Методическая статья

Методы нанесения татуировки Xenopus laevis с помощью ротационной тату-машинки

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67086

⸱

28 июня 2024 г.

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine, Dartmouth College

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем методы нанесения татуировки взрослой особи Xenopus laevis (африканская когтистая лягушка) с помощью ротационной тату-машинки. Правильная татуировка приводит к темным, легко читаемым цифрам, которые сохраняются в течение нескольких месяцев и делают животных легко различимыми для исследований и ведения учета.

Аннотация

Животные модели расширяют сферу биомедицинских исследований, углубляя наше понимание биологии развития, молекулярной и клеточной биологии и позволяя исследователям моделировать болезни человека. Регистрация и отслеживание отдельных животных позволяет исследователям сократить количество животных, необходимых для исследования, и усовершенствовать методы для улучшения благополучия животных. Существует несколько хорошо задокументированных методов маркировки и отслеживания млекопитающих, включая пробивание ушей и ушные бирки. Тем не менее, методы маркировки водных видов амфибий ограничены, а существующие ресурсы устарели, неэффективны или непомерно дороги. В этой рукописи мы описываем методы и лучшие практики маркировки Xenopus laevis с помощью ротационной тату-машинки. Правильная татуировка приводит к получению высококачественных татуировок, что делает людей легко различимыми для исследователей и представляет минимальный риск для здоровья животных. Мы также выделяем причины некачественных татуировок, результатом которых могут стать татуировки, которые быстро выцветают и причиняют ненужный вред животным. Такой подход позволяет исследователям и ветеринарам маркировать амфибий, что позволяет им отслеживать биологические репликации и трансгенные линии, а также вести точные записи о здоровье животных.

Введение

Животные модели являются полезными инструментами для исследования вопросов, относящихся к здоровью человека. На практике биомедицинские исследования на животных моделях требуют тщательной организации и содержания здоровой колонии животных. Передовые методы этичного обращения с животными и их содержания направлены на сокращение количества животных, необходимых для экспериментов, и совершенствование методов обеспечения благополучия животных1. Род когтистых лягушек, включая Xenopus laevis (X. laevis; Африканская когтистая лягушка) и Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Западная когтистая лягушка) использовались в биомедицинских исследованиях с 1930-х годов, когда X. laevis были использованы южноафриканскими врачами для проведения первых тестов на беременность. В то время как современные тесты на беременность больше не требуют содержания лягушек, роль исследований Xenopus сохраняется. К преимуществам использования Xenopus в биомедицинских исследованиях относятся их хорошо аннотированные геномы3, круглогодичная индуцируемая овуляция больших кладок яйцеклеток4 и отложенные извне яйцеклетки, поддающиеся экстракорпоральному оплодотворению. Эти особенности делают их полезным активом для эмбриологии и развития позвоночных 5,6,7, основ молекулярной и клеточной биологии 7,8,9,10 и для моделирования болезней человека 7,11,12,13.

Надежные методы отслеживания отдельных животных Xenopus имеют важное значение для регистрации биологических репликаций и повышения точности и воспроизводимости в исследованиях. Поскольку Xenopus часто размещаются в группах, маркировка животных позволяет исследователям легко отслеживать отдельных животных4. Ведение точного учета животных может сэкономить время и ресурсы, а также улучшить возможность отслеживания здоровья животных. Например, индивидуальная идентификация животных может улучшить организационные рабочие процессы для создания трансгенных линий Xenopus , поскольку для этого требуется несколько поколений лягушек с определенными генотипами, верифицированными с помощью секвенирования14, что требует организации и индивидуальной идентификации животных. Это особенно верно, когда в этих мутациях отсутствуют легко различимые фенотипы взрослых. Аналогичным образом, использование ооцитов и эмбрионов Xenopus для изучения основ клеточной биологии и биологии развития выигрывает от отслеживания отдельных животных. После стимуляции овуляции животным необходимо отдохнуть не менее 3 месяцев, чтобы предотвратить осложнения со здоровьем, такие как синдром гиперовуляции. Индивидуальные методы идентификации гарантируют, что у животных не будет слишком частой овуляции.

Маркировка и отслеживание животных также позволяет персоналу лаборатории отслеживать проблемы со здоровьем животных. Заболевание животных с одним и тем же генотипом может указывать на чрезмерный инбридинг или непредвиденные проблемы со здоровьем, связанные с трансгеном. Точно так же заболевшие животные после недавней овуляции могут указывать на проблемы с реагентами, материалами или методами. Отслеживание животных и их здоровья позволяет персоналу лабораторий и ветеринарам следить за возникающими проблемами и принимать профилактические меры для предотвращения заболеваний в будущем. У млекопитающих существует множество методов идентификации. Постоянные методы для мышей включают пробивание ушей, ушные бирки, татуировки и подкожные микрочипы. Они могут четко и надежно дифференцировать животных в колонии или клетке и могут быть легко введены лабораторным персоналом. Такие методы, как прокалывание ушей, являются минимально инвазивными, требуют только одного специализированного оборудования и подходят для животных большинства возрастов. В то время как эти системы просты и полезны для мышей, их использование на лягушках представляет собой уникальный набор проблем. У лягушек и других земноводных отсутствует ушная раковина (структура наружного уха). Некоторые исследователи прикрепляют метки к челюсти, пальцу ноги или задней конечности животного17,18. Такой подход приводил к различным проблемам: челюстные бирки вызывали раздражение, а взволнованные лягушки пытались сорвать метки передними конечностями. Бирки на пальцах ног протыкали перепонку между пальцами, затрудняя движения и неся риск потеряться. Таким образом, амфибиям требуются свои собственные методы идентификации. Исторически сложилось так, что стрижка пальцев ног также использовалась для маркировки амфибий17,19. Палец ноги подстригают острыми ножницами, и животное можно определить по длине пальцев на передних и задних лапах или по углу, под которым палец отрос (у саламандр). Тем не менее, этот метод создает этическую проблему, поскольку обрезание пальцев ног может нарушить движения животного17. Кроме того, это может вызвать кровотечение и внести риск инфицирования. Еще одной устоявшейся системой маркировки являются аутотрансплантаты кожи, при которых кожа берется из одной части лягушки и хирургическим путем прикрепляется к другой части. Например, описан способ маркировки спины или плеча лягушки с помощью кожного трансплантата светлого цвета из ее грудной клетки20. Пересадка кожи также имеет ограничения и риски: процедура является инвазивной и представляет риск заражения Aeromonas hydrophila или красной ноги, потенциально смертельного недуга; полное заживление аутотрансплантата занимает до 6 недель; И с помощью описанных методов только 6 лягушек могут быть размещены вместе из-за ограниченного количества мест для установки аутотрансплантата20.

Менее инвазивные подходы к маркировке включают стеклянные шарики и чипы транспондера17,19. При использовании метода стеклянных бусин стеклянные бусины нанизываются на небольшой шов и вшиваются в кожу лягушки. Это обеспечивает большую вариабельность, чем кожные аутотрансплантаты, с не менее чем 60 отличительными цветовыми комбинациями. Однако существует риск того, что шов может выйти, что приведет к потере бусин. В качестве альтернативы, транспондер с микрочипом может быть имплантирован под кожу в дорсальный лимфатический мешок лягушки. Это считается наиболее постоянным методом маркировки и позволяет идентифицировать и каталогизировать потенциально бесконечное количество животных. Тем не менее, это также самый дорогой метод, так как отдельные микрочипы стоят дорого, а маркировка большой колонии будет дорогостоящей. Микрочипы также требуют специального сканера для считывания19. Одним из распространенных подходов к идентификации Xenopus является обращение к естественной окраске и рисунку животных. Это особенно хорошо работает для таких лягушек, как X. laevis, у которых есть отчетливые узоры, сохраняющиеся на протяжении всей взрослой жизни. Однако эти узоры могут меняться со временем под воздействием стресса, а окраска может выглядеть иначе, когда лягушек перемещают между прозрачными и тонированнымиконтейнерами. Кроме того, этот метод идентификации менее полезен для X. tropicalis, который имеет менее отчетливые маркировочные узоры по сравнению с X. laevis, или для животных-альбиносов, которые не имеютцветовых отметин. Даже для видов с четкими отметинами персонал лаборатории может по-разному интерпретировать расположение и размер отметин, что может привести к ошибкам при идентификации. Благодаря этому фотографирование животных наиболее достоверно в сочетании с дополнительным методом идентификации. Поэтому мы стремимся маркировать и идентифицировать животных Xenopus с помощью метода, который является легко различимым, постоянным и минимально инвазивным.

Существует ограниченное количество опубликованных ресурсов, описывающих методы нанесения татуировок амфибиям. Татуировка была описана наряду с другими техниками клеймения, включая тепловые клейма, бренды нитрата серебра и бренды заморозки17. В том же ресурсе татуировка делалась путем рисования цифр иглой для подкожных инъекций 27G, и было отмечено, что процесс не вызывает инфицирования, в отличие от других техник клеймения, в которых использовалась проволока в форме цифры или другого знака. В другом источнике для маркировки лягушек использовалась электрическая татуировочная машинка (описанная как вибрирующая игла), но мало подробностей о технике17,19. Авторы предупреждают, что, нарушая защитный слой слизи лягушки, эта процедура увеличивает риск появления красной ноги. Несмотря на то, что не существует метода маркировки или идентификации, который был бы одновременно полностью неинвазивным (например, фотографии) и постоянным (например, микрочипы), татуировка обеспечивает эффективный компромисс. Татуировка относительно проста по сравнению с другими техниками, такими как аутотрансплантаты кожи. К дополнительным преимуществам относятся меньшая кривая обучения и относительно недорогое оборудование. Нанесение татуировок водным амфибиям сопряжено с определенными проблемами, которые могут напугать исследователей и помешать успешному мечению животных. Цель этой статьи — предоставить исследователям хорошо задокументированные методы нанесения татуировки взрослым Xenopus с помощью ротационной тату-машинки.

Протокол

Все описанные процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Дартмутского колледжа.

1. Настройка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: В комплект входят рабочий процесс для процедуры и пример настройки стенда (Рисунок 1).

  1. Подключите тату-пистолет и ножную педаль к источнику питания. Расположите ножную педаль под рабочей поверхностью.
  2. Сборка тату-пистолета
    1. С помощью шестигранного ключа или шестигранной отвертки ослабьте винты в рукоятке (рисунок 2A, обведен красным цветом).
    2. Вставьте пластиковый наконечник до упора в рукоятку. Затяните винт, чтобы удержать его на месте.
    3. Вставьте металлическую трубку в заднюю часть рукоятки (рисунок 2A). Это будет регулироваться, поэтому вставьте его на половину его длины. Затяните винт, чтобы зафиксировать его на месте.
    4. Вставьте иглу для татуировки через заднюю часть рукоятки так, чтобы она удобно сидела в пластиковом наконечнике в передней части рукоятки (рисунок 2B).
    5. Проденьте заднюю часть иглы и металлическую трубку через зажим трубки. Отрегулируйте металлическую трубку так, чтобы игла удобно помещалась в пластиковый наконечник (рисунок 2B). Затяните зажим трубки вручную до упора до тех пор, пока трубка не сможет двигаться (рисунок 2C).
    6. Снимите черное уплотнительное кольцо и зацепите иглу за рычаг ротора; Установите на место уплотнительное кольцо, чтобы зафиксировать иглу на месте (Рисунок 2C).
  3. Установите напряжение на блоке питания так, чтобы мощности хватало для прокалывания кожи, но не настолько мощное, чтобы его было сложно контролировать. После того как источник питания будет включен в розетку и подключен, нажмите ножную педаль, чтобы убедиться, что машина работает. Будьте осторожны, чтобы не направлять иглу на себя или других сотрудников.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тату-машинка, используемая в этом протоколе, лучше всего работает в диапазоне от 6,0 до 9,0 В, но она может варьироваться в зависимости от тату-машинки и источников напряжения и должна быть определена опытным путем.
  4. Заполните колпачок микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл или прилагаемой пластиковой чернильницы черными чернилами для татуировок примерно на три четверти.

2. Анестезия

  1. Приготовьте анестезию в резервуаре, достаточно большом, чтобы погрузить в воду одну взрослую самку лягушки X. laevis .
    1. Используя безопасную для лягушек (не содержащую хлора) воду, добавьте трикаин до конечной концентрации 1,5 г/л и бикарбонат натрия до конечной концентрации 3,5 г/л. Перемешайте до растворения. pH этого раствора составляет 7,15.
      ВНИМАНИЕ: Трикаин является раздражителем.
  2. Погрузите одну лягушку в резервуар для анестезии. Следите за тем, чтобы лягушка оставалась погруженной в раствор трикаина до тех пор, пока она не будет обезболена (7-8 минут).
    1. Чтобы проверить, полностью ли находится под наркозом лягушка, возьмите ее в руки, держите вниз головой и крепко сожмите одной ногой. Если лягушка не вздрагивает или не реагирует, на нее можно нанести татуировку.
    2. Если лягушкам постоянно требуется более 10 минут для обезболивания, приготовьте свежий раствор трикаина, буферизованный бикарбонатом натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лягушки не должны проводить более 30 минут в растворе трикаина15.

3. Татуировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением татуировки живому животному может быть полезно потренироваться на кусочке фрукта с твердой кожурой (например, лимона или банана).

  1. Подготовьте восстановительный резервуар для лягушек перед нанесением татуировки. Наполните бак 10-15 л свежей воды, безопасной для лягушек, и добавьте остров из пенополистирола. Это обеспечит поверхность для того, чтобы лягушка проснулась, не утонув.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остров из пенополистирола может быть изготовлен с использованием крышки контейнера для холодной транспортировки из пенополистирола, помещенного в пакет с застежкой-молнией.
  2. Положите находящуюся под наркозом лягушку на спину на сухое бумажное полотенце или скамейку бумаги (рисунок 3А). Используйте неотбеленные (коричневые) бумажные полотенца для всех работ, связанных с лягушками.
  3. С помощью сухой безворсовой салфетки сотрите воду и слизь с груди лягушки.
  4. Найдите пальцами грудину в центре груди лягушки и, используя недоминантную руку, натяните кожу.
  5. Маркировка лягушки
    1. Держите собранный тату-пистолет вертикально относительно рабочей поверхности и окуните иглу в чернила (рисунок 3В).
    2. Держа собранный тату-пистолет в вертикальном положении, перед тем как нажать на ножную педаль, прижмите кончик иглы к коже лягушки. Нарисуйте линии на коже лягушки, равномерно надавливая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительное кровотечение или покраснение являются нормальным явлением, как и незначительное шелушение кожи.
    3. Если игла застряла на коже лягушки, удалите излишки чернил или кожи с иглы салфеткой. Избыток чернил является нормальным явлением во время нанесения татуировки.
    4. Если грудная клетка лягушки покрыта слишком большим количеством чернил, чтобы четко разглядеть отмеченную область (Рисунок 3C), удалите излишки чернил безопасной для лягушки водой и салфеткой (Рисунок 3C'). Затем смойте влагу сухой салфеткой и продолжайте рисовать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением татуировки можно приготовить бутылку с водой, безопасной для лягушек.
    5. Продолжайте рисовать чернилами на той же области, пока не останутся темные, разборчивые цифры после стирания излишков чернил (Рисунок 3D). Вместо того, чтобы рисовать всю маркировку или цифру одним штрихом, многократно делайте более мелкие штрихи, особенно для кривых.

4. Восстановление

  1. Смочите бумажное полотенце водой, безопасной для лягушек, и положите его на вершину острова из пенополистирола (рисунок 4A).
  2. Возвращение лягушек в стоящие танки
    1. Положите лягушку животом вниз на полотенце лицом к воде (рисунок 4В). Накиньте половину бумажного полотенца на заднюю половину лягушки и, сложив чашечки, намочите верхнюю часть лягушки. Как только лягушка выйдет из наркоза (примерно через 1 час после нанесения татуировки), она будет самостоятельно входить в воду и нормально плавать.
    2. Возвращают лягушек в долгосрочное жилье через 24 ч, как только татуировка полностью заживет.

5. Чистка и обслуживание оборудования

  1. Повторное использование и автоклавирование игл для татуажа
    1. Промойте иглы в 100% изопропаноле и деионизированной воде, чтобы разрыхлить чернила, и сотрите остатки чернил, которые не растворились.
    2. После чистки поместите иглы в металлический футляр для автоклава или оберните их алюминиевой фольгой и автоклавируйте на 30 минут в сухом цикле.
  2. Если на кусочках тату-машинки или другого оборудования есть чернила, протрите их 100% этанолом и бумажным полотенцем.
  3. Раствор анестетика имеет конечную концентрацию трикаина примерно 0,5%. Утилизируйте их в соответствии с руководящими принципами обращения с опасными отходами учреждения.
  4. Хранение и обслуживание оборудования
    1. По возможности храните тату-машинку в сухом помещении. Избыток влаги повредит электрические компоненты и уменьшит срок службы машины.
    2. Чтобы сохранить тату-машинку в хорошем рабочем состоянии, проверьте подшипник на роторе (рисунок 2C), чтобы убедиться, что он не ослаб от вибраций22. Его можно затянуть с помощью шестигранного ключа или шестигранной отвертки.
    3. Примерно раз в месяц смазывайте подшипник на рычаге ротора густой консистентной смазкой22.
    4. На некоторых тату-машинках рычаг ротора может застрять и не будет вибрировать. Чтобы исправить это, поверните рычаг ротора или сожмите пружину так, чтобы игла оказалась в опущенном положении (рисунок 2C).

Результаты

Высококачественные татуировки будут иметь темные, разборчивые штрихи на груди лягушки и могут быть четко различимы с расстояния в несколько футов (Рисунок 5А). В целом, более крупные цифры и маркировки лучше для удобочитаемости, но более длинные имена и номера можно сделать меньше, чтобы они удобно помещались на груди лягушки. О долговечности татуировки судить сложнее, но качественные татуировки лягушки должны оставаться темными и разборчивыми не менее 3-6 месяцев (рисунок 5D-D'). Как только татуировка потускнеет, ее можно подправить с помощью той же техники.

Плохая техника не причинит вреда животным, но может привести к тому, что татуировки быстро выцветают (Рисунок 5B), что приводит к более частому подкрашиванию. Чрезмерное усердие в нанесении татуировки может вызвать кровотечение и покраснение, а размещение лягушки в неправильном положении для восстановления может привести к непреднамеренному утоплению.

Качество татуировок и эффективность техники можно оценить в течение нескольких месяцев после нанесения татуировки (Рисунок 5E). До тех пор, пока на лягушке есть чернила после восстановительного периода, татуировка считается удачной.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс протокола и настройка стенда. (A) Рабочий процесс и время. (1) Лягушки проводят 7-8 минут, находясь под наркозом в растворе 1,5 г/л трикаина и 3,5 г/л бикарбоната натрия, pH 7,15, растворенном в безопасной для лягушек воде. Пока одной лягушке делают татуировку, вторую лягушку можно поместить на палубу в резервуаре для анестезии. В растворе трикаина одновременно может находиться только одна лягушка. (2) Лягушки проводят около 10 минут вне воды, делая татуировки. Время будет варьироваться в зависимости от размера татуировки и опыта персонала лаборатории. (3) Находящихся в бессознательном состоянии лягушек кладут на пенопласт на 30-45 минут, чтобы предотвратить утопление, и накрывают мокрым бумажным полотенцем, чтобы предотвратить их высыхание. (4) После нанесения татуировки лягушки проводят 24 часа, восстанавливаясь в свежей стоячей воде, безопасной для лягушек. Как только лягушки выздоровеют, их можно будет вернуть в свою колонию. (B) Установка стенда для примера рабочего места. Рабочее место для татуировки, представляющее собой неотбеленное бумажное полотенце, расположено в центре скамейки. Тату-машинка и источник питания находятся слева от бумажного полотенца. Они размещаются на доминирующей стороне персонала (персонал является левшой). Чернильница и чернила для татуировки размещаются рядом с источником напряжения и в стороне от рабочего места для татуировки. Ножная педаль находится с той же стороны, что и источник напряжения. Нажатие на эту ножную педаль управляет вращательным движением. Безворсовые салфетки и бутылка с водой, безопасной для лягушек, находятся справа от бумажного полотенца. Они используются для удаления излишков чернил с кожи лягушки во время нанесения татуировки. Шестигранный ключ используется для затягивания и ослабления винтов в тату-машинке. Это используется для сборки и разборки тату-машинки. Резервуар для анестезии и дополнительные бумажные полотенца также хранятся на скамейке во время нанесения татуировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Сборка тату-машинки. (A) Изображение иглы для татуировки, рукоятки и связанных с ней компонентов в разобранном виде. Винты на металлической рукоятке обведены красным цветом. (B) Изображение иглы для татуировки, надлежащим образом собранной в рукоятке. (C) Изображение иглы для татуировки и рукоятки, встроенных в пистолет для татуировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Расположение и референсные изображения для татуировки лягушки. (A) Изображение лягушки, лежащей лицом вверх на бумажном полотенце. Стрелка указывает на грудину лягушки. (B) Изображение лабораторного персонала, рисующего лягушку. (C) Изображения цифр во время рукописного ввода, до (C) и после того, как (C') были смыты излишки чернил. (Г) Изображение татуировки лягушки сразу после нанесения краски, до восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Восстановление после татуировки. (A) Остров из пенополистирола. Крышка холодильника из пенополистирола помещается в пакет с застежкой-молнией. (Б) Лягушки в положении восстановления после нанесения татуировки. На островах из пенополистирола обычно могут разместиться 1 или 2 лягушки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Примеры репрезентативных результатов. (A) Свежая татуировка через 24 часа после нанесения татуировки. (B) Низкое качество техники. На рисунке (B) тату-машинка не была правильно собрана, но все еще была способна к вращательному движению. Эта фотография была сделана через 4 месяца после нанесения татуировки. В (B') тату-машинка не была собрана должным образом и не была способна к вращательному движению. Эта фотография была сделана через 6 месяцев после нанесения татуировки. (В) Неправильно собранная тату-машинка. Металлическая трубка и пластиковый наконечник отсутствуют, а металлическая рукоятка неправильно закреплена на остальной части тату-машинки. Резиновая лента ухудшает вращательное движение (D) до (D) и после (D') лягушки, нанесённой татуировкой при хорошей технике и правильной настройке оборудования. (D) был сделан сразу после нанесения татуировки, а (D') был сделан через 4 месяца после нанесения татуировки. (E) Количественные данные о результатах татуировки лягушки. Из татуированных лягушек 100% имели видимые татуировки сразу после нанесения татуировки, 100% имели их через 24 часа после татуировки, а 91% имели их через 4 месяца после татуировки. n = 58 лягушек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Татуировка людей — это форма искусства, насчитывающая тысячи лет, и до тех пор, как люди татуируют себя, они также татуируют или клеймят животных. Оборудование и методы маркировки животных, особенно млекопитающих, хорошо зарекомендовали себя, хорошо задокументированы и широко доступны. В то время как маркировка животных первоначально предназначалась для различения домашнего скота и предотвращениякраж23, ее роль в биомедицинских исследованиях стала не менее важной.

Преимущество татуировки амфибий заключается в том, что татуировки заживают в течение 24 часов, а хорошие татуировки сохраняются в течение нескольких месяцев (Рисунок 5D'). Нанесение татуировки дает множество преимуществ для содержания и разведения амфибий. Татуировки позволяют исследователям и ветеринарному персоналу легко различать отдельных животных по номерам, которые легко увидеть и интерпретировать, даже в аквариумах с более темнымиоттенками. Эту процедуру также можно делать любой взрослой лягушке, в отличие от кожных аутотрансплантатов, которые не рекомендуются для лягушек старше 2 лет15 лет. Самое главное, что татуировка позволяет идентифицировать большое количество животных, по крайней мере, три пальца удобно помещаются на груди X. laevis (рис. 5A).

По сравнению с прикреплением бусин или бирок, татуировка не оставляет ничего, что могло бы отвалиться и вызывает ограниченное раздражение17. Кроме того, татуировка обеспечивает большую универсальность, чем другие техники брендинга, которые требуют придания проволочной формы бренду. Сама процедура гораздо менее разрушительна, чем кожные аутотрансплантаты, потому что ткань не удаляется. Однако, как и аутотрансплантаты, татуировка также является частично инвазивной и представляет небольшой риск травмы или инфекции. Это необходимая часть маркировки любого животного, но исследователям важно опасаться чрезмерного кровотечения во время татуировки и следить за животными на предмет инфекции A. hydrophilia . Этого можно избежать, поддерживая чистоту на рабочем месте до, во время и после нанесения татуировки, а также убедившись, что татуировки полностью зажили, прежде чем животные будут возвращены в свою колонию. На момент написания и разработки этой статьи ни одна из лягушек не получила необратимых травм и не умерла от нанесения татуировок. Ограничением этой процедуры является то, что она была протестирована только на взрослых лягушках старше 1 года. На данный момент ни одна лягушка не была татуирована по этому протоколу. Кроме того, эта процедура не оптимизирована для X. tropicalis, которые имеют темную окраску на груди и делают татуировки менее различимыми21. В будущем этот протокол татуировки может быть обновлен, чтобы включить в него соображения по X. tropicalis.

Поскольку среда обитания Xenopus водная4, это нормально, что эти татуировки со временем исчезают. Необходимость частой замены татуировок документально подтверждена татуировками на губах человека внутри рта, которые исчезают быстрее, чем эпидермальные татуировки, из-за постоянного контакта со слюной инапитками. Однако долговечность татуировки во многом зависит от техники нанесения татуировки. Плохая техника может быть связана с неправильно собранной тату-машинкой (Рисунок 4C) или неоптимальными настройками напряжения. Слишком низкое напряжение не позволит игле проникнуть в кожу, что приведет к появлению слабых следов или линий. Установка слишком высокого напряжения нанесет ненужный вред животному. Еще одним распространенным источником плохой татуировки является неправильное положение иглы или давление, когда персонал держит пистолет для татуировки. Нанесение татуировки при слишком малом давлении имеет тот же эффект, что и установка слишком низкого напряжения, и приведет к появлению слабой татуировки, которая быстро исчезает (Рисунок 5B'). Во время нанесения татуировки может казаться, что игла скользит по коже лягушки, а не прокалывает ее. Нанесение татуировки со слишком большим давлением приведет к заметному или неконтролируемому кровотечению. Лучшая татуировка выполняется терпеливо и методично путем нанесения краски короткими участками и повторения линий с тяжелым, постоянным давлением.

В целом, преимущества маркировки животных татуировкой у амфибий перевешивают недостатки. Индивидуальное отслеживание Xenopus в биомедицинских исследованиях обеспечивает научную строгость в отслеживании биологических реплик, позволяет исследователям и ветеринарному персоналу оценивать благополучие отдельных животных и обеспечивает соответствующую частоту овуляции для поддержания здоровья животного в долгосрочной перспективе. Что касается 3R исследований на животных – уточнение, восстановление и удаление – этот протокол наиболее актуален для уточнения и восстановления1. Маркировка лягушек облегчает исследователям и ветеринарам отслеживание проблем со здоровьем, а также гарантирует, что лягушкам предоставляется достаточное время отдыха между экспериментами. Это усовершенствует процесс исследований, обеспечивая более высокое качество данных и образцов, собранных у животных, а также совершенствуя методы животноводства и ухода за ними. Это также помогает улучшить воспроизводимость в экспериментах. Кроме того, маркировка животных позволяет использовать их повторно, что сокращает общее количество необходимых животных. Лягушки, которые откладывают яйца особенно высокого качества или наиболее полезны в других экспериментах, могут быть помечены и идентифицированы как более подходящие для исследований. Если лягушки постоянно не пригодятся для экспериментов, их можно выявить и удалить из колонии, что сэкономит ресурсы и место. Цель этой статьи — задокументировать лучшие практики татуировки амфибий и предоставить лабораториям Xenopus подробный, легкодоступный протокол татуировки. Эта практика пока не является общепринятой в области Xenopus , отчасти потому, что существующие опубликованные ресурсы ограничены. Этот ресурс позволит исследователям безопасно и эффективно маркировать животных, улучшить ведение учета в больших колониях и усовершенствовать использование амфибий в биомедицинских исследованиях.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Центр сравнительной медицины и исследований Дартмутского колледжа за обеспечение ежедневного содержания животных, используемых в этом протоколе. Мы также благодарим Лию Джейкоб и Адвайту Бозе за помощь в тестировании протокола и фотографировании животных. Наконец, мы благодарим лабораторию Энн Миллер за обучение практике татуировки. Эта работа была поддержана грантом NIH R00 GM147826 J.L.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-игольчатые круглые вкладышиWorldwide Tattoo Supply1203RLBУпакованные стерильные
5-игольчатые круглые одноразовые ULTRAWorldwide Tattoo SupplyHTIPRS5-UУпакованные стерильные
5-игольчатые круглые вкладышиWorldwide Tattoo Supply1205RLBУпакованные стерильные
7-игольчатые круглые вкладышиWorldwide Tattoo Supply1207RLBУпакованные стерильные
Зажимной шнурWorldwide Tattoo SupplyN/A
Ножная педальWorldwide Tattoo SupplyN/A
InkpotsWorldwide Tattoo SupplyN/A
Kimwipes, салфетки для деликатных задачFisher Scientific06-666A
RCA ConnectionWorldwide Tattoo SupplyN/A
Scream Ink Pitch Black, 1ozWorldwide Tattoo SupplySI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Рукоятки из нержавеющей сталиWorldwide Tattoo SupplyN/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo MachineWorldwide Tattoo SupplyN/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box SetWorldwide Tattoo SupplySTEALTH2-SET
Остров пенополистиролаН/ДН/ДЭто крышка контейнера для холодной транспортировки пенополистирола
Трикаин (этил3-аминобензонат метансульфат)Sigma-AldrichE10521ВНИМАНИЕ: РАЗДРАЖАЮЩИЙ
Неотбеленные бумажные полотенцаГрейнджер2U229Бумажные полотенца ДОЛЖНЫ быть неотбеленными, отбеливатель токсичен для амфибий
Напряжение Источник питанияWorldwide Tattoo SupplyН/Д
Бутылка для мытья (с безопасной для лягушек водой)Fisher ScientificFB0340923TFrog безопасная вода дехлорирована, pH 7,0-8,5, проводимость 1200-1800 мк
<эм> X. laevis взрослая самкаXenopus1н/д
Пластиковый пакет на молниин/д н/дЭтот мешок должен быть достаточно большим, чтобы вместить остров из пенополистирола

Ссылки

  1. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
  2. Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
  3. Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
  4. Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
  5. Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
  6. Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
  7. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
  8. Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
  9. Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
  10. Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
  11. Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
  12. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
  13. Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
  14. Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
  15. Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
  16. Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
  17. Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
  18. Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
  19. Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
  20. Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
  21. Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
  22. Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
  23. Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
  24. Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

Методы нанесения татуировки Xenopus laevis с помощью ротационной тату-машинки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.