и увеличение костной массы после лечения таблетками Сяояо. Механизм действия этого явления может быть связан с ингибированием сигнального пути IL-17 и усилением остеогенных факторов, активности ЩФ и COL-1. Это исследование закладывает теоретический фундамент и экспериментальную основу для клинического применения таблеток Сяояо в лечении заболеваний, связанных с остеопорозом.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой научных исследований и технологического развития города Байсэ (20224128). Авторы благодарят доктора Дева Суранну из Имперского колледжа Лондона и YMUN за редактирование рукописи. YYX и ZYW внесли равный вклад в это исследование.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробоотборник 1 млGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Для анестезии у мышей
4% полиформальдегидBeijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.P1110Для фиксации тканей
6-0 рассасывающийся шовный материал (угловая игла)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Для наложения послеоперационных швов
Абсорбирующий ватный тампонWinnerMIANQIU-500gДля стерилизации и гемостаза
Адгезивные слайдыJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Для срезов тканей
АмобарбиталSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLДля анестезии у мышей
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.G1866Синяя окраска ядер клеток после действия раствора для дифференцировки гематоксилина
C57BL/6 мышейBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Для использования в экспериментах на животных
хирургические лезвия из углеродистой сталиPremier Medical Equipment Co.SP239Для мышиной хирургии
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS АНТИТЕЛАbs-6202Rсвязывается с Act1 в тканях
Раствор гематоксилина Коула (для обычного окрашивания)Beijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.G1140Для окрашивания парафиновых срезов
Коллаген типа I Поликлональные антителаproteintech14695-1-APСвязывается с COL-1 в тканях
DAB Substrate kit,20xBeijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.DA1010Для разработки цвета тканей
Одноразовый хирургический лист 50 * 60 смNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Для мышиной хирургии раствор
для декальцинации ЭДТА (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.E1171-500mlДля декальцинации тканей
Усиленный буфер для блохинга эндогенной пероксидазыBeyotime BiotechnologyP0100BСеквестрация тканевых или клеточных эндогенных пероксидаз
Экологически чистая депарафинизация прозрачная жидкостьServicebioG1128-1LДля депарафинизации срезов
этилового спиртаCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Для обезвоживания парафиновые срезы
Разбавитель антител общего назначенияEpizyme BiotechPS119LДля разведения антител
Раствор для дифференцировки гематоксилинаServicebioG1039-500MLДля дифференцировки после окрашивания гематоксилином и удаления чрезмерно связанного и неспецифически адсорбированного красителя из тканей
Набор для окрашивания гематоксилина Эозина (HE)Пекин Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.G1120-3 * 100 млДля окрашивания тканей
Высококачественная ручка хирургического ножа из нержавеющей сталиPremier Medical Equipment Co.SP0088Для мышиной хирургии
HRP-конъюгированный Affinipure Goat Anti-rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Связывается с первичным антителом и усиливает сигнал
IL-17A Поликлональное антителоproteintech13082-1-APСвязывается с IL-17 в тканях
IL-6 Поликлональное антителоproteintech21865-1-APСвязывается с IL-6 в тканях
Иммуногистохимический ручкаBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Для рисования кругов по иммуногистохимии
Медицинский хирургический шовный материал Неабсорбирующий (мяч) 5-0 3,5мЯнчжоу Юаньликан Медицинское оборудование Ко.FHX-5-2Для послеоперационного наложения швов
Иглы для медицинских швов Угловые иглы 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Для наложения швов
Нейтральный бальзамBeijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.G8590В качестве запайщика ломтиков
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Буфер для промывки стекла и частичного разбавления раствора
Безбелковый быстрый блокирующий буфер (1X)Epizyme BiotechPS108PПредотвращение неспецифического связывания белков
Антитела к костной щелочной фосфатазекролика BIOSS АНТИТЕЛАBS-6292RСвязывается с щелочной фосфатазой в тканях
Солевая дочерняя больница Медицинский университет Юцзян для национальностейLHN500Для животных с помощью бритья
/ Электрические машинки для стрижкиHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Для бритвенных мышей
Медицинский иглодержатель из нержавеющей стали 14 см Грубая иглаPremier Medical Equipment Co.SP784Для хирургии мышей
Офтальмологические щипцы из нержавеющей стали 10,5 см изогнутые (без крючка)ZhuoyouyueYKNWW-10,5Для хирургии мышей
Офтальмологические ножницы из нержавеющей стали / хирургические ножницы 10 см с прямым наконечникомPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJДля хирургии мышей
Игла для желудка из нержавеющей стали 12 калибра 55 мм ЛокотьGWJ-12-55WДля использования у мышей с помощью жидкости
восстановления антигена Tris-EDTA (50x)proteintechPR30002Для восстановления парафиновых срезов антигеном
Деревянная препарирующая доска 25 * 16 смJP16 * 24Для хирургии мышей
таблетки XiaoyaoJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Для доставки лекарств животным
Others
R 4.3.1Обработка данных
Cytoscape3.9.1Национальный ресурс сетевой биологииСоздание регулирующей сети для традиционной китайской медицины
ImageJ 1.54fНациональные институты здравоохраненияОбработка изображений для результаты иммуногистохимии
Adobe Photoshop 24.0.0AdobeДля комбинирования изображений
GraphpadPrism 9.5Программное обеспечениеСтатистический анализ
данных клеток РазмерностьOLYMPUSДля срезов и фотографирования
OLYMPUS BX53OLYMPUSДля окрашивания HE и иммуногистохимического среза фотографии
для GraphPad

Ссылки

  1. Kanis, J. A., Melton, L. J. 3rd, Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
  2. Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655(2023).
  3. Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609(2021).
  4. Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850(2023).
  5. Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
  6. Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456(2021).
  7. Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
  8. Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
  9. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8(2018).
  10. Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
  11. Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324(2019).
  12. Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332(2020).
  13. Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
  14. Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747(2023).
  15. Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
  16. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  17. Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767(2023).
  18. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  19. Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913(2021).
  20. Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
  21. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
  22. Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
  23. Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
  24. Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
  25. Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, Academic Press. 253-284 (2012).
  26. Chen, S. X. R. B. X. Pharmacology experimental methodology. , People's Medical Publishing House Co. Ltd. (2002).
  27. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  28. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  29. Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
  30. Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383(2020).
  31. Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527(2021).
  32. Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779(2018).
  33. Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402(2023).
  34. Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
  35. Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302(2019).
  36. Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395(2017).
  37. Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111(2024).
  38. Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
  39. Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
  40. Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757(2024).
  41. Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612(2022).
  42. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  43. Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870(2023).
  44. Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25(2023).
  45. Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046(2024).
  46. ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
  47. Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326(2022).
  48. Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
  49. Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
  50. Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
  51. Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508(2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Мыши с удаленными яичникамисигналинг IL-17иммуногистохимиякостные трабекулыколлаген 1-го типащелочная фосфатазаокрашивание гематоксилином и эозином
Исследования противовоспалительного эффекта таблеток сяояо в лечении постменопаузального остеопороза у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.