Модель in vitro, интегрирующая жесткость и текучесть субстрата для изучения реакций эндотелиальных клеток

Краткое содержание

Мы синтезировали и охарактеризовали перестраиваемый субстрат на основе желатина для культивирования сосудистых эндотелиальных клеток (ЭК) в соответствующих условиях сосудистого кровотока. Эта биомиметическая поверхность воспроизводит как физиологические, так и патологические состояния, что позволяет изучать механические силы, влияющие на поведение ЭК, и углублять наше понимание здоровья сосудов и механизмов заболеваний.

Аннотация

Мы представляем инновационную модель in vitro , направленную на изучение комбинированного влияния ригидности тканей и напряжения сдвига на функцию эндотелиальных клеток (ЭК), которые имеют решающее значение для понимания здоровья сосудов и возникновения таких заболеваний, как атеросклероз. Традиционно в исследованиях изучалось влияние напряжения сдвига и жесткости основания на EC независимо друг от друга. Тем не менее, эта интегрированная система сочетает в себе эти факторы для обеспечения более точного моделирования механической среды сосудистой системы. Цель состоит в том, чтобы изучить механотрансдукцию ЭК при различных уровнях жесткости тканей и условиях течения с использованием ЭК человека. Мы подробно описываем протокол синтеза гидрогелей метакрилата желатина (GelMA) с настраиваемой жесткостью и их засеивания EC для достижения конфлюенции. Кроме того, мы описываем конструкцию и сборку экономичной проточной камеры, дополненную вычислительным моделированием гидродинамики, для создания физиологических условий потока, характеризующихся ламинарным потоком и соответствующими уровнями напряжения сдвига. Протокол также включает флуоресцентное мечение для конфокальной микроскопии, что позволяет оценить реакцию ЭК как на податливость тканей, так и на условия потока. Подвергая культивируемые ЭК воздействию нескольких интегрированных механических стимулов, эта модель позволяет всесторонне исследовать, как такие факторы, как гипертония и старение, могут влиять на функцию ЭК и ЭК-опосредованные сосудистые заболевания. Выводы, полученные в результате этих исследований, будут иметь важное значение для выяснения механизмов, лежащих в основе сосудистых заболеваний, и для разработки эффективных стратегий лечения.

Введение

Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, играет ключевую роль в поддержании здоровья сосудов. Эндотелиальные клетки (ЭК) играют центральную роль в регуляции различных сердечно-сосудистых функций, включая контроль тонуса сосудов, селективную проницаемость, гемостаз и механотрансдукцию ^1,2. Исследования прочно связали дисфункцию ЭК с основной ролью в развитии атеросклероза. Примечательно, что ЭК сталкиваются с различными механическими силами на границах, где они взаимодействуют с кровотоком и тканями подлежащих сосудов ^3,4. В нескольких исследованиях дисфункция ЭК связана с аномальными изменениями механических факторов в сосудистой среде, таких как напряжение сдвига жидкости от кровотока и ригидность тканей ^5,6,7.

Тем не менее, предыдущим исследованиям уделялось ограниченное внимание в понимании комбинированного влияния жесткости тканей и напряжения сдвига на функцию EC. Чтобы повысить способность преобразовывать результаты исследований в эффективные методы лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых заболеваний, необходимо совершенствовать клеточные модели, используемые в полевых условиях. Значительный прогресс был достигнут в гуманизации клеточных моделей за счет использования человеческих ЭК и их воздействия либо на напряжение сдвига, либо на подложки с различными уровнями жесткости ^8,9,10. Тем не менее, принятие и совершенствование ячеистых моделей, которые интегрируют динамические среды течения с EC-подложками, обладающими регулируемыми свойствами жесткости, продвигается медленно. Сложность заключается в разработке ненабухающих EC-субстратов, чтобы предотвратить изменения параметров потока в проточном канале, а также облегчить выращивание неповрежденных и хорошо адгезивных монослоев. Модель in vitro, способная преодолеть эти препятствия, может способствовать более эффективным исследованиям того, как гипертония, старение и условия кровотока совместно влияют на механотрансдукцию ЭК, здоровье сосудов и, в конечном счете, на развитие атеросклероза. Были разработаны различные методы приложения напряжения сдвига к клеткам при контроле жесткости подложки, включая вращающиеся пластины и микрофлюидные устройства. При методе вращающихся пластин ячейки размещаются между двумя пластинами, а напряжение сдвига прикладывается за счет вращательного движения пластин. Этот метод менее сложен и обеспечивает быстрое моделирование; Тем не менее, он страдает от пространственного изменения напряжения сдвига, с нулевым напряжением сдвига в центре и максимальным напряжением сдвига на периферии¹¹.

С другой стороны, микрофлюидные устройства представляют собой новое поколение инструментов с возможностью контроля жесткости подложки и условий текучести. Эти системы подходят для имитации микроциркуляторного русла в условиях ламинарного потока. Однако изучать атеросклероз с помощью таких аппаратов нецелесообразно, так как атеросклероз возникает в крупных сосудах с нарушенным^{кровотоком 11}. Цель данной статьи – внести свой вклад в важнейшую область исследований EC путем представления экономически эффективной системы, способной изучать влияние различных уровней жесткости в EC-подложках при различных условиях текучести. Система объединяет субстраты с различной жесткостью для имитации патологических и физиологических кровеносных сосудов. В этом протоколе описан метод создания гидрогелей на основе желатина без уровней набухания и жесткости 5 кПа и 10 кПа, представляющих физиологическую и патологическую жесткость соответственно. Кроме того, подробно описана конструкция проточной камеры с параллельными пластинами, способной интегрировать эти подложки. Вычислительная гидродинамика (CFD) была использована для оценки напряжения сдвига и условий течения. Описывается приготовление гидрогелей для культивирования EC и проведение эксперимента с проточным потоком в течение 6 часов, после чего обсуждается вопрос об иммуноокрашивании после эксперимента.

Протокол

1. Синтез GelMA

1. Приготовьте 0,2 М раствор безводного карбоната натрия и 0,2 М раствор гидрокарбоната натрия.
2. Смешайте 46 мл раствора бикарбоната натрия с 15 мл раствора карбоната натрия и добавьте 139 мл деионизированной (DI) воды. При необходимости отрегулируйте pH до 9,5, используя 0,1 М NaOH и HCl.
3. Добавьте 10 г желатина типа А, 300-цветкового из свиной кожи в 100 мл карбонатно-бикарбонатного буфера в концентрации 10% по массе.
4. Растворите желатин на водяной бане при температуре 55 °C, перемешивая раствор со скоростью 700 об/мин с помощью магнитной мешалки. После полного растворения отрегулируйте pH желатинового раствора до 9,5, используя 0,1 М NaOH.
5. Чтобы начать метакрилацию, добавьте в раствор по каплям 938 мкл метакрилового ангидрида (МАГ). Улучшите начальное распределение MAH в желатиновом растворе, вводя его в различных местах, включая разную глубину и радиальные расстояния от центра.
6. Оберните реакционный сосуд алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света. Поддерживайте температуру на уровне 55 °C и перемешивайте раствор со скоростью 500 об/мин в течение 1 часа, чтобы завершить реакцию (Рисунок 1A)¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция прекращается при pH ниже 7,4.
7. Подготовьте один стакан объемом 2 л, содержащий 1,8 л ацетона, и один стакан объемом 0,6 л, содержащий 0,3 л ацетона.
8. Добавьте полученный раствор GelMA по каплям в стакан объемом 2 л, помешивая при 200 об/мин, чтобы вызвать выпадение осадка¹³. Чтобы максимально увеличить сбор осажденного продукта, поместите стержень или шпатель из нержавеющей стали в качестве места зарождения для более легкого переноса.
9. Переложите продукт из большого стакана в меньший и дайте ему постоять 10 минут, прежде чем приступить к этапу сушки. Осажденный GelMA должен выглядеть в виде белых волокон.
10. Соберите изделие на впитывающую бумагу, высушите в вакуумной печи при комнатной температуре (RT), и храните при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
    Примечание: Дополнительные сведения о химической характеристике продукта с помощью протонного ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР) можно найти в ранее опубликованной работе⁸.

2. Засоление стекла

ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепление гидрогелей к стеклянным предметным стеклам обеспечивает плоскую и ровную поверхность, облегчая обращение и обеспечивая устойчивость при напряжении сдвига, вызванном потоком. Функционализация стекла 3-(триметоксисилил)пропилметакрилатом необходима для улучшения поверхностных свойств и обеспечения ковалентного присоединения гидрогелей в процессе полимеризации.

1. С помощью стеклореза вы точно вырежьте предметные стекла обычного микроскопа (толщиной 1 мм) на части, аналогичные конечным размерам гидрогеля. Промойте порез предметного стекла с мылом, чтобы удалить поверхностные загрязнения и мусор, которые могут препятствовать обработке стеклянной поверхности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости обработайте стекла ультразвуком в течение 5 минут в этаноле, затем высушите на воздухе.
2. Приготовьте 0,5% раствор 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата в абсолютном этаноле. Приготовьте 10% раствор ледяной уксусной кислоты в деионизированной воде. Смешайте растворы до достижения конечной концентрации 3% ледяной уксусной кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ледяной уксусной кислоты можно готовить в больших количествах и хранить.
3. Организуйте стеклянные предметные стекла в стеклянном контейнере, чтобы стеклянные поверхности не загораживались. Вылейте полученный раствор на предметные стекла и подержите их примерно 5 минут на коромысле при 80 оборотах в минуту, чтобы реакция завершилась. Убедитесь, что обе стороны стеклянных стекол модифицированы, удалив все захваченные пузырьки воздуха.
4. После завершения реакции отсадите раствор и промойте стекла этанолом в 2 раза. Высушите предметные стекла на воздухе и храните их в темноте при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При таких условиях стеклянные стекла сохраняют свою модификацию в течение 1 месяца.

3. Приготовление гидрогеля

1. Изготовьте гидрогели с использованием метода окислительно-восстановительной полимеризации, вызванной свободными радикалами.
   1. Соберите двухкомпонентные формы из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с подходящей глубиной и открывающимися окнами 10^мм2 для придания формы окончательной подложке. Учитывайте 25% усадку высоты гидрогеля после полимеризации в процессе проектирования. Убедитесь, что формы плоские и плотно закреплены на нижней и верхней пластинах, чтобы предотвратить утечку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетные размеры пресс-формы намеренно на 10% больше предполагаемого размера гидрогеля. Эта конструкция служит нескольким целям: она предотвращает повреждение боковых сторон при разделении формы, повышает ровность поверхности гидрогеля, выталкивая примеси или пузырьки в стороны, и компенсирует ожидаемую 25% усадку после уравновешивания из-за эффекта синерезиса, когда сильно сшитые гидрогели отталкивают воду после уравновешивания, вызывая усадку. Размер усадки указан в протоколе⁸.
   2. Чтобы гидрогели имели ровную поверхность и постоянную высоту, подвесьте модифицированные стеклянные стекла к верхней пластине формы, обеспечивая узкое отверстие для впрыска полимерного раствора. Используйте покровное стекло для подвешивания предметных стекол с модифицированным стеклом (Рисунок 1B).
   3. Чтобы создать покровное стекло, разрежьте обычное микроскопическое стекло на 20% больше формы. Прикрепите две проставки к более коротким сторонам. Рассчитайте толщину дистанционной рамки следующим образом:
      Толщина распорки = 1,33 х конечная толщина геля + 1 (толщина модифицированного стекла) - глубина формы
   4. Нанесите тонкий слой герметизирующей смазки, совместимой с ячейками, на более длинные стороны покровного стекла, на той же поверхности, где прикреплены распорки.
   5. Прикрепите предметное стекло модифицированного стекла к покровному стеклу между двумя распорками.
   6. Поместите покровное стекло на форму так, чтобы распорки сидели на форме, а модифицированное стекло выдвигалось внутрь формы. Эта установка обеспечивает зазор в 1,33 от конечной высоты гидрогеля между модифицированным стеклом и дном формы.
   7. Растворите GelMA в деионизионной воде при концентрации 4% и 10% по массе для гидрогелей с концентрацией 5 кПа и 10 кПа соответственно и поместите его на водяную баню при температуре 45 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GelMA является термочувствительным полимером, и поддержание температуры раствора на уровне 45 °C предотвращает затвердевание перед полимеризацией и снижает вязкость раствора, что имеет решающее значение для изготовления плоских гидрогелей.
   8. Добавьте в раствор полимера ТЕМЕД (24 мМ для гидрогеля 5 кПа, 6,25 мМ для гидрогеля 10 кПа) и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TEMED сам по себе не инициирует полимеризацию, поэтому перед тем, как продолжить, убедитесь, что формы, пипетки и растворы подготовлены.
   9. Добавьте APS (24 мМ для гидрогеля 5 кПа, 24,5 мМ для гидрогеля 10 кПа) в раствор GelMA и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление APS инициирует полимеризацию, и гидрогели могут образовываться быстро, что требует быстрых действий для предотвращения дефектных гидрогелей. Более подробную информацию об измерениях жесткости можно найти в ранее опубликованной работе⁸.
   10. Тщательно пипеткой нанесите полученный раствор в отверстие между подвешенным стеклостеком и формой в точке RT и дайте ему сшить. Капиллярная сила загоняет полимерный раствор в форму. Избегайте добавления пузырьков в гели и прекратите пипетирование, когда в наконечнике пипетки остается небольшое количество раствора.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Во время полимеризации метакрилатные группы GelMA вступают в реакцию с остатками метакрилата на модифицированных предметных стеклах, что приводит к химическому прикреплению гидрогеля к стеклу.
   11. Через 15 минут реакция завершена. Отсоедините подложку от формы с помощью острого предмета, например иглы, и отодвиньте подложку от покровного стекла, чтобы отделить ее.
   12. Перенесите гидрогели в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) в чашку Петри диаметром 100 мм, закрытую пластиковой пленкой, и уравновесьте при 37 °C, чтобы удалить оставшиеся реагенты и побочные продукты.
   13. Поскольку гидрогель немного больше окончательных размеров, обрежьте все излишки геля по бокам, чтобы они соответствовали размерам, необходимым для окна проточной камеры.
   14. Используйте проточную камеру для проверки размеров гидрогеля. Убедитесь, что гидрогель правильно помещается в проточную камеру без зазоров между гидрогелем и формой или каких-либо дефектов, которые могут повлиять на характер потока. Если есть неровности формы, которые могут повлиять на характер потока в проточной камере, что приведет к неблагоприятному поведению клеток, сохраните гидрогель для статических условий.
   15. Перелейте четыре гидрогеля в чашку Петри, содержащую 1x PBS для стерилизации.
2. Простерилизуйте гидрогель, как описано ниже, используя 70% этанол.
   1. Приготовьте 25%, 50% и 70% спиртовые растворы для постепенной дегидратации гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не проводить постепенное обезвоживание, более жесткие гидрогели могут сжиматься и ломаться, в то время как на поверхности более мягких гидрогелей могут образовываться складки.
   2. Аспирируйте 1x PBS раствор из чашки Петри, содержащей гидрогели. Добавьте 25% раствор этанола в каждую чашку Петри, чтобы погрузить гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 15 минут.
   3. Отсадите 25% спиртовой раствор. Добавьте 50% спиртовой раствор в каждую чашку Петри, чтобы погрузить гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 15 минут.
   4. Отсадите 50% спиртовым раствором. Добавьте 70% спиртовой раствор в каждую чашку Петри, погрузив гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 5 минут. Поставьте чашку Петри на шейкер при 100 оборотах в минуту.
   5. Оставьте гидрогели 5 кПа погруженными в воду на 40 минут, а гидрогели 10 кПа на 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что гидрогели с массой 5 кПа более склонны к загрязнению по сравнению с гидрогелями с массой 10 кПа.
   6. Переложите образцы в 6-луночный планшет в шкафу биобезопасности и промойте гидрогели в 2-3 раза с помощью стерильного PBS.

4. Покрытие гидрогелями

1. Приготовьте раствор желатина с концентрацией 60 мкг/мл, растворив 3 мг желатина в 50 мл стерильного PBS (1 мл с солью магния и кальция). Нагрейте раствор на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут или до полного растворения всего желатина.
2. Стерильно отфильтровать раствор покрытия с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Отсадите 1x раствор PBS из каждой луночной пластины и добавьте раствор желатина в каждую лунку, обеспечивая полное покрытие каждого гидрогеля. Чтобы свести к минимуму риск загрязнения, добавьте в раствор покрытия 40 единиц/мл пенициллина и 10 μг/мл стрептомицина.
3. Инкубируйте каждую лунку в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 45 минут. Промойте гидрогели 1x раствором PBS.
4. Аспиратуйте PBS и добавьте среды для клеточных культур.
5. Не более двух суток выдерживайте гидрогели в питательных средах для клеточных культур и инкубируйте их в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 до посева клеток.
   Примечание: Несмотря на отличные свойства фибронектина по прикреплению клеток, существует обеспокоенность по поводу его использования из-за того, что ЭК откладывают эндогенный фибронектин в атеросклеротических условиях, что может привести к провоспалительной реакции. Чтобы избежать химически стимулированных клеточных реакций, мы воздерживаемся от использования фибронектина. Кроме того, Orr et al. продемонстрировали, что фибронектиновое покрытие, по сравнению с коллагеновым покрытием I, усиливает атерогенные гены. В частности, они наблюдали повышенные уровни экспрессии молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) и ядерного фактора-κB (NF-κB)¹⁴.

5. Затравка ячеек на субстраты

1. Приготовьте клеточную суспензию в соответствии с доступными протоколами отслойки и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра⁸.
2. Тщательно отсасывайте среду из гидрогелей. Добавьте 50 000 клеток/см2 к каждому образцу. Добавьте необходимый объем клеточной суспензии в каждый образец, чтобы предотвратить переполнение клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более жесткие субстраты более гидрофобны; Поэтому сведите к минимуму время между этапами для улучшения смачиваемости и диспергирования клеточной суспензии на поверхности субстрата.
3. Инкубировать гидрогели с клеточным семенем в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 2 ч. Добавляйте в образцы среды для клеточных культур после того, как клетки прикрепятся к гелям.

6. Изготовление проточной камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Подход к проектированию проточной камеры является экономически эффективным и требует минимальных знаний для изготовления и использования.

1. Используйте полиметилметакрилат для изготовления камер для визуальной оценки качества потока, целостности гидрогеля при напряжении сдвига и потенциальных исследований биомаркеров в режиме реального времени во время экспериментов с потоком. Конструкция камеры была создана с использованием программного обеспечения системы автоматизированного проектирования (САПР). Проточная камера была подана на патент, и подробности об этом устройстве не могут быть раскрыты в настоящем протоколе.
2. Вычислительная оценка условий течения в проточной камере
   1. Соберите отдельные компоненты спроектированной проточной камеры (. SLDPRT) для создания окончательной конфигурации камеры.
   2. Проведите линию вдоль осевой линии потока, касательную к поверхности гидрогеля, чтобы проанализировать напряжение сдвига. Закройте входное и выходное отверстия, чтобы определить закрытый контрольный объем.
   3. Откройте Flow Simulation на вкладке Надстройки в программном обеспечении САПР. На вкладке Моделирование потока откройте функцию Мастер, чтобы ввести свойства. Укажите систему единиц измерения и отрегулируйте давление и единицы измерения напряжения с точностью до дин/см².
   4. Проверьте расход жидкости и гравитацию в физических элементах. Установите гравитацию на -9,8 в компоненте Z; Компоненты X и Y должны быть равны нулю.
   5. Выберите Внутренний для типа анализа в окне Обработка геометрии. Выберите Вода в качестве жидкости по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предположим, что среда ведет себя как вода.
   6. Выберите Ламинарный и Турбулентный для типа потока. Определите стену как адиабатическую стену и введите шероховатость поверхности в поле Состояние стены.
   7. Установите температуру на 37,5 °C (310,65 K) в начальных условиях. Определите вычислительную область в проектах моделирования потоков, убедившись, что она охватывает весь объем управления.
   8. Выберите все стенки, взаимодействующие с жидкостью, чтобы определить подобласть жидкости. В поле «Граничное условие» укажите внутреннюю поверхность впускной крышки как «Объемный расход на входе» и укажите расход (Q) и равномерный расход. Затем назначьте внутреннюю поверхность уплотнения выпускной крышки как статическое давление.
   9. Определите глобальный размер сетки на основе доступных вычислительных ресурсов. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы запустить симуляцию.
   10. По завершении просмотрите желаемые результаты, включая графики напряжений сдвига и моделирование потока.
   11. Повторите шаги с 6.2.8 по 6.2.10 с различными скоростями потока, чтобы рассчитать приложенное напряжение сдвига при разных скоростях. Используйте регрессионный анализ для установления взаимосвязи скорости потока и напряжения сдвига.
   12. Оцените устойчивость системы к изменениям размеров гидрогеля для повышения реалистичности моделирования.

7. Запустите равномерный ламинарный поток

1. После культивирования клеток на гидрогелях с концентрацией 5 кПа и 10 кПа обеспечьте слияние монослоя клеток в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Следует добиться монослоя клеток на каждом гидрогеле.
2. Стерилизуйте автоклавируемые компоненты системы параллельных пластинчатых камер (винты из нержавеющей стали, шпатель, щипцы, прокладка и резервуар для фильтрующего материала) с помощью 30-минутного цикла гравитационного автоклава. Стерилизуйте другие детали (акриловые компоненты и герметик/демпферы резервуара) под воздействием ультрафиолетового излучения.
3. Соберите устройство проточной камеры в шкафу биобезопасности. Закрепите образцы гидрогеля в приборе, обеспечив однородность. Используйте наполнитель того же размера, что и гидрогели, если для потока доступно недостаточное количество образцов.
4. Предварительно намочите внутреннюю поверхность камеры и гидрогелевые поверхности, чтобы свести к минимуму образование пузырьков и предотвратить высыхание клеток во время сборки.
5. Добавьте достаточное количество фильтрующего материала во входной резервуар, чтобы 20–30% фильтрующего материала поступало в выпускной резервуар после сборки. Герметично загерметизируйте впускной бачок с помощью демпфера/герметика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повышение давления во входном бачке приводит к движению потока, а любые утечки воздуха изменяют скорость потока. Проверьте герметичность на наличие дефектов герметика, если на наружной трубке образуются пузыри.
6. Установите выпускную заслонку на атмосферное давление, чтобы установить перепад давления. Поместите устройство и резервуары в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Подсоедините трубку устройства к перистальтическому насосу, расположенному снаружи инкубатора (рисунок 1С).
7. Включите насос, чтобы начать вносить 3,6 дин/см² . Постепенно увеличивайте расход с шагом 2 мл/мин (например, достигните 85 мл/мин с 65 мл/мин через 10 мин) до нанесения примерно 8 дин/^см2.
8. Далее увеличивайте расход с шагом 2,5 мл/мин до достижения 12 дин/^см2 напряжения сдвига.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте клеткам время адаптироваться к динамическим условиям, так как быстрое увеличение скорости потока может привести к отрыву клеток и повреждению монослоя.
9. Через 6 ч остановите поток, извлеките устройство из инкубатора, и разберите проточную камеру. Затем перенесите образцы гидрогеля на шестилуночный планшет.
10. Промойте образцы ледяным PBS и либо зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, либо лизируйте их для выделения белка.

8. Установка иммуноокрашивания для конфокальной микроскопии с большим увеличением

Примечание: Для повышения эффективности исследования был разработан метод иммуноокрашивания небольших порций гидрогелей, позволяющий исследовать несколько биологических мишеней в одном образце.

1. Подготовьте пуансоны для биопсии или предпочтительные режущие инструменты диаметром 3 или 4 мм.
2. Используйте коробку с наконечником для пипетки в качестве камеры для окрашивания. Увлажните камеру, чтобы контролировать испарение красящего раствора во время длительной инкубации, положив влажное бумажное полотенце на дно коробки с наконечником для дозатора.
3. Сокращение потребления антител за счет создания небольших пулов растворов для отдельных образцов. Накройте стеллаж коробки для наконечников прозрачной пленкой, аккуратно прижимая пленку к отверстиям стойки кончиком пальца, чтобы сделать ямочки. Заполните ямочки 70 мкл PBS.
4. Перенесите отдельный гидрогель в пустую чашку Петри и разрежьте его с помощью пробойника для биопсии или предпочитаемого режущего инструмента. Используйте микроскоп, чтобы вырезать репрезентативную область образца. Разрежьте полный гелевый цилиндр, чтобы избежать проблем с конфокальной микроскопией.
5. Поместите вырезанные образцы гидрогеля в ямочки, созданные на шаге 8.3. Выполняйте окрашивание в соответствии со стандартным протоколом¹⁵. После окончательной промывки для окрашивания получите лист силиконовой резины, соответствующий толщине гидрогеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать лист с одной липкой стороной для лучшей герметизации. В этом исследовании актиновые волокна окрашивали с использованием флуоресцентного вторичного антитела, конъюгированного с фаллоидином в разведении 1:20.
6. Разрежьте резиновый лист на квадраты размером 15 мм х 15 мм. Проделайте отверстие диаметром 6 мм с помощью пуансона для биопсии или предпочитаемого режущего инструмента.
7. Создайте контейнер для образцов, прикрепив резину к покровному стеклу для микроскопии (No 1.5). Добавьте 10 мкл влажной монтажной среды в углубления, пока образец еще присутствует, и инкубируйте его в темноте в течение 10-15 минут.
   Примечание: Для данного исследования монтажная среда содержала 0,9 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для сокращения протокола окрашивания.
8. Извлеките образец из камеры окрашивания и поместите его в контейнер, созданный на шаге 8.7. Нанесите 1-2 мкл монтажной среды поверх образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество монтажных носителей влияет на качество изображения при большом увеличении. Чрезмерное или недостаточное количество монтажных носителей может ухудшить четкость изображения.
9. Поместите сверху еще одну защитную крышку и осторожно нажмите, чтобы образец соприкоснулся со стеклом. Храните образцы при температуре 4 °C в темноте до получения микроскопической визуализации.

Результаты

На рисунке 1 изображена экспериментальная установка, описывающая процесс синтеза GelMA с помощью реакции метакрилирования. Полученный продукт затем использовался для изготовления гидрогелевой подложки, на которую засеивались ЭК. Впоследствии клетки были введены в проточную камеру для эксперимента с потоком в течение 6 часов при давлении 12 дин/^см2.

¹Для оценки успешности реакции метакрилирования использовали ЯМР-спектроскопию (рис. 2А). Наличие метильной группы на уровне 1,9 ppm и винилового пика между 5,4-5,6 ppm в GelMA подтвердило успешное метакрилирование. Кроме того, снижение пика лизина на уровне 3 ppm в GelMA указывает на потребление остатков лизина, которые заменяются остатками метакрилата 12,13,16. Жесткость гидрогелей GelMA оценивали с помощью испытания на сжатие, которое показало, что модули сжатия увеличивались с концентрацией GelMA (рис. 2B). Гидрогели, состоящие из 4% и 8% (w/v) GelMA, использовали для имитации физиологической (5 кПа) и патологической (10 кПа) жесткости матрицы, соответственно⁸.

Проточная камера была спроектирована с учетом экономичности и простоты стерилизации за счет использования акрилового полимера, устойчивого к ультрафиолетовому излучению. Его прозрачность облегчает мониторинг гидрогелей и условий течения в режиме реального времени во время экспериментов. Камера, состоящая из трех отдельных слоев, сводит к минимуму риск повреждения гидрогеля во время загрузки или разгрузки: нижняя пластина обеспечивает прочное основание, средний слой обеспечивает боковую поддержку гидрогелей, а верхняя пластина, расположенная вдоль прокладки, создает зазор, необходимый для потока жидкости (Рисунок 3A). Вычислительное моделирование было проведено с использованием вычислительной гидродинамики для оценки условий течения и напряжения сдвига в камере. Следующее уравнение - напряжение сдвига = 0,0558 x скорость потока - рассчитано приложенное напряжение сдвига к ячейкам на основе скорости потока в качестве входных данных (Рисунок 3B). Примечательно, что изменения свойств материала, таких как жесткость, не изменили напряжение сдвига в моделировании. Чтобы учесть различия в размере гидрогеля в окончательной экспериментальной установке, гидрогели были намеренно немного меньше в вычислительной модели. Между одной стороной гидрогелей и средними стенками камеры был создан зазор в 0,5 мм, перпендикулярный направлению потока. Такая конфигурация позволила провести анализ эффектов напряжения сдвига в этих зазорах. В то время как в местах разрывов наблюдались неравномерности напряжения сдвига (Рисунок 3B), их воздействие было ограничено небольшой областью, прилегающей к разрывам, при этом оставшаяся поверхность гидрогеля испытывала равномерное напряжение сдвига (Рисунок 3C). Эти данные предполагают отбрасывание клеток с краев гидрогелей, чтобы свести к минимуму потенциальное воздействие турбулентных областей. Стоит отметить, что более высокое напряжение сдвига, до 15 дин/см², было экспериментально применено к ЭК, засеянным на гидрогелях 5 кПа и 10 кПа без утечки в устройстве (данные не включены). Тем не менее, дальнейшее увеличение напряжения сдвига потенциально может привести к отрыву клеток и разрушению гидрогеля, что подчеркивает необходимость тщательной оптимизации условий эксперимента.

Чтобы затравочные клетки образовали монослой, крайне важно использовать более высокую плотность клеток, чем в традиционных культурах. Было показано, что низкая плотность посева препятствует образованию монослоя на более мягких гидрогелях⁸. Кроме того, предварительное покрытие гидрогелей желатином перед посевом клеток улучшает первоначальное прикрепление клеток и их распределение на более мягких гидрогелях. Однако важно отметить, что благотворное воздействие такого покрытия носит временный характер, так как оно в первую очередь способствует первоначальному взаимодействию между клетками и субстратом.

На рисунке 4 показано, как жесткость и напряжение сдвига влияют на формирование актиновых волокон. Под действием напряжения сдвига образуются более толстые волокна напряжения, что предполагает более прочное прикрепление к поверхности. В более мягких образцах было больше периферических актиновых волокон, которые являются индикаторами физиологических состояний. Однако при ЭК на более жестких подложках наличие более прочных напряженных волокон и меньшего количества периферических волокон потенциально может привести к дисфункции ЭК¹⁷. Полученные данные подтверждают эффективность представленной системы в модуляции поведения ЭК.

Рисунок 1: Обзор текущего исследования. (A) Синтез GelMA. Желатин химически модифицировали в метакрилат желатина (GelMA) в результате реакции между желатином и метакриловым ангидридом (MAH) при 55 °C. Затем продукт осаждали в ацетоне и сушили в вакууме. (B) Изготовление гидрогеля. Защитное стекло было подготовлено путем крепления проставок. Затем модифицированное стекло крепилось к покровному стеклу. Защитное стекло помещалось на форму, а распорки обеспечивали желаемый зазор между модифицированным стеклом и дном формы. Раствор GelMA, содержащий инициаторы, добавляли в отверстие между модифицированным стеклом и формой, полимеризуясь с образованием гидрогеля, ковалентно связанного с модифицированным стеклом. (C) Эксперимент с потоком. Полученный гидрогель использовался для посева ЭК. После формирования монослоя клетки подвергались эксперименту с потоком в течение 6 часов при напряжении сдвига 12 дин/см². Эта фигура была создана с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: ¹спектры H-ЯМР для предварительной полимеризации желатина и GelMA. (А) Обратитесь к пунктирным полям для соответствующих пиков. Метакрилоильные пики (т.е. виниловая и метильная группы) появлялись после химической модификации желатина, в то время как лизиновая группа использовалась для количественной оценки степени замещения после^{химической реакции}. (B) Модуль Юнга гидрогелей был измерен с помощью компрессионного теста, и 4% (w/v) гидрогелей GelMA рассматривались как физиологические субстраты, а 10% (w/v) рассматривались как патологический субстрат (n=4, среднее значение ± SEM). Эта цифра была изменена с⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Проектирование проточной камеры с параллельными пластинами и численное моделирование. (A) Три отдельные пластины были использованы для снижения возможности повреждения гидрогелей во время загрузки или разгрузки; В то время как нижняя пластина обеспечивала подкладочную поверхность, средняя поверхность обеспечивала боковую поддержку гидрогелей, а верхняя пластина и прокладка образовывали зазор для потока жидкости. (B) Проточная камера подверглась вычислительному моделированию¹¹. При скорости потока 215 мл/мин напряжение сдвига вдоль проведенной линии составляет примерно 12 дин/^см2, представляя физиологическое напряжение сдвига. (C) Влияние зазора в 0,5 мм ограничено небольшой областью, прилегающей к зазору. Оставшаяся поверхность гидрогеля испытывает равномерное напряжение сдвига. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 4: Напряжение сдвига и жесткий гидрогель увеличивают образование волокон напряжения. Большее количество периферических актиновых волокон образуется в ЭК на образцах емкостью 5 кПа под потоком. Более прочные стрессовые волокна образовывались, когда клетки подвергались напряжению сдвига на гидрогелях с массой 10 кПа, что демонстрирует эффективность модели в поведении ЭК. Стрелками обозначен периферический актин, а звездочками – напряженные волокна. Масштабная линейка = 10 μм (синий: DAPI, красный: актиновые волокна). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Сосудистая система представляет собой динамичную среду, в которой различные силы существенно влияют на поведение клеток. Изучение биологических событий в сердечно-сосудистых заболеваниях без учета этих сил было бы неточным. Таким образом, решающее значение имеют клеточные модели, способные имитировать сосудистую механическую среду. Исследователи уже добились значительного прогресса в выявлении влияния этих сил на клеточное поведение¹¹. Тем не менее, чтобы понять поведение клеток как в патологических, так и в физиологических условиях в организме человека, важно разработать более точные модели, которые больше напоминают окружающую среду кровеносных сосудов. Поэтому мы стремились разработать систему, которая более точно воспроизводит среду кровеносных сосудов, сохраняя при этом простоту доступа и удобство для пользователя.

Модель может применять контролируемое напряжение сдвига, полученное от потока, к клеткам человека на подложках с различными уровнями жесткости, создавая условия, приближенные к физиологическим реалиям по сравнению с существующими моделями. GelMA был синтезирован и использован в этой модели для удовлетворения следующих критериев: 1) настраиваемые механические свойства, 2) отсутствие набухания, 3) совместимость и адгезия клеток, а также 4) способность встраивать сосудистые клетки для более точного моделирования кровеносных сосудов. Регулируемость механических свойств достигалась путем варьирования концентрации биополимера⁸ для имитации физиологических и патологических состояний. Вторым критерием было отсутствие отека. Крайне важно иметь ненабухающую подложку для поддержания постоянных размеров проточной камеры, соответствующих условий потока и напряжения сдвига на ячейках. ГельМА с высокой степенью метакрилалирования продемонстрировал ненабухающие свойства, сохраняя форму гидрогеля и гладкость его поверхности на протяжении всего эксперимента⁸. Важно отметить, что концентрация и жесткость не влияли на поведение набухания, что упростило модель, исключив необходимость в отдельных корректировках для каждой экспериментальной группы. Третьим критерием была адгезия клеток, так как правильное прикрепление необходимо для предотвращения отслоения клеток и сохранения целостности монослоя. GelMA обеспечивает адгезию клеток, тем самым снижая потребность в дополнительных этапах конъюгации клеточных адгезивных молекул с субстратом, что имеет важное значение для многих биополимеров. Кроме того, была рассмотрена способность GelMA к инкапсуляции клеток, хотя она не была непосредственно проверена в этом исследовании. Потенциал инкапсуляции клеток имеет показания для поддержки 3D-культивирования клеток и интеграции слоев клеток, таких как сосудистые гладкомышечные клетки или перициты, для повышения точности^{модели19}. Кроме того, синтез GelMA является экономически эффективным и требует минимального количества оборудования, что делает его отличным кандидатом в качестве биоматериала для изготовления субстратов 20,21,22.

Проточная камера с параллельными пластинами обычно используется для приложения напряжения сдвига к ячейкам, но традиционно она используется только со стеклянными покровными стеклами или жесткими материалами. Однако такие материалы лишены физиологической значимости²³. В отличие от них, микрофлюидные устройства привнесли более сложную геометрическую сложность и более мягкие подложки за счет использования материалов на основе полимеров. Однако эти устройства часто не могут точно контролировать режим потока, а их небольшие размеры ограничивают их возможности для изучения лишь небольшого числа ячеек, ограничивая^{результаты} экспериментов. Предлагаемое устройство сочетает в себе преимущества обеих систем за счет интеграции монослойных гидрогелей эндотелиальных клеток с проточной камерой, применяющей точно контролируемое напряжение сдвига.

Устройство продемонстрировало способность интегрировать как текущие, так и твердотельные механические силы. При приложении напряжения сдвига 12 дин/^см2 в течение 6 ч наблюдалось образование цитозольных напряженных волокон, контрастирующее с преобладанием периферического актина в группе более мягкого субстрата. Это согласуется со многими отчетами, показывающими меньшее количество волокон напряжения, образующихся при культивировании EC на более мягких поверхностях 24,25,26,27. С другой стороны, ламинарный поток может привести к образованию заметных волокон напряжения. Было показано, что реакция цитоскелета на условия потока начинается в течение 1 ч после воздействия ^{потока, но} требует значительно большего времени для завершения^{реорганизации.} Периферическая актиновая сеть имеет важное значение для различных функций ЭК, включая межклеточную адгезию и барьерную функциональность¹⁷. Активация этой сети в здоровой экспериментальной группе по сравнению с патологической группой с обширными стрессовыми волокнами подтверждает успешное моделирование здоровых и больных состояний с помощью устройства.

Одним из недостатков этого устройства является возможность повреждения гидрогелей, что может нарушить поток и снизить вероятность успеха экспериментов. Эта проблема в первую очередь возникает из-за начальных дефектов гидрогелей, которые под действием напряжения сдвига могут ухудшиться, что приведет к отрыву образца и частичному препятствованию потоку. Поэтому этапы подготовки образцов, включая полимеризацию, уравновешивание и резку, должны проводиться осторожно, чтобы предотвратить любое дополнительное повреждение образцов. Еще одной проблемой в этой системе является достижение и поддержание целостности монослоя. В то время как покрытие гидрогелей желатином может улучшить первоначальное прикрепление клеток, наша предыдущая работа показала, что это покрытие не влияет^на пролиферацию клеток. Таким образом, для усиления образования монослоя, особенно с учетом того, что пролиферация клеток происходит медленнее на более мягких гидрогелях³¹, целесообразно увеличить плотность посева. Кроме того, ячейки могут отделяться из-за напряжения сдвига, вызванного потоком жидкости. Следовательно, крайне важно постепенно увеличивать скорость потока, давая клеткам достаточно времени для адаптации к новым условиям окружающей среды.

В заключение следует отметить, что устройство представляет собой значительный шаг вперед в более точном моделировании сосудистой среды благодаря своей способности одновременно моделировать механические силы, полученные как из жидкости, так и из твердых веществ. Он предлагает комплексную платформу для изучения поведения ЭК при различных физиологических и патологических состояниях. Эта универсальность делает его ценным инструментом для углубления нашего понимания биологии сосудов и прогрессирования заболеваний. Эта модель может внести вклад в различные научные исследования, включая механобиологию, атеросклероз, развитие метастазов рака, инженерию сосудистой ткани и ангиогенез, а также доставку лекарств и скрининг.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(триметоксисилил)Пропилметакрилат, тетраметилэтилендиамин (TEMED)	Инвитроген	15524-010	Производство гидрогеля
3-(триметоксисилил)Пропилметакрилат	Сигма-Олдрич	440159	Засолка стекла
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)-содержащий монтажный материал	Вектор Лаборатории	H-1200	Иммуноокрашивание
Ацетон	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Фаллоидин	Технология клеточной сигнализации	8953S	Иммуноокрашивание
персульфата аммония (APS)	Bio-RAD	1610700	Производство гидрогеля
Прозрачный устойчивый к царапинам и ультрафиолетовому излучению литой акриловый лист (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Изготовление проточной камеры
Конфокальный микроскоп	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Иммуноокрашивание
Covidien Monoject Rigid Pack 60 мл Шприцы без игл	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC	Американская коллекция типовых культур (ATCC)	PCS-100-041	Клеточная культура
Этанол 200 Proof	Decon Labs	2701	Стекло
Соление Желатин Тип А (300 цветков) из свиной кожи	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Ледяная уксусная кислота	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Стекло Соление
Высокочистый Высокотемпературный Силикон Резиновый лист	McMaster-Carr	87315K74	Производство проточной камеры
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC)	Американская коллекция типовых культур (ATCC)	PSC-100-010	Клеточная культура
M3x30 мм Машинные винты с шестигранной головкой Винт с круглой головкой 304 Крепежные элементы из нержавеющей стали Болты 20 шт.	Uxcell	B07Q5RM2TP	Изготовление
проточной камерыЦифровой привод Masterflex L/S с функцией Easy-Load® 3 Головка насоса для прецизионных трубок; 115/230 В переменного тока	VWR	#MFLX77921-65	Эксперимент с потоком
Трубки для прецизионных насосов Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25-футовый	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Метакриловый ангидрид (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Синтез
параформальдегида	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Клеточная культура
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco	14080-055	Общий
бикарбонат натрия	Fisher Chemical	S233-3	Синтез GelMA
Карбонат натрия	Fisher Chemical	S263-500	Синтез GelMA Версия
SOLIDWORKS для учебных заведений
SOLIDWORKS Student Edition Настольный ПК, 2023	SolidWorks	N/A	Проточная камера
Дизайн Сосудистая базальная среда	Американская коллекция культур типа (ATCC)	PCS-100-030	Клеточная культура