Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует лазерную клеточную абляцию отдельных нейронов у интактных личинок дрозофилы . Метод позволяет изучить эффект снижения конкуренции между нейронами в развивающейся нервной системе.

Аннотация

Протокол описывает однонейронную абляцию с помощью 2-фотонной лазерной системы в центральной нервной системе (ЦНС) интактных личинок Drosophila melanogaster . Используя этот неинвазивный метод, развивающаяся нервная система может быть манипулирована клеточно-специфическим образом. Нарушение развития отдельных нейронов в сети может быть использовано для изучения того, как нервная система может компенсировать потерю синаптического входа. Отдельные нейроны были специально удалены в системе гигантских волокон дрозофилы, с акцентом на два нейрона: пресинаптическое гигантское волокно (GF) и постсинаптический терготровертельный моторный нейрон (TTMn). GF синапсируется с ипсилатеральным TTMn, который имеет решающее значение для реакции побега. Удаление одной из GF в мозге3-го возраста, сразу после того, как GF начинает рост аксонов, навсегда удаляет клетку во время развития ЦНС. Оставшаяся GF реагирует на отсутствующего соседа и образует эктопическую синаптическую окончанию к контралатеральной TTMn. Этот атипичный, билатерально симметричный терминал иннервирует оба ТТМ, как показано на примере связи красителя, и приводит в движение оба моторных нейрона, как показывают электрофизиологические анализы. Таким образом, абляция одного интернейрона демонстрирует синаптическую конкуренцию между двусторонней парой нейронов, которая может компенсировать потерю одного нейрона и восстановить нормальные реакции на цепь побега.

Введение

Лазерная абляция является предпочтительным инструментом для препарирования нейронных цепей в самых разных организмах. Разработанная в модельных генетических системах, таких как черви и мухи, она была применена в животном мире для изучения структуры, функций и развития нервной системы 1,2,3. Здесь абляция одного нейрона была использована для изучения того, как нейроны взаимодействуют во время сборки цепи у дрозофилы. Система побега мухи является излюбленной схемой для анализа, потому что она содержит самые большие нейроны и самые большие синапсы у взрослой мухи, и эта цепь была хорошо охарактеризована впоследние десятилетия. Роль, которую нейрон-нейронные взаимодействия играют в сборке цепи гигантского волокна, находится в центре внимания данного исследования.

Одним из видов взаимодействия, который был в центре внимания нейробиологии со времен работы Хьюбела и Визеля в 1960-х годах, является «синаптическая конкуренция». В этом протоколе лазерная абляция была использована для того, чтобы пересмотреть роль конкуренции через одноклеточную абляцию в системе гигантских волокон (GFS) дрозофилы, где могут быть обнаружены молекулярные основы этого явления.

Абляция нейронов у развивающейся мухи была затруднена по целому ряду причин, в том числе из-за визуализации целевых нейронов, точности метода абляции и выживаемости образца. Чтобы преодолеть эти проблемы в GFS, система UAS/Gal4 7 была использована для маркировки интересующих нейронов, а двухфотонный микроскоп был использован для удаления пресинаптического гигантского волокна или постсинаптического прыгающего моторного нейрона (TTMn).

В этом исследовании, чтобы определить роль, которую соседние двусторонние нейроны играют в корректировке синаптической связи и синаптической силы в GFS, одна из билатеральных пар нейронов (либо пресинаптическая GF, либо постсинаптическая моторная нейрона) была удалена непосредственно перед развитием куколки. На этой стадии развития аксоногенез GF еще не завершен8. Затем были изучены структура GF и функция синаптической цепи у взрослого человека, при этом особое внимание было уделено выходу оставшейся GF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные, использованные для составления протокола, принадлежали к виду Drosophila melanogaster. Нет никаких этических проблем, связанных с использованием этого вида. Для выполнения этой работы не требовалось этического разрешения. Подробная информация о видах дрозофил, реагентах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Разведение дрозофилы и выбор правильной личиночной стадии

  1. Выберите линию драйвера Gal4, которая управляет экспрессией в ячейках, подлежащих абляции, и рекомбинируйте ее с репортерной линией UAS-GFP или пересекайте ее. Выращивайте мух на стандартном корме для мух при температуре 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для абляции гигантского волокна (GF) R91H05-Gal4 или A307-Gal4 рекомбинировали с UAS-GFP. ShakB(летальный)-GAL4, рекомбинированный с UAS-GFP, использовали для абляции TTMn (см. Таблицу материалов).
  2. Выберите личинок, которые начали выходить из пищи и ползут вверх по боковой стороне флакона с едой. Эти личинки находятся на стадии блуждания, которая является предпочтительной стадией для проведения абляции клеток GF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Абляцию можно проводить на любой личиночной стадии. Последняя личиночная стадия была важна для манипулирования развитием GFS, потому что тела клеток GF могут быть легко идентифицированы в мозге, но аксоны GF не установили связи со своими мишенями на этой стадии.

2. Подготовкаличинки3-го возраста

ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки подвергались анестезии с использованием метода, аналогичного методу Burra et al.9. Чтобы сократить время процедуры, готовьте только одну личинку за раз. Кратковременное воздействие анестетика повысит выживаемость подопытных животных10.

  1. Приготовьте стеклянную посуду с плотно прилегающей крышкой. Положите в посуду ватный тампон, и под вытяжку добавьте около 3-5 мл этилового эфира (опасная, легковоспламеняющаяся жидкость, лабораторный халат, перчатки, защитные очки). Накройте блюдо крышкой.
  2. Соберите отдельные личинки3-го возраста из флаконов с мухами. На3-й личиночной стадии личинки покидают пищевую среду и ползут вверх по стенке пищевого флакона11.
    1. Убедитесь, что личинки все еще движутся и не начали образование пупарий. Личинки, которые неподвижны и демонстрируют укорочение тела, начинают окукливание и непригодны для абляции. Подцепите личинок с помощью небольшой кисточки.
      ПРИМЕЧАНИЕ:3-я личиночная стадия начинается после второй линьки на 72 ч развития (после откладки яиц) и длится до образования пупария через 120 ч у мух, выращенных при 25 °C.
  3. Пересадите одну личинку в небольшую открытую емкость. Поместите емкость в стеклянную посуду с этиловым эфиром и плотно закройте посуду. Открывая стеклянную посуду, поместите ее под трубку или в вытяжной шкаф, чтобы предотвратить утечку дыма.
    1. С интервалом в 30 с снимите крышку с личинкой с посудой и проверьте личинку на подвижность под микроскопом вскрытия. Личинка, как правило, обездвиживается в течение 1 минуты. Как только крючки для рта перестают дергаться, личинка готова к посадке. Выбросьте все личинки, которые не полностью обездвижены через 3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контейнера можно использовать верхнюю часть перевернутой крышки микроцентрифужной пробирки (снятая с пробирки крышка).

3. Крепление личинок на предметные стекла для абляции

  1. Поместите обезболенную личинку на предметное стекло микроскопа. Погрузите личинку в каплю солевого раствора насекомых; Это смоет часть остатков пищи, которые могут прилипнуть к личинке.
  2. Под микроскопом для вскрытия удалите большую часть физиологического раствора с помощью бумажной салфетки. Расположите личинку спинной стороной вверх для абляции GF или вентральной стороной вверх для абляции TTMn. Медленно опустите на личинку стеклянный покровный листок. Добавьте физиологический раствор на боковую сторону покровного стекла, чтобы заполнить пространство между предметным стеклом и покровным стеклом.
  3. Для абляции GF проверьте положение мозга при большом увеличении на диссекционном микроскопе. Следите за тем, чтобы мозг лежал ровно и был виден через кутикулу. Часто мозг покрывается жировой тканью, что делает невозможным визуализацию и абляцию клеток.
    1. Чтобы сместить жировую ткань, покрывающую мозг, слегка надавите щипцами на покровную ткань и двигайте ее из стороны в сторону. Если жировая ткань не может быть удалена от мозга таким образом, используйте вместо нее другую личинку.

4. Определение местоположения целевых ячеек

Примечание: Многофотонная система, использованная в этом исследовании, была установлена на вертикальном микроскопе. Для управления настройками сбора данных и лазерной стимуляции использовалось системное программное обеспечение. Система была оснащена эпифлуоресцентным источником света для определения местоположения образцов. Объектив представлял собой водную иммерсионную линзу с 25-кратным увеличением, большим рабочим расстоянием 2 мм и NA 1,10.

  1. Поместите образец на предметный столик многофотонного микроскопа и используйте фильтр GFP, чтобы найти образец в режиме эпифлуоресценции. При абляции GF можно идентифицировать клеточные тела в головном мозге, как показано на рисунке 1A, C, D. При абляции TTMn кластер из четырех клеток может быть идентифицирован с вентральной стороны в вентральном нервном канатике (VNC), как показано на рисунке 1A, B. Когда закончите фокусировку, центрируйте ячейки в поле зрения и переключитесь в 2-фотонный режим.

5. Настройка параметров абляции

  1. Отрегулируйте настройки лазера и усиление детектора для просмотра GFP-экспрессирующих клеток с помощью сканера Galvano. Длина волны 870 нм лучше всего подходит для визуализации сигнала GFP. Центрируйте ячейку в поле зрения.
  2. Используйте круговую область интереса (ROI) для определения области для абляции. Убедитесь, что ROI охватывает большую часть поверхности ячейки (рис. 1E, G).
  3. Настройте протокол абляции в программном обеспечении. Установите одну систему захвата, затем стимуляцию, а затем еще одну систему захвата.
  4. Начните настройку мощности лазера для стимуляции с более низкого значения (10%-20%) и запустите протокол стимуляции. Успешная абляция может быть распознана по четкому кругу в центре сомы клетки в месте расположения ROI и увеличению флуоресценции вокруг ROI (рис. 1F).
    1. Если абляция не увенчалась успехом и привела к простому отбеливанию клетки (рис. 1H), увеличьте мощность лазера с шагом 5% или количество петель по одной за раз и запустите протокол снова. Мощность применяемого лазера составляла от 10% до 40% для системы, используемой в протоколе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки мощности лазера для абляции в значительной степени зависят от того, насколько глубоко клетки расположены в ткани, и других факторов, таких как складчатость кутикулы. Если ячейки яркие и хорошо видимые, мощность лазера будет находиться на нижней границе диапазона. Мощность лазера будет разной для каждой системы в зависимости от модели лазера и возраста лазера.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Идентификация нейронов для лазерной абляции у интактных личинок L3 дрозофилы . (A) Схема расположения сомы гигантского волокна (GF) в головном мозге и скопления моторных нейронов, содержащих терготровертельный моторнейрон (TTMn) в вентральном нервном канатике (VNC). (B) Проекция максимальной интенсивности SHAKB(летального)-Gal4 управляющего экспрессии GFP в личиночном VNC. Срединная линия обозначается пунктирной линией. Кругом обозначен кластер нейронов, содержащих TTMn, которые являются мишенью для лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 мкм. (C) Частичное проекционное изображение мозга личинки, экспрессирующего GFP под контролем A307-Gal4. Кружком обозначена сома GF, предназначенная для лазерной абляции. Масштабная линейка: 50 мкм. (D) Проекция максимальной интенсивности мозга при управлении R91H05-Gal4 UAS-GFP. Обе GF (круги) можно определить по расположению, форме и размеру. Масштабная линейка: 50 мкм. (E) GF soma увеличенный вид до лазерной абляции. Пурпурный круг указывает на целевую область для лазерной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (F) GF soma увеличенный вид после подачи локализованной мощности лазера и успешной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (G) GF soma увеличенный вид до лазерной абляции. Пурпурный круг указывает на целевую область для лазерной абляции. Масштабная линейка: 10 мкм. (H) GF soma увеличенный вид после подачи локализованной мощности лазера и неудачной абляции (отбеливания). Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Восстановление личинок

  1. После успешной абляции ячейки снимите покровный стекло и аккуратно подхватите личинки с предметного стекла кистью. Поместите личинок в пищевой флакон. Личинки снова начнут ползать в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сокращение времени процедуры улучшает выживаемость животных. При наличии опыта эксперимент может быть выполнен менее чем за 10 минут.
  2. Продолжайте выращивать личинок в стандартных условиях до тех пор, пока они не сомкнутся от оболочки куколки.

7. Тестирование работоспособности ГФС на взрослых мухах

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги подробно описаны в Аллане и Годеншвеге12 и Августине и др.13.

  1. Испытывайте взрослых мух в возрасте 2-5 дней после эклозии. Обезболите мухСО2 и закрепите их на зубном воске, вдавливая ноги в воск. Расправьте крылья под углом 90° и зафиксируйте их на месте воском. Закрепите головку, протолкнув хоботок в воск.
  2. Поместите стимулирующие провода в оба глаза, заземляющий провод в брюшную полость, а стеклянные записывающие электроды в прыгающие мышцы (ТТМ) с каждой стороны.
  3. Стимулируйте цепь GF с помощью одного стимула, чтобы измерить латентность реакции для обеих мышц. Стимулируйте цепь с помощью последовательностей стимулов с частотой 100 Гц и 200 Гц соответственно, чтобы измерить следующую частоту для обеих мышц.

8. Диссекция и мечение системы гигантских волокон для конфокальной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Диссекция ЦНС мухи и инъекция красителя подробно описаны в Boerner and Godenschwege14.

  1. Аккуратно удалите муху из зубного воска с помощью щипцов и перенесите ее в чашку Петри, выстланную силиконовым эластомером, под эндоскоп для вскрытия.
  2. Удалите ножницы с ног, крылья и хоботок и с помощью булавок от насекомых закрепите спинную сторону мухи вверх в эластомерном покрытии.
  3. Сделайте боковой разрез по средней линии от середины живота, через всю грудную клетку, и вверх по шее, соединив грудную клетку с головой. Раскройте ширинку булавками от насекомых. Удалите органы и железы у мухи, не повреждая нервную систему.
    Примечание: На этом этапе аксоны GF могут быть введены с помощью красителей для маркировки GF и электрически связанных нейронов13.
  4. Снимите капсулу головы с головы, чтобы обнажить мозг.

9. Иммуногистохимия нервной системы

  1. После вскрытия ЦНС зафиксировать муху в 4% PFA в PBS на 45 мин при комнатной температуре (ОТ). Стирать в течение 20 минут в PBS при RT (3 раза).
  2. Заблокируйте образец на 1 ч при RT в 3% BSA в PBS с 0,5% раствором моющего средства.
  3. Инкубировать в течение 2-3 ночей при 4 °C в 3% BSA в PBS с 0,3% раствором моющего средства и анти-GFP кроликов (1:500). Умываться в течение 20 минут в PBS при температуре RT (6 раз).
  4. Инкубировать в течение ночи при 4 °C в PBS с анти-кроликом Alexa 488. Умываться в течение 20 минут в PBS при температуре RT (6 раз).
  5. Обезвоживайте образцы с помощью восходящего этанола (50%, 70%, 90%, 100% этанол) в течение 10 мин на каждом этапе. Удалите штифты и обрежьте живот и летные мышцы. Перенесите остальную часть грудной клетки, содержащую нервную систему, на предметное стекло и накройте ее монтажной средой, такой как метилсалицилат. Наденьте на образец покровный лист и заклейте его лаком для ногтей.
  6. Визуализируйте нервную систему на конфокальном микроскопе, чтобы проанализировать анатомию терминала GF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод может быть использован для манипулирования развитием специфических нейронных сетей в нервной системе дрозофилы. Основным вопросом исследования здесь было формирование синаптических связей. Удаление либо пресинаптического GF, либо постсинаптического TTMn позволило исследовать реактивный синаптогенез в этом центральном синапсе и молекулярные механизмы, имеющие решающее значение для синаптической функции и развития. Как описано в протоколе, была проведена лазерная клеточная абляция одной из ГФ или одного...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Клеточная абляция с помощью 2-фотонного микроскопа оказалась весьма успешным методом манипулирования развитием нейронных цепей у дрозофил. Так как этот метод является неинвазивным, он наносит минимальный ущерб животному. Полученные данные подтверждают полезность этого специфического для клетки манипулирования известными цепями.

Решающее значение для успеха абляции имел выбор наиболее подходящего драйвера Gal4. Поскольку GFS хорошо изучена, было описано много специфических линий драйве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эксперименты с 2-фотонным микроскопом проводились в FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Мы хотели бы поблагодарить инициативу Jupiter Life Science за финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Антизеленый флуоресцентный белок, кроликFisher ScientificA11122концентрация 1:500
Apo LWD 25x/1.10W ОбъективNikonMRD77220погружение в воду большое рабочее расстояние
Бычья сыворотка альбумин (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Лазерныйкогерентный
ватный шарикGenesee Scientific51-101
Dextra, тетраметилродамин, 10 000 МВт, фиксируемый лизин (фтор-рубин)Fisher ScientificD1817
Рецепт солевого раствораот Gu и O'Dowd, 2006
Этиловый эфирFisher ScientificE134-1Опасность, легковоспламеняющаяся жидкость
Fly food B (рецепт Блумингтона)LabExpress7001-NV
МетилсалицилатFisher ScientificO3695-500
Микроцентрифуга пробирка 1,5 млEppendorf22363204
Микроскоп 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Вектор нейробиотина ЛабораторииSP-1120
Nikon A1R многофотонный микроскопNikonна вертикальном стенде FN1 microsope
Элементы NIS Advanced ResearchNikonПрограммное обеспечение для сбора и анализа данных
Параформальдегид (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (фосфатный буферный салин)Fisher BioReagentsBP2944-100Таблетки
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(летальный)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost микроскоп предметное стеклоFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000моющее средство
раствор UAS-10xGFPBloomington Фондовый центр дрозофил32185
дрозофилы

Ссылки

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Двухфотонная микроскопиясборка нейронных цепейсистема гигантских волоконоптогенетикаабляция одиночного нейроназащитное поведение (реакция избегания)GFP-экспрессирующие клетки
Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.