Методическая статья

Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует лазерную клеточную абляцию отдельных нейронов у интактных личинок дрозофилы . Метод позволяет изучить эффект снижения конкуренции между нейронами в развивающейся нервной системе.

Аннотация

Протокол описывает однонейронную абляцию с помощью 2-фотонной лазерной системы в центральной нервной системе (ЦНС) интактных личинок Drosophila melanogaster . Используя этот неинвазивный метод, развивающаяся нервная система может быть манипулирована клеточно-специфическим образом. Нарушение развития отдельных нейронов в сети может быть использовано для изучения того, как нервная система может компенсировать потерю синаптического входа. Отдельные нейроны были специально удалены в системе гигантских волокон дрозофилы, с акцентом на два нейрона: пресинаптическое гигантское волокно (GF) и постсинаптический терготровертельный моторный нейрон (TTMn). GF синапсируется с ипсилатеральным TTMn, который имеет решающее значение для реакции побега. Удаление одной из GF в мозге3-го возраста, сразу после того, как GF начинает рост аксонов, навсегда удаляет клетку во время развития ЦНС. Оставшаяся GF реагирует на отсутствующего соседа и образует эктопическую синаптическую окончанию к контралатеральной TTMn. Этот атипичный, билатерально симметричный терминал иннервирует оба ТТМ, как показано на примере связи красителя, и приводит в движение оба моторных нейрона, как показывают электрофизиологические анализы. Таким образом, абляция одного интернейрона демонстрирует синаптическую конкуренцию между двусторонней парой нейронов, которая может компенсировать потерю одного нейрона и восстановить нормальные реакции на цепь побега.

Введение

Лазерная абляция является предпочтительным инструментом для препарирования нейронных цепей в самых разных организмах. Разработанная в модельных генетических системах, таких как черви и мухи, она была применена в животном мире для изучения структуры, функций и развития нервной системы 1,2,3. Здесь абляция одного нейрона была использована для изучения того, как нейроны взаимодействуют во время сборки цепи у дрозофилы. Система побега мухи является излюбленной схемой для анализа, потому что она содержит самые большие нейроны и самые большие синапсы у взрослой мухи, и эта цепь была хорошо охарактеризована впоследние десятилетия. Роль, которую нейрон-нейронные взаимодействия играют в сборке цепи гигантского волокна, находится в центре внимания данного исследования.

Одним из видов взаимодействия, который был в центре внимания нейробиологии со времен работы Хьюбела и Визеля в 1960-х годах, является «синаптическая конкуренция». В этом протоколе лазерная абляция была использована для того, чтобы пересмотреть роль конкуренции через одноклеточную абляцию в системе гигантских волокон (GFS) дрозофилы, где могут быть обнаружены молекулярные основы этого явления.

Абляция нейронов у развивающейся мухи была затруднена по целому ряду причин, в том числе из-за визуализации целевых нейронов, точности метода абляции и выживаемости образца. Чтобы преодолеть эти проблемы в GFS, система UAS/Gal4 7 была использована для маркировки интересующих нейронов, а двухфотонный микроскоп был использован для удаления пресинаптического гигантского волокна или постсинаптического прыгающего моторного нейрона (TTMn).

В этом исследовании, чтобы определить роль, которую соседние двусторонние нейроны играют в корректировке синаптической связи и синаптической силы в GFS, одна из билатеральных пар нейронов (либо пресинаптическая GF, либо постсинаптическая моторная нейрона) была удалена непосредственно перед развитием куколки. На этой стадии развития аксоногенез GF еще не завершен8. Затем были изучены структура GF и функция синаптической цепи у взрослого человека, при этом особое внимание было уделено выходу оставшейся GF.

Протокол

Все животные, использованные для составления протокола, принадлежали к виду Drosophila melanogaster. Нет никаких этических проблем, связанных с использованием этого вида. Для выполнения этой работы не требовалось этического разрешения. Подробная информация о видах дрозофил, реагентах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Разведение дрозофилы и выбор правильной личиночной стадии

  1. Выберите линию драйвера Gal4, которая управляет экспрессией в ячейках, подлежащих абляции, и рекомбинируйте ее с репортерной линией UAS-GFP или пересекайте ее. Выращивайте мух на стандартном корме для мух при температуре 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для абляции гигантского волокна (GF) R91H05-Gal4 или A307-Gal4 рекомбинировали с UAS-GFP. ShakB(летальный)-GAL4, рекомбинированный с UAS-GFP, использовали для абляции TTMn (см. Таблицу материалов).
  2. Выберите личинок, которые начали выходить из пищи и ползут вверх по боковой стороне флакона с едой. Эти личинки находятся на стадии блуждания, которая является предпочтительной стадией для проведения абляции клеток GF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Абляцию можно проводить на любой личиночной стадии. Последняя личиночная стадия была важна для манипулирования развитием GFS, потому что тела клеток GF могут быть легко идентифицированы в мозге, но аксоны GF не установили связи со своими мишенями на этой стадии.

2. Подготовкаличинки3-го возраста

ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки подвергались анестезии с использованием метода, аналогичного методу Burra et al.9. Чтобы сократить время процедуры, готовьте только одну личинку за раз. Кратковременное воздействие анестетика повысит выживаемость подопытных животных10.

  1. Приготовьте стеклянную посуду с плотно прилегающей крышкой. Положите в посуду ватный тампон, и под вытяжку добавьте около 3-5 мл этилового эфира (опасная, легковоспламеняющаяся жидкость, лабораторный халат, перчатки, защитные очки). Накройте блюдо крышкой.
  2. Соберите отдельные личинки3-го возраста из флаконов с мухами. На3-й личиночной стадии личинки покидают пищевую среду и ползут вверх по стенке пищевого флакона11.
    1. Убедитесь, что личинки все еще движутся и не начали образование пупарий. Личинки, которые неподвижны и демонстрируют укорочение тела, начинают окукливание и непригодны для абляции. Подцепите личинок с помощью небольшой кисточки.
      ПРИМЕЧАНИЕ:3-я личиночная стадия начинается после второй линьки на 72 ч развития (после откладки яиц) и длится до образования пупария через 120 ч у мух, выращенных при 25 °C.
  3. Пересадите одну личинку в небольшую открытую емкость. Поместите емкость в стеклянную посуду с этиловым эфиром и плотно закройте посуду. Открывая стеклянную посуду, поместите ее под трубку или в вытяжной шкаф, чтобы предотвратить утечку дыма.
    1. С интервалом в 30 с снимите крышку с личинкой с посудой и проверьте личинку на подвижность под микроскопом вскрытия. Личинка, как правило, обездвиживается в течение 1 минуты. Как только крючки для рта перестают дергаться, личинка готова к посадке. Выбросьте все личинки, которые не полностью обездвижены через 3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контейнера можно использовать верхнюю часть перевернутой крышки микроцентрифужной пробирки (снятая с пробирки крышка).

3. Крепление личинок на предметные стекла для абляции

  1. Поместите обезболенную личинку на предметное стекло микроскопа. Погрузите личинку в каплю солевого раствора насекомых; Это смоет часть остатков пищи, которые могут прилипнуть к личинке.
  2. Под микроскопом для вскрытия удалите большую часть физиологического раствора с помощью бумажной салфетки. Расположите личинку спинной стороной вверх для абляции GF или вентральной стороной вверх для абляции TTMn. Медленно опустите на личинку стеклянный покровный листок. Добавьте физиологический раствор на боковую сторону покровного стекла, чтобы заполнить пространство между предметным стеклом и покровным стеклом.
  3. Для абляции GF проверьте положение мозга при большом увеличении на диссекционном микроскопе. Следите за тем, чтобы мозг лежал ровно и был виден через кутикулу. Часто мозг покрывается жировой тканью, что делает невозможным визуализацию и абляцию клеток.
    1. Чтобы сместить жировую ткань, покрывающую мозг, слегка надавите щипцами на покровную ткань и двигайте ее из стороны в сторону. Если жировая ткань не может быть удалена от мозга таким образом, используйте вместо нее другую личинку.

4. Определение местоположения целевых ячеек

Примечание: Многофотонная система, использованная в этом исследовании, была установлена на вертикальном микроскопе. Для управления настройками сбора данных и лазерной стимуляции использовалось системное программное обеспечение. Система была оснащена эпифлуоресцентным источником света для определения местоположения образцов. Объектив представлял собой водную иммерсионную линзу с 25-кратным увеличением, большим рабочим расстоянием 2 мм и NA 1,10.

  1. Поместите образец на предметный столик многофотонного микроскопа и используйте фильтр GFP, чтобы найти образец в режиме эпифлуоресценции. При абляции GF можно идентифицировать клеточные тела в головном мозге, как показано на рисунке 1A, C, D. При абляции TTMn кластер из четырех клеток может быть идентифицирован с вентральной стороны в вентральном нервном канатике (VNC), как показано на рисунке 1A, B. Когда закончите фокусировку, центрируйте ячейки в поле зрения и переключитесь в 2-фотонный режим.

5. Настройка параметров абляции

  1. Отрегулируйте настройки лазера и усиление детектора для просмотра GFP-экспрессирующих клеток с помощью сканера Galvano. Длина волны 870 нм лучше всего подходит для визуализации сигнала GFP. Центрируйте ячейку в поле зрения.
  2. Используйте круговую область интереса (ROI) для определения области для абляции. Убедитесь, что ROI охватывает большую часть поверхности ячейки (рис. 1E, G).
  3. Настройте протокол абляции в программном обеспечении. Установите одну систему захвата, затем стимуляцию, а затем еще одну систему захвата.
  4. Начните настройку мощности лазера для стимуляции с более низкого значения (10%-20%) и запустите протокол стимуляции. Успешная абляция может быть распознана по четкому кругу в центре сомы клетки в месте расположения ROI и увеличению флуоресценции вокруг ROI (рис. 1F).
    1. Если абляция не увенчалась успехом и привела к простому отбеливанию клетки (рис. 1H), увеличьте мощность лазера с шагом 5% или количество петель по одной за раз и запустите протокол снова. Мощность применяемого лазера составляла от 10% до 40% для системы, используемой в протоколе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки мощности лазера для абляции в значительной степени зависят от того, насколько глубоко клетки расположены в ткани, и других факторов, таких как складчатость кутикулы. Если ячейки яркие и хорошо видимые, мощность лазера будет находиться на нижней границе диапазона. Мощность лазера будет разной для каждой системы в зависимости от модели лазера и возраста лазера.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Идентификация нейронов для лазерной абляции у интактных личинок L3 дрозофилы . (A) Схема расположения сомы гигантского волокна (GF) в головном мозге и скопления моторных нейронов, содержащих терготровертельный моторнейрон (TTMn) в вентральном нервном канатике (VNC). (B) Проекция максимальной интенсивности SHAKB(летального)-Gal4 управляющего экспрессии GFP в личиночном VNC. Срединная линия обозначается пунктирной линией. Кругом обозначен кластер нейронов, содержащих TTMn, которые являются мишенью для лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 мкм. (C) Частичное проекционное изображение мозга личинки, экспрессирующего GFP под контролем A307-Gal4. Кружком обозначена сома GF, предназначенная для лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 мкм. (D) Проекция максимальной интенсивности мозга при управлении R91H05-Gal4 UAS-GFP. Обе GF (круги) можно определить по расположению, форме и размеру. Масштабная линейка: 50 мкм. (E) GF soma увеличенный вид до лазерной абляции. Пурпурный круг указывает на целевую область для лазерной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (F) GF soma увеличенный вид после подачи локализованной мощности лазера и успешной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (G) GF soma увеличенный вид до лазерной абляции. Пурпурный круг указывает на целевую область для лазерной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (H) GF soma увеличенный вид после подачи локализованной мощности лазера и неудачной абляции (отбеливания). Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Восстановление личинок

  1. После успешной абляции ячейки снимите покровный стекло и аккуратно подхватите личинки с предметного стекла кистью. Поместите личинок в пищевой флакон. Личинки снова начнут ползать в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сокращение времени процедуры улучшает выживаемость животных. При наличии опыта эксперимент может быть выполнен менее чем за 10 минут.
  2. Продолжайте выращивать личинок в стандартных условиях до тех пор, пока они не сомкнутся от оболочки куколки.

7. Тестирование работоспособности ГФС на взрослых мухах

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги подробно описаны в Аллане и Годеншвеге12 и Августине и др.13.

  1. Испытывайте взрослых мух в возрасте 2-5 дней после эклозии. Обезболите мухСО2 и закрепите их на зубном воске, вдавливая ноги в воск. Расправьте крылья под углом 90° и зафиксируйте их на месте воском. Закрепите головку, протолкнув хоботок в воск.
  2. Поместите стимулирующие провода в оба глаза, заземляющий провод в брюшную полость, а стеклянные записывающие электроды в прыгающие мышцы (ТТМ) с каждой стороны.
  3. Стимулируйте цепь GF с помощью одного стимула, чтобы измерить латентность реакции для обеих мышц. Стимулируйте цепь с помощью последовательностей стимулов с частотой 100 Гц и 200 Гц соответственно, чтобы измерить следующую частоту для обеих мышц.

8. Диссекция и мечение системы гигантских волокон для конфокальной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Диссекция ЦНС мухи и инъекция красителя подробно описаны в Boerner and Godenschwege14.

  1. Аккуратно удалите муху из зубного воска с помощью щипцов и перенесите ее в чашку Петри, выстланную силиконовым эластомером, под эндоскоп для вскрытия.
  2. Удалите ножницы с ног, крылья и хоботок и с помощью булавок от насекомых закрепите спинную сторону мухи вверх в эластомерном покрытии.
  3. Сделайте боковой разрез по средней линии от середины живота, через всю грудную клетку, и вверх по шее, соединив грудную клетку с головой. Раскройте ширинку булавками от насекомых. Удалите органы и железы у мухи, не повреждая нервную систему.
    Примечание: На этом этапе аксоны GF могут быть введены с помощью красителей для маркировки GF и электрически связанных нейронов13.
  4. Снимите капсулу головы с головы, чтобы обнажить мозг.

9. Иммуногистохимия нервной системы

  1. После вскрытия ЦНС зафиксировать муху в 4% PFA в PBS на 45 мин при комнатной температуре (ОТ). Стирать в течение 20 минут в PBS при RT (3 раза).
  2. Заблокируйте образец на 1 ч при RT в 3% BSA в PBS с 0,5% раствором моющего средства.
  3. Инкубировать в течение 2-3 ночей при 4 °C в 3% BSA в PBS с 0,3% раствором моющего средства и анти-GFP кроликов (1:500). Умываться в течение 20 минут в PBS при температуре RT (6 раз).
  4. Инкубировать в течение ночи при 4 °C в PBS с анти-кроликом Alexa 488. Умываться в течение 20 минут в PBS при температуре RT (6 раз).
  5. Обезвоживайте образцы с помощью восходящего этанола (50%, 70%, 90%, 100% этанол) в течение 10 мин на каждом этапе. Удалите штифты и обрежьте живот и летные мышцы. Перенесите остальную часть грудной клетки, содержащую нервную систему, на предметное стекло и накройте ее монтажной средой, такой как метилсалицилат. Наденьте на образец покровный лист и заклейте его лаком для ногтей.
  6. Визуализируйте нервную систему на конфокальном микроскопе, чтобы проанализировать анатомию терминала GF.

Результаты

Этот метод может быть использован для манипулирования развитием специфических нейронных сетей в нервной системе дрозофилы. Основным вопросом исследования здесь было формирование синаптических связей. Удаление либо пресинаптического GF, либо постсинаптического TTMn позволило исследовать реактивный синаптогенез в этом центральном синапсе и молекулярные механизмы, имеющие решающее значение для синаптической функции и развития. Как описано в протоколе, была проведена лазерная клеточная абляция одной из ГФ или одного из ТТМ, а также проанализировано влияние на синапс после развития куколки у взрослой мухи.

Чтобы процедура не оказала негативного влияния на выживаемость животных, параллельно проводились имитационные абляции. Для имитационных абляций с животными обращались так же, как и с подопытными, но лазерные импульсы подавались с мощностью лазера 0%. В 82,4% случаев животные из имитационных абляций развились во взрослых мух. ГФ мух с имитацией абляции были способны реагировать с задержкой менее 1 мс и следовать стимуляции с частотой 100 Гц для 79,3% стимулов. Анатомия GF была неотличима от необработанных мух.

Для каждого подопытного животного абляция была проверена анатомо. У животных, получавших абляцию СН, неабляционный ГФ вводили краситель и визуализировали (см. ниже). Если в шейном соединительном отделе (CvC) был виден только один аксон GF, предполагалась абляция другого GF. Абляция также может быть верифицирована по отсутствию меченой GFP сомы на абляционной стороне мозга (рис. 2А, круг). Для оценки абляции TTMn был проанализирован сигнал GFP в VNC взрослого человека, где сома и дендрит TTMn могут быть легко идентифицированы. Отсутствие ТТМн с одной стороны было легко распознано из-за отсутствующих сомы и дендритов (рисунок 2В, круг).

Для проверки функции GFS у обработанных мух регистрировали синаптические потенциалы от прыгучих мышц12,13, которые иннервируются TTMn (рис. 3A). GFs образуют смешанный электрохимический синапс с медиальным дендритом TTMn15. Окончание GF не разветвлено и демонстрирует типичный боковой изгиб, который противоположен дендриту TTMn в синаптической области (Рисунок 3D, Рисунок 4A стрелка). В контрольных мухах каждая ГФ иннервирует исключительно свой ипсилатеральный мотонейрон. При записи с волокон TTM прочность соединения оценивалась путем анализа латентности отклика при стимуляции 1 Гц и последующей частоты при стимуляции 100 Гц (рис. 3B, C). Контрольные мухи показали среднюю латентность реакции менее 1 мс и могли следовать за стимуляцией 100 Гц для 78,1% стимулов (рис. 3B). После проведения физиологических регистраций образец был препарирован для выявления ЦНС и ГФ, которым вводили краситель с помощью смеси ТРИТК-декстрана и нейробиотина. Большая молекула декстрана помечает аксон и терминал GF, но не проходит через щелевые соединения. Нейробиотин может пересекать щелевые соединения между GF и TTMn, а сигнал нейробиотина был обнаружен в постсинаптическом дендрите (рис. 3E, F, стрелки). Эта связь нейробиотина с красителем подтвердила электрическую связь между двумя нейронами. Нейробиотин также может быть обнаружен во многих других нейронах в VNC, которые соединены через щелевые соединения с GF16 (рис. 3E, F).

Такие же физиологические и анатомические тесты были проведены после того, как одна ГФ была абляирована в L3. Аксон большинства (13/15) оставшихся GF у абляционных мух демонстрирует разделение терминала на две ветви: одна в обычном ипсилатеральном месте и другая, пересекающая срединную линию в гомологичное положение, контралатеральное интактному GF (рисунок 3G, стрелка). Каждая ветвь была соединена красителем с одним из дендритов TTMn (рис. 3H, I, наконечники стрел). Физиологические записи с ТТМ подтвердили эту синаптическую связь одной ГФ с обоими ТТМ, хотя и более слабой, чем обычно. Задержки отклика ТТМ были более 1 мс для обеих сторон, а следующие частоты на частоте 100 Гц составили 37,1% для ТТМн, ипсилатеральной к интактной ГФ и 28% для контралатеральной ТТМ (рис. 3C).

Поскольку абляция одного GF заставляла оставшуюся GF иннервировать оба целевых нейрона, следующий эксперимент был направлен на наблюдение за реакцией соседних GF, когда у одного из них отсутствовал нормальный ипсилатеральный двигательный нейрон-мишень. Для этого эксперимента был удален один из постсинаптических нейронов, а также оценены анатомия и функция остальных TTMn, а также морфология окончаний GF. При визуализации как ТТМ, так и СФ у взрослых животных контрольной группы, область предполагаемого синаптического контакта была четко видна (рис. 4А, стрелки). Каждый медиальный дендрит TTMn был прикреплен к ипсилатеральной пресинаптической окончании GF. Небольшие выступы дендритов TTMn с обеих сторон соприкасались с срединной линией (рис. 4C; врезка). Связь красителя с нейробиотином была заметна в обоих TTMn (рисунок 4D, стрелки).

При абляции одного TTMn морфология оставшегося медиального дендрита TTMn изменялась. Медиальный дендрит в этих образцах тянул длинную толстую ветвь через среднюю линию (рис. 4I, K; желтые стрелки). Кроме того, более тонкие выступы в сторону обоих окончаний GF простирались вперед (рис. 4E, G; желтые стрелки). GF, ипсилатеральная по отношению к TTMn, имела свою обычную анатомию с терминалом, выступающим вдоль дендрита TTMn.

Реакция «осиротевшей» ГФ, у которой отсутствовал целевой моторный нейрон, представляла основной интерес. В большинстве случаев (у 61,5% животных) у осиротевшей GF наблюдалась расщепленная окончание, одна из которых находилась на ипсилатеральной стороне, а другая концевая пересекала срединную линию и выступала в сторону контралатерального дендрита TTMn (рис. 4J, стрелки). Эти скрещенные ветви GF всегда были меньше, чем те, которые наблюдались в дополнительном эксперименте, когда соседняя GF была удалена (рис. 3F). Ипсилатеральная клемма соприкасалась с ветвью TTMn, которая проходила через срединную линию (рис. 4I, желтая стрелка). У 23% образцов осиротевшая GF пересекала срединную линию (рис. 4F, стрелка) и проецировалась вдоль одной из передних ветвей TTMn (рис. 4E, желтые стрелки) и была соединена красителем с оставшейся TTMn (рис. 4H, стрелка).

Еще два фенотипа наблюдались у абляционных мух TTMn (рис. 4М). У одной из 13 мух обе ГФ сделали нормальный изгиб и остались на своих сторонах нервной системы. В еще одном случае осиротевшая ГФ продемонстрировала бесконечное фенотип, при котором осиротевшая ГФ не сделала терминал и остановилась перед областью, где она обычно изгибается. Для всех четырех фенотипов записи TTM на стороне интактного TTMn были сопоставимы с физиологией дикого типа (WT) с латентностью отклика менее 1 мс и последующей частотой на частоте 100 Гц на 100% или близкой к 100%. Удаление одного целевого объекта может позволить обоим GF совместно использовать оставшийся целевой TTMn. В большинстве случаев обе GF будут соединяться с оставшимся TTMn. Как правило, осиротевшая ГФ будет выставлять двусторонний терминал. В контрольных мухах ГФ никогда не пересекут среднюю линию; однако примерно в 85% мух с абляцией ТТМн одна ГФ пересекала срединную линию, чтобы контактировать с контралатеральной ТТМн. Иннервация одного TTMn двумя GF не влияла отрицательно на синаптическую функцию.

Примечательно, что отсутствие соседней ГФ оказывает большее влияние, чем отсутствие целевого моторного нейрона. Двусторонняя терминальность, образованная при отсутствии контралатеральной ГФ, значительно больше и более очевидна функциональна, чем изменения, происходящие при удалении мишени.

figure-results-1
Рисунок 2: Примеры успешной абляции в ЦНС взрослой особи. (A) Проекция максимальной интенсивности мозга взрослой мухи после абляции личиночного GF. GFP (зеленый) приводится в движение A307-GAL4. Кружком обозначена область, в которой отсутствует абляционная ГФ. Стрелка указывает на оставшуюся GF, экспрессирующую GFP на другой стороне мозга. GF была заполнена TRITC-Dextran (красным). Аксон выступает кзади в сторону VNC. Масштабная линейка: 20 мкм. (B) Проекция максимальной интенсивности VNC взрослого человека, где один TTMn был абляционирован в L3. Оставшийся TTMn (стрелка) выражает GFP под драйвером shakB (летальный). Область отсутствующего ТТМн обозначена кружком. Масштабная линейка: 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 3: Личиночная абляция одного гигантского волокна (GF) вызывает двустороннее ветвление пресинаптической окончания оставшегося GF. (A) Схема экспериментальной установки для тестирования структуры и функции взрослой системы гигантских волокон (GFS). Регистрирующий электрод измеряет латентность и следующую частоту выходов терготровертельных моторнейронов (ТТМн) в терготровертельных мышцах (ТТМ) при стимуляции мозга у интактного животного. После вскрытия нервной системы краситель вводили в аксоны GF в шейном соединительном отделе (CvC). (В,В) Выборка трассировок для задержки отклика TTM и последующей частоты на частоте 100 Гц (n представляет количество записанных TTM из каждой ситуации с указанием средней задержки и последующей частоты). (В) Контрольные животные с двумя интактными ТС демонстрируют задержки ТТМ ниже 1 мс и последующие частоты, близкие к 100% при 100 Гц. (В) Одиночный оставшийся ГФ у абляционных животных иннервирует оба ТТМ. Задержки для обоих ТТМ длиннее, чем у контрольной группы, и после 100 Гц частота значительно снижается. (Д-И) Проекция максимальной интенсивности конфокальных стеков изображений для заполненных красителем GF. TRITC-Dextran (D,G,F,I красного цвета) и нейробиотин (E,H,F,I серого цвета) были введены одновременно. Нейробиотин может пересекать щелевые соединения между GF и TTMn, маркируя постсинаптические нейроны. Пунктирными линиями обозначена срединная линия. (D) Типичная анатомия GF контрольных животных с терминальным изгибом. (Э,Ж) Нейробиотин помечает многие постсинаптические нейроны, электрически связанные с GF. Транссинаптически помеченные дендриты TTMn обозначены стрелками. (G) После абляции у оставшегося GF вырастает дополнительный терминал (стрелка), который пересекает срединную линию, чтобы иннервировать контралатеральный TTMn. (H,I) Оба TTMn (наконечники стрелок) связаны красителями с одним и тем же GF. Масштабные линейки: 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 4. Личиночная абляция одного терготровертельного мотонейрона (TTMn) вызывает иннервацию оставшегося TTMn обоими гигантскими волокнами (GF). (А-Л) Проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков изображений ТТМ, помеченных GFP (зеленым) под контролем shakB (летальный)-Gal4, и GF были заполнены TRITC-Dextan (пурпурный) и нейробиотин (красный). Пунктирной линией обозначена срединная линия нервной системы. (А-Г) Контрольные образцы с обоими неповрежденными ТТМ. GF делают свой типичный изгиб терминала в сторону от средней линии, чтобы соприкоснуться с TTMn (A,B), и каждая GF контактирует с одним TTMn. Дендриты TTMn встречаются на средней линии (C). Каждая GF представляет собой краситель, соединенный со своим TTMn (D, белые стрелки). (Э-Х) Левый ТТМн был удален. Медиальный дендрит оставшегося TTMn проецируется поперек средней линии (G, желтая стрелка). Осиротевшая GF пересекает срединную линию (белая стрелка) в синаптической области и контактирует с контралатеральным дендритом TTMn (E,F). GF представляют собой краситель, соединенный с оставшимся TTMn (H, наконечник стрелы). (И-Л) Пример другого фенотипа GF, в котором левый TTMn был удален. Медиальный дендрит остального TTMn проецируется поперек средней линии (I и K, желтая стрелка). Оставленная осиротевшая ГФ строит двусторонний терминал; одна ветвь выступает контралатерально, а другая остается ипсилатеральной (J, стрелки) для соединения с TTMn. Масштабные линейки: 20 мкм. (M) Схема наблюдаемых четырех различных фенотипов GF у животных с абляцией TTMn. n обозначает количество животных в каждом классе. Приведены средние значения со стандартной погрешностью для задержки отклика TTM и частоты следования (FF) на частоте 100 Гц для стороны неповрежденного TTMn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Клеточная абляция с помощью 2-фотонного микроскопа оказалась весьма успешным методом манипулирования развитием нейронных цепей у дрозофил. Так как этот метод является неинвазивным, он наносит минимальный ущерб животному. Полученные данные подтверждают полезность этого специфического для клетки манипулирования известными цепями.

Решающее значение для успеха абляции имел выбор наиболее подходящего драйвера Gal4. Поскольку GFS хорошо изучена, было описано много специфических линий драйвера Gal47. Большинство драйверов Gal4 очень ограничены, но все же экспрессируются во многих других нейронах. Одной из задач была надежная идентификация клеток-мишеней у интактного животного. Для животных с четко видимой меткой GFP абляция могла быть выполнена при низкой мощности лазера и часто требовала только одного испытания. У животных, у которых жировая ткань покрывала мозг или экспрессия GFP была слабой, делеция клеток-мишеней требовала более высокой мощности лазера и нескольких петель лазерного воздействия. Тела клеток GF располагались на глубине около 100 мкм от дорсальной стороны мозга. Для экспериментов, в которых клетки-мишени расположены на большей глубине, может быть полезно проводить абляцию на более ранних личиночных стадиях, когда нервная система меньше.

В предыдущих экспериментах в лаборатории были изучены различные методы клеточной абляции. Использование системы UAS/Gal4 для управления экспрессией токсинов также привело к удалению определенных нейронов. Тем не менее, гораздо сложнее контролировать делецию одиночных клеток и избежать побочных эффектов. Другая сложность заключается в контроле точного времени события удаления клетки. Лазерная абляция клеток позволила точно контролировать целевое местоположение и время делеции, но все еще оставались некоторые проблемы, которые необходимо было преодолеть, прежде чем метод был усовершенствован и достигнуты показатели успеха более 80% (выживаемость животных и успешная абляция клеток). На выживаемость животных негативно влияло длительное воздействие этилового эфира и длительное время процедуры. Исследования показали, что высокие показатели выживаемости до окукливания (78%) и эклозии до взрослых особей (67%) могут быть достигнуты при 3,5-минутном воздействии этилового эфира на личинок L3 дрозофилы 10. Воздействие в течение 3,5 минут гарантирует, что животное будет неподвижно на срок до 8 часов. Для лазерной абляции клеток животные должны быть неподвижны в течение 30 минут или меньше. Таким образом, время воздействия этилового эфира может быть значительно ниже 3,5 минут. В большинстве случаев личинки были полностью неподвижны в течение 1 минуты.

Результаты лазерной абляции демонстрируют, что ГФ может быть чисто удалена, а влияние на контралатеральную соседнюю ГФ легко оценивается. Результат абляции был четким и стабильным. В 13 из 15 случаев абляции одиночных клеток у остальных партнеров GF наблюдается двусторонняя терминальность, которая никогда не наблюдается у контрольных животных. Этот билатерально симметричный терминал легко распознается, а необычная контралатеральная ветвь по размеру похожа на нормальную терминаль и связана красителем с контралатеральным двигательным нейроном-мишенью. Двусторонний терминал связан с обоими двигательными нейронами-мишенями и в большинстве образцов функционирует почти по дикому типу, управляя как нормально-ипсилатеральной мишенью, так и контралатеральным моторным нейроном-мишенью с латентностями и частотами, близкими к контрольным значениям.

Дополнительный эксперимент, представляющий собой одностороннюю абляцию целевого моторного нейрона, представляет собой интересное сравнение. Оставшийся моторный нейрон часто демонстрирует реактивный дендритный рост, распространяя отросток через срединную линию в пространство, обычно занимаемое удаленным соседом. Хотя этот дендрит не такой большой, как удаленный, он демонстрирует реакцию, аналогичную тому, как у ГФ отсутствует их двусторонний партнер. В противоположность этому, теперь уже не имеющая мишени ГФ реагирует на отсутствующую мишень лишь незначительно, распространяя второстепенные отростки по средней линии и вдоль оставшихся дендритов двигательных нейронов. Эта скромная реакция резко контрастирует с драматической реакцией ГФ на отсутствующую билатерально гомологичную ГФ, при которой образуется большая контралатеральная окончание, дополняющая нормальную концевую и формирующая двустороннюю концевую стадию.

Недавно был проведен эксперимент по параллельной абляции пресинаптических входов в GF в мозге,где был выявлен аналогичный тип «конкуренции» за синаптическое пространство. Визуальные входы в GF находятся в клубочке, где нейроны зрительной проекции (VPN) достигают дендритов GF. Удаление одной группы VPN (в данном случае генетически) демонстрирует, что оставшиеся VPN захватывают и иннервируют часть синаптического пространства отсутствующего соседа и производят компенсаторное физиологическое восстановление визуальной реакции на надвигающиеся стимулы. Когда первые прибывшие афференты удаляются, более поздние приходят занимают место и больше не занимаются. Основное феноменологическое сходство с данной работой заключается в очевидной роли, которую физическая занятость играет в определении баланса между различными входными данными. Выходные терминалы двух GF, по-видимому, конкурируют друг с другом за физическое синаптическое пространство.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эксперименты с 2-фотонным микроскопом проводились в FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Мы хотели бы поблагодарить инициативу Jupiter Life Science за финансовую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Антизеленый флуоресцентный белок, кроликFisher ScientificA11122концентрация 1:500
Apo LWD 25x/1.10W ОбъективNikonMRD77220погружение в воду большое рабочее расстояние
Бычья сыворотка альбумин (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Лазерныйкогерентный
ватный шарикGenesee Scientific51-101
Dextra, тетраметилродамин, 10 000 МВт, фиксируемый лизин (фтор-рубин)Fisher ScientificD1817
Рецепт солевого раствораот Gu и O'Dowd, 2006
Этиловый эфирFisher ScientificE134-1Опасность, легковоспламеняющаяся жидкость
Fly food B (рецепт Блумингтона)LabExpress7001-NV
МетилсалицилатFisher ScientificO3695-500
Микроцентрифуга пробирка 1,5 млEppendorf22363204
Микроскоп 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Вектор нейробиотина ЛабораторииSP-1120
Nikon A1R многофотонный микроскопNikonна вертикальном стенде FN1 microsope
Элементы NIS Advanced ResearchNikonПрограммное обеспечение для сбора и анализа данных
Параформальдегид (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (фосфатный буферный салин)Fisher BioReagentsBP2944-100Таблетки
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(летальный)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost микроскоп предметное стеклоFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000моющее средство
раствор UAS-10xGFPBloomington Фондовый центр дрозофил32185
дрозофилы

Ссылки

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

GFP
Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.