Методическая статья

Генерация и совместное культивирование первичной микроглии и корковых нейронов мышей

DOI:

10.3791/67078

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает кокультуру микроглии и нейронов, созданную из первичных нейрональных клеток, выделенных из эмбрионов мышей на 15-16 день эмбрионального периода, и первичной микроглии, полученной из мозга неонатальных мышей на 1-2 день после рождения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия — это тканевые резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС), выполняющие многочисленные функции, поддерживающие здоровье нейронов и гомеостаз ЦНС. Они представляют собой основную популяцию иммунных клеток, связанных с активностью заболевания ЦНС, принимая реактивные фенотипы, которые потенциально способствуют повреждению нейронов во время хронических нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Различные механизмы, с помощью которых микроглия регулируют функцию нейронов и выживаемость во время здоровья и болезни, остаются ограниченными из-за проблем в разрешении сложных взаимодействий in vivo между микроглией, нейронами и другими факторами окружающей среды ЦНС. Таким образом, подход in vitro к совместному культивированию микроглии и нейронов остается ценным инструментом для изучения микроглии и нейронных взаимодействий. В этой статье мы представляем протокол генерации и совместного культивирования первичной микроглии и нейронов у мышей. В частности, микроглия была выделена через 9-10 дней in vitro из смешанной культуры глии, полученной из гомогенатов мозга, полученных от неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения. Нейрональные клетки были выделены из коры головного мозга эмбрионов мышей между 16-18 днями эмбрионального периода. После 4-5 дней in vitro нейрональные клетки засеивали в 96-луночные планшеты с последующим добавлением микроглии для формирования кокультуры. Тщательное определение времени имеет решающее значение для этого протокола, поскольку оба типа клеток должны достичь экспериментальной зрелости для создания совместной культуры. В целом, эта кокультура может быть полезна для изучения взаимодействий микроглии и нейронов и может обеспечить многократное считывание, включая иммунофлуоресцентную микроскопию, живую визуализацию, а также анализы РНК и белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия – это тканевые резидентные макрофаги, которые способствуют иммунонадзору и гомеостазу в центральной нервной системе (ЦНС)1,2,3. Они происходят из эритромиелоидных клеток-предшественников желточного мешка, которые колонизируют мозг во время эмбрионального развития 4,5,6 и поддерживаются на протяжении всей жизни организма за счет самообновления, которое включает пролиферацию и апоптоз7. В равновесном состоянии микроглия в состоянии покоя имеет разветвленную морфологию и участвует в тканевом контроле 8,9,10.

Микроглия экспрессирует многочисленные рецепторы клеточной поверхности, что позволяет ей быстро реагировать на изменения в ЦНС11,12 и стимулировать воспалительные реакции в случае инфекций или повреждений тканей 12,13,14, а также при нейродегенеративных заболеваниях 9,15, таких как рассеянный склероз (РС)16,17. Микроглия также экспрессирует рецепторы к различным нейротрансмиттерам и нейропептидам 18,19,20, что позволяет предположить, что они также могут реагировать и регулировать активность нейронов 21,22. Действительно, микроглия и нейроны взаимодействуют в различных формах двунаправленной коммуникации 8,23, таких как прямые взаимодействия, опосредованные мембранными белками, или косвенные взаимодействия через растворимые факторы или промежуточные клетки23,24.

Например, различные нейротрансмиттеры, секретируемые нейронами, могут модулировать нейропротекторную или воспалительную активность микроглии 25,26,27. Кроме того, прямое взаимодействие между нейронами и микроглией помогает поддерживать микроглию в гомеостатическом состоянии28. И наоборот, прямое взаимодействие микроглии с нейронами может формировать нейронные схемы29 и влиять на передачу нейронных сигналов 30,31,32. Поскольку нарушения этих взаимодействий вызывают гипервозбудимость нейронов30 и реактивность микроглии 33,34, нерегулируемые взаимодействия микроглии и нейронов участвуют в качестве фактора, способствующего развитию неврологических заболеваний33,35. Действительно, было описано, что психотические заболевания23,26 и нейродегенеративные заболевания демонстрируют дисфункциональные взаимодействия микроглии и нейронов33. В то время как эти наблюдения подчеркивают важность микроглиально-нейрональной коммуникации в ЦНС, конкретные механизмы того, как эти взаимодействия регулируют микроглиальные и нейрональные функции в здоровом и заболеваемом состоянии, относительно неизвестны.

В такой сложной среде, как ЦНС, многочисленные факторы окружающей среды могут влиять на микроглиально-нейронные взаимодействия, что ограничивает возможность изучения транзиторных клеточных взаимодействий in vivo. В данной работе мы представляем систему совместного культивирования микроглии и нейронов in vitro, которая может быть использована для изучения прямых клеточных взаимодействий между микроглией и нейронами. Этот протокол описывает генерацию первичной микроглии и нейронов из коры головного мозга неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения и эмбриональными мышами 16-18 днями соответственно. Затем нейроны и микроглия совместно культивируются в 96-луночных планшетах для последующих высокопроизводительных экспериментов. Ранее мы использовали этот подход, чтобы продемонстрировать, что фагоцитоз микроглии защищает нейроны от окисленной опосредованной фосфатидилхолином клеточной смерти37, предполагая, что этот метод может помочь понять роль микроглии в контексте нейродегенерации и рассеянного склероза. Аналогичным образом, культуры микроглии и нейронов также могут быть полезны для исследования влияния перекрестных помех микроглия и нейронов в других контекстах, таких как вирусные инфекции38 или повреждение и восстановление нейронов39. В целом, системы сокультуры микроглии и нейронов in vitro позволяют исследователям изучать микроглии-нейрональные взаимодействия в управляемой и контролируемой среде, которая дополняет модели in vivo.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные, использованные в этом исследовании, были размещены и обработаны с одобрения Университетского комитета по уходу за животными (UACC) Университета Саскачевана и Канадского совета по уходу за животными (CCAC). Для исследования использовали эмбрионы 0-2 дней CD1 самцов и самок мышей и эмбрионы 16-18 дней (E16-18) беременных мышей с CD1. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Первичная культура микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно рассчитать время для смешанных культур глии и нейронов так, чтобы микроглия созрела и была готова к сбору урожая в течение 2 дней после того, как нейроны были засеяны в 96-луночную пластину.

  1. Подготовка
    1. Предварительно подогрейте полнорационные питательные среды глии, которые включают модифицированную орлиную среду Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и 10% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку, 50 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина с 2,92 мг/мл L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1x заменимые аминокислоты и 20 мМ HEPES на водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Добавьте 5 мл 10 мкг/мл поли-L-орнитина (ПО) гидробромида в каждую колбу Т-75. Осторожно поворачивайте колбу, чтобы ПО полностью покрывало дно колбы. Инкубировать при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 не менее 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап нанесения покрытия необходим для облегчения адгезии ячеек к колбам Т-75.
  2. Выделение мозга у неонатальных мышей P0-P2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все инструменты для вскрытия и поддерживайте стерильность реагентов. Обеспечьте соблюдение асептических методов на всех этапах.
    1. Перед началом вскрытия распылите на столешницу 70% этанол или дезинфицирующий спрей в месте проведения вскрытия. Установите диссекционный микроскоп и поместите чашку Петри под микроскоп. Налейте 20 мл среды L-15 Лейбовица в чашку Петри. Держите крышку чашки Петри закрытой, пока микроскоп не используется, чтобы уменьшить загрязнение.
    2. Положите вниз несколько слоев бумажного полотенца и тщательно сбрызните бумажные полотенца 70% этанолом. Подготовьте инструменты для вскрытия (ножницы для вскрытия, пару микрощипцов и тканевые щипцы), тщательно опрыскав их 70% этанолом и положив инструменты на бумажные полотенца.
    3. Перенесите мышь с 0-2 дня после рождения на бумажные полотенца и тщательно опрыскайте мышь 70% этанолом. Обезглавьте мышь с помощью ножниц для вскрытия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    4. Осторожно удерживая голову, сделайте разрез по средней линии в черепной коробке, начиная от шеи до носа. Отклейте череп с помощью тканевых щипцов, чтобы открыть мозг.
    5. С помощью тканевых щипцов аккуратно вычерпните мозг, вставив щипцы под мозг, и поднимите мозг из головы. Немедленно поместите мозг в чашку Петри, содержащую 20 мл среды L-15 Лейбовица.
    6. Под микроскопом для вскрытия осторожно удалите ствол мозга и мозговые оболочки с помощью пары микрощипцов. Соберите мозги в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл среды L-15 Лейбовица.
  3. Диссоциация мозга, посев и поддержание культуры смешанной глии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги в шкафу биобезопасности.
    1. Измельчите мозги примерно на 1 мм2 штуки стерильным одноразовым лезвием скальпеля. Осторожно переложите измельченные мозги в новую стерильную пробирку объемом 50 мл.
    2. К измельченным мозгам добавьте концентрацию 0,25% трипсина и инкубируйте ткань на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут. Каждые 2-3 минуты перемешивайте раствор, осторожно переворачивая трубку, чтобы способствовать диссоциации тканей.
    3. Из инкубатора с 5% содержаниемСО2 переложите колбы Т-75, содержащие 5 мл ПО, в шкаф биобезопасности. Выбросьте PO и промойте колбы 3 раза стерильным 1x фосфатным буферным раствором (PBS). Обязательно тщательно промойте колбы, так как избыток PO токсичен для клеток.
    4. Перенесите переваренную ткань из водяной бани при температуре 37 °C в шкаф биобезопасности. Добавьте 5 мл полной среды для культивирования глии для нейтрализации трипсина. Аккуратно перемешайте тканевую суспензию с помощью пипетки объемом 10 мл.
    5. Поместите стерильное нейлоновое сетчатое сетчатое сетчатое фильтр 70 мкм на стерильную коническую пробирку объемом 50 мл и намочите сетку, налив примерно 5 мл L-15. Осторожно сцедите клеточную суспензию через клеточное ситечко. Извлеките поршень из стерильного шприца объемом 1 мл, измельчите ткань в сетку с помощью поршня, чтобы избавиться от тканевых комков, и сгенерируйте гомогенизированную клеточную суспензию.
    6. Периодически наливайте примерно 5 мл фильтрующего материала L-15 Leibovitz в нейлоновую сетку толщиной 70 мкм и продолжайте растирать ткань на сетке с помощью поршня шприца объемом 1 мл. Когда на сетке практически не останется видимой ткани, выбросьте сетку и отложите клеточную суспензию в сторону.
    7. Перемешайте клеточную суспензию, аккуратно пипетируя вверх и вниз. В каждую колбу добавляют равные объемы клеточной суспензии, содержащей 1-2 мозга с питательными средами глии, до конечного объема 15 мл.
    8. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение ночи. На следующий день дважды промойте колбы стерильным 1x PBS, чтобы удалить неприкрепленные клетки и мусор.
    9. Добавьте в культуру 15 мл свежей питательной среды для полной глии и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 . Через 3 дня замените половину среды на 10 мл свежей питательной среды глии с добавлением 40 нг/мл макрофагального колониестимулирующего фактора (MCSF).
      Примечание: После этого половину среды заменяют 10 мл свежей среды для культуры глии с добавлением 40 нг/мл MCSF каждые 3 дня. Культуру выдерживают в течение 8-10 дней до сбора микроглии.

2. Первичная культура нейронов

  1. Подготовка
    1. Размораживание B-27 плюс добавка из B-27 плюс система культивирования нейронов. Предварительно подогреть нейробазальную плюс среду из B-27 плюс система культуры нейронов, 1x сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) и инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку (FBS) при 37 °C на водяной бане.
    2. Покройте колбы Т-25 5 мл 10 мкг/мл перорально и инкубируйте колбы не менее 1 часа при 37 °С. Подготовьте инструменты и принадлежности для вскрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап нанесения покрытия способствует адгезии ячеек к колбам Т-25.
  2. Выделение мозга из эмбрионов мышей E16-E18
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все инструменты для вскрытия и поддерживайте стерильность реагентов. Обеспечьте соблюдение асептических методов на всех этапах.
    1. Перед началом вскрытия распылите на столешницу 70% этанол или дезинфицирующий спрей в месте проведения вскрытия. Установите диссекционный микроскоп и поместите чашку Петри под микроскоп. Налейте 20 мл 1x HBSS в чашку Петри. Держите крышку чашки Петри закрытой, пока микроскоп не используется, чтобы уменьшить загрязнение.
    2. Положите вниз несколько слоев бумажного полотенца и тщательно сбрызните бумажные полотенца 70% этанолом. Подготовьте инструменты для препарирования (пружинные ножницы, пару микрощипцов и тканевые щипцы), тщательно опрыскав их 70% этанолом и положив инструменты на бумажные полотенца.
    3. Обезболите беременную мышь между 16-18 днями беременности с помощью изофлурана и усыпьте мышь при вывихе шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    4. Положите мышь на спину на лист бумажного полотенца, смоченного в 70% этаноле. Продезинфицируйте область живота 70% этанолом. Подтяните кожу нижней части живота тканевыми щипцами и выполните V-образный разрез от этой точки до нижней грудной клетки с помощью ножниц для рассечения.
    5. Захватите рога матки, содержащие эмбрионы, тканевыми щипцами и аккуратно извлеките эмбрионы из брюшной полости. Кратковременно продезинфицируйте рога матки, содержащие эмбрионы, с помощью 70% этанола.
    6. Препарируйте по одному эмбриону из его индивидуального мешочка за раз. С помощью пружинных ножниц сделайте разрез по средней линии в верхней части черепа, начиная с задней части шеи и заканчивая носом. Затем поднимите череп в сторону от места разреза, чтобы открыть мозг. Аккуратно вычерпните мозг тканевыми щипцами и перенесите мозг в чашку Петри диаметром 10 см, содержащую 15 мл 1x HBSS.
    7. Под микроскопом вскрытия осторожно удалите ствол мозга и мозговые оболочки с обеих сторон коры головного мозга с помощью пары микрощипцов. Перенесите кору головного мозга в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл 1x HBSS, и положите на лед.
  3. Диссоциация мозга и посев корковых нейронов в клеточной культуре
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги в шкафу биобезопасности.
    1. Измельчите мозги примерно по1 мм по 2 штуки в конической трубке объемом 50 мл стерильным одноразовым лезвием скальпеля. Переложите измельченные мозги в новую стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Добавьте в пробирку трипсин с конечной концентрацией 0,25%. Погрузите трубку в водяную баню с температурой 35-38 °C на 15 минут и осторожно перемешивайте трубку для гомогенизации ткани каждые 2-3 минуты.
    3. Выньте трубку из водяной бани. Осторожно пипетируйте тканевую суспензию вверх и вниз для дальнейшей диссоциации клеток, затем добавьте 0,5 мл термоинактивированного FBS в гомогенизированную суспензию для нейтрализации активности трипсина. Избегайте пузырьков воздуха, чтобы свести к минимуму токсичность для нейронных клеток.
    4. Поместите стерильный нейлоновый сетчатый клеточный фильтр 70 мкм на стерильную коническую трубку объемом 50 мл и намочите сетку, добавив примерно 5 мл нейробазальной среды. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сетчатое сетчатое фильтр 70 мкм. С помощью поршня шприца объемом 1 мл аккуратно вдавите ткань в клеточное ситечко. Периодически вливайте примерно 5 мл 1x HBSS, продолжая растирание, чтобы промыть сетчатый фильтр ячейки.
    5. Центрифугируйте коническую пробирку при давлении 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. В течение этого времени разведите добавку B-27 плюс в нейробазальной плюс среде до 1-кратной конечной концентрации для использования в качестве полноценной нейробазальной среды.
    6. Выбросьте ПО в колбы Т-25 и промойте колбы три раза 5 мл 1x PBS.
    7. Осторожно сцедите, чтобы удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу, осторожно дозируя вверх и вниз 2-3 мл полной нейробазальной среды. Определяют концентрацию клеток и общее количество клеток с помощью гемоцитометра и трипанового синего цвета. Ожидайте до 1,0 x 107 клеток на эмбрион.
    8. Поместите клетки в колбы Т-25 с пероральным покрытием примерно 2,0 x 10-7 клеток в колбе в 5 мл полной нейробазальной среды. Инкубируйте культуру клеток при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
    9. Выполняйте половинную замену среды каждые 2-3 дня, заменяя 2,5 мл среды из культуральной колбы свежеприготовленной полной нейробазальной средой.

3. Совместное культивирование первичных нейронов и микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны выполняться в стерильном шкафу биобезопасности.

  1. Посев нейронов в 96-луночные планшеты
    1. Добавьте 100 мкл 10 мкг/мл перорально в лунку и инкубируйте колбы не менее 1 ч при 37 °С, чтобы покрыть лунки пероральным препаратом. Промойте пластину 1x PBS 3 раза перед засевом клеток и отсасывайте всю оставшуюся жидкость после последней промывки.
    2. Нейроны, выращенные в колбах Т-25, собирают для совместной культуры через 2-5 дней в культуре. Замените среду 5 мл 1x раствора Версена с 0,25% трипсином и 1 мг/мл ДНКазы I, чтобы отсоединить нейроны от колбы. Поместите колбы внутрь инкубатора на 5-6 минут для переваривания и осторожно поворачивайте колбу каждые 2-3 минуты, чтобы способствовать отделению клеток.
    3. Достаньте колбу из инкубатора и проверьте, не отделены ли клетки под микроскопом. Добавьте 0,5 мл инактивированного при нагревании FBS для нейтрализации трипсина и ДНКазы I. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте колбу 5 мл полной нейробазальной среды один раз, чтобы максимально увеличить собранные нейроны. Соберите все клетки в одну коническую пробирку объемом 15 мл.
    4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 2-3 мл полной нейробазальной среды.
    5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и добавьте полную нейробазальную среду для достижения конечной концентрации 7,5 x 105 нейронов/мл. Засейте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку в 96-луночном планшете с пероральным покрытием для получения 7,5 x 104 нейронов/лунку. Ожидается выход в 5-6 миллионов нейронов на колбу.
    6. Инкубируйте нейроны в 96-луночной пластине на ночь. Добавьте по 100 мкл полной нейробазальной среды в каждую лунку на следующий день.
      Примечание: Как только нейроны продемонстрируют соответствующий рост нейритного процесса (примерно на 3-4 день после посева в 96-луночные планшеты), они готовы к совместному культивированию с микроглией.
  2. Изоляция и совместное культивирование микроглии и нейронов
    1. Между 8-10 днями смешанного культивирования глии соберите микроглию, аккуратно промыв колбы Т-75 питательными средами глии в каждой колбе с помощью пипетки объемом 10 мл, и перенесите клетки и среду в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Снова промойте колбы 10 мл свежей среды для культуры глии, чтобы отделить дополнительную микроглию от колб и собрать среду. Ожидается выход 7,5 x 105 микроглии на колбу.
    2. Добавьте в каждую колбу 20 мл свежей питательной среды глии с добавлением 20 нг/мл MCSF. Микроглию можно собирать еще один или два раза, если поддерживать смешанную культуру глии.
    3. Центрифугируйте сбор клеток при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 2 мл полной нейробазальной среды.
    4. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра и трипана синьего. Добавьте полную нейробазальную среду до конечной концентрации 2,5 x 105 клеток/мл.
    5. Из 96-луночного нейронального культурального планшета удалите 100 мкл нейробазальной среды и добавьте 100 мкл суспензии клеток 2,5 x 105 клеток/мл в затравку 2,5 x 104 микроглии на лунку 7,5 x 104 нейронов. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 , чтобы микроглия могла осесть. Совместная культура теперь может быть использована для последующих экспериментов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Блок-схема, показывающая основные этапы формирования смешанной культуры глии для микроглии, показана на рисунке 1A. В целом, в 1-й день ожидается разреженность клеток и чрезмерное количество клеточного мусора (рисунок 1B). К 4-му дню следует наблюдать увеличение количества клеток, особенно с образованием адгезивных астроцитов, на что указывает их удлиненная морфология (рис. 1С). Некоторые микроглии могут наблюдаться на вершине астроцитов или в виде небольших круглых клеток, плавающих в среде. К 8-му дню сливающийся слой астроцитов образует адгезивные слои клеток, в то время как микроглия будет выглядеть как круглые и яркие клетки, которые наполовину прикреплены к астроцитам или плавают в среде (Рисунок 1D). Если плотность микроглии к 8-му дню низкая, культуру можно инкубировать в течение дополнительных дней до сбора урожая.

Блок-схема, показывающая ключевые этапы формирования культуры нейронов, показана на рисунке 2А. В здоровой культуре нейроны прикрепляются и образуют нейритные отростки через 1-3 дня in vitro (рисунок 2B). Точно так же, при посеве нейронов в 96-луночную пластину, они сначала будут казаться круглыми, но к 3-му дню нейроны должны стать адгезивными и сформировать нейритные отростки, которые соединяются с соседними нейронами (рис. 2C). И наоборот, нездоровые культуры нейронов будут содержать клеточные скопления и клеточный мусор, которые могут возникнуть в результате недостаточной диссоциации клеток или неправильного обращения с нейронами (рис. 2D).

Блок-схема, показывающая ключевые этапы протокола совместного культивирования микроглии и нейронов, показана на рисунке 3A. После добавления микроглии 2,5 х 104 к 7,5 х 104 нейронам круглая и большая микроглия должна появиться сверху или между нейронами и нейритными отростками (рисунок 3В). Для дальнейшей визуализации совместной культуры микроглии и нейронов микроглию и нейроны по отдельности или в кокультуре помечали ионизированной молекулой кальций-связывающего адаптера 1 (IBA-1, красный) и тубулином βIII (TUJ1, зеленый) антителами37 для иммунофлуоресцентной микроскопии (рис. 3C-F).

Процесс культивирования клеток: суспензия одиночных клеток из коры головного мозга мышей; шаги, показанные на схеме; изображения с микроскопа.
Рисунок 1: Обзор первичной культуры микроглии. (A) Блок-схема ключевых этапов создания смешанной культуры глии. (Б-Г) Репрезентативные 10-кратные изображения культуры смешанной глии с помощью светлопольного микроскопа в день 1 (B), день 4 (C) и день 8 (D). Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема процесса культивирования нейронов; Подготовка эмбриональных клеток мыши и визуализация в T25, 96-луночные планшеты.
Рисунок 2: Обзор культуры первичных нейронов. (A) Блок-схема ключевых этапов генерации нейронов. (B) Репрезентативные 10-кратные изображения яркопольного микроскопа, показывающие нейроны, культивируемые в колбах T-25. (C) Репрезентативный 10-кратный светлопольный микроскоп нейронов, культивируемых в 96-луночном планшете. (D) Репрезентативный 10-кратный светлопольный микроскоп нездорового нейронного кластера в 96-луночном планшете. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рабочий процесс изоляции микроглии и микроскопический анализ; Иммунофлуоресцентные изображения отображают клеточные маркеры.
Рисунок 3: Обзор кокультуры микроглии и нейронов. (A) Блок-схема ключевых этапов совместной культуры микроглии и нейронов. (B) Репрезентативные 10-кратные изображения кокультуры микроглии и нейронов в 96-луночных планшетах, полученные с помощью светлопольного микроскопа. Масштабные линейки: 100 мкм. (C,D) Репрезентативные иммунофлуоресцентные микроскопические изображения только нейронов (C), только микроглии (D), совместной культуры нейронов и микроглии 2-го дня (E) или 12-дневной совместной культуры нейронов и микроглии (F) в 96-луночном планшете. Микроглия и нейроны помечены IBA-1 (красный) и тубулин βIII (зеленый) соответственно. Ядра окрашиваются DAPI (синим). Иммунофлуоресцентные изображения были получены с помощью 25-кратного объектива с температурой погружения 0,8 NA с широкопольным флуоресцентным микроскопом. Масштабные линейки: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается протокол выделения и культивирования первичных нейронов и первичной микроглии мыши, которые впоследствии используются для создания кокультуры микроглии и нейронов, которая может быть использована для изучения того, как взаимодействия микроглии и нейронов регулируют их клеточное здоровье и функцию. Этот относительно простой и доступный подход может дать критически важное представление о механизмах и функциональных результатах взаимодействия нейронов микроглии в ЦНС.

Для достижения оптимальной совместной культуры несколько критических аспектов этого протокола требуют особой осторожности. Во время изоляции мозга (шаги 1.2.6 и 2.2.7) мозговые оболочки, прикрепленные к поверхности как эмбрионального, так и постнатального мозга, должны быть полностью удалены перед сбором тканей. Как и в случае с другими протоколами нейроглии, неполное удаление мозговых оболочек может привести к контаминации клеточной культуры эндотелиальными клетками или клетками, полученными из крови 40,41,42. Кроме того, при культивировании первичных нейронов (шаги 2.3.7 и 3.1.4) крайне важно получить одноклеточную суспензию и избегать скопления клеток перед посевом нейронов в колбы или 96-луночные планшеты. Нейронные агрегаты не будут должным образом прилипать к культуре и приведут к чрезмерному стрессу нейронов и гибели клеток. Кроме того, длительное лечение нейронов трипсином при попытке их диссоциации из колб Т-25 может привести к нежелательной гибели клеток (шаг 3.1.2). Чтобы смягчить эту проблему, нейроны могут быть непосредственно засажены в 96-луночные планшеты с желаемой плотностью клеток после диссоциации от эмбрионального мозга (шаг 2.3.7). Более того, в этом протоколе соотношение нейронов: микроглии 3:1 было выбрано таким образом, чтобы частично представлять повышенное количество микроглии, которое может присутствовать в микроокружении ЦНС во время нейровоспаления. В качестве альтернативы, соотношение клеток в кокультуре может быть скорректировано в соответствии с экспериментальной необходимостью. Кроме того, временная точка, выбранная для нейронов совместной культуры, может быть увеличена, если цель состоит в том, чтобы оценить более зрелые состояния нейронов.

Примечательно, что при диссоциации нейронов из колб Т-25 на 96-луночные планшеты использование только трипсина может привести к неполной диссоциации и образованию клеточных сгустков вместо монослойной культуры в 96-луночных планшетах (рис. 2D). Чтобы решить эту проблему, нейроны могут быть диссоциированы от колбы Т-25 с помощью 1x раствора Версена, содержащего 1 мг/мл ДНКазы I. Другие факторы, способствующие агрегации нейронов и снижению жизнеспособности, включают неполную растирание клеточной суспензии, недостаточную нейтрализацию трипсина с помощью термоинактивированного FBS, чрезмерное центрифугирование или длительное образование клеточных гранул. Таким образом, обеспечение правильной диссоциации тканей и генерация суспензии одиночных клеток имеют решающее значение для создания здоровой микроглии и совместной культуры нейронов.

Этот протокол направлен на повторение микроглии и нейрональных взаимодействий in vitro, чтобы лучше понять функциональную важность их взаимодействия в ЦНС. В то время как были разработаны другие типы систем совместного культивирования, такие как культивирование отдельных клеточных популяций на различных поверхностях, чтобы обеспечить независимую обработку двух клеточных популяций43,44, эта система смешанных культур обеспечивает прямой и тесный контакт микроглии и нейронов. Кроме того, при правильном поддержании путем замены половины среды каждые 3 дня, эта смешанная культуральная система может оставаться здоровой от 12 дней (рисунок 3F) до потенциально 3 недель, что позволяет проводить долгосрочные исследования нейрональных взаимодействий и микроглии.

В то время как относительная простота системы совместного культивирования является преимуществом для доступности, ключевым ограничением этого подхода является то, что двумерная клеточная культура не полностью представляет тканевую среду ЦНС. Действительно, показано, что трикультура микроглии, нейронов и астроцитов имитирует in vivo нейровоспалительную реакцию более надежно, чем микроглия или совместная культура астроцитов и нейронов46,47. Кроме того, последние разработки в органоидных системах мозга с микроглией и другими глиальными клетками, включая астроциты и олигодендроциты, больше подходят для изучения трехмерной (3D) архитектуры тканей и взаимодействий ЦНС48. Аналогичным образом, показано, что человеческая 3D-система трикультуры, состоящая из нейронов, микроглии и астроцитов, эффективна в моделированииболезни Альцгеймера. Другие культуры микроглии и нейронов человека могут быть более физиологически релевантными для исследований нейродегенеративных заболеваний. Например, совместное культивирование микроглии и моторных нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека50, может быть полезным для изучения таких заболеваний, как боковой амиотрофический склероз51. Тем не менее, учитывая относительную распространенность и низкую стоимость генерации первичных нейронов и микроглии у мышей, оценка совместного культивирования микроглии и нейронов в 96-луночных планшетах может быть высокопроизводительным подходом к изучению механизмов и функциональных последствий микроглии-нейрональных взаимодействий. Последующие анализы могут включать использование визуализации живых клеток для определения клеточных функциональных изменений в режиме реального времени, секвенирование РНК для определения клеточных транскрипционных изменений, иммунофлуоресцентную микроскопию для определения клеточных фенотипических изменений, масс-спектрометрию для определения клеточных и протеомных изменений или иммуноферментный анализ и вестерн-блоттинг для измерения белка, секретируемого в надосадочной жидкости совместно культуры.

Поскольку микроглия является важным медиатором здоровья и заболеваний ЦНС, эта кокультура также может быть использована для исследования влияния молекул и соединений, связанных с заболеванием, на двунаправленную коммуникацию микроглии и нейронов. В контексте РС активированная микроглия может играть деструктивную роль, способствуя ухудшению патологии52,53. Например, они могут секретировать провоспалительные цитокины и активные формы кислорода, а также способствовать активации астроцитов45. Этот протокол может помочь в дальнейшем изучении вредной роли микроглии путем лечения микроглии в кокультуре воспалительными цитокинами, обнаруженными при рассеянном склерозе, и оценки результатов здоровья нейронов. В качестве альтернативы, эта культура микроглии и нейронов была использована для демонстрации защитного эффекта микроглии на нейроны в ответ на окисленный фосфатидилхолин, окислительный продукт, обнаруженный в MS54. Кроме того, апоптоз нейронов ремоделирует экспрессию генов микроглии во время развития, способствуя выживанию микроглии и фагоцитозу55. Таким образом, этот протокол также может помочь определить влияние гибели нейронов на фенотип и функцию микроглии.

Таким образом, этот протокол описывает генерацию и совместное культивирование первичных нейронов, полученных от мыши, и микроглии in vitro. Совместное культивирование микроглии и нейронов, созданное в 96-луночных планшетах, может быть высокопроизводительным подходом для изучения механизмов и функций взаимодействия микроглии с нейронами в контексте здоровья и заболеваний ЦНС, включая рассеянный склероз.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JP выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и Медицинского колледжа Университета Саскачевана. YD выражает признательность за финансовую поддержку от Фонда стартапов Медицинского колледжа Университета Саскачевана, Гранта на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2023-03659), Гранта MS Canada Catalyst (1019973), Гранта на создание Фонда исследований в области здравоохранения Саскачевана (6368) и Гранта Фонда Brain Canada для будущих лидеров в канадских исследованиях мозга. Рисунок 1A, Рисунок 2A и Рисунок 3A были созданы с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка Петри 10 см Рыбак 07-202-011Стерильный
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Система культуры нейронов Gibco 
Диссекционный микроскопVWR
DNase iRoche11284932001
Dulbecco' s Модифицированный Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
ГемацитометрHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 
Колониестимулирующий фактор макрофагов Peprotech315-02
МикрощипцыRWDF11020-11Автоклавные/стерильные
заменимые аминокислотыЦитиваSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Пенициллин стрептомицин глутамин (100x)Gibco103780-16
Поли-L-орнитина гидробромид SigmaP3655-100MG
Пируват натрия (100 мМ)Gibco11360-070
Пружинные ножницыRWDS11008-42Автоклавное/Стерильное
хирургическое лезвиеFeather08-916-5DСтерильные
колбы T-25 Fisher10-126-9
Фляги T-75 Fisher13-680-65
Тканевые щипцыCodman30-4218Автоклавные/стерильные
тканевые ножницыRWDS12052-10Автоклавные/стерильные
трипаны Blue Thermofisher Sci 15250-061
Трипсин (2,5%)ThermoFisher Sci
Zeiss
A365340121083027Широкопольный иммунофлуоресцентный микроскоп 15090046

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи