Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) может характеризовать структурную динамику белков специфичным для остатков образом. Мы предоставляем практический протокол для записи экспериментов с релаксацией NMR 15NR 1 и R2 и гетероядерным эффектом Оверхаузера {1H}-15N (hetNOE), чувствительным к масштабу от пикосекунд до наносекунд.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
NMR 15N Релаксационные эксперименты для исследования пикосекундной и наносекундной структурной динамики белков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволяет изучать белки в растворе и при физиологических температурах. Часто либо амидные группы белкового скелета, либо метильные группы в боковых цепях используются в качестве репортеров структурной динамики белков. Исследование структурной динамики белковой основы глобулярных белков на меченых 15N и полностью протонированных образцах обычно хорошо работает для белков с молекулярной массой до 50 кДа. При применении дейтерации боковых цепей в сочетании с спектроскопией, оптимизированной с поперечной релаксацией (TROSY), этот предел может быть увеличен до 200 кДа для глобулярных белков и до 1 МДа, когда основное внимание уделяется боковым цепям. Когда исследуются внутренне неупорядоченные белки (IDP) или белки с внутренне неупорядоченными областями (IDR), эти ограничения по весу не применяются, но могут выходить далеко за их пределы. Причина в том, что МВУ или РДЭ, характеризующиеся высокой внутренней гибкостью, часто динамически разъединяются. Различные методы ЯМР позволяют получить представление о структурной динамике белка с атомным разрешением в широком диапазоне временных масштабов, от пикосекунд до часов. Стандартные измерения релаксации 15Н дают обзор внутренней гибкости белка и характеризуют динамику белковой основы на быстром пико- и наносекундном временном масштабе. В данной статье представлен практический протокол для постановки и записи экспериментов NMR 15N R1, R2 и гетеронуклеарного эффекта Оверхаузера (hetNOE). Мы показываем примерные данные и объясняем, как их просто качественно интерпретировать перед любым более сложным анализом.
Введение
Функция белка определяется не только его трехмерной структурой, но и его структурной динамикой, охватывающей его внутреннюю гибкость и структурные переходы между различными конформациями, которые будет принимать белок. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволяет исследовать структурную динамику белков в растворе 1,2,3. Последние разработки в области твердотельного ЯМР, детектируемого протонами, также позволяют охарактеризовать динамику белка в менее растворимом состоянии, например, липидной бислойной мембраны 4,5,6
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка образцов ЯМР
Примечание: Изотопное мечение белков выполняется для ЯМР более высокой размерности и расширенных экспериментов ЯМР. После того как экспрессия белка в E. coli и очистка белка были установлены с использованием насыщенных сред (например, Лурия-Бертани [LB] или 2-кратного триптонного экстракта дрожжей [2YT]) с выходом в несколько миллиграммов на литр, получение изотопно меченного образца ЯМР обычно является относительно простым.
- Для мечения изотопов используйте минимальную среду M9 для экспрессии генов, где хлорид аммония 15N является еди....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ниже приведены некоторые примеры данных релаксации ЯМР, зарегистрированных на везикулярном белке SNARE Synaptobrevin-2 (1-96), часто называемом VAMP2 (везикулоассоциированный белок 2). Для регистрации данных ЯМР мы использовали образец 171 мкМ 15N Synaptobrevin-2 (1-96) (далее названный Syb-2) в буфере 50 мМ MES (pH 6,0), содержащем 150 мМ NaCl, 0,1 мМ TCEP и 1 мМ ЭДТА. Все экспериментальные данные регистрировали при температуре 278,15 К с использованием объема 250 мкл, заполненного в 3-миллиметровую пробирку .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе описывалась постановка экспериментов по релаксации ЯМР 15N, проведенных Lakomek et al.69 и Stief et al.70. Мы сосредоточились на последовательностях импульсов ЯМР с использованием схемы детектирования HSQC с повышенной чувствительностью. Эксперименты с 15N R1 и R1ρ реализованы так, как подробно описаны Stief et al.70, а эксперимент с hetNOE описан Lakomek et al.69.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Благодарности
Мы благодарим Мелинду Джасперт и Кевина Бочински за полезные дискуссии. Н.Л. благодарит Немецкий научный фонд за финансирование в рамках программы Гейзенберга (грант DFG No 433700474). Эта работа также поддерживается проектом «Вирусологические и иммунологические детерминанты патогенеза COVID-19 – уроки подготовки к будущим пандемиям (KA1-Co-02 «COVIPA»), грантом Фонда инициатив и сетевого взаимодействия Ассоциации им. Гельмгольца. Мы признательны за щедрый доступ к Юлих-Дюссельдорфскому биомолекулярному ЯМР-центру, совместно управляемому Исследовательским центром Юлиха и Дюссельдорфским университетом имени Генриха Гейне (HHU).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Спектрометр Bruker 600 МГц AVANCE III HD  | Bruker | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html | NMR |
Ссылки
- Sekhar, A., Kay, L. E. An NMR view of protein dynamics in health and disease. Annu Rev Biophys. 48, 297-319 (2019).
- Rosenzweig, R., Kay, L. E. Bringing dynamic molecular machines into focus by methyl-TROSY NMR. Annu Rev Biochem. 83, 291-315 (2014).
- Pa....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
