Методическая статья

Создание мышиной модели тонкого эндометрия

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67084

⸱

1 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Shenzhen Zhongshan Obstetrics and Gynecology Hospital (formerly Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), 2Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-Implantation, 3School of Biomedical Engineering, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описан подробный протокол получения надежного и воспроизводимого тонкого эндометрия с очень низким уровнем смертности и минимальными внутриматочные спайки путем введения 95% этанола в матку мыши в течение 1-3 минут.

Аннотация

Тонкий эндометрий (ТЭ) широко признан одной из важнейших причин бесплодия. Тем не менее, патогенез ТЭ остается неясным, и по-прежнему срочно необходимы удовлетворительные варианты лечения. Было разработано несколько животных моделей ТЭ, но мышиная модель, включающая абдоминальную хирургию и инъекцию 95% этанола, представляет собой сложную проблему из-за высокого уровня смертности и риска внутриматочных спаек при неправильном выполнении. Здесь мы описываем подробный протокол, который позволяет получить надежную и воспроизводимую ТЭ с очень низким уровнем смертности и минимальными внутриматочные спайки путем введения 95% этанола в матку мыши с различным временем инфузии. Результаты показали, что у всех мышей успешно развилась ТЭ при времени инфузии от 1 до 3 минут, характеризующаяся типичным уменьшением толщины эндометрия и количества желез, а также чрезмерным фиброзом эндометрия. Эти результаты свидетельствуют о том, что эта мышиная модель подходит для изучения тонкого эндометрия и может служить платформой для разработки будущих методов лечения ТЭ.

Введение

Тонкий эндометрий (ТЭ) – серьезное заболевание в акушерстве и гинекологии, которое часто поражает женщин детородного возраста. ТЭ диагностируется, когда толщина эндометрия составляет менее 7 мм на ультразвуковом исследовании, сопровождается нормальным состоянием полости матки и тесно связана с невынашиванием беременности 1,2. Подсчитано, что примерно 1,5-9,1% женщин, проходящих лечение методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), будут испытывать ТЭ, что делает его растущей проблемой в репродуктивной медицине 3,4,5. Наиболее частыми причинами ТЭ являются неправильная коррекция эндометрия после хирургического разделения внутриматочных спаек (ВМС) и выскабливание, которые часто сопровождаются нарушением распределения кровеносных сосудов и разрежением желез 6,7,8. На сегодняшний день клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ТЭ, остаются неясными. Восстановление эндометрия у пациенток с ТЭ занимает много времени, хотя лечение эстрогеном и терапия низкими дозами аспирина были изучены в качестве потенциальных вмешательств9. Таким образом, углубленное изучение патогенеза ТЭ является наиболее непосредственным подходом к решению проблем, связанных с этим состоянием. Тем не менее, исследования патогенеза ТЭ опираются на животные модели, что делает выбор подходящей модели критически важным.

Большинство гистопатологических исследований тонкого эндометрия (ТЭ) показали, что нарушение пролиферации эпителиальных клеток и макрофагов, снижение экспрессии рецепторов стероидных гормонов яичников, чрезмерное отложение внеклеточного матрикса и клеточное старение являются наиболее значимыми патологическими признаками ТЭ 6,9,10. В настоящее время разработаны различные модели крыс для имитации ТЭ, в том числе модели, вызванные расчесыванием11,12,13, ишемией14, термической травмой15 и химической травмой 16,17,18,19. Модель крысы индуцируется путем расчесывания эндометрия иглой или катетером, что часто приводит к внутриматочной спайке (ВМС), а не TE 11,12,20,21,22. Также сообщалось о модели ТЭ, вызванной ишемией, у крыс, при которой ишемия эндометрия достигается путем проведения двустороннего лигирования маточных артерий, что приводит к уменьшению толщины эндометрия. Однако этот метод занимает много времени, требует трех месяцев, и не находит широкого распространенияв исследованиях. В модели, вызванной термической травмой, искусственная трубка для осеменения используется для вливания предварительно нагретой воды с температурой 85 °C в одну сторону маточного рога через слияние двух сторон, что делает ее более сложной, чемдругие методы. Химически индуцированная модель включает в себя введение 95% этанола в открытый рог матки для повреждения всего эндометрия. Эта модель предлагает преимущества низкой стоимости и короткого экспериментального периода для изучения патологических механизмов и методов лечения при ТЭ, но она в основном используется на крысах, а не на мышах. Хотя существуют различные животные модели, особенно крысиные, каждая из них имеет свои ограничения. Они могут моделировать только определенные аспекты ТЭ, и лишь немногие модели мышей точно повторяют характеристики заболевания ТЭ, будучи при этом удобными и универсальными для исследований.

В этом контексте мы разработали новую мышиную модель тонкого эндометрия (ТЭ) путем вливания 95% этанола в полость матки с использованием временного градиентного подхода с модифицированным методом24 (Рисунок 1). Результаты показали, что у всех мышей успешно развилась ТЭ при времени инфузии в диапазоне от 1 до 3 минут, демонстрируя типичные характеристики, такие как уменьшенная толщина эндометрия, уменьшение железы и повышенный фиброз эндометрия. Эти результаты свидетельствуют о том, что наша мышиная модель является подходящим инструментом для изучения ТЭ и может служить платформой для разработки будущих методов лечения ТЭ.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Шэньчжэньской больницы акушерства и гинекологии Чжуншань (ранее Шэньчжэньская урологическая больница), где проводились все эксперименты на животных. В исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (возраст 6-8 недель, масса 18-20 г). Все животные были размещены в определенной среде, свободной от патогенов (SPF) в одном и том же помещении и акклиматизировались в течение одной недели перед экспериментами в помещении без специфических патогенов при температуре (22 ± 1) °C в течение 12-часового цикла свет/темнота. Им был предоставлен свободный доступ к еде и воде. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Выявление течки

Примечание: Фаза течки у мышей сравнима с поздней лютеиновой фазой у людей, с относительно толстой слизистой оболочкой эндометрия в это время. Отбор мышей в период течки для модельной индукции гарантирует, что они находятся в относительно стабильном физиологическом состоянии. Кроме того, результаты истончения эндометрия более выражены, когда толщина эндометрия относительно толстая. Подробнее об этой процедуре читайте в ранее опубликованных отчетах 25,26.

  1. Приготовьте 20 μл физиологического раствора с помощью пипетки. Взявшись за уши мыши с обеих сторон и зафиксировав хвост мыши, аккуратно введите кончик пипетки во влагалищное отверстие на глубину примерно 2 мм. Влейте 20 μL физиологического раствора во влагалище и аккуратно промойте его в течение 5 циклов.
  2. Извлеките физиологический раствор и равномерно переложите его на чистое предметное стекло. Дайте ему испариться и высохнуть естественным путем при комнатной температуре.
  3. Нанесите 30 мкл этанола на каждое предметное стекло, чтобы зафиксировать элементы. Дайте этанолу испариться в течение 5 минут, пока предметное стекло не высохнет.
  4. Нанесите 50 мкл кристаллического фиолетового окрашивающего раствора на каждое предметное стекло и окрашивайте клетки при комнатной температуре в течение 10 минут.
  5. Промойте каждое предметное стекло деионизированной водой, чтобы удалить излишки красителя и уменьшить неспецифическое окрашивание.
  6. Наблюдайте за морфологией клеток и определяйте долю типов клеток под микроскопом.
  7. Наблюдайте за эстральными циклами мышей два раза подряд, чтобы обеспечить устойчивость. Выберите для эксперимента мышей в период третьей течки.
    Эстральный цикл у мышей обычно длится 4-5 дней и делится на четыре стадии: проэструс, течка, метеструс и диэструс. Проэструс длится около 24 ч и характеризуется эпителиальными клетками с круглыми и овальными ядрами (рис. 2А). Течка длится от 12 ч до 48 ч и характеризуется преимущественно ануклеированными ороговевшими эпителиальными клетками (рис. 2B). Metestrus сохраняется до 24 ч и характеризуется смесью аноклеированных ороговевших эпителиальных клеток и нейтрофилов (рис. 3C). Диеструс длится от 48 ч до 72 ч и характеризуется комбинацией нейтрофилов, ядросодержащих эпителиальных клеток и нескольких ануклеированных ороговевших клеток (рис. 2D).

2. Групповое проектирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки влияния различной продолжительности инфузии 95% этанола на стабильность модели ТЭ было выделено шесть групп лечения. Одной группе была проведена симуляция операции без введения этанола в качестве контроля за процедурными эффектами. Мыши с этанол-индуцированной ТЭ были случайным образом разделены на пять групп лечения в зависимости от времени инфузии (n = 5 в группе) следующим образом:

  1. Группа 1 мин: Ввести этанол в полость матки в течение 1 мин.
  2. Группа 2 мин: Ввести этанол в полость матки в течение 2 мин.
  3. Группа 3 мин: Ввести этанол в полость матки в течение 3 мин.
  4. Группа 4 мин: Ввести этанол в полость матки в течение 4 мин.
  5. Группа 5 минут: Ввести этанол в полость матки в течение 5 минут.

3. Индукция модели ТЭ у мышей

  1. Обезболивайте мышей с помощью наркозного аппарата с 5% изофлураном и 100% кислородом в течение 3 минут (в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом). Поддерживайте анестезию на уровне 1%-3% изофлурана с помощью носового конуса. Нанесите ветеринарную мазь на глаза мышей, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Контролируйте частоту дыхания, зажимая палец ноги на протяжении всей процедуры.
  2. С помощью медицинской ленты закрепите конечности мышей и удерживайте их в лежачем положении на операционном столе, предварительно нагретом электронным одеялом. Осторожно слегка потяните за язык мыши, чтобы предотвратить обструкцию дыхательных путей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание мышей в тепле во время операции помогает поддерживать иммунную функцию и кровообращение, а также предотвращает свертывание крови. Кроме того, вытягивание языка мышей обеспечивает чистоту дыхательных путей, чтобы избежать удушья во время анестезии.
  3. Нанесите крем для удаления волос животных на нижнюю часть живота мышей на 3 минуты. Удалите волосы чистыми салфетками. Продезинфицируйте участок 75% этанолом и йодофором.
  4. Сделайте разрез на 1 см в области живота, на 1 см от отверстия мочеиспускательного канала. Используйте стерильные ножницы и щипцы, чтобы расширить разрез вплоть до брюшной полости.
  5. Аккуратно отодвиньте внутренности в сторону с помощью стерильных щипцов, чтобы найти матку и обнажить правый маточный рог. Наложите кровоостанавливающие зажимы на проксимальном конце возле шейки матки и дистальном конце возле яичника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим обоих концов маточного рога обеспечивает отсутствие утечки во время инъекции этанола, предотвращая повреждение шейки матки, влагалища и яичников.
  6. Закапывайте примерно 50 мкл 95% этанола27 в полость матки с помощью шприца массой 25 г, при этом игла должна быть параллельна направлению маточного рога. Введите иглу в полость матки под углом 30 градусов. Удерживайте шприц в течение 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут или 5 минут, в зависимости от необходимости. Извлеките этанол и промойте полость матки стерильным физиологическим раствором 5 раз, чтобы удалить остатки этанола. Аналогичным образом, закапывайте равный объем стерильного физиологического раствора в левый рог матки в качестве контроля, следуя тем же процедурам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что игла шприца параллельна направлению маточного рога. Избегайте введения иглы под слишком крутым углом, чтобы предотвратить ее проход по всему рогу матки. Извлеките этанол как можно полнее, чтобы избежать стойкого повреждения и экспериментальной нестабильности.
  7. Снимите зажимы и верните матку и внутренности в исходное положение.
  8. Сшить брюшину 5-0 рассасывающимися полигликолидными хирургическими нитями с последующим ушиванием эпидермиса 5-0 нерассасывающимися полигликолидными хирургическими нитями.
  9. Продезинфицируйте надрез 75% этанолом и йодофором, а затем верните животных в клетку. После операции внимательно понаблюдайте, увеличивается ли частота сердечных сокращений мыши постепенно и неуклонно до тех пор, пока мышь полностью не выздоровеет и не сможет нормально двигаться (рисунок 3A-H).
    Примечание: Пероральный анальгетик (3,2 мг/мл ацетаминофена в питьевой воде) был введен за день до операции и продолжался в течение оставшейся части исследования.
  10. Наблюдайте за мышами в 9:00 и 15:00 каждый день и дезинфицируйте разрез йодофором, чтобы убедиться, что они находятся в хорошем состоянии.

4. Забор образцов

  1. Усыпьте мышей при вывихе шейного отдела позвоночника под глубокой анестезией через 7 дней после 95% лечения этанолом (в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом).
  2. Разрежьте швы, чтобы обнажить матку с помощью хирургических ножниц.
  3. Осторожно и медленно извлеките всю матку с помощью хирургических щипцов. Отделите матку от окружающих внутренностей.
  4. Сразу же удалите оба рога матки и разделите каждый рог на 3-4 небольших сегмента.
  5. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки. Сохранить ткань матки в 4% параформальдегиде в течение 24 ч для фиксации.

5. Обезвоживание тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание тканей достигается с помощью автоматического тканевого процессора (см. Таблицу материалов).

  1. Поместите зафиксированные формалином образцы в тканевые кассеты.
  2. Перенесите тканевые кассеты через ряд повышающих концентраций этанола для обезвоживания ткани следующим образом: 70% этанол в течение 1 часа, 85% этанол в течение 1 часа, 95% этанол дважды (по 1 часу каждый) и 100% этанол дважды (по 1 часу каждый).
  3. Замените этанол на 100% ксилол (135 мин при первом погружении, 20 мин при каждом последующем погружении дважды), чтобы парафин проник в ткани.
  4. Погрузите кассеты с салфетками в парафин в инкубатор при температуре 60-65 °C (3 раза по 140 мин) и держите кассеты в тепле до закладки.

6. Заделка парафина

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги с помощью модульного центра встраивания тканей (см. Таблицу материалов).

  1. Заполните восковую форму расплавленным парафином, нагретым до 55 °C.
  2. Используйте нагретые щипцы для быстрого переноса инфильтрированных сегментов из загрузочной кассеты в восковую форму, следя за тем, чтобы поперечное сечение каждого сегмента лежало параллельно основанию формы.
  3. После того, как сегменты будут правильно расположены, поместите нижнюю часть встраиваемой кассеты поверх гистологической формы.
  4. Поместите форму прямо на охлаждающую пластину, установленную на 4 °C, не менее чем на 20 минут, чтобы парафин затвердел.
  5. После того как воск застынет, извлеките образец из формы и с помощью парафинового триммера удалите излишки воска вокруг него.

7. Срез парафина

  1. Приготовьте водяную баню при температуре 42 °C. Перед резкой поместите парафиновые блоки на холодную плиту, чтобы они остыли и их стало легче обрезать.
  2. Зажмите залитый парафином образец на вращающемся микротоме поверхностью ткани вверх.
  3. Срез 20 мкм за один раз для удаления излишков парафина, покрывающего ткань, до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плоскость ткани.
  4. Вырежьте секции по 4 мкм за один раз.
  5. Перенесите парафиновую ленту на ванну с теплой водой при температуре 42 °C на 2 минуты.
  6. Возьмите срезы с поверхности воды и поместите их на предметное стекло микроскопа после разворачивания.
  7. Высушите предметные стекла в инкубаторе при температуре 60 °C в течение 30 минут.

8. Окрашивание гематоксилином и эозином

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание гематоксилином и эозином осуществляется с помощью автоматизированной машины для окрашивания предметных стекол (см. Таблицу материалов).

  1. Подготовьте все реактивы заранее, прежде чем приступать к процедуре окрашивания.
  2. Замочите предметные стекла в 100% ксилоле на 10 минут, 5 минут и 3 минуты соответственно.
  3. Регидратируйте стекла в уменьшающемся ряду этанола в деионизированной воде следующим образом: 100% этанол, 95% этанол (дважды) и 80% этанол в течение 2 мин каждый.
  4. Промойте предметные стекла в деионизированной воде.
  5. Закрасьте предметные стекла раствором гематоксилина на 10 мин. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 1 минуты или пока вода не перестанет быть фиолетовой.
  6. Дважды опустите предметные стекла в 0,5% кислотный раствор для дифференцировки этанола на 3-5 с каждый раз. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 1 минуты.
  7. Поместите предметные стекла в буфер для воронения (1% раствор аммиака) на 1 минуту. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 1 минуты.
  8. Обезвоживайте предметные стекла 80% этанолом, а затем опустите их в рабочий раствор эозин-Y на 10 с.
  9. Переведите предметные стекла на 95% этанол и промойте дважды по 10 секунд каждое. Затем переведите предметные стекла в абсолютный этанол и дважды обезвожьте их по 10 с каждое.
  10. Окуните предметные стекла в 100% ксилол, чтобы очистить ткань дважды, по 2 минуты каждый.
  11. Наденьте на салфетку покровный лист и запечатайте его натуральной смолой.

9. Окрашивание Массона

  1. Депарафинизируйте ткань, замочив предметные стекла в 100% ксилоле на 10 минут, 5 минут и 3 минуты соответственно.
  2. После депарафинизации замочите предметные стекла в уменьшающемся ряду этанола в деионизированной воде: 100% этанол, 95% этанол (дважды) и 80% этанол на 2 минуты каждое.
  3. Промойте предметные стекла в деионизированной воде.
  4. Закрасьте предметные стекла в растворе железного гематоксилина Вейгерта в течение 5 минут, затем промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 30 секунд.
  5. Дифференцируйте цвета окрашенных тканевых структур путем инкубации предметных стекол в 1% спирте соляной кислоты в течение 15 с.
  6. Промойте слайды в деионизированной воде в течение 30 с.
  7. Инкубируйте ткань в растворе воронения в течение 3-5 минут.
  8. Промойте слайды в деионизированной воде в течение 30 с.
  9. Поместите предметные стекла в раствор фуксина с кислотой Понсо на 5-10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте деионизированную воду и слабокислотный раствор в соотношении 2:1 для приготовления слабокислотного рабочего раствора.
  10. Промойте предметные стекла слабым кислотным рабочим раствором в течение 30 с.
  11. Дифференцировать ткань в растворе фосфомолибдоновой кислоты в течение 1-2 мин, а затем промыть срезы слабым кислотным рабочим раствором в течение 30 с.
  12. Срезы ткани окрашиваем раствором анилинового синего в течение 1-2 мин.
  13. Быстро обезвоживайте участки тканей в 95% этаноле в течение 2-3 с, а затем дважды в 100% этаноле в течение 5-10 с каждый. Очистите предметные стекла в ксилоле дважды, по 1-2 минуты каждый.
  14. Наденьте на салфетку покровный лист и запечатайте его натуральной смолой.
  15. Слейте излишки смолы и дайте предметным стеклам высохнуть.

10. Визуализация и анализ

  1. Делайте снимки сечений с помощью системы сканирования слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цель 4x или 10x для обзора разделов; Для получения более детализированных изображений используйте объективы с 20-кратным увеличением до 100-кратного увеличения.
  2. Выполните количественный анализ толщины эндометрия, количества желез и степени фиброза тканей с помощью платформы анализа изображений HALO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя толщина получается путем измерения вертикального расстояния от полости матки до миометрия в 5 случайно выбранных полях зрения.

11. Статистический анализ

  1. Проводите статистический анализ с помощью SPSS версии 23.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США).
  2. Оцените статистическую значимость экспериментальных различий между контрольной и модельной группами, сначала выполнив тест на нормальное распределение.
  3. Представление данных, которые обычно распределяются как среднее значение ± SEM.
  4. Анализируйте данные из разных групп лечения с помощью одностороннего ANOVA. Сделайте поправку на множественные сравнения числа тестируемых аллелей в каждом локусе с помощью метода Бонферрони. Рассматривайте P-значение <0,05 как статистически значимое.

Результаты

Ключевыми особенностями тонкого эндометрия (ТЭ) являются уменьшение толщины эндометрия и плотности желез, наряду с повышенным фиброзом эндометрия. Этот метод успешно воспроизвел эти характеристики на модельных мышах. Анализ данных выявил достоверное уменьшение толщины эндометрия в группе 1 мин (222,3 мкм ± 13,96 мкм против 359,2 мкм ± 12,41 мкм, P < 0,05), группе 2 мин (168,7 мкм ± 17,57 мкм против 359,2 мкм ± 12,41 мкм, P < 0,05) и группе 3 мин (131,8 мкм ± 3 мкм против 359,2 мкм ± 12,41 мкм, P < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Тем не менее, не наблюдалось существенной разницы в толщине эндометрия между группами 2 и 3 минуты (168,7 мкм ± 17,57 мкм против 131,8 мкм ± 3 мкм, P > 0,05) (рис. 3A, B).

Количество эндометриальных желез было достоверно снижено в группе за 1 минуту (4,4 ± 2,38 против 24,4 ± 1,6, P < 0,05), группе с 2 минутами (0,8 ± 0,49 против 24,4 ± 1,6, P < 0,05) и группе с 3 минутами (4,4 ± 3,20 против 24,4 ± 1,6, P < 0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 3A, C). Однако достоверной разницы в количестве эндометриальных желез в группах 1-мин, 2-мин и 3-мин не наблюдалось.

Поскольку ТЭ возникала после лечения 95% этанолом в течение 7 дней, было выдвинуто предположение, что толщина эндометрия может быть связана с продолжительностью инфузии. Чтобы исследовать это, две дополнительные группы получали 95% этанол в течение 4 минут и 5 минут соответственно. Интересно, что результаты показали выраженную адгезию матки при увеличении времени инфузии. (Рисунок 4), при этом полость матки становится практически незаметной. Кроме того, при длительном времени инфузии в матке мышей не наблюдалось никаких эндометриальных желез (рис. 4).

Более того, уровень фиброза эндометрия увеличивался при длительности инфузии 95% этанола, что подтверждается окрашиванием по Массону, что указывает на чрезмерный фиброз в поврежденном эндометрии (рис. 5А,В).

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема создания модели мыши TE . Вся процедура включает в себя следующие этапы: Во-первых, мышам дали акклиматизироваться в течение 1 недели до эксперимента. Далее наблюдались два эстральных цикла. Затем мышей в третьей течке отбирали для создания модели путем введения 95% этанола в полость матки. Через семь дней после инъекции этанола мышей умерщвляли, а рога матки собирали для дальнейшего окрашивания HE и анализа на окрашивание по Массону. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Идентификация течки у мышей. (A) Проэструс характеризуется преобладанием ядросодержащих эпителиальных клеток (стрелка). (В) Течка характеризуется преобладанием ануклеированных ороговевших эпителиальных клеток (звездочек). (C) Metestrus характеризуется комбинацией ануклеированных ороговевших эпителиальных клеток и нейтрофилов (треугольник). (D) Диеструс характеризуется комбинацией нейтрофилов, ядросодержащих эпителиальных клеток и небольшого количества ануклеированных ороговевших клеток. Увеличение объектива 20x. Масштабные линейки = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Процедура индукции ТЭ путем инфузии 95% этанола. (A) Мышей обезболивают с помощью наркозного аппарата. (B) Волосы на животе удаляются. (C) Разрез 1 см делается на расстоянии 1 см от отверстия уретры. (D) Матка расположена, и одна сторона маточного рога обнажена. (E) Гемостатические зажимы накладываются с обеих сторон маточного рога. (F) 95% этанола закапывают в рог матки, а затем промывают стерильным физиологическим раствором. (G) Зажимы удаляются, и матка помещается обратно. (H) Разрез зашивается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Наблюдение за морфологией эндометрия у мышей с использованием окрашивания HE под микроскопией. (A) Была изучена морфология эндометрия на поврежденной и контрольной сторонах. В правую матку вводили 95% этанола, в то время как в левую матку вводили стерильный физиологический раствор в качестве контроля. Масштабные линейки = 200 мкм. (B) Сравнение толщины эндометрия в группе Con, 1 мин, 2 мин и 3 мин. (C) Сравнение количества желез в эндометрии в группе Con, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин и 5 мин. Кон, контроль; **P < 0,01, ****P < 0,0001 с односторонним ANOVA. Данные представляются в виде среднего ± стандартной погрешности среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Фиброз эндометрия в эндометрии мыши. (А) Трихромное окрашивание по Массону было использовано для оценки фиброза эндометрия, где синий цвет указывает на распределение коллагеновых волокон, в указанных группах лечения. Масштабные линейки = 200 мкм. (B) Сводная гистограмма показывает уровень коллагенового фиброза среди различных групп. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 с односторонним ANOVA. Данные представляются в виде среднего ± стандартной погрешности среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

ТЭ характеризуется недостаточной пролиферацией клеток и дисфункцией клеток, тесно связанными с бесплодием, повторными выкидышами и патологиями плаценты 2,3. К сожалению, в настоящее время не существует эффективной терапии ТЭ. Животные модели играют решающую роль в изучении этого состояния. В период с 2014 по 2024 год крысы использовались в качестве модельных организмов в 16,4% из 208 000 исследований (34 200 исследований), а мыши — в 22,7% (47 300 исследований). Растущее использование мышей в экспериментах можно объяснить их преимуществами перед другими моделями, в частности, их потенциалом в исследованиях регенерации 28,29,30. Учитывая важность согласованности моделей, существует растущая потребность в более совместимых инструментах для проведения исследований с использованием мышей в качестве моделей31.

Общие методы индукции моделей ТЭ, как сообщалось в предыдущих исследованиях, включают царапины11,12, ишемию14, термическую травму15 и химическую травму 16,17,23. Чтобы облегчить использование животных моделей в исследованиях ТЭ и заложить основу для эффективного лечения, Gao et al.24 впервые создали модель ТЭ у крыс SD путем введения абсолютного этанола в течение 5 минут для повреждения эндометрия. Хотя этот метод ограничивает рост эндометрия, он часто приводит к сильным спайкам в брюшной полости, при этом выживаемость составляет всего 70%.

Ранее 95% этанол преимущественно использовался на крысах из-за простоты его применения, но этот метод позволил получить несколько мышиных моделей для исследований ТЭ. После клинических наблюдений, всестороннего обзора литературы, предварительных экспериментов, повторных обсуждений и анализа был разработан усовершенствованный метод с более коротким временем инфузии матки. Квалифицированные методы позволяют вводить 95% этанола в полость матки для создания модели TE с различным временем инфузии.

Модель мыши, представленная в этом исследовании, основана на принципах моделиГао 24. Тем не менее, было внесено несколько изменений, в том числе сокращение времени инфузии этанола и увеличение частоты промывки солевым раствором. В этой модели матку мышей подвергали воздействию через абдоминальную диссекцию, и 95% этанол вводили в одну сторону маточных рогов в течение различной продолжительности: 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин и 5 мин. Благодаря точному контролю времени инфузии этанола и стандартизированной процедуре были достигнуты стабильные данные в экспериментах на мышах, что свело к минимуму отклонения из-за индивидуальных различий между мышами.

Гистологические результаты демонстрируют явные изменения толщины эндометрия, количества желез эндометрия и фиброза эндометрия в разной степени у мышей ТЭ, подтверждая достоверность модели, установленной в данном исследовании 3,6,9. Примечательно, что когда время инфузии этанола превышало 4 минуты или 5 минут, наблюдались тяжелые внутриматочные спайки (ВМС). Эти результаты свидетельствуют о том, что мышиная модель ТЭ может быть эффективно установлена при инфузии 95% этанола в течение 1-3 минут, в то время как время инфузии более 3 минут может вызвать тяжелую ВМС.

На сегодняшний день разработано несколько животных моделей для изучения ТЭ, включая модели царапин, ишемии, термически индуцированные и химически индуцированные. Модель, вызванная царапинами, хотя и проще в выполнении, часто приводит к внутриматочной спайке (ВМС), а не к ТЭ. Модель ТЭ, индуцированная ишемией, требует гораздо большей продолжительности, чем модель, индуцированная химическим веществом, а термически индуцированный метод более сложен и труден в исполнении по сравнению с химической индукцией. Несмотря на то, что химически индуцированная модель эффективна по времени и стабильна, она имеет потенциальные ограничения, такие как травмы животных и риски инфицирования или смерти из-за неправильной техники. Эти проблемы можно смягчить с помощью тщательного обучения и опыта.

В заключение, результаты демонстрируют, что мышиную модель TE можно эффективно установить путем введения 95% этанола в полость матки в течение 1-3 минут. Этот подход предлагает перспективный метод для изучения патологических механизмов и процессов репарации ТЭ, а также для разработки эффективных методов лечения пациентов с этим заболеванием.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы с благодарностью благодарим анонимных рецензентов за их важные и полезные комментарии. Эта работа была поддержана Шэньчжэньским научно-техническим проектом (No. JCYJ20220818103207016) и Фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (No 2024A1515010478).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аппарат для анестезииRWD Life ScienceR530Мобильный ингаляционный наркозный аппарат для мелких животных
0,9% физиологического раствораHubei Kelun Pharmaceutical C230817A210 мл, медицинский инъекционный
75% этанолLIRCON6303060031500 мл, дезинфицирующий реагент
95% этанолGuangzhou Chemical Reagent Factory64-17-5500 мл, химический реагент
Рассасывающиеся швыJinhuan MedicalCR537Толщина: 5-0; Длина: 90 см
Водный аммиакMilliporeSigma1336-21-61000 мл, химический реактив
Автоматический тканевый процессорLeicaTP1020100 встраиваемых коробок может быть обработан за один раз
C57BL/6 мышей Центр экспериментальных животных Южного медицинского университета 
Eosin-YBASOBA40241000 мл, используется для окрашивания парафиновых срезов, замороженных срезов и т.д
ГематоксилинBASOBA40411000 мл, используется для окрашивания парафиновых срезов, замороженных срезов и т.д
HALO Image Analysis PlatformIndica labsПрибор отличается простотой использования и масштабируемостью, мощными аналитическими возможностями и самой быстрой обработкой скоростные
Кровоостанавливающие зажимыHUAYON18-50211,8 см общей длиной с челюстью 0,7 см
Гемостатические щипцыHUAYON18-502010 см общей длиной
HistoCore Rotary MicrotomeLeica149BIO000C1Толщина ломтика от 1 до 60 мкм; m
IndorphorADF1005500 мл, дезинфицирующее реагент
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10100 мл, действующее вещество 100% изофлуран
Masson's trichrome окрашиваниеSOLARBIOG13407 × 100 мл за 100 тестов
предметное стекло МикроскопаGene TechGT100511Длина: 75 см; Ширина: 25 см
Модульный центр встраивания тканейLeicaEG1150 CИнструмент содержит холодный столик и модуль распределения парафина с подогревом, обеспечивающий гибкость для работы по встраиванию
Натуральная смолаSAKURA4770Пленка со смоляным покрытием, подходит для гистологического окрашивания
Olympus SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200Прибор захватывает высококачественные виртуальные слайды и позволяет проводить расширенный количественный анализ изображений 
Параформальдегидный фикс растворServicebioG1011500 мл, универсальный тканевый фиксатор (нейтральный)
Хирургические щипцыHUAYON18-13002,2 мм прямые, 12,5 см шириной
Хирургические ножницыHUAYON18-011010 см, хирургические ножницы из нержавеющей стали
ШприцKindly600170311 мл, одноразовый стерильный шприц с иглой
Tissue кассетыCITOTEST80106-1100-16белые; проточные прорези; 0-цельная цельная крышка; участки маркировки расположены с трех сторон
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSПроизводительность обработки составляет 60 слайдов единовременно
XyleneGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 мл, органический растворитель
. .

Ссылки

  1. Mahajan, N., Sharma, S. The endometrium in assisted reproductive technology: How thin is thin. J Hum Reprod Sci. 9 (1), 3-8 (2016).
  2. Liu, X., et al. Thin endometrium is associated with the risk of hypertensive disorders of pregnancy in fresh IVF/ICSI embryo transfer cycles: A retrospective cohort study of 9,266 singleton births. Reprod Biol Endocrinol. 19 (1), 55(2021).
  3. Liu, K. E., Hartman, M., Hartman, A. Management of thin endometrium in assisted reproduction: A clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society. Reprod Biomed Online. 39 (1), 49-62 (2019).
  4. Wang, Y., Tang, Z., Teng, X. New advances in the treatment of thin endometrium. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1269382(2024).
  5. Saad-Naguib, M. H., Kenfack, Y., Sherman, L. S., Chafitz, O. B., Morelli, S. S. Impaired receptivity of thin endometrium: Therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1268990(2023).
  6. Lv, H., et al. Deciphering the endometrial niche of human thin endometrium at single-cell resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (8), e2115912119(2022).
  7. Gharibeh, N., et al. Cell-based therapy in thin endometrium and Asherman syndrome. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 33(2022).
  8. Lei, L., et al. Angiogenic microspheres for the treatment of a thin endometrium. ACS Biomater Sci Eng. 7 (10), 4914-4920 (2021).
  9. Maekawa, R., et al. Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure. Reprod Med Biol. 16 (2), 206-227 (2017).
  10. Xu, L., Fan, Y., Wang, J., Shi, R. Dysfunctional intercellular communication and metabolic signaling pathways in thin endometrium. Front Physiol. 13, 1050690(2022).
  11. Hu, J., Song, K., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B. Z. Effects of menstrual blood-derived stem cells on endometrial injury repair. Mol Med Rep. 19 (2), 813-820 (2019).
  12. Kim, Y. Y., et al. Efficient production of murine uterine damage model. Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 119-129 (2019).
  13. Chen, K., et al. A novel method to repair thin endometrium and restore fertility based on menstruation-derived stem cell. Reprod Sci. 31 (6), 1662-1673 (2024).
  14. Hu, J., Yuan, R. Decreased expression of C-kit and telomerase in a rat model of chronic endometrial ischemia. Med Sci Monit. 17 (4), Br103-Br109 (2011).
  15. Wang, G., Ren, C., Jiang, J. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity of damaged endometrium in rats. J Obstet Gynaecol Res. 47 (9), 3223-3231 (2021).
  16. Lin, J., et al. Microenvironment-protected exosome-hydrogel for facilitating endometrial regeneration, fertility restoration, and live birth of offspring. Small. 17 (11), e2007235(2021).
  17. López-Martínez, S., et al. Bioengineered endometrial hydrogels with growth factors promote tissue regeneration and restore fertility in murine models. Acta Biomater. 135, 113-125 (2021).
  18. Haghighi, L., et al. Angiogenic lipid-based drug delivery system (phytosolve) for treatment of a thin endometrium in animal model. Tissue Cell. 90, 102481(2024).
  19. Saleem Raheem, S., Falah Hasan, H., Hashim Abid Ali, A., Mansour Jasim, A. Effectiveness of histopathological changes of induced thin layer endometrium by pentoxifylline and pentoxifylline-loaded poly lactic-co-glycolic acid on female rats. Arch Razi Inst. 78 (6), 1762-1770 (2023).
  20. Feng, Q., et al. Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats. Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).
  21. Bazoobandi, S., et al. Induction of Asherman's syndrome in rabbit. J Reprod Infertil. 17 (1), 10-16 (2016).
  22. Bai, X., et al. Therapeutic effect of human amniotic epithelial cells in rat models of intrauterine adhesions. Cell Transplant. 29, 963689720908495(2020).
  23. Liu, J., et al. The effects and mechanisms of GM-CSF on endometrial regeneration. Cytokine. 125, 154850(2020).
  24. Yan-Ping, L. Establishment and identification of rat thin endometrium model. Life Sci Res. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:88150888 (2011).
  25. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  26. Quignon, C. Collection and analysis of vaginal smears to assess reproductive stage in mice. Curr Protoc. 3 (9), e887(2023).
  27. Yi, K. W., et al. marrow-derived cells or C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12) treatment improve thin endometrium in a mouse model. Biol Reprod. 100 (1), 61-70 (2019).
  28. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541 (7636), 222-227 (2017).
  29. Mylonas, K. J., et al. Cellular senescence inhibits renal regeneration after injury in mice, with senolytic treatment promoting repair. Sci Transl Med. 13 (594), eabb0203(2021).
  30. Mckellar, D. W., et al. Large-scale integration of single-cell transcriptomic data captures transitional progenitor states in mouse skeletal muscle regeneration. Commun Biol. 4 (1), 1280(2021).
  31. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. J Vis Exp. 187, e64538(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи