Method Article

Модель in vitro для изучения дифференцировки и изменения мультиомики на эпителиальных клетках дыхательных путей мышей, стимулированных экстрактом сигаретного дыма

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем in vitro модель выделения и дифференцировки эпителиальных клеток дыхательных путей мышей, уделяя особое внимание их акклиматизации к экстракту хронического сигаретного дыма (CSE). Модель может быть использована для всесторонней характеристики мультиомиксного воздействия КСО, что, возможно, дает представление о клеточных реакциях при хроническом воздействии дыма.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) в значительной степени связана с воздействием табачного дыма. Изучение того, как эпителиальные клетки дыхательных путей функционально адаптируются к табачному дыму, имеет решающее значение для понимания патогенеза ХОБЛ. Настоящее исследование заключалось в создании модели in vitro с использованием первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей для имитации реального воздействия табачного дыма. В отличие от устоявшихся клеточных линий, первичные клетки сохраняют больше естественных свойств, включая модели роста, старения и дифференцировки. Эти клетки проявляют чувствительную воспалительную реакцию и эффективную дифференцировку, таким образом, точно представляя физиологические условия. В этой модели первичные эпителиальные клетки дыхательных путей мышей культивировались в течение 28 дней на границе раздела воздух-жидкость с оптимальной концентрацией экстракта сигаретного дыма (CSE), что приводило к трансформации монослоя недифференцированных клеток в псевдостратифицированный столбчатый эпителий, что свидетельствует об акклиматизации CSE. Затем был применен комплексный мультиомический анализ, чтобы выяснить механизмы, с помощью которых CSE влияет на дифференцировку базальных клеток дыхательных путей. Эти данные обеспечивают более глубокое понимание клеточных процессов, лежащих в основе прогрессирования ХОБЛ в ответ на воздействие табачного дыма.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой гетерогенное заболевание легких со сложными характеристиками, при этом пациенты с ХОБЛ постепенно становятся моложе1. Курение, являющееся основным фактором риска развития ХОБЛ2-го типа, оказывает глубокое воздействие на эпителиальные клетки дыхательных путей, которые служат первоначальным барьером против табачного дыма. Несмотря на эту известную связь, детально изученные механизмы, с помощью которых табачный дым вызывает изменения в эпителиальных клетках дыхательных путей, остаются недостаточно изученными. Глубокое понимание этих молекулярных изменений имеет важное значение для ранней диагностики маркеров и терапевтических мишеней для ХОБЛ.

Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали новую модель in vitro с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей мышей. Эти клетки были подвергнуты длительной стимуляции экстрактом сигаретного дыма (CSE), что позволило нам отслеживать динамические клеточные изменения и исследовать изменения в эпителиальных клетках дыхательных путей при длительной стимуляции табаком и лежащий в их основе механизм. В этой модели трансвелл использовали для обеспечения воздушно-жидкостного интерфейса эпителиальных клеток дыхательных путей, а экстракт сигаретного дыма стимулировали на ранней стадии дифференцировки эпителиальных клеток до окончания дифференцировки через 28 дней. В предыдущих исследованиях изучалась только дифференцировка и краткосрочная стимуляция эпителиальных клеток дыхательных путей (доминирование клеточной линии). Они были ограничены одним регуляторным путем 3,4,5,6. Тем не менее, представленный здесь протокол использует первичные эпителиальные клетки дыхательных путей мыши и оптимизирует процесс экстракции клеток для лучшей клеточной активности по сравнению с предыдущими методами культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта модель фокусируется на изменениях в клеточной дифференцировке наряду с комплексным транскриптомным, протеомным, метаболомическим и эпигеномным анализами. Используя иммунофлуоресценцию и передовые методы мультиомики, мы стремились выяснить клеточные реакции эпителиальных клеток дыхательных путей на хроническое воздействие табачного дыма, тем самым способствуя более глубокому пониманию патогенеза ХОБЛ. Эта модель может быть использована для изучения изменений в характере дифференцировки эпителиальных клеток дыхательных путей и ее механизма, вызванных длительной стимуляцией различными загрязнителями.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий протокол требует 44 дня, включая 1 день на подготовку эпителиальных клеток дыхательных путей, выделенных из трахеи мышей, 15 дней на пролиферацию клеток и 28 дней на стимуляцию CSE на границе между воздухом и жидкостью. Все экспериментальные животные размещены в комнате барьерных животных SPF Центра экспериментов на животных Столичного медицинского университета и были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных и лабораторных животных Столичного медицинского университета (AEEI-2020-100) на соответствие требованиям руководящих принциповARRIVE7.

1. Выделение первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей из трахеи мышей

  1. Подготовка
    1. Приготовьте полную среду расширения, смешав 1 мл добавки 50x и 0,05 мл гидрокортизона с базальной средой расширения 48,95 мл. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 4 недель.
    2. Растворите 7,5 мг протеинады и 5 мг дезоксирибонуклеазы I в 5 мл F-12 Хамса для приготовления раствора протеиназы. Отфильтруйте его для стерилизации и храните при температуре 4 °C и используйте в течение 4 недель.
    3. Приготовьте растворы антибиотиков, добавив 0,05 мл 100-кратного пенициллина/стрептомицина и 0,01 мл 500-кратного гентамицина/амфотерицина к 5 мл полной расширяющей среды, PBS и раствора протеиназы (100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В). Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 4 недель.
    4. Стерилизуйте хирургические инструменты и подготовьте бокс биологической безопасности для изоляции клеток. Одновременно убедитесь, что стандартное оборудование для культивирования клеток готово к использованию.
    5. Приготовьте блюда, покрытые коллагеном из крысиного хвоста, добавив коллаген крысиного хвоста (100 мкг/мл в 0,02 N уксусной кислоты) в 100 мм чашки для культивирования и 24 мм трансвеллы (0,05 мл/см2). Оставьте открытым на ночь под ультрафиолетовым светом для стерилизации.
  2. Выделение первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей
    1. Используйте мышей C57BL/6 (в возрасте 6-8 недель, самец, с повышенным SPF) для выделения эпителиальных клеток трахеи. Усыпить с 1% передозировкой раствора пентобарбитала натрия (около 200 мг/кг). Используйте пять мышей для достаточного выхода клеток.
    2. Простерилизуйте мышь, погрузив ее в 75% раствор этанола, не погружая нос и рот в спирт, чтобы предотвратить попадание алкоголя в трахею.
    3. Препарируйте мышь.
      1. Используйте хирургические лезвия и щипцы, один комплект приспособлений для разрезания и вскрытия эпидермиса от нижней челюсти до брюшной полости мыши.
      2. Используйте другой набор хирургических инструментов, чтобы разорвать щитовидные железы с обеих сторон и удалить соединения между трахеей, окружающей мышечной тканью и пищеводом.
      3. После этого аккуратно разрежьте грудную клетку, с помощью щипцов углубитесь в грудную полость, удалите все легкое и найдите конец трахеи.
    4. Обработайте трахею.
      1. Вырежьте трахею от щитовидного хряща до трахео-бронхиальной ветви и поместите ее в предварительно холодную расширяющую среду, содержащую четыре антибиотика.
      2. Встряхните трубку, чтобы смыть как можно больше крови с поверхности трахеи, держите ее на льду, а затем начните операцию для следующей мыши.
    5. Перенесите все собранные трахеи в буфер PBS, содержащий четыре антибиотика (200 ЕД/мл пенициллина, 200 ЕД/мл стрептомицина, 20 г/мл гентамицина и 0,5 г/мл амфотерицина В) для предварительной обработки перед перевариванием.
    6. С помощью набора хирургических инструментов удалите сгустки и другие ткани с поверхностей трахеи, а затем разрежьте их на 1 см2 размера.
    7. Инкубировать ткань трахеи в растворе протеиназы при 37 °С в течение 40 мин.
    8. Через 40 минут покачайте трубку несколько раз и используйте клеточный фильтр 40 мкм для удаления оставшихся тканей. Измельченные трахеи промойте на ситечке с 5 мл расширяющей среды, центрифугируйте клеточную суспензию при 400 х г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    9. Ресуспендируйте полученные клетки в 8 мл расширяющей среды.
    10. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
    11. Планшет P0 суспензируют клетки на 100 мм чашках (1 x 104 живых клеток/см2), предварительно покрытых коллагеном из крысиного хвоста, и культивируют клетки в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2.

2. Культивирование экспансии и пассаж первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей

  1. Заменяйте среду для клеточной культуры P0 каждые 3 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 70%-80% конфлюенции, обычно в течение 6 дней. На этом этапе эпителиальные клетки трахеи мышей могут образовывать неповрежденный монослой с видом булыжника (рисунок 1A-D).
  2. Предварительно нагрейте достаточные объемы PBS, полную расширяющую среду и комплект для диссоциации клеток животного происхождения (ACF) до 37 °C.
  3. Аккуратно промойте клетки 3 мл PBS.
  4. Проводят ферментативную диссоциацию.
    1. Добавьте в чашку 3 мл раствора ферментативной диссоциации ACF и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. После пипетирования аккуратно вытесните клетки и перенесите клеточную суспензию в 3 мл раствора ингибирования фермента ACF.
    2. Повторите добавление 3 мл раствора ферментативной диссоциации ACF и снова инкубируйте в течение 5 мин для обеспечения максимальной отслойки клеток.
  5. Вращайте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируйте клетки в 1 мл расширяющей среды.
  7. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
  8. Планшет P1 суспензируют клетки на нескольких 100 мм чашках (5 x 104 живых клеток /см2), предварительно покрытых коллагеном из крысиного хвоста, и культивируют клетки в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2.

3. Дифференцировка и стимуляция КСЭ первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей на границе раздела воздух-жидкость

  1. Подтвердите тип ячейки.
    1. Верифицировать эпителиальное происхождение выделенных клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) с антителами к цитокератинам. Семенные клетки на предметных стеклах покрыты коллагеном крысиного хвоста и используют параформальдегид для их фиксации в течение как минимум 12 часов после того, как клетки достигнут 80% конфлюенции.
    2. Промыть предметные стекла 3 раза раствором PBS в течение 5 мин и инкубировать их с 3% BSA и 0,1% triton X-100 в растворе PBS при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
    3. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при 4 °C с коммерческими антителами против панцитокератина в разведении 1:500.
    4. На следующий день промыть предметные стекла 3 раза раствором PBS в течение 5 мин и инкубировать их с буфером вторичных антител в разведении 1:1000 при РТ в течение 2 ч в темноте.
    5. После инкубации промыть предметные стекла 3 раза PBS (5 мин на промывку), и добавить к ним DAPI в разведении 1:1000. После инкубации в RT в течение 15 мин промойте предметные стекла PBS один раз в течение 5 мин.
    6. Рассмотрите предметные стекла под флуоресцентным микроскопом и сравните паттерны экспрессии с положительным контролем (клеточная линия A549) и отрицательным контролем (клеточная линия Raw264.7) (рис. 2).
  2. Засейте клетки для дифференцировки.
    1. Отделить и центрифугировать Р2-клетки, как описано выше, и повторно суспендировать клеточную гранулу в соответствующем объеме расширяющей среды для облегчения осаждения 1 x 104 живых клеток/см2.
    2. Пипеткой 1 мл клеточной суспензии нанесите на апикальную камеру мембранной вставки из поликарбоната transwell. В базальный отсек трансвелла добавьте 1,5 мл пролиферационной среды.
  3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C и полностью меняйте всю среду в базальной и апикальной камерах каждые 3 дня с использованием расширяющей среды до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Обычно это занимает 3-6 дней.
  4. Приготовьте 50 мл среды для полной дифференцировки, добавив 5 мл добавки ALI 10x, 500 мл поддерживающей добавки ALI, 100 мл раствора гепарина и 250 мл стокового раствора гидрокортизона к 44,15 мл базальной среды ALI.
  5. Подготовьте CSE.
    1. Проведите одну сигарету через 12,5 мл дифференцировочной среды, а затем отфильтруйте ее через фильтр пор 0,22 мкм для приготовления CSE. Чтобы обеспечить стандартизацию между экспериментами и партиями CSE, измерьте поглощение на длине волны 320 нм на спектрофотометре и определите оптическую плотность (OD) 1 как 100%8.
  6. Используйте среду для дифференцировки, содержащую соответствующую концентрацию CSE, для стимуляции первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей с целью выявления эффектов на дифференцировку клеток.
  7. Дают клеткам дифференцироваться в течение 28 дней, в течение которых изменяют среду базальной камеры, а апикальную сторону промывают два раза в неделю путем удаления среды апикальной камеры и замены среды базальной камеры средой для дифференцировки, содержащей соответствующую концентрацию CSE.
  8. Проанализируйте клетки после контакта.
    1. После контакта с дифференцировочной средой, содержащей CSE, в любой момент времени (т.е. через 0-28 дней) проводят забор клеток и надосадочной жидкости для выявления морфологических изменений (т.е. иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) или окрашивания гематоксилин-эозином (ПЭ) или для биоинформатических аналитических процедур (т.е. транскриптомики, протеомики, метаболомики и т.д.).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференциация
Эпителиальные клетки дыхательных путей мышей успешно дифференцировались после культивирования на границе воздух-жидкость со средой для дифференцировки в течение 28 дней. Наличие реснитчатых и бокаловидных клеток было продемонстрировано иммунофлуоресцентным анализом маркера ресничек ацетилированного α-тубулина (зеленый; Рисунок 3А) и маркер бокаловидных клеток Mucin5AC, соответственно6 (красный; Рисунок 3В).

Определение концентрации CSE для дифференцировки клеток
Стимулируйте выделенные эпителиальные клетки различными концентрациями CSE в течение 24 ч. Результаты показали, что жизнеспособность эпителиальных клеток снижалась, когда концентрация CSE превышала 6% (p <0,05, рисунок 4A). Для поддержания активности клеток при длительной стимуляции использовали культуральные среды, содержащие 2%, 4% и 6% CSE, для стимуляции дифференцировки эпителиальных клеток в течение 28 дней. Кроме того, результаты показали, что с увеличением концентрации CSE не наблюдалось значительной гибели клеток в эпителиальных клетках (рисунок 4B), но наблюдалось постепенное изменение количества межклеточных трансмембранных резистентных (TEER) (рисунок 4C) и отшелушивающихся клеток (рисунок 4D). Кроме того, было отмечено общее снижение дифференцированных клеток и реснитчатых клеток при хроническом воздействии КГЭ на культурах эпителиальных клеток дыхательных путей мышей (рис. 4E-H). Таким образом, была выбрана среда для дифференцировки, содержащая 6% CSE, для нарушения функции эпителиального барьера и уменьшения количества реснитчатых клеток без снижения жизнеспособности клеток при дифференцировке эпителиальных клеток в течение 28 дней.

Мультиомический анализ
В течение 28 дней собирали две группы клеток, стимулированных дифференциальной средой, содержащей 0% или 6% CSE. Общая мРНК была выделена для транскриптомного анализа. После подготовки библиотеки, секвенирования, контроля качества, картирования прочтений в референсный геном и количественной оценки экспрессии генов был проанализирован дифференциальный экспрессия генов между двумя группами. Пакет clusterProfiler R был использован для проведения обогащенного анализа онтологии генов (GO) для генов, которые демонстрировали дифференциальную экспрессию, с поправками, внесенными с учетом различий в длине генов (рис. 5A). Киотская энциклопедия генов и геномов (KEGG) служит всеобъемлющей базой данных, способствующей пониманию сложных функций и ролей биологических систем на различных уровнях, включая клеточный, организменный и экологический, путем интеграции данных молекулярного уровня, полученных из обширных наборов данных, таких как полученные с помощью геномного секвенирования и высокопроизводительных экспериментальных методологий (рис. 5B). Для протеомики общие белки экстрагировали из двух групп клеток через 28 дней после культур с дифференциальными средами, содержащими 0% или 6% CSE. После проверки качества белка, удаления соли, ферментативного гидролиза белка, мечения пептидов с помощью Tandem Mass Tags (TMT), разделения фракций, анализа LC-MS, идентификации белка и количественного определения белка можно определить дифференциально экспрессируемые белки между двумя группами. Анализ ГО проводили с помощью программы interproscan по базе данных белков без резервирования (рис. 6A), а для анализа пути использовали KEGG (рис. 6B). Для метаболомики супернатанты культур собирали из двух групп эпителиальных клеток дыхательных путей через 28 дней после культур со средой дифференцировки, содержащей 0% или 6% CSE. После анализа ВЭЖХ-МС/МС, идентификации и количественного определения метаболитов можно определить дифференциальные метаболиты между двумя группами. Для аннотирования всех метаболитов использовались база данных KEGG (рисунок 7A), база данных метаболомов человека (рисунок 7B) и база данных липидmaps (рисунок 7C). База данных KEGG была использована для анализа функций этих дифференциальных метаболитов и метаболических путей (рис. 7D). Для эпигеномики ATAC-seq проводили, как сообщалось ранее9. Ядра экстрагировали из двух групп клеток через 28 суток после культивирования дифференциальной средой, содержащей 0% или 6% CSE, и гранулу ядер ресуспендировали в реакционной смеси транспозазы Tn5. Реакцию транспозиции инкубировали при 37 °C в течение 30 мин. После добавления адаптера, подготовки библиотеки, оценки качества, кластеризации и секвенирования можно определить дифференциальную эпигеномику между двумя группами. Анализ обогащения GO генов, связанных с дифференциальными пиками, непосредственно отражает распределение количества дифференциально связанных с пиками генов в элементах GO, обогащенных биологическими процессами, клеточными компонентами и молекулярными функциями (рис. 8A). Для анализа функций этих дифференциальных генов и путей использовалась база данных KEGG (рис. 8B).

Гены, кодирующие белки плотных соединений
Транскриптомные данные показали, что после длительной стимуляции CSE наблюдалось снижение экспрессии многочисленных генов, кодирующих белки плотных соединений, включая Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 и Ocln (рисунок 9A), в которых сниженная экспрессия Cldn3 и Ocln была дополнительно подтверждена методом вестерн-блоттинга и иммуногистохимии (ИГХ) (рисунки 9B-E). Эти данные свидетельствуют о том, что воздействие CSE заметно снижает экспрессию белков плотных соединений эпителиальных клеток дыхательных путей.

Экспрессия цитокинов и хемокинов
В дополнение к разрыву тесных связей, транскриптомика также показала, что после длительной стимуляции CSE экспрессия некоторых цитокинов и хемокинов, включая Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 и Il33, увеличивалась, но экспрессия Ccl5 снижалась (рис. 10A). Тест Luminex также подтвердил повышенные концентрации CXCL-5, CSF-3 и IL-1α (рис. 10B-D), но снижение CCL-5 (рис. 10E) в надосадочной жидкости эпителиальных клеток дыхательных путей мышей. Эти результаты свидетельствуют о том, что воздействие CSE избирательно влияет на экспрессию цитокинов и хемокинов.

figure-results-1
Рисунок 1: Рост первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей. (А) Вновь выделенные клетки выглядят круглыми и прозрачными. (B) Ко второму дню после изоляции расширенные клетки сформировались в мелкие клеточные островки. (C) К 4-му дню происходит образование более крупных клеточных островков. (D) К 6-му дню более 90% слияния с морфологией булыжника. (4-кратное увеличение; масштабные линейки: 250 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Иммунофлуоресцентный анализ маркеров эпителиальных клеток. Экспрессия цитокератина в первичных эпителиальных клетках дыхательных путей мышей, A549 (положительный контроль) и Raw264.7 (отрицательный контроль). Ядра окрашены DAPI (63-кратное увеличение; масштабные линейки: 40 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентный анализ на маркеры реснитчатых и бокаловидных клеток. В качестве маркеров использовались ацетилированный (А)α-тубулин и (В) муцин 5АС для подтверждения ресничек и бокаловидных клеток соответственно (увеличение 100; масштабные линейки: 10 мкм на панели А и 50 мкм на панели В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Влияние концентраций CSE на эпителиальные клетки. (A) Жизнеспособность клеток через 24 ч при различных концентрациях CSE. (В) Жизнеспособность клеток на 28 день. (C) Измерение TEER. (D) Количество отслоившихся клеток. (Э-Х) Иммунофлюоресценция для реснитчатых (зеленых) и бокаловидных клеток (фиолетовых) в концентрациях 0%, 2%, 4% и 6% CSE (20-кратное увеличение; масштабные линейки: 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Анализ обогащения GO и KEGG на экспрессию генов. (A) Значение термина GO в обогащенном биологическом процессе, клеточном компоненте и молекулярной функции. (B) Доля дифференциально экспрессируемых генов в путях KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Анализ экспрессии белка. (A) Гистограмма обогащения GO, показывающая дифференциальную экспрессию белка. (B) Анализ путей KEGG на основе дифференциально экспрессируемых белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Анализ пути метаболитов KEGG. (A) Аннотирование всех метаболитов с использованием базы данных KEGG. (B) Аннотирование всех метаболитов с использованием базы данных метаболомов человека. (C) Аннотирование всех метаболитов с использованием базы данных Lipidmaps. (D) Распределение дифференциально экспрессируемых метаболитов в различных путях KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Дифференциально пиковый анализ экспрессии генов. (A) Гистограмма обогащения GO, показывающая дифференциальную экспрессию белка. (B) Анализ путей KEGG на основе дифференциально экспрессируемых белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Экспрессия белка плотного соединения в эпителиальных клетках дыхательных путей мыши со стимуляцией CSE или без нее. (A) Тепловая карта экспрессии белка плотного соединения в транскриптоме. (В-Е) Уровни экспрессии (B,C) Cldn3 и (D,E) Ocln в эпителиальных клетках дыхательных путей мышей определяли с помощью вестерн-блоттинга и иммуногистохимии для Cldn3 и Ocln (увеличение 80; масштабные линейки: 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 10: Анализ экспрессии цитокинов. (A) Транскриптомная тепловая карта экспрессии цитокинов. (В-Е) Анализ Luminex на уровни CXCL-5, CSF-3, IL-1α и CCL-5 в клетках с/без стимуляции CSE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ХОБЛ является распространенным хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей. Воздействие табачного дыма приводит к хроническому воспалению дыхательных путей, ремоделированию дыхательных путей и структурному разрушению легких, что является результатом взаимодействия различных структурных клеток и иммунных клеток10. Являясь передней линией врожденной иммунной системы в легких, эпителиальные клетки дыхательных путей играют очень важную роль во времяразвития заболевания. С этой точки зрения, выяснение того, как эпителиальные клетки изменяются и регулируют нижестоящие клетки под воздействием вредных веществ, является научной проблемой, требующей срочного решения.

В последнее время сообщалось о нескольких животных моделях ХОБЛ, которые преодолели некоторыеограничения12. В этих моделях могут наблюдаться умеренные уровни нейтрофильного воспаления дыхательных путей, воспалительная сигнатура Th1/Th17, выраженная гиперпродукция слизи, повышенное ремоделирование дыхательных путей, снижение функции легких и увеличение воздушных пространств. Хотя этим моделям требуется всего 1 месяц для установления изменений, подобных ХОБЛ, что произошло у мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма в течение 1 месяца, до сих пор неясно. Использование долгосрочной стимуляции КСО имеет преимущество в том, что ее легче откалибровать, что означает, что эпителиальные клетки дыхательных путей могут подвергаться максимально сильному воздействию сигаретного стимула без смерти, точно так же, как эпителиальные клетки дыхательных путей у курильщиков. В этом случае мониторинг динамических патологических изменений, приводящих к воспалению дыхательных путей и формированию эмфиземы, имеет решающее значение для дальнейшего понимания патогенеза ХОБЛ, относящегося к курению. Поэтому мы создали модель in vitro для имитации состояния дыма и попытались отслеживать динамические изменения во время воздействия CSE на эпителиальные клетки дыхательных путей. Кроме того, относительно очищенные эпителиальные клетки дыхательных путей делают мультиомиксное исследование более легким, чем исследование целых тканей, что может помочь нам найти молекулярные и клеточные реакции в эпителиальных клетках дыхательных путей, подвергшихся воздействию CSE, и определить ключевые пути и терапевтические мишени ХОБЛ с высокой пропускной способностью.

В данном случае протокол, описывающий выделение эпителиальных клеток трахеи мышей, адаптирован из протоколов Hilaire et al.13 и You et al.14 с некоторыми модификациями. В протоколе, использованном в данном исследовании, эпителиальные клетки дыхательных путей мышей были размножены и дифференцированы в псевдостратифицированную структуру, содержащую реснитчатые и бокаловидные клетки, с использованием воздушно-жидкостной границы раздела и среды, содержащей КГЭ, тем самым установив модель хронической акклиматизации КГЭ. Следующие события являются ключевыми моментами данной модели.

Учитывая, что вывих шейки матки может привести к механическому растяжению шеи и физическому повреждению эпителиальных клеток, а хлоралгидратная анестезия также может повлиять на дыхательные пути, для эвтаназии был использован пентобарбиталнатрия. Во время хирургических процедур на мышах погружение только в шею и нижние области для предотвращения попадания алкоголя в нос может увеличить жизнеспособность эпителиальныхклеток дыхательных путей. Предварительные данные настоящего исследования показали, что эпителиальные клетки дыхательных путей, подвергшиеся интубации трахеи или погружению в алкоголь, имели низкую жизнеспособность и не расширялись. Кроме того, чтобы получить эпителиальные клетки дыхательных путей без эритроцитов, необходимо быть осторожным в хирургических процедурах, чтобы избежать заражения крови при изоляции основных дыхательных путей.

Даже у мышей, не содержащих специфических патогенов, дыхательные пути колонизировали значительное количество микробов. Добавление соответствующих антибиотиков в среду расширения P0 первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей имеет важное значение для предотвращения контаминации бактериальными или грибковыми патогенами. Коктейльный раствор пенициллина, стрептомицина, амфотерицина В и гентамицина17 эффективно обеспечивает экспансию эпителиальных клеток дыхательных путей мышей P0 в стерильной среде in vitro . Предварительные эксперименты показали, что при отсутствии эффективного ингибирования бактериального загрязнения эпителиальные клетки дыхательных путей мышей P0 будут погибать до первого прохода.

В методах сбраживания были испытаны как 4 °C, так и 37 °C. Результаты предварительных экспериментов показали, что дигест при 37 °C превосходит 4 °C с точки зрения временной эффективности, жизнеспособности клеток и выхода клеток.

Перед посевом эпителиальных клеток коллаген крысиного хвоста растворяли в уксусной кислоте и использовали для покрытия культуральной чашки для улучшения адгезии эпителиальных клеток18. Однако плотность коллагенового покрытия не должна быть слишком высокой или слишком низкой; Недостаточная плотность не обеспечивает адекватных условий адгезии, в то время как избыточная плотность приводит к образованию кристаллического остатка на поверхности культуры.

Критически важным шагом является сохранение большего количества эпителиальных клеток живыми и предотвращение загрязнения фибробластов. Для достижения этих целей мы рекомендуем, чтобы: 1) использование набора для диссоциации клеток животного происхождения без компонентов могло мягко изолировать эпителиальные клетки и уменьшить ненужное повреждение клеток, и 2) использование дифференциальной среды, содержащей гидрокортизон, могло ингибировать рост фибробластов и способствовать пролиферации эпителиальных клеток.

Традиционные погруженные монослойные культуры эпителиальных клеток дыхательных путей были основным продуктом в респираторных и токсикологических исследованиях. Тем не менее, эти методы не позволяют точно воспроизвести дифференцированные характеристики эпителиальных тканей дыхательных путей, обнаруженные in vivo. Чтобы устранить это ограничение, мы выбрали альтернативную модель эпителия дыхательных путей. Эта модель основана на культивировании первичных клеток дыхательных путей на микропористых мембранных каркасах, таких как те, которые обеспечиваются трансвелл-системами, на границе раздела воздух-жидкость19. Воздействие на апикальную поверхность окружающего воздуха в этой культуральной установке ALI играет важную роль в стимулировании клеточной дифференцировки, тем самым более точно имитируя условия in vivo 20.

Если дифференцировка неэффективна, крайне важно оценить потенциальные причины. Это включает в себя возможность того, что эпителиальные клетки дыхательных путей могли подвергнуться чрезмерному прохождению, что может поставить под угрозу их способность к дифференцировке. Кроме того, крайне важно убедиться, что скопление слизи и жидкости в апикальной камере полностью устраняется во время процесса обмена средой раз в две недели, так как остаточное содержание может препятствовать процессу дифференцировки.

Несмотря на то, что эта модель имеет определенные ограничения, она остается ценным инструментом для исследований. Одним из ограничений является то, что использование среды, содержащей CSE, для стимуляции эпителиальных клеток дыхательных путей может не полностью воспроизводить in vivo условия, испытываемые эпителиальными клетками дыхательных путей у курильщиков. Кроме того, жизнеспособность дифференцированных реснитчатых эпителиальных клеток in vitro обычно ограничена месяцем. Несмотря на эти ограничения, модель эффективно интегрирует несколько ключевых аспектов: она облегчает изучение дифференцировки эпителиальных клеток дыхательных путей на границе между воздухом и жидкостью, долгосрочную акклиматизацию к CSE и применение мультиомиксного анализа в течение определенного периода времени. Этот комплексный подход предлагает сложную и целостную основу для будущих исследований физиологических и патологических механизмов эпителиальных клеток дыхательных путей. Кроме того, это помогает в идентификации потенциальных биомаркеров и терапевтических мишеней для заболеваний дыхательных путей. Мы надеемся, что наш опыт даст полезную информацию для тех, кто хотел бы использовать эту модель для актуальных исследований.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x раствор пенициллина/стрептомицинаGibco15140122
24 мм Transwell с 0,4 мк; m Мембранная вставка из полиэстера пор, стерильнаяBIOFILTCS016012
40 & микро; m Клеточное ситечкоFalcon352340
500x Раствор гентамицина/амфотерицинаGibcoR01510
ацетилированный &альфа;-тубулинCST#5335
ацетил-&альфа;-тубулин (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Набор для диссоциации свободных клеток животного происхождениястволовые клетки05426
Антитела к пан-цитокератинуabcamab7753
СигаретаMarlboro
Claudin3иммунопутьYT0949
Дезоксирибонуклаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichDN25
Дезоксирибонуклаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigmaDN25
Ham' s F-12Sigma-AldrichN6658
Раствор гепарина Стволовая клетка07980
Стоковый раствор гидрокортизонаСтволовая клетка07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Раствор пенициллина-стрептомицинаGibco15140122
PneumaCult-ALI
Базальная средняя		стволовая клетка05002 
PneumaCult-ALI 10x Добавкастволовые клетки05003 
PneumaCult-ALI Поддерживающая ДобавкаСтволовая Клетка05006
PneumaCult-Ex Plus 50x ДобавкаСтволовая Клетка05042
PneumaCult-Ex Plus Базальная СредняяСтволовая Клетка05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Коллаген из крысиного хвостаCorning354236
Трипановый синийСтволовые клетки07050 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles