Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Надежная митохондриальная изоляция из сердечной ткани грызунов

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

23 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Биоэнергетические и метаболомные исследования митохондрий выявили их многогранную роль во многих заболеваниях, но методы выделения этих органелл различаются. Описанный здесь метод способен очищать высококачественные митохондрии из нескольких тканевых источников. Качество определяется соотношением респираторного контроля и другими показателями, оцениваемыми с помощью респирометрии с высоким разрешением.

Аннотация

Митохондриальная изоляция практикуется на протяжении десятилетий в соответствии с процедурами, установленными пионерами в области молекулярной биологии и биохимии для изучения метаболических нарушений и заболеваний. Постоянное качество митохондрий необходимо для правильного исследования физиологии и биоэнергетики митохондрий; Тем не менее, существует множество различных опубликованных методов изоляции для исследователей. Несмотря на то, что различные экспериментальные стратегии требуют разных методов выделения, основные принципы и процедуры схожи. В этом протоколе подробно описывается метод, способный извлекать хорошо связанные митохондрии из различных источников тканей, включая мелких животных и клетки. Описанные этапы включают в себя вскрытие органов, митохондриальную очистку, количественное определение белка и различные проверки качества. Основным показателем контроля качества, используемым для определения высококачественных митохондрий, является коэффициент респираторного контроля (RCR). RCR — это отношение частоты дыхания во время окислительного фосфорилирования к скорости в отсутствие АДФ. Обсуждаются альтернативные метрики. Несмотря на то, что с помощью этого протокола можно получить высокие значения RCR относительно их тканевого источника, несколько этапов могут быть оптимизированы в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей. Эта процедура надежна и неизменно приводит к выделению митохондрий со значениями RCR выше среднего на животных моделях и в тканевых источниках.

Введение

Митохондрии — это субклеточные органеллы, которые создают цитоплазматические энергетические условия, оптимизированные для определенных функций клетки. В то время как исследования на клеточном, тканевом и биологическом уровнях могут дать представление о функции митохондрий, выделение органелл обеспечивает уровень экспериментального контроля, невозможный в противном случае. Митохондриальная изоляция проводится с 1940-х годов, что позволяет проводить механистические исследования метаболизма и дыхания в различных клетках и тканях. Историческая значимость митохондрий также хорошо задокументирована3. Являясь основными продуцентами АТФ, митохондрии играют множество ключевых ролей, жизненно важных для оптимального функционирования клеток и органов4. В митохондриальном матриксе субстраты окисляются в рамках цикла TCA, образуя восстановительные эквиваленты и мобильные переносчики электронов, такие как NADH и UQH2 5,6. Цитохром С является третьим основным подвижным переносчиком электронов в сети митохондриальных биохимических реакций7. Затем эти молекулы окисляются трансмембранными комплексами электронно-транспортной системы (ETS), встроенными во внутреннюю митохондриальную мембрану8. Редокс-реакции ETS сопряжены с транслокацией протонов из матрицы в межмембранное пространство. Эти процессы создают электрохимический протонный градиент, который используется для фосфорилирования АДФ с Pi с помощью F1F0 АТФ-синтазы для производства АТФ 9,10. Отдельные процессы, происходящие в каждом комплексе, могут быть изучены с помощью респирометрии высокого разрешения с использованием электродов типа Кларка или микропланшетных анализов потребления кислорода11,12. Кроме того, модели заболеваний и методы лечения с использованием изолированных митохондрий могут определить влияние или важность функции митохондрий в прогрессировании определенных патологий. Это оказалось плодотворным в области кардиологии, где изменения в доставке топлива и субстрата были использованы для выяснения того, как митохондриальная дисфункция влияет на сердечную недостаточность 13,14,15,16. Также известно, что митохондрии влияют на развитие других заболеваний, таких как диабет, рак, ожирение, неврологические расстройства и миопатии17,18. Таким образом, использование изолированных или очищенных митохондрий позволяет проводить механистические исследования окислительного метаболизма и продукции АТФ в исходной ткани.

Нет недостатка в протоколах выделения митохондрий из-за их важности в биоэнергетических исследованиях. Кроме того, можно найти высокоспецифичные методы, адаптированные к субпопуляциям митохондрий в тканях и клетках19,20. Основные процедурные этапы при использовании методов выделения схожи, но для улучшения количества и качества митохондрий могут быть внесены изменения в состав буфера, этапы гомогенизации и спины центрифугирования. Изменения в этих аспектах основаны на метаболических потребностях ткани, общей функции органов, плотности митохондрий и других факторах. В таких тканях, как печень и скелетные мышцы, используются портативные гомогенизаторы для сохранения целостности митохондрий и ограничения повреждения митохондриальных мембран21. Тем не менее, при выделении из почек некоторые протоколы предлагают использовать гомогенизацию с ручным приводом или коммерческие наборы для получения лучших результатов22. Несмотря на то, что оба метода позволяют получить функциональные митохондрии, качество органелл может быть нарушено из-за дополнительного времени, необходимого для полной изоляции с использованием этих протоколов. Центрифугирование также жизненно важно для экстракции митохондриального белка, поскольку оно отделяет клеточные компоненты, такие как ядра и другие органеллы, от митохондрий23. В процессе выделения обсуждается вопрос о том, следует ли применять дифференциальное центрифугирование или центрифугирование на основе плотности для получения более чистыхизолятов 24. В то время как центрифугирование по плотности может отделить митохондрии от органелл аналогичного удельного веса, таких как пероксисомы, точно не установлено, лучше ли митохондрии этих методов представляют функцию органелл in situ по сравнению с митохондриями, выделенными с помощью дифференциального центрифугирования. В области физиологии митохондрий предпочтение отдается центрифугированию, основанному на плотности, которое может быть легко изменено для повышения чистоты изолята. Следует учитывать до начала эксперимента изменения в перегрузках, продолжительности центрифугирования и количестве спинов центрифугирования из-за их влияния на очистку митохондрий. Кроме того, митохондриальная ресуспензия, возможно, самый важный этап во время изоляции, сильно различается между исследованиями, с использованием соскабливания, вихревого смешивания или гомогенизации 23,25,26. Механическая ресуспендия этих типов может быть слишком абразивной и нарушить целостность мембраны митохондрий. По этой причине для исправления этого следует проводить бережную стирку. Несмотря на обилие модуляций и предлагаемых методологий, существует все меньше всеобъемлющих протоколов с высокой воспроизводимостью и адаптируемостью для моделей грызунов.

Описанные здесь методы представляют собой подробный, надежный и высоковоспроизводимый протокол, который позволяет получить очищенные, хорошо связанные митохондрии из сердечной ткани мелких животных. Как показано, этот метод может быть легко адаптирован к конкретным потребностям каждого эксперимента и/или лабораторной среды для выделения митохондрий из почек, печени и культивируемых клеток. Дальнейшие модификации могут быть сделаны для выделения митохондрий из тканей и других животных, не перечисленных здесь. Предоставляются буферные рецепты, используемые для всех изоляций, которые при необходимости могут быть изменены. Как и в других опубликованных протоколах, реализованы моторизованная гомогенизация и дифференциальное центрифугирование; Тем не менее, корректируются как время сдвига, так и сила, с которой образцы центрифугируются, чтобы стабильно доставлять высококачественные митохондриальные изоляты, в зависимости от источника изоляции. Примечательно, что этот протокол отличается от других тем, что для ресуспендирования гранулированных митохондрий используется щадящее промывание с помощью пипетирования, что помогает сохранить целостность митохондриальной мембраны и поддерживать общую функциональность органелл. Митохондриальный белок количественно определяется либо путем определения общего белка, либо путем измерения активности цитратсинтазы. Полезность и широкая применимость этого метода изоляции также подтверждаются значениями коэффициентов респираторного контроля (RCR), достигаемыми в различных организмах и тканевых источниках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование и лечение всех позвоночных животных проводилось в соответствии с утвержденными протоколами, рассмотренными и принятыми Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете штата Мичиган. Этот протокол был разработан с использованием как самцов, так и самок морских свинок Хартли и крыс Sprague Dawley (SD). Для выделения сердечных митохондрий от морских свинок животных умерщвляли в возрасте от 4 до 6 недель (300-450 г). Сердечные митохондрии от крыс с СД обоего пола были получены в возрасте 10-13 недель (250-400 г). Рецепты буферов описаны в таблице 1 и должны быть подготовлены заранее. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Перед началом изоляции пометьте две центрифугирующие пробирки объемом 50 мл как «Spins 1 и 2» и «Spin 3».
  2. Поместите на лед пробирки, только что размороженный изоляционный буфер (IB), острые ножницы для измельчения, собранный гомогенизационный зонд и стакан объемом 5 мл или контейнер аналогичного размера.
  3. Поместите только что размороженный дыхательный буфер (ОРД) в инкубатор, чтобы он согрелся для последующих дыхательных анализов.
  4. Предварительно охладите охлаждаемую центрифугу до 4 °C.
  5. Убедитесь, что все оборудование расставлено по местам и в пробирку с маркировкой «Спины 1 и 2» добавлено 20 μл 7-15 ЕД/мг протеазы из Bacillus licheniformis .
  6. Настройте гравитационно-зависимую систему давления для перфузии с помощью канюляции с использованием буфера для кардиоплегии (CB, таблица 1), стеклянной канюли и пластиковой трубки с прикрепленным клапаном запорного крана.
  7. Разложите хирургические инструменты и приложите к себе подходящие ножницы и щипцы для рассечения и канюляции сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся вода должна быть чистого качества (18,2 МОм·см)

2. Диссекция тканей

  1. Вводить животным стерильный гепарин сульфат внутрибрюшинно в дозе 500 ЕД/кг.
  2. Дайте животному посидеть в индукционной камере в течение 15 минут после введения гепарина. В течение этого времени подайте 2 л/мин чистого газаO2 , чтобы полностью насытить животных кислородом, успокоить их и свести к минимуму любой стресс, который может иметь неблагоприятные последствия для представляющих интерес тканей.
  3. Начните индукцию анестезии непрерывным потоком изофлурана в дозе 0,5%. Через 1 минуту увеличьте до 1%. Продолжайте увеличивать на 1% каждую минуту, пока не будет достигнуто 5%. Как только температура достигнет 5%, подождите 1 минуту и следите за дыханием животного.
  4. Как только дыхание замедлится и станет затрудненным (примерно на отметке 6,5 минут), выключите поток изофлурана и кислорода.
  5. Быстро извлеките животное из индукционной камеры и проверьте подходящую глубину анестезии, сжимая лапу и проверяя роговичный рефлекс. Если животное реагирует на любой из стимулов, поместите его обратно в индукционную камеру, повторно внесите анестезию и повторите проверку глубины анестезии.
  6. Как только будет достигнута надлежащая глубина анестезии, быстро обезглавьте с помощью гильотины, чтобы повредить шейный отдел позвоночника, и положите лежащее тело на лед.
  7. Сделайте два параллельных вертикальных разреза от ключиц, идущие вдоль боковой грудной клетки вниз по длине грудной клетки. Убедитесь, что разрезы достаточно глубокие, чтобы разрезать ребра на боковой стороне грудной клетки, но избегайте повреждения внутригрудных структур, таких как сердце или магистральные сосуды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры вертикальных разрезов зависят от используемого животного. Если вы используете морских свинок и крыс, режьте до диафрагмы (примерно 6,35 см для крыс и 11 см для морских свинок). При использовании мышей выполните стандартную торакотомию27.
  8. Обнажите сердце с помощью гемостата, чтобы сместить переднюю грудную клетку, и запачкайте обнаженную грудную полость льдом. Этот этап сводит к минимуму время теплой ишемии и повышает жизнеспособность изолированных органелл.
  9. С помощью пинцета можно тупо рассечь вилочковую железу и перикард и полностью обнажить сердце.
  10. С помощью щипцов наложите мягкое нижнее вытяжение на сердце, чтобы обнажить и идентифицировать аорту. Аорта – это самый толстый большой сосуд, отходящий от основания сердца. Другие крупные сосуды, такие как легочная вена, заметно более прозрачны, чем аорта.
  11. Разрежьте аорту примерно на 4-6 мм выше корня аорты, но ниже точек разветвления сонной артерии.
  12. Канюлировать аорту и перфузировать сердце 28,29 ледяным раствором кардиоплегии (КБ) с использованием гравитационно-зависимой головки давления до тех пор, пока коронарные артерии не очистятся от крови и орган не побледнеет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупных грызунов хорошо подходит диаметр канюли 1,8-2,2 мм, в то время как для более мелких грызунов рекомендуется диапазон диаметров 1,4-1,8 мм. Ретроперфузия должна занимать не более 15-30 с, чтобы коронарные сосуды очистились от крови.
  13. Изолируйте миокард желудочков, рассекая предсердия, хрящевую клапанную ткань и жировые ткани.
  14. Поместите желудочки в предварительно охлажденный стакан объемом 10 мл, содержащий 0,1-0,2 мл ледяного IB.
  15. Острыми хирургическими ножницами измельчите ткань до тех пор, пока кусочки не станут примерно 1 мм3.

3. Очистка митохондрий и количественное определение белка

  1. Переложите измельченную салфетку в предварительно охлажденную центрифужную пробирку с маркировкой «Spins 1 and 2», содержащую раствор протеазы.
  2. Добавьте ледяной IB до конечного объема 25 мл.
  3. С помощью моторизованного ручного роторно-статорного гомогенизатора диспергируйте ткань при 18 000 об/мин на льду в течение 20-25 с.
  4. Центрифугируйте гомогенизированную ткань в пробирке с маркировкой «Spins 1 и 2» при 8 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость (которая содержит протеазу), насыпав ее в контейнер для отходов, и аккуратно промойте гранулу 5 мл IB, чтобы удалить остатки протеазы.
  6. После удаления ополаскивателя повторно суспендируйте гранулу свежим ледяным IB до конечного объема 25 мл с помощью мягкого вихря.
  7. Центрифугируйте при 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  8. Удалите надосадочную жидкость (содержит митохондрии), аккуратно налив ее в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл с надписью «Spin 3». Во время заливки следите за тем, чтобы не сместить рыхлую верхнюю часть гранулы. В качестве альтернативы для сбора надосадочной жидкости можно использовать переводную пипетку или полоску.
  9. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 8000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  10. Откажитесь от образовавшейся надосадочной жидкости и сохраните митохондриальную гранулу.
  11. Используйте безворсовую салфетку, чтобы впитать излишки надосадочной жидкости с внутренней стенки трубки, стараясь не повредить гранулу. Держите гранулу на льду при температуре 4 °C как можно дольше.
  12. Чтобы ресуспендировать митохондрии, добавьте 80 мкл ледяного IB на дно трубки. Аккуратно ресуспендируйте гранулу, многократно промывая IB над гранулой.
  13. Чтобы избежать образования пузырьков, установите микропипетку на аспирацию и подачу объема от 40 до 60 μл.
  14. По мере диспергирования митохондриальных гранул увеличивайте объем микропипетки, чтобы эффективно ресуспендировать гранулированные митохондрии. Не прикасайтесь к грануле кончиком пипетки и избегайте образования пузырьков.
  15. После ресуспензии перенесите митохондрии в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку и пометьте ее как стоковые митохондрии. Запишите общий объем ресуспензии.
  16. Чтобы определить концентрацию митохондриального белка в образце, проведите анализ общего белка с использованием хорошо известных анализов белка BCA или Брэдфорда, как определено в инструкции производителя.
    Примечание: Альтернативной или дополнительной стратегией для оценки выхода является определение активности цитратсинтазы. Для справки, содержание митохондрий может быть количественно определено в соответствии с протоколом, описанным в Vinnakota et al.30.

4. Проверки контроля качества

  1. В предварительно охлажденной микроцентрифужной пробирке разбавьте митохондриальный запас до желаемой рабочей концентрации с IB.
    Примечание: Митохондриальные запасы разбавляют до 40 мг/мл для работы в конечной концентрации 0,1 мг/мл для респирометрических анализов при использовании изолятов из сердечной ткани.
  2. Промойте оксиграфические камеры, пробки и микролитровые шприцы десять раз дистиллированной водой, чтобы очистить их перед использованием в респирометрических анализах.
  3. Чтобы проверить жизнеспособность и качество митохондриальных изолятов, загрузите 2,3 мл дыхательного буфера (RB) в камеры оксиграфа и дайте сигналу потребления кислорода уравновеситься при 37 °C в течение примерно 10 минут или когда скорость близка к 0.
  4. Как только сигнал уравновесится, нажмите на стопоры и втяните избыточный буфер, который выходит из капилляра пробки.
  5. Добавьте 1 мМ EGTA с помощью микролитрового шприца, чтобы хелатировать остаточный кальций в буферах или митохондриальном образце.
  6. Чтобы улучшить дыхание, добавьте 5 мМ пирувата натрия и 1 мМ L-малата.
  7. После добавления субстратов добавьте болюс разбавленных митохондрий для достижения рабочей концентрации и дайте дышать в течение 5 минут. Этот период называется LEAK или дыханием состояния 2.
  8. На отметке 5 минут добавьте болюс 500 мкМ АДФ, чтобы начать дыхание в состоянии 3, также называемом OXHPOS, и дайте митохондриям дышать до аноксии.
  9. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания (RCR), разделив максимальную скорость потребления кислорода в состоянии 3 на скорость потребления кислорода непосредственно перед добавлением ADP в состоянии 2 (см. рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативное выражение RCR 1 - 1/RCR также может быть использовано в качестве метрики качества, которая ограничена от 0 до 1; однако это затрудняет дифференциацию качества с помощью этой метрики, когда RCR > 10 (см. рис. 2).
  10. Промойте камеры и пробки 10 раз чистой водой, чтобы очистить оксиграф для последующих анализов. Если респирометрия завершена, заполните камеры 70% этанолом и поместите пробки в камеры до следующего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После завершения митохондриальной изоляции качество и функциональность изолятов должны быть проверены путем количественной оценки скорости потребления кислорода (JO2) с помощью респирометрии с высоким разрешением. Для этого митохондриальные запасы разбавляли до 40 мг/мл, чтобы обеспечить рабочие концентрации 0,1 мг/мл в 2 мл RB для всех анализов респирометрии с использованием изолированных сердечных митохондрий. Дыхание подпитывали 5 мМ пирувата натрия и 1 мМ L-малата в присутствии 1 мМ EGTA, хелатора...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Следование методам, кратко описанным в этом протоколе, обеспечит выделение хорошо связанных митохондрий из сердечной ткани мелких грызунов, в дополнение к другим типам тканей и источникам. В целом, процесс должен занять в общей сложности 3-3,5 часа, в течение которых все ткани животных, образцы и изоляты должны оставаться на льду при температуре 4 °C, насколько это возможно, чтобы ограничить деградацию. Эта процедура надежна и может быть изменена несколькими способами, чтобы лучше соотве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что раскрывать нечего.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность Дэниелу А. Бирду и Кальяну К. Виннакоте за их основополагающий вклад в этот протокол. Эта работа была профинансирована грантом NSF CAREER MCB-2237117.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки
1,7 мл Стеклянный стаканДля диссекции органов и измельчения
50 мл ЦентрифугаЦентрифуга
Аденозин 5'-дифосфат монокалия соль дигидратSigma A5285Респирометрические анализы
BSA Набор для анализа белкаThermo ScentificPI23225количественное определение митохондриального белка
DextroseSigma DX0145Для буфера (CB)
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота Сигма E4378Для буферов (CB и IB) и респирометрических анализов
Стеклянная канюляRadnotiПерфузия сердца морской свинки и крысы
Гепарин натрия слизистая свиньяSigma SRE0027-250KUAnimal IP injection
РеспирометрЭлектрод типа Кларка; оксиграф с камерами 2 мл
Индукционная камера
ИзофлуранSigma 792632Обезболивающее 
L-яблочная кислотаSigma 02288-50GРеспирометрические анализы
Магния хлорид гексагидратSigma M9272Для буфера (RB)
MannitolSigma MX0214Для буферных (IB)
Микролитровые шприцыРазмеры от 5– 50 & микро; L
Считывательдолжен быть способен к инкубации при 37 °°; С 
MOPSSigma 475898Для всех буферов
O2 бак
OMNI THQ ГомогенизаторOMNI International 12-500Аналогичные роторные статорные гомогенизаторы будут работать
пипеткамиобъемом от 2  20 &микро; L; 20– 200 &микро; L; 200– 1000 &микро;
L Хлорид калияSigma P3911Для буферов (RB и CB)
Двухосновной фосфат калияSigma 795496Для буферов (IB и RB)
Протеаза из Bacillus licheniformisSigma P5459
Натрия хлоридSigma S9888Для буфера (CB)
Пируват натрияБиореагенты ФишераBP356-100Респирометрические анализы
СахарозаSigma 8510-OPДля буфера (IB)
для хирургического вскрытияЗависит от животного и источника тканей
НастольнаяДолжна охладиться до 4°°; С 
10 мл высокого разрешения микропланшетов Набор центрифуга

Ссылки

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Очистка митохондрийкоэффициент дыхательного контроляколичественное определение белкадиссекция органовбиоэнергетический дефицитгранулы фосфата кальциясердечная недостаточностьфизиология митохондрий
Надежная митохондриальная изоляция из сердечной ткани грызунов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.