Method Article

Понимание развития компенсаторных путей у мутантного малярийного паразита, несущего гипоморфный аллель растительных киназ

DOI:

10.3791/67079

⸱

November 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химическая генетика включает в себя замену остатка привратника аминокислотой, содержащей другую боковую цепь в месте мишени. Здесь мы сгенерировали мутантного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1 , и идентифицировали компенсаторные пути, принятые паразитом на мутантном фоне.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из механизмов ослабления действия лекарств малярийным паразитом является перепрограммирование его транскриптома. Эффект более выражен для генов-мишеней, принадлежащих к семейству мультигенов. Протеинкиназы Plasmodium falciparum , принадлежащие к семейству CDPK, необходимы для развития стадии крови. Таким образом, CDPK считаются хорошими мишенями для разработки противомалярийных соединений. Химико-генетический подход исторически использовался для выяснения функции протеинкиназ у высших эукариот. Для этого требуется замена остатка привратника на другую аминокислоту с другой боковой цепью с помощью генетических манипуляций. Замена аминокислоты в позиции привратника модулирует активность протеинкиназы и изменяет ее восприимчивость к определенному классу соединений, известных как ингибиторы выпуклых киназ (BKI), которые помогают в функциональной идентификации гена-мишени. В данной работе мы использовали подход химической генетики для понимания компенсаторных механизмов, развившихся у мутантного паразита, несущего гипоморфный аллель cdpk1. В целом, наш подход помогает в выявлении компенсаторных путей, которые могут быть одновременно нацелены на предотвращение развития лекарственной устойчивости против отдельных киназ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малярия является одним из ведущих инфекционных заболеваний, от которого ежегодно умирают миллионы людей, особенно среди детейв возрасте до 5 лет. Клинически доступной вакцины против малярии не существует. Кроме того, известно, что Plasmodium falciparum, самый смертоносный малярийный паразит человека, приобрел устойчивость к препарату первой линии под названием артемизинин 2,3,4,5. Существует острая необходимость в определении новых мишеней для лекарств и новых стратегий, которые могут быть быстро развернуты, чтобы избежать распространения устойчивости к артемизинину во всем мире. Лучшее понимание механизма действия лекарственного средства и молекулярной основы компенсаторных путей может помочь в разработке более эффективных стратегий для предотвращения развития лекарственной устойчивости.

Протеинкиназы, принадлежащие к семейству кальций-зависимых протеинкиназ (CDPK), играют решающую роль на многих стадиях развития паразита во время эритроцитарных, половых и преэритроцитарных стадий6. Во время бесполого размножения P. falciparum, CDPK5, как известно, играет решающую роль в выходе мерозоитов из зрелых шизонтов7. Условная делеция CDPK5 не позволяет шизонтам высвобождать мерозоиты в кровоток, что приводит к гибели паразита. Молекулярный механизм CDPK5-опосредованного выхода паразита до конца не изучен и, как полагают, включает протеинкиназу G (PKG) в качестве регулятора 7,8. CDPK7 необходим для созревания паразитов кольцевой стадии до трофозоита9. CDPK4 является еще одним членом семейства CDPK, который имеет решающее значение для развития половой стадии у комаров. Он участвует в нескольких этапах процесса эксфлагелляции и поэтому имеет решающее значение для формирования свободных, подвижных, мужских гамет 10,11,12,13. CDPK1 фосфорилируют компоненты внутреннего мембранного комплекса и ротрии14,15. Кроме того, условная делеция CDPK1 приводит к гипофосфорилированию белков, участвующих во вторжении эритроцитов16. Было показано, что CDPK1 регулирует выделение апикальных органелл в процессе инвазии17. CDPK1 также помогает в выводе мерозоитов из инфицированных эритроцитов путем фосфорилирования протеазы SERA518. Фосфорилированный CDPK1 преимущественно локализуется на апикальном конце мерозоита, где он может взаимодействовать с другими белками паразита, необходимыми для процесса инвазии19,20. CDPK1 также участвует в образовании мужских и женских гамет, что является критическим этапом для передачи малярии и полового развития паразита среди комаров.

Химико-генетический подход исторически использовался для определения функциональных ролей киназ млекопитающих22,23. В подходе используется замена остатка в позиции привратника аминокислотой другой боковой цепи. Изменение остатка привратника модулирует размер соседнего кармана АТФ, что, в свою очередь, изменяет доступность химических соединений, называемых ингибиторами выпуклых киназ (BKI), по отношению к мутантному ферменту по сравнению с диким типом. Замена громоздкого остатка в положении привратника на меньший остаток обеспечивает доступ к БКИ, в то время как обратная замена делает киназу устойчивой к БКИ. В некоторых случаях замена остатка привратника связана со снижением киназной активности фермента-мишени, что делает модификацию непереносимой для функциональных исследований24,25. Негативное влияние замены гейткипера на активность фермента может быть обращено вспять путем генерации мутации-супрессора во втором месте в непереносимой киназе25. Для изучения функции апикомплексанкиназ протеинкиназы был использован химико-генетический подход. CDPK4 дикого типа, содержащий меньший остаток привратника, селективно ингибировался усиленными ингибиторами киназы BKI-1 и 1294, что приводило к блокировке мужского гаметогенеза и развитию ооцисты11,12. Замена небольшого остатка привратника в CDPK4 на объемный остаток метионина приводила к снижению BKI-опосредованного ингибирования при эксфлагелляции11. Было показано, что CDPK1 Toxoplasma gondii, апикомплексного паразита, тесно связанного с малярийным паразитом, участвует в подвижности и инвазии в клетки хозяина тахизоитов 26,27. Меньший карман привратника дикого типа TgCDPK1 был использован для разработки специфических ингибиторов, которые снижают патогенез заболевания в животных моделях28,29. Участие . falciparum Протеинкиназа G (ПКГ) в позднем шизогоническом развитии и образовании гамет была продемонстрирована путем ингибирования активности фермента с помощью специфических фармакологических ингибиторов30,31. Замена треонина в позиции привратника на глутамин (T618Q) значительно снижала чувствительность мутантного фермента к ингибиторам, что приводило к нормальному гаметогенезу и прогрессированию шизонта в кольцо30,31.

В большинстве предыдущих исследований использовался химико-генетический подход для функциональной характеристики целевых киназ 11,12,22,23,26,30,31, однако мы приняли этот подход для понимания развития компенсаторных механизмов у паразитов, которые являются носителями гипоморфного аллеля протеинкиназы. Ранее мы показали, что замена остатка дикого типа в CDPK1 на метионин (T145M) приводит к снижению потенциала трансфосфорилирования мутантного фермента32 на ~ 47%. Мутантный паразит, содержащий гипоморфный аллель cdpk1 (cdpk1t145m), предварительно адаптирован к сниженной активности CDPK1 путем транскрипционной перестройки других членов семейства CDPK. Мы полагаем, что эта стратегия может быть использована в целом для выяснения компенсаторных механизмов у мутантных паразитов, содержащих гипоморфные аллели эссенциальных протеинкиназ. Другие киназы, которые частично компенсируют функцию целевой киназы, могут быть одновременно ингибированы вместе с целевой киназой для предотвращения развития лекарственной устойчивости против отдельных киназ. Это может послужить более эффективной стратегией борьбы с малярией.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. Штамм паразита falciparum (NF54) был получен от Alvaro Molina Cruz 21,32,33. Красные кровяные тельца человека O+, используемые для культивирования паразитов, были получены в Центре крови Ротари, Нью-Дели, Индия. Плазмиды, pL6eGFP и pUF1, были получены от Хосе-Хуана Лопеса-Рубио. DSM267 был получен от Маргарет А. Филлипс и Прадипсинха К. Ратхода. WR99210 была предоставлена фармацевтической компанией Jacobus.

1. Конструирование плазмиды для экспрессии рекомбинантного CDPK1 в Escherichia coli

  1. Сконструируйте пару олигонуклеотидных праймеров для амплификации полного CDS гена cdpk1 (PlasmoDB accession no. PF3D7_0217500) с использованием программного обеспечения для анализа праймеров.
    1. Амплифицируйте полный CDS с помощью ДНК-полимеразы с ген-специфичной олигонуклеотидной парой: Pk1fpgex и Pk1rpgex (см. Таблицу 1) с использованием кДНК, полученной из Plasmodium falciparum , в качестве матрицы в реакционном объеме 20 μл. Установите следующие условия амплификации ПЦР: Начальная денатурация при 98 °C в течение 2 мин, (Денатурация при 98 °C в течение 30 с, Отжиг при 52 °C в течение 20 с, Удлинение при 62 °C в течение 20 с) x 36, окончательное удлинение при 62 °C в течение 10 мин. Храните продукт ПЦР при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  2. Расщепляют 1 г амплифицированного продукта ПЦР и 1 г экспрессирующей плазмиды pGEX4T1 с эндонуклеазами рестрикции BamHI (20 000 Ед/мл) и NotI (20 000 Ед/мл) в течение 3-4 ч при 37 °C в общем объеме реакции 30 мкл.
  3. Чтобы очистить продукт ПЦР двойного расщепления и плазмиду, используйте набор для очистки ПЦР на основе колонки и следуйте инструкциям производителя.
  4. Лигатировать 100 нг дважды переваренной, очищенной плазмиды pGEX4T1 со вставкой в соотношении вектор-вставка молярного отношения 1:5 с использованием 1 мкл ДНК-лигазы Т4 в общем объеме реакции 10 мкл. Инкубировать реакцию лигирования при 16 °C в течение ночи.
  5. Трансформация E. Кишечная палочка DH5α компетентные клетки с лигированной смесью в соответствии с протоколом производителя и планшетом на LB агаровых планшетах, содержащих ампициллин (100 мкг/мл).
  6. Проведите скрининг четырех бактериальных клонов, полученных в результате трансформации, на наличие рекомбинантной плазмиды путем очистки плазмиды с помощью мини-набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя. Подтвердите рекомбинантную плазмиду путем двойного рестрикционного разложения с использованием BamHI и NotI, как описано выше в шаге 1.3.
  7. Дополнительно проверьте клоны, положительные на рестрикцию пищеварения, на наличие правильной последовательности с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру. Трансформация E. Кишечная палочка BLR(DE3) pLysS-компетентные клетки с верифицированной последовательностью плазмидной конструкцией для экспрессии белка CDPK1.

2. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка CDPK1 в кишечной палочке

  1. Экспрессия рекомбинантного CDPK1
    1. Инокулируйте один клон E. Кишечная палочка Штамм BLR(DE3) pLysS, содержащий верифицированную по последовательности плазмидную конструкцию, в 10 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Инкубируют культуру в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200-250 об/мин.
    2. Инокулируйте вторичную культуру 1% от первичной культуры и дайте бактериальным клеткам вырасти до средней логарифмической фазы при 37 °C. Когда оптическая плотность (OD) вторичной культуры достигает 0,7-0,9 при длине волны 600 нм, индуцировать экспрессию полноразмерного рекомбинантного CDPK1 путем добавления 1 мМ изопропил Ο-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и инкубировать в течение 10-12 ч при 24 °C.
    3. После инкубации соберите урожай E. Клетки кишечной палочки путем центрифугирования при 5000 x g в течение 10 мин. Сцедите надосадочную жидкость и задержите клеточную гранулу.
    4. Приготовьте буфер для лизиса со следующим составом: 1 мМ дитиотреитол (DTT), 0,1 мг/мл лизоцима, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 1x коктейль ингибиторов протеазы в фосфатно-солевом буфере (PBS).
    5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в объеме, в 10 раз превышающем массовый объем гранулы буфера для лизиса. Ультразвуком наносите клеточную суспензию в течение 15 мин с интервалом 9 с вкл., 15 с выкл., чтобы предотвратить локализованный нагрев, который может привести к денатурации белка.
    6. Центрифугируйте лизат при 17 000 x g в течение 1 ч и инкубируйте прозрачный надосадочный слой с гранулами глутатиона в течение ночи при 4 °C. Следуйте протоколу, указанному ниже, чтобы получить очищенный рекомбинантный белок CDPK1.
  2. Аффинная хроматография с использованием гранул глутатиона для очистки CDPK1 с меткой GST.
    1. Возьмите 500 мкл полностью ресуспендированных гранул глутатиона на 250 мл бактериальной культуры и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
    2. Промойте шарики 5 мл связующего буфера (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,3) и переверните для перемешивания.
    3. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Повторите промывку и центрифугирование в течение 3-4 раз.
    4. Добавьте шарики в лизат клеток бактерий и инкубируйте в течение 12 ч при температуре 4 °C с легким встряхиванием (20-30 об/мин).
    5. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Надосадочная жидкость может быть сохранена для оценки количества рекомбинантного CDPK1, который остается несвязанным.
    6. Промойте связанные с CDPK1 бусины не менее 5-6 раз PBS, содержащим 1 мМ DTT, а затем промойте 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, pH 7,5.
    7. Сначала 2 раза разбавьте связанный белок 250 мкл элюирующего буфера 1 (EB1), а затем 2 раза 250 мкл элюирующего буфера 2 (EB2). Состав EB1 и EB2 представляет собой 10 мМ восстановленного глутатиона в 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 7,5 и 20 мМ восстановленного глутатиона в 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl и pH 7,5 соответственно.
    8. Инкубируйте связанные с CDPK1 гранулы в элюирующих буферах 1 и 2 при комнатной температуре (RT) в течение 5-10 минут, используя осторожное перемешивание или вращение из конца в конец.
    9. Центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно перенесите надосадочную жидкость, содержащую элюированный рекомбинантный белок CDPK1, в отдельную пробирку.
    10. Повторите шаги 2.2.8 и 2.2.9, чтобы получить по 2 элюя с EB1 и EB2.

3. Сайт-направленный мутагенез для получения рекомбинантных мутантных белков CDPK1

  1. Используйте плазмиду pGEX4T1, содержащую ген cdpk1 с проверенной последовательностью. Мы предпочитаем использовать ту же плазмиду, которая использовалась для трансформации штамма pLysS E . coli BLR(DE3).
  2. Разработайте праймеры для введения мутации привратника в последовательность гена cdpk1 дикого типа. Остаток привратника дикого типа (T145) кодируется кодоном ACC в гене cdpk1 . Замените треониновый привратник мелкими (серин, T145S) и объемными (метионин, T145M) остатками треонина, которые кодируются кодонами AGC и ATG соответственно.
  3. Следуйте приведенным ниже рекомендациям по проектированию прямого и обратного праймеров для сайт-направленного мутагенеза.
    1. Убедитесь, что оба праймера дополняют друг друга. Сохраняйте 15-20 нуклеотидов неизмененной последовательности с обеих сторон мутации. Убедитесь, что Tm находится в диапазоне от 50 °C до 55 °C для последовательности, исключая мутировавший сайт.
  4. Используйте набор site-directed mutagenesis для генерации мутантных конструкций привратника cdpk1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы ввести нужную мутацию. Праймеры, используемые для сайт-направленного мутагенеза, перечислены в таблице 1.
  5. Обработайте реакционную смесь ферментом 0,5 мкл DpnI (20 000 Ед/мл) для расщепления исходной, метилированной плазмиды. Инкубировать реакционную смесь при 37 °C в течение 3 ч. Преобразовать компетентные клетки E. coli DH5α с помощью реакционной смеси, обработанной DpnI.
  6. Скрининг четырех клонов каждой из плазмидных конструкций T145M и T145S для проверки введения желаемой мутации в последовательность гена cdpk1 с помощью секвенирования ДНК.
  7. Трансформируйте верифицированные плазмиды в штамме E. coli BLR(DE3) pLysS для экспрессии рекомбинантных белков CDPK1 T145M/S, как описано на шаге 1.5.
  8. Экспрессируйте и очищайте мутантные белки CDPK1, следуя шагам, описанным в разделе 2 для белка CDPK1 дикого типа.

4. Анализ активности CDPK1 in vitro

Примечание: Киназная активность рекомбинантного CDPK1 дикого типа и мутантных белков привратника оценивается с помощью подхода к мечению полусинтетических эпитопов, описанного в Allen et al.34.

  1. Инкубировать 50 нг рекомбинантного белка в буфере, содержащем 50 мМ Tris, 50 мМ MgCl2, 1x коктейль ингибитора фосфатов с 2 мкг основного белка миелина (MBP) в качестве экзогенного субстрата CDPK1 в общей реакционной смеси 50 мкл.
  2. В зависимости от условий, требующих наличия или отсутствия кальция, добавляют CaCl2 или EGTA, соответственно, чтобы получить конечную концентрацию 2,5 мМ каждого в буфере для киназного анализа. Добавьте ATPγS до конечной концентрации 100 мкМ в буфер, чтобы использовать его в качестве источника переносимой терминальной фосфатной группы.
  3. Инкубировать реакционную смесь при 30 °С на водяной бане в течение 1 ч с последующим прекращением реакции добавлением 5 мМ EGTA. Добавьте 5 мкл 50 мМ-нитробензилмезилата (PNBM) в реакционную смесь и дайте ей инкубироваться при 20 °C на водяной бане в течение 2 ч для алкилирования фосфорилированных остатков серина и треонина в трансфосфорилировании MBP и аутофосфорилированном CDPK1.
  4. К общим 55 мкл реакционной смеси добавьте 19 мкл 4x буфера для образцов SDS и нагревайте при 95 °C в течение 5 минут.

5. Вестерн-блоттинг для выявления тиофосфорилированных продуктов in vitro киназного анализа

  1. Приготовьте 12% гель SDS-PAGE и загрузите по 15 мкл каждого образца. Разделите реакционную смесь, чтобы визуализировать аутофосфорилированный CDPK1 и трансфосфорилированный MBP.
  2. Перенос отделенных белков из геля SDS-PAGE на мембрану PVDF с использованием метода влажного переноса32.
  3. Блокируйте неспецифические участки на мембране PVDF, инкубируя ее с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном физрастворе (20 мМ Tris-HCL, pH 7,5, 150 мМ NaCl), содержащем 0,05% Tween 20, в течение 1 ч в режиме ЛТ.
  4. Инкубируйте мембрану PVDF с первичным антителом кролика против алкилированных тиофосфорилированных аддуктов в соотношении 1:2500 в течение ночи при 4 °C в блокирующем буфере.
  5. После ночной инкубации промойте блотку 3 раза с Трис-буферным физиологическим раствором с 0,05% Tween 20 в течение 10 минут каждая.
  6. Далее инкубируют блот с козьим вторичным антителом против кролика в блокирующем буфере в разведении 1:5000 в течение 1 ч в режиме ЛТ, а затем промывают трис-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween 20.
  7. Блотку наложить на хемилюминесцентную подложку, смешав равные пропорции раствора А и раствора Б согласно инструкции производителя и экспонировать на рентгеновской пленке в темном помещении для получения сигналов аутофосфорилирования CDPK1 и трансфосфорилирования МБП.

6. Клонирование направляющей последовательности для нацеливания налокусcdpk1 для введения замены привратника  

Направляющая последовательность из 20 нуклеотидов была выбрана путем ручного курирования и клонирована в плазмиду pL6eGFP в сайте BtgZI с использованием следующих этапов.

  1. Расщепление pL6eGFP с помощью фермента BtgZI
    1. Расщепляют 1 г плазмиды pL6eGFP35 с 1 мкл фермента BtgZI (5000 ЕД/мл) в течение 4 ч при 60 °C в реакционной смеси объемом 20 мкл, следуя протоколу производителя фермента для условий реакции.
    2. После 4-часового инкубационного периода пропустите расщепленную плазмиду на 1% агарозном геле и вырежьте кусочек геля (~ 9,8 kb), содержащий расщепленную плазмиду. Очистите расваренную плазмиду с помощью набора для экстракции геля на основе колонн в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Отжиг олигопластов
    1. Восстановите олигонуклеотиды (Ck1GUIDEFWD и Ck1GUIDEREV) в воде, не содержащей ДНКазы/РНКазы, для приготовления стокового раствора с концентрацией 100 мкМ.
    2. Соедините 20 мкМ каждого олигонуклеотида в растворе, содержащем 10 мМ Трис (pH 8,0), 50 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА. Выдержать смесь при температуре 95 °C в сухой бане в течение 5 минут и дать реакции остыть до комнатной температуры. Обычно требуется 1 ч, чтобы температура реакционной смеси достигла RT.
    3. Разбавляют отожженные олигонуклеотиды до 0,5 мкМ при Трис рН 8,0, в результате чего общий объем реакционной смеси составляет 100 мкл.
  3. Реакция синтеза
    1. Смешайте 1,5 мкл разбавленных олигонуклеотидов со 100 нг линеаризованной плазмиды, расщепленной BtgZI в 5x ферментном премиксе In-Fusion в общем объеме реакции 10 мкл для получения проводника CDPK1, содержащего плазмиду pL6CK1G.
    2. Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при 50 °C. Храните реакцию при температуре 4 °C до тех пор, пока не начнется преобразование E. кишечная палочка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения реакционную смесь можно хранить при температуре -20 °C.
  4. Трансформация Е. Кишечная палочка Звездные компетентные клетки
    1. Добавьте 2,5 мкл реакционной смеси в Е. Кишечная палочка Звездные компетентные клетки и приступают к процессу трансформации в соответствии с протоколом производителя.
    2. Поместите трансформированные компетентные клетки на пластину с ампициллином LB (100 мкг/мл) и дайте трансформированным бактериям вырасти при 37 °C в течение ночи.
    3. Выберите трансформированные колонии и извлеките плазмиду с помощью коммерчески доступного набора для мини-подготовки плазмид. Следуйте инструкциям производителя по очистке плазмид. Валидация введения проводника в плазмиду с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру.

7. Клонирование группы гомологии для репарации локуса cdpk1, ограниченного эндонуклеазой Cas9

Примечание: Гомологическое плечо, содержащее SNP, которые должны быть введены в целевой локус, коммерчески синтезировано. Обычно мы берем плечо гомологии длиной 400-1000.о. Плечо гомологии содержит молчаливые мутации в области направляющей РНК и PAM, чтобы предотвратить повторное разрезание модифицированного локуса после включения желаемых SNP. Плечо гомологии (соответствующее нуклеотидам с 133 по 553 CDPK1), включающее мутацию Met или Ser gatekeeper и тихие мутации, окружено сайтами рестрикции AflII и SpeI.

  1. Дважды расщепляют 1 мкг pL6CK1G и плазмиду, содержащую гомологическое плечо, с использованием по 0,5 мкл ферментов рестрикции AflII (20 000 Ед/мл) и SpeI (20 000 Ед/мл) в течение 4 ч при 37 °C в реакционной смеси объемом 20 мкл.
  2. Проведите полную реакцию дважды расщепленных плазмид на 1,5 % агарозном геле и очистите полосы, соответствующие плечу гомологии и плазмидному остову pL6CK1, используя набор для экстракции геля, следуя инструкциям производителя.
  3. Лигируйте расваренную гомологическую группу 100 нг плазмиды pL6CK1 в соотношении вектор к вставке 1:5 в общем объеме реакции 10 мкл с использованием ДНК-лигазы T4. Инкубируйте реакцию лигирования в течение ночи при 16 °C. Трансформируйте компетентные клетки E. coli DH5α полной смесью лигирования в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Поместите трансформированные клетки на агаровые планшеты LB, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) для выбора положительных трансформантов. Выберите одиночные колонии из ампициллиновой пластины LB и очистите плазмиду с помощью набора для экстракции плазмид.
  5. Подтвердите наличие у клона группы гомологии путем расщепления очищенной плазмиды ферментами AflII и SpeI с использованием тех же условий переваривания, которые описаны в шаге 7.3. Подтвердите клоны с положительным двойным пищеварением с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру для валидации полной последовательности группы гомологии.

8. Очистка плазмид pL6CK1Met, pL6CK1Ser и pUF1 для трансфекции малярийных паразитов

  1. Всадить 5 мл первичных культур верифицированных по методу секвенирования клонов pL6CK1Met, pL6CK1Ser и pUF1 в LB-среды, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать в течение 10 ч. Перенесите первичную культуру во вторичную культуру в соотношении 1:1000 и инкубируйте еще 12 ч.
  2. Гранулируйте бактериальную культуру центрифугированием при давлении 5000 x g в течение 10 минут в бутылке для центрифуги.
  3. Изолируйте плазмиды с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с протоколом производителя. Растворите плазмидную ДНК в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы, для прямой трансфекции паразита.

9. Культивирование in vitro Plasmodium falciparum и синхронизация сорбита для трансфекции

Примечание: Культуру P. falciparum in vitro в эритроцитах человека (эритроцитах) проводят в соответствии с методом, описанным Trager и Jensen36.

  1. Пропагандируют штамм NF54 P. falciparum путем культивирования в О+ эритроцитах человека с гематокритом 2% в полной среде RPMI (cRPMI), содержащей RPMI 1640 с добавлением L-глутамина, 25 мМ HEPES, 25 мМ бикарбоната натрия и 50 мкг/мл гипоксантина. Добавьте в среду 0,5 % AlbuMAX II и 10 мкг/мл гентамицина и поддерживайте культуру при температуре 37 °C в атмосфере 5%O2, 5%CO2 и 90%N2.
  2. Для синхронизации сорбита с получением кольцевой стадии паразита гранулируйте асинхронных паразитов в конической пробирке объемом 50 мл путем центрифугирования при 2300 x g в течение 3 минут в режиме РТ. Выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Инкубировать паразитированные эритроциты с 9 объемами 5% сорбита в течение 10 мин при 37 °С. После инкубации гранулируйте эритроциты центрифугированием при давлении 2300 x g в течение 3 минут и выбросьте сорбит.
  4. Обработанных сорбитом паразитов промывают неполными РПМИ, иРПМИ (среды РПМИ без альбумакса и бикарбоната натрия) и затем инкубируют их в сРПМИ. Используйте кольцевую стадию паразитов в следующем цикле для трансфекции плазмид.

10. Трансфекция кольцевой стадии паразита плазмидами pL6CK1Met, pL6CK1Ser и pUF1

Примечание: Для прямой трансфекции кольцевых паразитов плазмидной ДНК используются следующие этапы.

  1. Приготовьте 2x цитомиксный буфер37 , растворив в 30 мл воды, 240 мМ KCl, 0,3 мМ CaCl2, 4 мМ EGTA, 10 мМ MgCl2, 20 мМ K2HPO4/KH2PO4 и 50 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,6. Отрегулируйте итоговый объем до 50 мл. Фильтр простерилизовать буфер с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Затем разбавьте 2-кратный цитомиксный буфер стерильной водой, чтобы получить 1-кратный цитомиксный буфер.
  2. В стерильную коническую пробирку объемом 15 мл добавьте 100 мкл упакованных кольцевых паразитированных эритроцитов и промойте их 2 раза 5 мл 1x цитомиксного буфера. Выполните промывку центрифугированием при 994 x g в течение 3 минут при RT.
  3. После промывки удалите буфер и добавьте по 50 мкг каждой плазмиды (pL6CK1Met/pUF1 для генерации мутации T145M и pL6CK1Ser/pUF1 для генерации мутации T145S) в упакованные паразитированные эритроциты. Затем добавьте 2x буфер в соответствии с объемом плазмиды и отрегулируйте объем до 400 мкл с 1x концентрацией буфера.
  4. Перелейте 400 мкл вышеуказанного раствора в кюветы по 0,2 см для каждой трансфекции. Электропорировать при следующих условиях: 0,31 кВ, 950 μF и сопротивление, установленное на Infinite.
  5. После электропорации удалите трансфицированных паразитов из кюветы, смешайте их с cRPMI и переложите в колбу T25 общим объемом 15 мл. Инкубируйте паразитов в течение 2 ч в условиях, указанных в пункте 9.1.
  6. После инкубации перенесите трансфицированных паразитов в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 994 x g в течение 3 минут. Удалите надосадочную жидкость и промойте паразитов 10 мл неполного РПМИ. Заквашивайте их свежим cRPMI в течение 2 дней, пополняя питательную среду через 24 ч.
  7. Через 48 ч извлеките cRPMI из каждой колбы и повторно суспендируйте культуру в cRPMI, содержащую 2 нМ WR99210 и 150 нМ DSM26738. Затем переложите культуру в колбу T75, добавив 400 μл свежих эритроцитов. Ежедневно пополняйте среду cRPMI, содержащим WR99210 и DSM267, в течение 7 дней. В дальнейшем добавляйте cRPMI, содержащий оба препарата, через день до 14 дня после трансфекции.
  8. На 14-е сутки аликвот 200 мкл трансфицированной культуры в 1,5 мл микроцентрифужной пробирки (МСТ) для приготовления предметного стекла. Гранулируйте клетки центрифугированием при 500 x g в течение 5 минут в режиме RT. Отсадите надосадочную жидкость и перенесите клетки на предметное стекло. Сделайте мазок с помощью другого предметного стекла, расположив его под углом 45°.
  9. Закрепите предметное стекло в метаноле и приготовьте пятно Гимзы, разбавив его в соотношении 1:10 в сверхчистой воде. Затем испачкайте предметное стекло, полностью погрузив его в морилку Giemsa на 20 минут. Промойте горку под проточной водой и тщательно просушите ее. Затем понаблюдайте за предметным стеклом под световым микроскопом при 100-кратном увеличении, нанеся иммерсионное масло.
  10. Как только паразиты будут визуализированы, ежедневно пополняйте среду и дайте им расти в течение 2-3 дней. Затем удалите паразитов, чтобы проверить желаемое изменение в последовательности гена-мишени в целевом локусе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если паразиты не видны на 14-й день, пополните среду (содержащую оба препарата) через 4 дня. Разрежьте паразита на 30% и добавляйте свежую кровь для поддержания 2% гематокрита каждые 7 дней, пока паразиты не появятся снова.

11. ПЦР-верификация трансгенного паразита с желаемой модификацией локуса cdpk1

  1. Через 2-3 дня роста паразита выньте 500 мкл культуры и перенесите ее в 1,5 мл MCT.
  2. Гранулируйте клетки центрифугированием при концентрации 2 400 x g в течение 5 минут. Затем лизируют эритроциты путем обработки сапонином.
    1. Для обработки сапонином добавьте 10 μл 10% раствора сапонина в 1 мл ресуспендированной гранулы паразита и выдержите при температуре 4 °C в течение 5 минут. Центрифугируйте клетки при давлении 2 400 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока покраснение не исчезнет полностью и не получится гранула паразитов черного цвета.
  3. Промойте гранулу от паразита 1 мл 1x PBS центрифугированием при 2 400 х г в течение 5 минут. После этого повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы. Нагрейте ресуспендированную гранулу паразита при 95 °C в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при 16 200 x g в течение 10 минут при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую ДНК паразита, в свежую пробирку.
  4. Используйте вышеуказанный генетический материал для ПЦР-амплификации полноразмерного гена с использованием набора праймеров ck1f1 и ck1r3wt (см. Таблицу 1), в частности, нацеливаясь на область за пределами группы гомологии, как описано выше на шаге 1.2. Секвенирование области гомологии, содержащей мутацию T145M, с помощью праймера ck1f1 .

12. Предельное разведение для получения клональных трансгенных паразитов

  1. После проверки последовательности разведите трансфицированную культуру паразита до достижения конечной концентрации 1 паразита на 200 мкл. Затем добавьте 100 мкл разбавленной культуры в лунки 96-луночного планшета для культивирования тканей. Выполните следующие шаги (12.2-12.4) для получения 1 паразита/200 μл.
  2. Приготовьте 10 мл паразитированных эритроцитов с 2% гематокритом. Оцените процент паразитемии культуры с помощью описанного выше метода окрашивания по Гимзе. Затем подсчитайте общее количество эритроцитов в разведенной культуре 1:100 с помощью гемоцитометра.
    Общее количество эритроцитов/мл = Среднее количество подсчитанных эритроцитов x Коэффициент разбавления x 104
    Количество паразитированных эритроцитов/мл = (процент паразитемии x общее количество эритроцитов/мл)/100
  3. Приготовьте разведение паразитированных эритроцитов в соотношении 1:10 000 путем последовательного разбавления исходной культуры в 2 раза (каждое разведение в соотношении 1:100).
  4. Добавьте соответствующий объем (в микролитрах) из разведенной культуры, чтобы получить в общей сложности 50 паразитов в 10 мл среды, обеспечивая 2% гематокрита. Затем добавьте 100 мкл среды, содержащей 50 паразитов, в каждую лунку 96-луночного планшета. Поместите планшет в герметичный секадор, промытый газовой смесью (состав, описанный выше в пункте 9.1) и инкубируйте при температуре 37 °C. Заменяйте носитель каждые 2 дня.
  5. Замените среду на cRPMI, содержащую 2% гематокрита, каждые7-й день до появления паразитов.
    1. Наклоните 96-луночный планшет под углом 45° и дайте эритроцитам осесть. С помощью серологической пипетки осторожно удалите среду из каждой лунки и наблюдайте изменение цвета на желтый в лунках, содержащих паразитов, контрастирующий с розовым цветом среды в лунках, свободных от паразитов. Такое изменение цвета происходит из-за того, что паразиты подкисляют среду.
  6. После наблюдения за изменением цвета выньте небольшое количество культуры из лунки, проявляющей изменение цвета, и приготовьте мазок на предметном стекле, пометив его номером, соответствующим положению лунки. Окрасьте предметное стекло морилкой Гимзы и понаблюдайте за ним под микроскопом, как описано выше.
  7. Переложите содержимое лунки в колбу Т25, где под микроскопом наблюдались паразиты. Дайте паразитам расти в колбе Т25 в течение 4-5 дней и пополняйте среду через день.
  8. Как только паразитемия достигнет 2-3%, извлеките 500 мкл культуры паразита. Затем сапонин-лизируют эритроциты и приступают к извлечению генетического материала паразита методом, описанным в разделе 11.
  9. Для подтверждения генерации клональных трансгенных паразитов необходимо настроить реакцию ПЦР, как описано выше в шаге 1.1.1 и отправить продукт ПЦР на секвенирование ДНК для подтверждения введения желаемых SNP в целевой локус.

13. Анализ транскриптов с помощью ПЦР в реальном времени

  1. Перколл/Сорбит очистка и синхронизация паразитов
    1. Приготовьте градиент Перколла/сорбита 39,40 путем последовательного наслоения по 3 мл каждого по 70% с последующим добавлением 40% растворов перколла/сорбита в коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Аккуратно нанесите 1-2 мл культуры паразита, содержащей преимущественно паразита стадии шизонта WT и CDPK1 T145M, поверх градиента.
    3. Центрифугируйте градиент при 2 300 x g в течение 15 мин при RT, используя замедление, установленное на 4 в центрифуге в качающемся роторе ведра.
    4. Соберите среднее кольцо, содержащее трофозоитную и шизонтную стадии паразита, из границы раздела градиента в свежую коническую пробирку объемом 50 мл.
    5. Промойте паразитов, добавив равный объем 9:1 (cRPMI: 10xPBS), затем центрифугируйте при 994 x g в течение 3 минут, чтобы гранулировать паразитов.
    6. Снова промойте гранулу раствором 19:1 (cRPMI: 10xPBS), затем центрифугируйте при 994 x g в течение 3 минут.
    7. Добавьте каждую гранулу от паразита в отдельные колбы, содержащие cRPMI с 2% гематокритом (предварительно инкубированный при 37 °C). Инкубируйте колбы в течение 4 ч в условиях, описанных выше на шаге 9.1, чтобы обеспечить инвазию мерозоитов из обогащенных шизонтов в свежие эритроциты.
    8. Через 4 ч обрабатывают паразитов сорбитом, как описано выше на этапах 9.2-9.4 для получения высокосинхронизированных 0 - 4 ч кольцевой стадии паразитов.
    9. Инкубируйте синхронизированных паразитов в течение 44 ч после обработки сорбитом до 44 - 48 ч шизонтной стадии паразита.
  2. Выделение РНК из шизонтов паразитов WT и CDPK1 T145M
    1. Соберите паразитов WT и CDPK1 T145M через 44-48 ч после инвазии. Промойте гранулы от паразитов 1x PBS при 994 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    2. Повторно суспендируйте гранулы паразита в 1 мл 1x PBS и обработайте их сапонином для лизирования окружающих эритроцитов, как описано в шаге 11.2.1.
    3. Суспендируйте гранулу паразита в 1 мл реагента для экстракции РНК и храните при -80 °C до дальнейшей обработки.
    4. Замороженную гранулу разморозьте при 15-30 °C для полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов.
    5. Добавьте 200 мкл хлороформа на мл реагента для экстракции РНК и энергично встряхивайте пробирки вручную в течение 15 с. Инкубировать при RT в течение 2-3 минут.
    6. Центрифугируйте смесь при давлении 16 200 x g в течение 15 мин при 4 °C. РНК остается исключительно в бесцветном верхнем водном слое. Выделите РНК с помощью набора в соответствии с инструкцией производителя.
  3. Синтез кДНК из РНК паразита WT и CDPK1 T145M
    1. Обрабатывайте образцы, содержащие РНК, с помощью набора для удаления ДНК, следуя инструкциям производителя по удалению загрязняющей ДНК.
    2. Синтезируйте кДНК из выделенных образцов РНК с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с протоколом производителя. Мы используем случайные гексамерные праймеры для процесса обратной транскрипции вместо олиго-dT-праймеров.
    3. Убедитесь, что NO-RT (реакции, настроенные без добавления фермента обратной транскриптазы) контролируется для каждого образца РНК, используемого для получения кДНК, чтобы исключить перенос геномного загрязнения ДНК из очищенной РНК во время подготовки кДНК.
    4. Проверьте кДНК путем амплификации любого сегмента гена, содержащего промежуточную интронную последовательность, например, полноразмерный ген cdpk1 , чтобы исключить загрязнение геномной ДНК. Используйте условие ПЦР, как описано в шаге 1.1.1.
  4. Анализ экспрессии транскриптов паразита WT и CDPK1 T145M
    1. Используйте кДНК, полученную из паразитов WT и CDPK1 T145M, для проведения анализа экспрессии транскриптов 11 различных генов с помощью ПЦР в реальном времени. 11 генов-мишеней включают 7 членов семейства CDPK и 4 киназы, участвующие в инвазии эритроцитов (см. Таблицу 2 для генов и соответствующих праймеров, используемых для ПЦР в реальном времени).
    2. Проектируйте праймеры с помощью программного обеспечения для синтеза праймеров. Амплифицируйте примерно 120.о. каждого выбранного гена с помощью ген-специфичных праймеров с аналогичными температурами плавления.
    3. Амплифицируйте гены-мишени с помощью предварительного смешивания и запустите планшет на системе ПЦР в реальном времени с использованием следующих параметров цикла: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин с последующим 40 циклами денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг при 52 °C в течение 20 с и удлинение при 62 °C в течение 30 с.
    4. Нормализуйте уровень экспрессии каждого гена с помощью двух хозяйственных генов: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и треонин-тРНК-лигазы (ThrRS)32. Рассчитайте относительную экспрессию каждой целевой киназы у паразита CDPK1 T145M по сравнению с контролем WT.
    5. Выполните статистический анализ с помощью пакета статистического анализа R. В качестве альтернативы можно использовать любое другое программное обеспечение для анализа.
      Глобальные методы транскриптомики, такие как RNA-Seq или микрочипы, являются превосходными подходами для получения более широкого представления о перестройке транскриптома у мутантных паразитов по сравнению с WT.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантный WT CDPK1 экспрессируется в виде гибридного белка с N-концевой меткой глутатион-S-трансферазы (GST) и очищается с помощью аффинной хроматографии GST. Очищенный белок CDPK1 был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против CDPK1 и анти-GST (рис. 1). Остаток треонина (T145) в WT CDPK1 был заменен на Met и Ser с использованием сайт-направленного мутагенеза для получения CDPK1T145M и CDPK1T145S мутантных рекомбинантных белков соответственно (рис. 2). Был проведен анализ киназы in vitro для оценки киназной активности всех рекомбинантных белков CDPK1. Активность киназы проверяли с использованием подхода34 к мечению полусинтетических эпитопов путем детектирования группы эфиров тиофосфата с использованием специфического антитела в формате вестерн-блоттинга (фиг.3). Влияние замены гейткипера на активность аутофосфорилирования CDPK1 и трансфосфорилирование MBP, используемого в качестве экзогенного субстрата CDPK1, оценивали путем количественной оценки интенсивности соответствующих полос аутофосфорилирования и трансфосфорилирования. Мутантный CDPK1 с метиониновым гейткипером сохранял ~ 53% активности трансфосфорилирования, в то время как присутствие серина в позиции гейткипера приводило к полной отмене субстратного трансфосфорилирования (рис. 3). SNP, приводящие к замене гейткипера с Thr на Met (T145M), были сконструированы в эндогенном локусе cdpk1 через CRISPR-Cas9 с использованием двухплазмидной системы (рис. 4 и рис. 5). Мутантные паразиты с заменой T145S не могли быть сгенерированы, возможно, из-за летального влияния привратника Ser на активность CDPK1. Мутантные паразиты CDPK1T145M были субклонированы с использованием метода предельного разведения, а замена привратника была подтверждена с помощью секвенирования по Сэнгеру для верификации генерации CDPK1T145M мутантного паразита. Уровни транскриптов 11 различных киназ, включая 7 членов семейства CDPK и 4 других киназ, участвующих в позднем шизогоническом развитии паразита, были проверены с помощью ПЦР в реальном времени (рис. 6). Сравнивали уровни экспрессии 11 различных киназ между CDPK1T145M мутантными паразитами и паразитами дикого типа (WT), нормализованными к домашним генам. Экспрессия транскриптов членов семейства CDPK была изменена у CDPK1T145M мутанта по сравнению с паразитом WT (рис. 6). Транскрипты, демонстрирующие более высокую экспрессию у CDPK1T145M мутанта, могут компенсировать функцию CDPK1 у CDPK1T145M мутантного паразита.

figure-results-1
Рисунок 1: Характеристика полноразмерного рекомбинантного дикого типа (WT) PfCDPK1. Полноразмерный белок WT CDPK1, слитый с N-концевой меткой глутатион-S-трансферазы (GST), очищали с помощью аффинной хроматографии и разделяли на 10% SDS-PAGE. CDPK1 мигрировал на предсказанную молекулярную массу ~ 87 кДа, как показано в окрашенном полиакриламидном геле Coomassie Brilliant Blue R-250. Рекомбинантный белок, выделенный на SDS-PAGE, переносили на мембрану PVDF и обрабатывали для вестерн-блоттинга антителами против CDPK1 и против GST. С обоими антителами была обнаружена полоса, соответствующая полноразмерному рекомбинантному CDPK1 на SDS-PAGE, что подтвердило идентичность белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Характеристика очищенных рекомбинантных мутантных белков CDPK1 . (A) Выравнивание первичной аминокислотной последовательности TgCDPK1 и PfCDPK1 (Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). Треонин в положении 145 PfCDPK1 соответствует глицину 128, положению привратника в TgCDPK1 (выделено красным). (B) Карикатуристическое изображение остатка привратника (выделено красным), закодированного триплетным кодоном ACC (черный круг) в WT CDPK1. Замещение остатка привратника путем сайт-направленного мутагенеза для получения рекомбинантных мутантных белков CDPK1 с Met (выделено желтым цветом) в CDPKT145M и Ser (выделено синим) в CDPKT145S. (C) SDS-PAGE профиль рекомбинантных WT и мутантных белков CDPK1. Рекомбинантные белки WT и мутантные белки гейткипера очищали с помощью аффинной хроматографии GST и разделяли на SDS-PAGE. Все рекомбинантные белки соответствуют ожидаемой молекулярной массе ~87 кДа. М- молекулярно-массовая лестница. (D) Характеристика рекомбинантного CDPK1 WT и мутантных белков с помощью вестерн-блоттинга. Рекомбинантные WT и мутантные белки CDPK1 были разделены на SDS-PAGE и перенесены на мембрану PVDF для вестерн-блоттинга. Были обнаружены полосы, соответствующие полноразмерным рекомбинантным белкам WT и мутантным белкам CDPK1 на SDS-PAGE с антителами против CDPK1 и против GST, что подтвердило идентичность всех рекомбинантных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Замена привратника в CDPK1 приводит к снижению киназной активности мутантных ферментов. (A) Карикатуристическое представление подхода к мечению полусинтетических эпитопов для определения киназной активности белка CDPK1. Здесь изображена только активность трансфосфорилирования. Белок CDPK1 тиофосфорилирует экзогенный субстрат (S, сплошной зеленый квадрат) в присутствии ATPγS (сплошной желтый треугольник), источника переносимой терминальной тиофосфатной группы). Тиофосфорилированный остаток алкилируется обработкой-нитробензилмезилатом (PNBM), образуя сложный эфир тиофосфата, который затем детектируется антителом, специфически распознающим алкилированный аддукт тиофосфата. (B) Анализ активности киназы in vitro с использованием метода полусинтетического мечения эпитопов был использован для проверки влияния замены привратника на потенциал аутофосфорилирования и трансфосфорилирования рекомбинантных мутантных белков CDPK1. Все рекомбинантные белки проявляют кальций-зависимую киназную активность. Аутофосфорилирование CDPK1 и трансфосфорилирование основного белка миелина (MBP), экзогенного субстрата, было обнаружено только в присутствии хлорида кальция (Ca2+), в то время как фосфорилирование не было обнаружено в присутствии EGTA, специфического хелатора ионов Ca2+ . Мутанты гейткипера демонстрируют сниженную активность аутофосфорилирования, в то время как трансфосфорилирование ПМБ было полностью отменено в CDPK1T145S. CDPK1T145M сохраняет потенциал трансфосфорилирования (~ 53 %), как сообщалось ранее32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Конструирование плазмид для введения SNP в позицию привратника в локусе cdpk1 с использованием CRISPR-Cas9. Направляющая последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующих 432-451.о., была клонирована в сайт рестрикции BtgZI в плазмиде pL6eGFP для получения pL6CK1G. Гомологическая группа (421.н.), включающая желаемые SNP (T145M или T145S, соответствующий кодон показан зеленым цветом) вместе с мутациями щита (показаны красным), была клонирована в pL6CK1G в пределах сайтов фермента рестрикции AflII и SpeI для получения pL6CK1GT145M и pL6CK1GT145M соответственно. Щитовые мутации препятствуют повторному вырезанию модифицированного локуса после желаемого редактирования. Эндонуклеаза Cas9, кодируемая во второй плазмиде, pUF1, направляется к сайту-мишени в пределах локуса cdpk1 с помощью направляющей РНК, экспрессируемой из плазмиды pL6CK1GT145M/S . Cas9 вводит двухцепочечный разрыв в целевом участке ближе к 5'-стороне последовательности PAM. DSB восстанавливается с помощью плеча гомологии в плазмиде pL6CK1GT145M/S . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Схематическое изображение . Трансфекция falciparum плазмидами CRISPR для введения мутации gatekeeper (T145M) в локус cdpk1. i) Асинхронный. Культуру falciparum обрабатывают сорбитом для получения синхронизированных кольцевых стадий паразитов. ii) Синхронизированные кольцевые паразиты забираются в электропорационную кювету вместе с плазмидами pL6CK1G, T145M/S и pUF1, ресуспендированными в буферном растворе. iii) Паразиты подвергаются электропорации при напряжении 310 вольт, 950 μF и бесконечном сопротивлении. iv) После трансфекции паразитов переносят в колбу T25, содержащую свежую полную среду RPMI (cRPMI), и культивируют в течение 48 часов. Через 48 ч трансфицированных паразитов переключают на cRPMI с добавлением препаратов WR99210 и DSM267 и расширяют в колбе T75. v) На 14-й день подготавливаются предметные стекла и окрашиваются морилкой Giemsa. vi) Впоследствии мазок крови визуализируется под световым микроскопом для оценки наличия паразитированных эритроцитов. vii) После визуализации паразитам позволяют расти в присутствии лекарственных препаратов. Впоследствии паразитов обрабатывают для получения матрицы для ПЦР и секвенирования ДНК для верификации желаемой модификации целевого локуса cdpk1. viii) После проверки клональные трансгенные паразиты получают путем установки предельного разведения в 96-луночном планшете. ix) Клональные трансгенные паразиты из положительных лунок переносятся в колбы T25 и позволяют им расти. x) Клональные трансгенные паразиты дополнительно проверяются с помощью ПЦР и наличия желаемых SNP на позиции привратника путем секвенирования ДНК и анализа хроматограммы. Цифра изменена с32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Схематическое изображение этапов, используемых для анализа транскриптов генов-мишеней с помощью ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (ОТ-ПЦР). i) P. Культуру falciparum с преимущественно зрелыми паразитами стадии шизонта получают путем обработки сорбитом в том же цикле. ii) Паразиты аккуратно наслаиваются на градиент 70/40 перколл/сорбит в конической пробирке объемом 15 мл для обогащения зрелых паразитов стадии шизонта. iii) Кольцо черного цвета на межфазном уровне 40 % и 70 % персоникал/сорбита переносят в свежую пробирку объемом 50 мл, обрабатывают и ресуспендируют в cRPMI. Паразиты, обогащенные на стадии шизонта, инкубируются со свежими эритроцитами, предварительно инкубированными при 37 °C для инвазии. iv) Паразитов культивируют в течение 4 ч, а затем обрабатывают 5 % сорбитом для получения высокосинхронизированных 0-4 ч кольцевых стадий паразитов. v) Паразитов дополнительно культивируют для дополнительной обработки через 44 ч после сорбита для получения высокосинхронизированных 44-48 ч стадий шизонта. vi) Синхронизированных паразитов обрабатывают сапонином для высвобождения из эритроцитов и хранят в реагенте для экстракции РНК. Общая РНК выделяется из выделения РНК ресуспендированных паразитов. vii) кДНК получают из выделенной РНК. viii) Проводится эксперимент ПЦР в реальном времени с матрицей кДНК для амплификации генов-мишеней с использованием ген-специфичных праймеров. Планшет запускается на системе ПЦР в реальном времени. ix) Данные экспрессии транскрипта анализируются с помощью аналитического программного обеспечения. На графике представлены дифференциальные уровни экспрессии транскриптов 11 киназ у паразитов CDPK1 T145M по сравнению с диким типом (WT). Эта цифра изменена с32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Название генаПоследовательность праймеров
Pk1fpgexATGCGCGGATCCATGGGGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgexATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATCACAAATTTTTTGTGCATC
СК1Т145СGTTTGATGTTTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTTTAGTAAGCGAATTTTATTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145MGTTTGATGTTTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTTTTATTATTTAGTAATGGAATTTTATTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWDTAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTTTAGAGTAGA
Ck1GUIDEREVTTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATATACTTA
CK1f1 ATTTTCTTCTGAACGTGTAACATG
CK1R3WTTGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Таблица 1: Список праймеров, использованных в исследовании.

Имя генаФорвард ПраймерОбратный праймер
CDPK1 (PF3D7_0217500)GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATCATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)GGAACAGGAGAATTTACAACGACTGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGGCAGCGTCCATTGTAAG
ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)ATACTTCTCTCAGGGTGCCCCTTATCACTAATTTTTTT
GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAGTATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCGATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)AGTCCTAAAAAAGATATA
TAAAGAACTAGGTAGTAG		ТТТААААААТКТКТКТКТККККАЧК
ПКА (PF3D7_0934800)AATCATCCATTTTGTAAATTTACATGGCTTTTGTTTCTCTCTTAAA
AATGTAAAAAATTCTCC
ПКГ (PF3D7_1436600)АААГГГААТГААААААААААААААГГКCATATCAATATCTCTGAAAGCTTCCC
ПКБ (PF3D7_1246900)CACAATAGAAATGATGTTCTTTTTTTTACGGAGAGCGCAATTAGCCATATTG
ПИ3К (PF3D7_0515300)CCCCTTCAATTTGTTTTTGAAACAGATCACATTTGTTATACTT
ATTATCATCACATTTTTT
ГАПДХ (PF3D7_1462800)GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGGGGTTACCTCACATGG
ТрРС (PF3D7_1126000)CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTTTAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

Таблица 2: Список генов-мишеней (идентификационный номер PlasmoDB) вместе с последовательностью праймеров, используемых для ПЦР-анализа в реальном времени.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение мутантного трансгенного паразита, содержащего гипоморфный аллель cdpk1, основано на данных об активности киназы in vitro с рекомбинантными ферментами. Лучше получить как можно больше мутантных рекомбинантных белков с различными остатками привратника. Поскольку геном P. falciparum очень богат AT, следовательно, экспрессия рекомбинантных белков в E. Для работы с коли может потребоваться оптимизация кодонов. Это поможет в комплексной оценке замены привратника на киназную активность мутантного фермента. Для генерации аллельного обменного трансгенного паразита выбрана замена привратника, приводящая к снижению потенциала трансфосфорилирования. Параллельно с этим в качестве отрицательного контроля следует принимать замену привратника, которая полностью отменяет активность трансфосфорилирования киназы. Еще одним важным соображением при создании аллельного обменного паразита является введение синонимичной мутации наряду с тестовой мутацией и отрицательным контролем. Генерация паразита, содержащего синонимичную мутацию в локусе cdpk1 , служит важным внутренним контролем для исключения технических ошибок при введении тестовой мутации. Более того, трансгенный паразит, несущий синонимичную мутацию, может быть использован в качестве контроля для всех сравнительных исследований вместо паразита WT.

Мы использовали двухплазмидную систему для генерации мутантного паразита32,35. Тем не менее, эффективность введения SNP в целевой локус может быть увеличена за счет использования одной плазмидной системы вместо двухплазмидной системы41. В системе с одной плазмидой все критические элементы, необходимые для опосредованного редактирования генов CRISPR-Cas9, включены в одну плазмиду вместо двух. Одиночная плазмида кодирует эндонуклеазу Cas9, транскрибирует sgРНК, состоящую из тракрРНК и направляющей РНК, и содержит гомологическое плечо для репарации двухцепочечного разрыва, введенного эндонуклеазой Cas9 в целевой сайт. В двухплазмидной системе паразиты трансфицируются совместно с обеими плазмидами. Поскольку количество паразитов, получающих обе плазмиды одновременно в двухплазмидной системе, будет низким по сравнению с одноплазмидной системой, эффективность CRISPR-опосредованного редактирования генов ниже в двухплазмидной системе по сравнению с одноплазмидной системой. В альтернативном варианте также может быть использована стратегия42 спасения от самоубийства, в которой гомологическое плечо представлено в виде линейного фрагмента или в плазмиде без маркера выбора лекарственного средства (спасательная плазмида). Эндонуклеаза Cas9 и направляющая РНК, кодирующая sgРНК, представлены в плазмиде, содержащей кассету для выбора лекарственного препарата (плазмида самоубийства). Поскольку линейный фрагмент или плазмида без кассеты для выбора лекарства с большей вероятностью будут потеряны во время репликации паразита, двухцепочечный разрыв, введенный эндонуклеазой Cas9 в локус-мишень, должен быть легко восстановлен с помощью гомологического плеча, которое может быть доступно в течение ограниченного времени. Эта стратегия имеет некоторые преимущества по сравнению с двухплазмидной системой, поскольку она более эффективна, и нет необходимости в субклонировании плеча гомологии в другой плазмиде. Другие варианты редактирования гена CRISPR-Cas9 также могут быть рассмотрены для введения SNP в целевой локус43.

Мы вручную выбрали регион-проводник для введения замены T145M в локус cdpk1 . Подходящая направляющая последовательность для введения двухцепочечного разрыва в целевом локусе может быть выбрана с помощью различных свободно доступных онлайновых программ, таких как Chopchop44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47. Это программное обеспечение, в дополнение к обеспечению эффективности каждой направляющей последовательности, также предоставляет оценки нецелевого значения и специфичности, которые увеличивают вероятность успеха эксперимента по редактированию генов, опосредованного CRISPR-Cas9.

Существуют различные методы трансфекции малярийных паразитов. Мы использовали кольцевых стадий паразитов для экспериментов по трансфекции48,49, однако предварительная загрузка эритроцитов плазмидами также была успешно использована в исследованиях по трансфекции паразитов50. В этом методе эритроциты трансфицируются плазмидами под определенным набором параметров с помощью электропорации и впоследствии используются для заражения очищенными паразитами на поздних стадиях. Паразиты проникают в эритроциты, которые предварительно загружены плазмидами. Во время их роста в эритроцитах, предварительно загруженных плазмидами, паразит поглощает плазмидную ДНК с помощью неизвестногомеханизма. Существует еще один метод, который может быть использован для трансфекции паразитов, который требует очень зрелых очищенных паразитов стадии шизонта для прямой трансфекции плазмидами. Инструментом, используемым для трансфекции очищенных шизонтов, является 4D-нуклеофектор51. Выбор метода трансфекции варьируется в разных исследовательских группах в зависимости от имеющихся ресурсов и процента успеха. Хорошей идеей будет проверить, какой из трех методов работает для группы, и использовать его для последующих экспериментов по трансфекции. Два метода могут быть применены последовательно для дальнейшего повышения эффективности трансфекции. Например, на первом этапе трансфекции могут быть использованы паразиты кольцевой стадии с последующим добавлением свежих эритроцитов, предварительно загруженных плазмидами.

Мы отобрали только несколько генов для анализа транскриптов у CDPK1T145M паразитов по сравнению с контролем на основе предшествующей литературы или наличия представителей семейства CDPK. Тем не менее, для получения всестороннего представления о глобальной транскрипционной перестройке в трансгенном паразите, содержащем гипоморфный аллель CDPK1 , можно использовать подходы, такие как RNA-Seq или микрочипы.

Метод, использованный в данном исследовании, может быть применен к другим киназам малярийного паразита для понимания развития компенсаторных механизмов под давлением препарата. Информация, полученная с помощью этого метода, может быть полезна при стратегическом развертывании комбинированных препаратов во избежание развития и распространения лекарственной устойчивости. Нацеливание на две или несколько киназ, которые демонстрируют функциональную комплементацию, является лучшей стратегией, чем нацеливание на отдельные киназы для борьбы с малярией и ее элиминации.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов отсутствует конфликт интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны за поддержку и средства, доступные через Центральный центр контрольно-измерительных приборов Школы наук о жизни JNU. Также выражается благодарность за финансовую поддержку AB со стороны Департамента биотехнологии (BT/PR28256/MED/29/1313/2018). Мы благодарим Хосе-Хуана Лопеса-Рубио за предоставление плазмид pL6eGFP и pUF1. Финансирующее агентство не играет никакой роли в подготовке и принятии решения о публикации работы. MS является получателем стипендии JRF-SRF от Совета по научным и промышленным исследованиям.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x коктейль ингибиторов фосфатовSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Антитела к GSTThermoFisher ScientificG7781
Антитела против мышиHRP Sigma-AldrichA4416
Анти-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
ЦентрифугаThermoFisher Центрифуга ScientificSorvall legend micro 17R
(Для гранулирования бактериальных клеток)Центрифуга ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
(Для гранулирования/переработки паразитов)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (ротор TX-400)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS компетентные клеткиSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Компетентные клеткиTakara Bio9057
Электропорационные кюветы, зазор 0,2 смBioRad1652086
ЭлектропораторBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP хемилюминесцентный реагентG-Bioscience7860-003
ГентамицинThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Глутатиона сефароза 4BGE Healthcare17075601
HEPES, свободная кислотаMerck391338
гипоксантинMerck4010CBC
Набор для клонирования In-fusion HDTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, дефосфорилированный  Merck13-110
NotI NEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF   Takara Bio740424
NucleoSpin Гель и ПЦР для очистки Мини-наборTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
-нитробензилмезилат (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max ДНК-полимеразаTakara BioR045A
Коктейль ингибиторов протеазыRoche
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL набор для сайт-направленного мутагенезаAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
СапонинSigma-Aldrich47036
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
Spei-HFNEBR3133S
SuperScript III Набор для синтеза первой нитиThermoFisher Scientific18080-051
T4 ДНК-лигазаThermoFisher Scientific15224017
антитела к тиофосфатному эфируAbcamAb92570
11836170001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).">World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
  2. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).">Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).">Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).">Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).">Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).">Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).">Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).">Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).">Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).">Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).
  11. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).">Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).">Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).">Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).
  14. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).">Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).">Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).">Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).
  17. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).">Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).">Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).">Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).
  20. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).">More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).">Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).">Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).">Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).">Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).">Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).">Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).">Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).">Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).">Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).">McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).
  31. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).">Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).">Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).">Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).">Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).">Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).">Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).">van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).
  38. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).">Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).">Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).">Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).">Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).">Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).
  43. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).">Sharma, M., Bansal, A. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).
  44. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).">Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).">Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  46. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).">Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  47. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).">Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).">Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).">Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).">Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).">Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Malaria ParasiteCompensatory PathwaysProtein KinasesCDPK FamilyChemical GeneticsHypomorphic AlleleCRISPR Cas9 EditingDrug ResistanceKinase InhibitionTranscriptional Rewiring

Related Articles