Методическая статья

Модифицированная модельная подготовка для реперфузии окклюзии средней мозговой артерии

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67060

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процесс подготовки к реперфузии окклюзии средней мозговой артерии через общую сонную артерию.

Аннотация

Модель реперфузии окклюзии средней мозговой артерии (MCAO/R) имеет решающее значение для понимания патологических механизмов инсульта и разработки лекарственных препаратов. Тем не менее, среди широко используемых методов моделирования метод Коидзуми часто подвергается тщательному изучению из-за его лигирования общей сонной артерии (ОСА) и его неспособности достичь адекватной реперфузии. Аналогичным образом, метод Лонга подвергался критике за отсоединение и перевязку наружной сонной артерии (ЭХА). Данное исследование направлено на внедрение модифицированного метода подготовки модели, который сохраняет целостность ЭХА, включает в себя введение монофиламентного нейлонового шва через ОСА, восстановление лигированного разреза ОСА и поддержание реперфузии от ОСА. Реперфузия кровотока подтверждена с помощью лазерной спекл-визуализации. Методы оценки, такие как шкала Лонга, модифицированная шкала неврологической тяжести, окрашивание трифенилтетразолия хлорида (ТТС) и иммунофлуоресцентное мечение нейронов, продемонстрировали, что этот подход может индуцировать стабильное ишемическое повреждение нервов. Этот модифицированный протокол модели MCAO/R прост и стабилен, предоставляя ценные рекомендации для практикующих врачей в области ишемии головного мозга.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, инсульт остается второй по значимости причиной смерти во всем мире в течение последнего десятилетия, с высоким уровнем заболеваемости, высокой смертностью и высоким коэффициентом инвалидности 1,2. По мере старения населения мира ожидается, что заболеваемость инсультом в развивающихся странах будет расти, что потенциально может стать основной причиной преждевременной смерти и инвалидности среди взрослых. Кроме того, существует тенденция к тому, что инсульты случаются в более раннем возрасте3 лет. Потеря рабочей силы после инсульта также ложится тяжелым бременем на семьи и общество4. Таким образом, разработка безопасных и эффективных методов лечения представляет собой серьезную проблему в исследованиях инсульта.

Животные модели служат важнейшими инструментами для изучения профилактики и лечения заболеваний человека. Успешная трансляция стратегий лечения инсульта зависит от воспроизводимости и надежности моделей пациентов с инсультомна животных 5,6. Средняя мозговая артерия (МКА) является распространенным местом для клинического инсульта, что делает модель МЦАО наиболее близкой моделью к ишемическому инсульту человека. Модель MCAO, полученная с использованием шовного метода, была одобрена исследователями благодаря таким преимуществам, как отсутствие трепанации черепа и легкий контроль времени ишемии. Он был использован более чем в 40% нейропротекторных экспериментов7. Однако, несмотря на многочисленные преимущества, эксплуатационные детали этой модели остаются спорной темой для многих исследователей.

Для модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), вызванной швом, реперфузия происходит путем удаления шва. В настоящее время для наложения швов используются два основных метода: методКоидзуми 8 и метод Лонги9. В методе Коидзуми шов входит во внутреннюю сонную артерию (ВСА) в основном через разрез общей сонной артерии (ОСА), в то время как в методе Лонги он проходит через разорванную наружную сонную артерию (ОСА) в ВСА. Во время реперфузии метод Коидзуми требует постоянного лигирования разреза CCA и опирается на круг Виллиса для реперфузии10. Тем не менее, некоторые исследования показывают, что эффективная реперфузия не может быть достигнута исключительно за счет компенсаторного питания виллизиева круга после потери запаса ОСА. Кроме того, круг Виллиса демонстрирует высокую анатомическую вариабельность, особенно у мышей C57Bl/6, увеличивая вариабельность инфаркта и снижая надежность экспериментальных данных. Следовательно, этот метод все чаще ставится под сомнениеисследователями11.

Метод Лонга включает в себя наложение шва через разорванную ЭКА, а затем постоянное перевязку внутренней сонной артерии (ВСА) после снятия шва. Это сохраняет проходимость CCA, позволяя проводить перфузию крови до 100% от исходных значений. Однако этот метод требует отделения наружной сонной артерии и небольших артериальных ветвей, их отрезания или электрокоагуляции, что делает процедуру сложной. Он также нарушает полную структуру кровотока в мозге, что отличается от клинического состояния пациента12. Важно отметить, что исследования показывают, что разрезание или лигирование ECA может вызвать ишемические повреждения в мышцах, контролирующих жевание и глотание, влияя на рацион животных и приводя к послеоперационной смерти животных и серьезным сенсорным и двигательнымповреждениям у крыс.

Следовательно, для решения этих проблем срочно необходим модифицированный метод подготовки моделей. В этом исследовании представлен модифицированный метод моделирования MCAO, который восстанавливает разрез при введении CCA и обеспечивает эффективную реперфузию. Процедура проста, практична и осуществима, вызывая значительные неврологические повреждения и воспроизводимые поражения инфаркта, а также предоставляя ценные рекомендации для исследователей инсульта.

Протокол

Протокол эксперимента был проведен в соответствии с рекомендациями Комитета по использованию лабораторных животных и Комитета по уходу и использованию институциональных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (регистрационный номер: 2019-DL-002). Все данные исследований на животных были задокументированы в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Для исследования были использованы самцы крыс Sprague Dawley (SD) массой от 250 г ± 20 г в возрасте 6-8 недель. Особенности использования животных, реагентов и оборудования приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Вызывайте и поддерживайте глубокую анестезию у крыс с помощью Золетила 50 (50 мг/кг, внутримышечно) и гидрохлорида ксилазина (40 мг/кг, внутримышечно). Следите за тем, чтобы температура тела поддерживалась на уровне 37 ± 0,5 °C с помощью ректального зонда, подключенного к грелке, на протяжении всей хирургической процедуры. Нанесите ветеринарную мазь на глаза крысы, чтобы предотвратить их пересыхание.
  2. Сбрейте шерсть с головы и шеи крыс. Используйте крем для депиляции, чтобы удалить шерсть с головы и шеи, затем смойте крем обычным физиологическим раствором. Продезинфицируйте кожу в месте операции, трижды нанеся этанол и повидон-йод с помощью стерильных ватных шариков.
  3. Сделайте разрез в 2 см посередине головы крысы по направлению сагиттального шва с помощью скальпеля, и аккуратно удалите мышцы, покрывающие череп.
  4. Истончите череп на ишемизированной стороне крысы с помощью сверла для черепа. Используйте обычный физиологический раствор для охлаждения и удаления мусора в процессе измельчения. Запишите исходный уровень кровотока крыс с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI).
  5. Нанесите этанол и повидон-йод трижды на кожу шеи с помощью стерильных ватных шариков. Сделайте разрез 2 см по средней линии шеи с помощью хирургического лезвия. Используйте ретракторы, чтобы боково оттянуть кожу и слюнные железы, обнажая грудино-ключично-сосцевидные и шейные мышцы.
  6. Отделите грудино-ключично-сосцевидную и шейную мышцы, чтобы обнажить сонную артерию. Определите сосудистую анатомию общей сонной артерии (ОСА), внутренней сонной артерии (ВСА) и наружной сонной артерии (ЭКА). Основываясь на анатомии сосудов, разделите CCA, а также ECA и ICA15, производные от CCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анатомическое строение крысы указывает на то, что область ОСА в основном покрыта грудино-ключично-сосцевидными и шейными мышцами, при этом ВСА и ОСА происходят от ОСА. После того, как разделение обнажает CCA, вдоль CCA можно увидеть Y-образную вилку, представляющую ICA и ECA. Будьте осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв, который проходит параллельно ОСА.

2. Окклюзия MCA

  1. Завяжите легко распутывающийся узел над наружной сонной артерией (ECA) и общей сонной артерией (CCA) с помощью шелковой нити 3-0, чтобы временно блокировать кровоток. Расположите зажим для судна на CCA примерно в 0,5 см от первого узла.
    1. Покрасьте иглу шприца объемом 5 мл в черный цвет. Сделайте небольшой прокол в ОСА с помощью иглы, окрашенной в черный цвет, и отметьте отверстия черным цветом.
  2. Вставьте монофиламентный нейлоновый шов в CCA через черную метку. Откройте сосудистый зажим и введите нейлоновую проволоку во внутреннюю сонную артерию (ВСА) до упора с небольшим сопротивлением. Надежно затяните второй узел, чтобы монофиламентный нейлоновый шов оставался на месте внутри артерии, предотвращая смещение из блокирующего положения.
  3. Обратите внимание на время ишемии в этот момент и измерьте значение кровотока на ишемической стороне с помощью LSCI. Капли бупивакаина закапывают в рану на шее для обезболивания и закрытия раны. Снимите маску для анестезии и дайте крысе восстановиться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если шовный материал из мононити из нейлона сталкивается с трудностями при введении в ICA, слегка втяните его и повторите попытку введения.

3. Реперфузия МЦАО

  1. После 90 минут ишемии повторно обезболите крыс изофлураном. Измерьте мозговой кровоток с ишемической стороны с помощью LSCI и убедитесь, что монофиламентный нейлоновый шов не сместился.
  2. Развяжите узлы на наружной сонной артерии (ЭКА), чтобы обеспечить реперфузию крови. Отпустите узел на общей сонной артерии (ОЦА), зафиксируйте монофиламентный шов и снимите шов. Наложите сосудистый зажим перед несъемным монофиламентным швом, чтобы предотвратить кровотечение.
  3. Замените первый узел CCA сосудистым зажимом. С помощью пинцета поверните разрез сосуда в сторону (рисунок 1). Зажмите разрез пинцетом и перевяжите его с помощью нити 6-0 для восстановления разреза. Снимите сосудистый зажим, проверьте наличие подтеканий и подтвердите полную реперфузию (Видео 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните лигирование для восстановления разреза, чтобы избежать чрезмерного зажима сосуда, которое может привести к стенозу CCA.
  4. Запишите показатели кровотока в коре головного мозга с помощью LSCI после лигирования разреза для подтверждения успешной реперфузии. Закройте разрез на шее швами и введите 1 00 000 единиц пенициллина и 2 мл физиологического раствора для предотвращения инфекции и обезвоживания.
  5. Сохраняйте тепло до тех пор, пока крысы не придут в сознание. Предлагайте мягкую пищу после операции и следите за жизненными показателями животных.

4. Оценка нервной функции и ишемического повреждения головного мозга

  1. Как только крысы полностью проснутся, их нервная функция будет оценена исследователями, не знающими о группировке животных. Используйте шкалу Лонга (Таблица 1) и модифицированную шкалу неврологической тяжести (mNSS) (Таблица 2) для оценки неврологической функции всех крыс.
  2. Через 24 ч после операции усыпить крыс под индуцированной изофлураном анестезией (4% изофлуран при концентрации кислорода 4 л/мин) путем вывиха шейки матки16 (в соответствии с институционально утвержденными протоколами). Промойте мозг ледяной водой, чтобы удалить остатки крови.
  3. Разделите ткани мозга на 5 участков и окрасьте их с помощью ТТС. Сделайте снимки обеих сторон срезов мозговой ткани, измерьте ишемизированную область передней и задней сторон с помощью программного обеспечения Image J и рассчитайте частоту инфаркта по следующей формуле:
    figure-protocol-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: S1 и S2 представляют собой область инфаркта проксимального отдела переднего мозга и проксимальной стороны ствола мозга соответственно. Площадь инфаркта каждого среза мозга корректируется с помощью формулы Свенсона, где h представляет толщину среза мозга. Эта формула, ранее изложенная автором в предыдущем исследовании17, позволяет более точно рассчитать размер поражения инфаркта.
  4. Анализируйте данные с помощью статистического и графического программного обеспечения, чтобы оценить успешность и стабильность модели.
  5. Используйте метод иммунофлуоресценции для мечения корковых нейронов у крыс, дополнительно подтверждая повреждение нейронов, вызванное этим методом. После 24 ч ишемии-реперфузии у крыс проводили перфузию сердца с использованием предварительно охлажденного PBS для получения мозговой ткани.
  6. Внедрите и заморозьте мозговую ткань на срезы. Используйте нейрональные антитела, такие как незрелый нейрональный маркер Doublecortin (DCX)18, маркер ядра нейрона Neuronal Nuclei (NeuN)18 и нейронный дендритный маркер Microtubule-ассоциированный белок-2 (MAP-2)19. Наблюдайте за экспрессией ишемических нейронов с помощью лазерной конфокальной микроскопии.

Результаты

Лазерная визуализация спекл-потока показала, что до окклюзии монофиламентного нейлонового шва в области средней мозговой артерии (МКА) наблюдался обильный кровоток, и были зарегистрированы исходные значения кровотока крыс. После окклюзии MCA величина кровотока на ишемизированной стороне мозга быстро снижалась. Перед снятием шва показатели кровотока на ишемизированной стороне были повторно проверены, чтобы подтвердить, окклюзирует ли шов MCA. Результаты показали лишь незначительное изменение кровотока. После снятия шва перфузия кровотока быстро восстановилась (Рисунок 2). На видео 1 также показан сильный пульс наполнения общей сонной артерии, что позволяет предположить, что этот метод может обеспечить достаточный кровоток перфузии после церебральной ишемии.

Результаты оценки неврологических функций (рис. 3) показали, что по сравнению с группой фиктивной хирургии оценка по шкале Лонга модельной группы составила 1,80 ± 0,27 (p < 0,05), а оценка mNSS составила 7,4 ± 0,89 (p < 0,05). Эти баллы указывают на то, что модель окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии (MCAO/R), полученная с использованием этого метода, привела к значительным неврологическим повреждениям. Видео 2 демонстрирует характерное поведение крыс модельной группы, вращающихся во время ползания, что является отличительным признаком травмы, вызванной инсультом, что еще раз подтверждает обоснованность этого метода.

Окрашивание TTC показало, что частота инфаркта у крыс модельной группы составила 5,58 ± 1,79 (p < 0,05), при этом площадь инфаркта в первую очередь поражала стриатум и кору, а размер инфаркта оставался относительно стабильным. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало потерю корковых нейронов после ишемии-реперфузии (рис. 4). Эти результаты в совокупности указывают на то, что данный метод может создать стабильную модель MCAO/R, подходящую для оценки доклинической эффективности препарата.

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема лигирования коннектора CCA. Желтый круг обозначает точку прикрепления и место лигирования проволочной пробки, в то время как положение лигирования (желтая стрелка) указывает на место, где была перевязана общая сонная артерия (CCA) с проволокой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Лазерные спекл-изображения кровотока у крыс на ишемической стороне до, после окклюзии, а также до и после реперфузии. (A) Изображения мозгового кровотока крыс, где синие области указывают на низкие значения кровотока, а красные области указывают на высокие значения кровотока. Масштабные линейки: 200 мм. (B) Изменения ишемии-реперфузии головного мозга у крыс, представленные в виде среднего ± стандартного отклонения, с размером выборки n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Результаты оценки площади инфаркта и неврологических функций в фиктивной и модельной группах. (A) Окрашивание TTC отображало инфарктные участки ткани мозга как в фиктивной, так и в модельной группе, с белыми областями, указывающими на инфарктную ткань, и красными областями, указывающими на нормальную ткань. (B) Представлены количественные результаты шкал Лонга и mNSS, а также частота инфаркта. Статистическая значимость по сравнению с фиктивной группой обозначается как *p < 0,05 при размере выборки n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Результаты повреждения корковых нейронов в фиктивной и модельной группах. Экспрессия NeuN (A), DCX (B) и MAP-2 (C) в корковых нейронах. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Диаграмма окклюзии и реперфузии МКА по Коидзуми, Лонга и модифицированному методу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Моторные тесты/сильные>Точки
Поднятие крысы за хвост3
1 Сгибание передней конечности
1 Сгибание задней конечности
1 Головка перемещена > 10° к вертикальной оси в течение 30 с
Размещение крысы на полу3
0 Обычная прогулка
1 Неспособность ходить прямо
2 Кружение в сторону паретики
3 Падайте на паретическую сторону
Сенсорные тесты2
1 Вступительный тест (визуальный и тактильный тест)
2 Проприоцептивная проба (глубокое ощущение, прижатие лапы к краю стола до
стимулируют мышцы конечностей)
Испытания на балансировку луча6
0 Балансирует с устойчивой осанкой
1 Захватывает сторону балки
2 Обнимает бревно и одна ветка падает вниз с балки
3 Обнимает балку и две конечности падают вниз с балки, или вращается на балке (>60 с)
4 Пытается балансировать на луче, но падает (>40 с)
5 Пытается балансировать на луче, но падает (>20 с)
6 Падения: Нет попыток балансировать или держаться за луч (<20 с)
Рефлексы отсутствуют и ненормальные движения4
1 Рефлекс ушной раковины (покачивание головой при прикосновении к слуховому проходу)
1 Роговичный рефлекс (мигание глаз при легком прикосновении к роговице ватой)
1 Рефлекс испуга (моторная реакция на короткий шум от щелчка бумаги из буфера обмена.
1 Судороги, миоклонус, миодистония
Максимальное количество баллов18

Таблица 1: Модифицированная шкала неврологической тяжести.

Зеа-Лонга забивает гол
СчётСимптом
0 балловОтсутствие неврологических дефицитов
1 баллЛегкая: неспособна полностью вытянуть правую переднюю лапу при поднятом хвосте
2 баллаУмеренный: круги вправо/влево при ходьбе
3 баллаТяжелая: кувыркается вправо/влево при ходьбе
4 баллаНеспособность самостоятельно ходить с потерей сознания

Таблица 2: Очки Zea-Longa.

Видео 1: Основные этапы лигатурного восстановления разреза CCA во время реперфузии у крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Поведенческие видео крыс, проходящих MCAO/R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

Модель окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), индуцированная монофиламентным нейлоновым швом, является наиболее распространенным методом, используемым для подготовки моделей MCAO. Этот подход широко применяется в доклинических исследованиях и получил признание многих практикующих врачей благодаря своей простоте, отсутствию необходимости в трепанации черепа, минимальной хирургической травме и возможности достижения реперфузии.

Существует два классических хирургических метода внутрипросветной нити MCAO: метод Коидзуми8 и метод Лонга9. Основное различие между этими методами заключается в том, как вводится шов для окклюзии МКА. При методе Коидзуми шов вводится через разрез общей сонной артерии (ОСА) во внутреннюю сонную артерию (ВСА). Передний конец шовной нити покрыт силиконом, чтобы блокировать начальную точку MCA. И наоборот, при методе Лонга шов вводится в ВСА через разорванную наружную сонную артерию (ЭКА). Передний конец шва расширяется в сферическую форму, чтобы блокировать начальную точку MCA (Рисунок 5). Во время реперфузии шов аккуратно отводится для восстановления кровотока.

Метод Лонга предполагает введение шва во внутреннюю сонную артерию (ВСА) через разорванную наружную сонную артерию (ЭКА). Этот процесс требует отделения и отсоединения ЭХА, а также отделения и удаления небольших ветвей, которые затем срезаются с помощью электрокоагуляционной ручки для предотвращения кровотечения. Следовательно, этот метод требует осторожной и точной работы. Кроме того, короткий остаточный конец разорванного ЭХА может облегчить соскальзывание шва во время введения, что еще больше усложняет процедуру. Эта проблема особенно заметна при подготовке мышиной модели ишемии головного мозга, поскольку часто требуется использование микроскопа для обеспечения точности, что еще больше усложняет общую операцию.

Основная проблема метода Коидзуми заключается в перевязке общей сонной артерии (ОСА), что приводит к компенсаторной реперфузии мозговой ткани на ишемической стороне исключительно через Виллис круг. ОСА является важнейшей ветвью дуги аорты от сердца и служит основной артерией, обеспечивающей перфузию мозгового кровотока. Поэтому модель ишемии-реперфузии головного мозга, созданная по методу Коидзуми, часто испытывает состояние гипоперфузии. Эта гипоперфузия не ограничивается областью средней мозговой артерии, а распространяется на все ишемизированное полушарие с той же стороны. Даже после 35 дней моделирования значение кровотока не возвращается к исходному уровню, что позволяет предположить, что метод Коидзуми следует рассматривать как ишемическую модель с хронической гипоперфузией, а не как ишемию-реперфузионную модель10.

В отличие от этого, метод Лонга может достичь значения кровотока 100% у животных MCAO/R. Тем не менее, важно отметить, что достижение полной реканализации не обязательно означает, что следует отказаться от метода Коидзуми. При рассмотрении клинической трансляции метод Коидзуми может быть более подходящим для пациентов со спонтанной медленной реканализацией после окклюзии артерии. Однако в клинической практике это явление встречается относительно редко. Лишь небольшой процент пациентов с ишемическим инсультом соответствует критериям тромболизиса и получает эффективное лечение в течение временного окна лечения20,21. Кроме того, у некоторых пациентов не удается достичь полной реваскуляризации даже после тромболитическойтерапии. Следовательно, метод Коидзуми может быть использован для моделирования состояний таких пациентов.

С другой стороны, метод Лонга позволяет сосудам быстро реканализироваться после окклюзии, что делает его более подходящим для моделирования пациентов, получающих эффективную тромболитическую терапию или тромбэктомию в клинической практике. Для моделирования пациентов, не подвергавшихся тромболитической терапии, модель постоянной ишемии головного мозга, полученная по методу Коидзуми, может предложить более полную окклюзию и более простую хирургическую процедуру.

Метод Лонга для индуцирования окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии (MCAO/R) может привести к более значительному повреждению реперфузии за счет сохранения сосудистой реканализации, вызванной общей сонной артерией (CCA)23,24. Тем не менее, важно отметить, что наружная сонная артерия (ЭКА) должна быть отрезана и навсегда перевязана во время метода Лонга, что нарушает полную структуру кровотока мозга и не согласуется с клиническими пациентами. Кроме того, язычная, верхнечелюстная и затылочная артерии являются ветвями ECA13. Таким образом, сокращение или постоянное лигирование ECA может вызвать расстройства пищевого поведения и питья, что приведет к потеревеса. Предыдущие исследования показали, что смерть мышей после моделирования MCAO в первую очередь связана с недостаточным потреблением пищи или воды, а не с ишемическим повреждением головного мозга14,26. Кроме того, лигирование ЭХА может уменьшить кровоток в сетчатке и вызвать повреждение сетчатки ввиде гибели клеток.

Кроме того, наиболее важным показателем для исследования инсульта является объем инфаркта; Тем не менее, было доказано, что объем инфарктов, индуцированных методом наложения швов, имеет значительное стандартное отклонение, даже при соблюдении строгих протоколов хирургического вмешательства и сбора данных. В предыдущих отчетах объем инфаркта был связан со степенью реперфузии28, а реперфузия модели инсульта, полученной по методу Коидзуми, зависит от циркуляции Виллиса 29,30,31. Тем не менее, было доказано, что виллизонный цикл имеет высокую анатомическую вариабельность, особенно у мышей C57Bl/6, где у 90% животных может отсутствовать одна или две задние сообщающиеся артерии32, что является ключевым фактором, определяющим высокую вариабельность ишемического повреждения33. Таким образом, сохранение перфузии ОСА может снизить вариабельность объема инфаркта34. Сообщалось, что средний коэффициент вариации размера инфаркта в исследованиях по лечению инсульта составил 29,5%31, что способствовало низкой статистической мощности исследований по лечению инсульта. Это также представляет собой огромную проблему для потенциального открытия лекарств. Это, несомненно, увеличивает стоимость разработки и клинического перевода и может привести к тому, что исследователи упустят потенциально эффективные препараты. Это также увеличивает количество животных, которые должны быть включены в статистический анализ эксперимента, что еще больше нарушает принцип 3R этики животных.

Поэтому в данном исследовании методы моделирования были модифицированы для обеспечения целостности структуры кровотока мозговой ткани и достаточной реперфузии после ишемии головного мозга. Основные модификации включают в себя два этапа: (1) введение шовной нити в ОСА с помощью иглы шприца объемом 5 мл вместо небольшого разреза; этот шаг уменьшает разрез ОСА и в большей степени способствует лигированию разреза; (2) отвести шов и использовать более тонкие шелковые нити для перевязки отверстия иглы ОСА, не влияя на перфузию кровотока ОСА. Конечно, это тоже требует тщательной хирургической операции, но отличается от введения шва через ЭХА; этот метод сохраняет целостность мозговой структуры кровотока, позволяя при этом полностью реперфузировать кровоток через ОСА, что упрощает операционную процедуру и снижает вариабельность объема инфаркта. Некоторые исследователи использовали аналогичные методы исследования для заживления разрезов с помощью тканевого клея, но это может привести к тромбозу, который принесет неконтролируемые последствия. А для стабилизации разреза требуется больше времени25.

В заключение следует отметить, что данное исследование предлагает модифицированный подход к подготовке модели ишемии-реперфузии головного мозга, которая позволяет обеспечить адекватную перфузию крови после изъятия нити и может привести к значительно воспроизводимым объемам инфаркта и неврологическим повреждениям. Все вышеуказанные результаты демонстрируют, что модифицированный метод является осуществимым и воспроизводимым и может служить ориентиром для практикующих врачей при подготовке моделей, способствующих эффективному клиническому переводу ишемических препаратов для головного мозга.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82173781 и 82373835), Исследовательским проектом для постдокторантов (BKS212055), Проектом научно-технических инноваций Фошаньского научно-технического бюро (2320001007331), Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2019A1515010806), Ключевыми полевыми проектами (интеллектуальное производство) общих университетов провинции Гуандун (2020ZDZX2057) и Научно-исследовательскими проектами (характерные инновации) общего Университеты провинции Гуандун (2019KTSCX195).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система анестезии для животныхRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Средство поддержания температуры для животныхRayward Life Technology Co., Ltd69020
Cy3 вторичное антителоWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB21303
антитело DAP1Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1012
DCX антителоWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB13434
Козья сывороткаBeyotime Biotechnology Co., LTDC0265
GraphPad PrismПрограммное обеспечениеGraphPad GraphPad Prism 8.0
ImageJНациональные институты здравоохраненияПрограммное обеспечение ImageJ Isofluran
Rayward Life Technology Co., LtdR510-22
Лазерная спекл-кровь система визуализации потокаRayward Life Technology Co., LtdPeriCam PSI NR
MAP-2 антителоWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11128
Миниатюрная ручная дрель для черепаRayward Life Technology Co., Ltd87001
монофиламентный шовRayward Life Technology Co., Ltd250-280 г
антитела NeuNWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11138
агент для встраивания ОКТBIOSHARPBL557A
Пенициллин натрияChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
Раствор для быстрого извлечения антигена для замороженных срезовBeyotime Biotechnology Co., LtdP0090
SD крысыSPF ( Пекин ) Biotechnology Co., Ltd.250-280г
Triton X-100Beyotime Biotechnology Co., LTDST795
TTCChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.
2019030101

Ссылки

  1. Paul, S., Candelario-Jalil, E. Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: An overview of clinical and preclinical studies. Exp Neurol. 335, 113518(2021).
  2. Feigin, V. L., Owolabi, M. O. Pragmatic solutions to reduce the global burden of stroke: a World Stroke Organization-Lancet Neurology Commission. Lancet Neurol. 22 (12), 1160-1206 (2023).
  3. Putaala, J. Ischemic Stroke in Young Adults. Continuum (Minneapolis, Minn). 26 (2), 386-414 (2020).
  4. Girotra, T., Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. A contemporary and comprehensive analysis of the costs of stroke in the United States. J Neurol Sci. 410, 116643(2020).
  5. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: The rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. JCBFM. 30 (8), 1412-1431 (2010).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Ann Neurol. 59 (3), 467-477 (2006).
  8. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Nosotchu. , 1-7 (1986).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Faber, J. E., Moore, S. M., Lucitti, J. L., Aghajanian, A., Zhang, H. Sex differences in the cerebral collateral circulation. Transl Stroke Res. 8 (3), 273-283 (2017).
  11. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  12. Li, Y., et al. Comparison of cerebral microcirculation perfusion in rat models of middle cerebral artery occlusion prepared through common carotid artery insertion and external carotid artery insertion. CJTER. 27 (11), 1683-1691 (2023).
  13. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  14. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  15. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovasc Res. 114 (2), 291-299 (2018).
  16. Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovasc Res. 118 (3), 814-827 (2022).
  17. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  18. Belayev, L., et al. Docosanoids promote neurogenesis and angiogenesis, blood-brain barrier integrity, penumbra protection, and neurobehavioral recovery after experimental ischemic stroke. Mol Neurobiol. 55 (8), 7090-7106 (2018).
  19. Guo, H., et al. Carthamin yellow improves cerebral ischemia-reperfusion injury by attenuating inflammation and ferroptosis in rats. Int J Mol Med. 47 (4), 52(2021).
  20. Chia, N. H., et al. Determining the number of ischemic strokes potentially eligible for endovascular thrombectomy: a population-based study. Stroke. 47 (5), 1377-1380 (2016).
  21. Henninger, N., Fisher, M. Extending the time window for endovascular and pharmacological reperfusion. Transl Stroke Res. 7 (4), 284-293 (2016).
  22. Zhang, P. L., et al. Use of Intravenous thrombolytic therapy in acute ischemic stroke patients: evaluation of clinical outcomes. Cell Biochem Biophys. 72 (1), 11-17 (2015).
  23. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the Longa and Koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLOS One. 11 (2), e0148503(2016).
  24. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).
  25. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  26. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  27. Ogishima, H., et al. Ligation of the pterygopalatine and external carotid arteries induces ischemic damage in the murine retina. Invest Ophth Vis Sci. 52 (13), 9710-9720 (2011).
  28. Irvine, H. J., et al. Reperfusion after ischemic stroke is associated with reduced brain edema. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1807-1817 (2018).
  29. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  30. Dirnagl, U., Dirnagl, U. Bench to bedside: The quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
  31. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: A meta-analysis. Sci Rep. 6, 21086(2016).
  32. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  33. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  34. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Dis Model Mech. 10 (7), 931-938 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи