Надежная митохондриальная изоляция из сердечной ткани грызунов

Краткое содержание

Биоэнергетические и метаболомные исследования митохондрий выявили их многогранную роль во многих заболеваниях, но методы выделения этих органелл различаются. Описанный здесь метод способен очищать высококачественные митохондрии из нескольких тканевых источников. Качество определяется соотношением респираторного контроля и другими показателями, оцениваемыми с помощью респирометрии с высоким разрешением.

Аннотация

Митохондриальная изоляция практикуется на протяжении десятилетий в соответствии с процедурами, установленными пионерами в области молекулярной биологии и биохимии для изучения метаболических нарушений и заболеваний. Постоянное качество митохондрий необходимо для правильного исследования физиологии и биоэнергетики митохондрий; Тем не менее, существует множество различных опубликованных методов изоляции для исследователей. Несмотря на то, что различные экспериментальные стратегии требуют разных методов выделения, основные принципы и процедуры схожи. В этом протоколе подробно описывается метод, способный извлекать хорошо связанные митохондрии из различных источников тканей, включая мелких животных и клетки. Описанные этапы включают в себя вскрытие органов, митохондриальную очистку, количественное определение белка и различные проверки качества. Основным показателем контроля качества, используемым для определения высококачественных митохондрий, является коэффициент респираторного контроля (RCR). RCR — это отношение частоты дыхания во время окислительного фосфорилирования к скорости в отсутствие АДФ. Обсуждаются альтернативные метрики. Несмотря на то, что с помощью этого протокола можно получить высокие значения RCR относительно их тканевого источника, несколько этапов могут быть оптимизированы в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей. Эта процедура надежна и неизменно приводит к выделению митохондрий со значениями RCR выше среднего на животных моделях и в тканевых источниках.

Введение

Митохондрии — это субклеточные органеллы, которые создают цитоплазматические энергетические условия, оптимизированные для определенных функций клетки. В то время как исследования на клеточном, тканевом и биологическом уровнях могут дать представление о функции митохондрий, выделение органелл обеспечивает уровень экспериментального контроля, невозможный в противном случае. Митохондриальная изоляция проводится с 1940-х годов, что позволяет проводить механистические исследования метаболизма и дыхания в различных клетках и тканях^. Историческая значимость митохондрий также хорошо задокументирована³. Являясь основными продуцентами АТФ, митохондрии играют множество ключевых ролей, жизненно важных для оптимального функционирования клеток и органов⁴. В митохондриальном матриксе субстраты окисляются в рамках цикла TCA, образуя восстановительные эквиваленты и мобильные переносчики электронов, такие как NADH и UQH₂ ^5,6. Цитохром С является третьим основным подвижным переносчиком электронов в сети митохондриальных биохимических реакций⁷. Затем эти молекулы окисляются трансмембранными комплексами электронно-транспортной системы (ETS), встроенными во внутреннюю митохондриальную мембрану⁸. Редокс-реакции ETS сопряжены с транслокацией протонов из матрицы в межмембранное пространство. Эти процессы создают электрохимический протонный градиент, который используется для фосфорилирования АДФ с Pi с помощью F₁F₀ АТФ-синтазы для производства АТФ ^9,10. Отдельные процессы, происходящие в каждом комплексе, могут быть изучены с помощью респирометрии высокого разрешения с использованием электродов типа Кларка или микропланшетных анализов потребления кислорода^11,12. Кроме того, модели заболеваний и методы лечения с использованием изолированных митохондрий могут определить влияние или важность функции митохондрий в прогрессировании определенных патологий. Это оказалось плодотворным в области кардиологии, где изменения в доставке топлива и субстрата были использованы для выяснения того, как митохондриальная дисфункция влияет на сердечную недостаточность 13,14,15,16. Также известно, что митохондрии влияют на развитие других заболеваний, таких как диабет, рак, ожирение, неврологические расстройства и миопатии^17,18. Таким образом, использование изолированных или очищенных митохондрий позволяет проводить механистические исследования окислительного метаболизма и продукции АТФ в исходной ткани.

Нет недостатка в протоколах выделения митохондрий из-за их важности в биоэнергетических исследованиях. Кроме того, можно найти высокоспецифичные методы, адаптированные к субпопуляциям митохондрий в тканях и клетках^19,20. Основные процедурные этапы при использовании методов выделения схожи, но для улучшения количества и качества митохондрий могут быть внесены изменения в состав буфера, этапы гомогенизации и спины центрифугирования. Изменения в этих аспектах основаны на метаболических потребностях ткани, общей функции органов, плотности митохондрий и других факторах. В таких тканях, как печень и скелетные мышцы, используются портативные гомогенизаторы для сохранения целостности митохондрий и ограничения повреждения митохондриальных мембран²¹. Тем не менее, при выделении из почек некоторые протоколы предлагают использовать гомогенизацию с ручным приводом или коммерческие наборы для получения лучших результатов²². Несмотря на то, что оба метода позволяют получить функциональные митохондрии, качество органелл может быть нарушено из-за дополнительного времени, необходимого для полной изоляции с использованием этих протоколов. Центрифугирование также жизненно важно для экстракции митохондриального белка, поскольку оно отделяет клеточные компоненты, такие как ядра и другие органеллы, от митохондрий²³. В процессе выделения обсуждается вопрос о том, следует ли применять дифференциальное центрифугирование или центрифугирование на основе плотности для получения более чистых^{изолятов 24}. В то время как центрифугирование по плотности может отделить митохондрии от органелл аналогичного удельного веса, таких как пероксисомы, точно не установлено, лучше ли митохондрии этих методов представляют функцию органелл in situ по сравнению с митохондриями, выделенными с помощью дифференциального центрифугирования. В области физиологии митохондрий предпочтение отдается центрифугированию, основанному на плотности, которое может быть легко изменено для повышения чистоты изолята. Следует учитывать до начала эксперимента изменения в перегрузках, продолжительности центрифугирования и количестве спинов центрифугирования из-за их влияния на очистку митохондрий. Кроме того, митохондриальная ресуспензия, возможно, самый важный этап во время изоляции, сильно различается между исследованиями, с использованием соскабливания, вихревого смешивания или гомогенизации 23,25,26. Механическая ресуспендия этих типов может быть слишком абразивной и нарушить целостность мембраны митохондрий. По этой причине для исправления этого следует проводить бережную стирку. Несмотря на обилие модуляций и предлагаемых методологий, существует все меньше всеобъемлющих протоколов с высокой воспроизводимостью и адаптируемостью для моделей грызунов.

Описанные здесь методы представляют собой подробный, надежный и высоковоспроизводимый протокол, который позволяет получить очищенные, хорошо связанные митохондрии из сердечной ткани мелких животных. Как показано, этот метод может быть легко адаптирован к конкретным потребностям каждого эксперимента и/или лабораторной среды для выделения митохондрий из почек, печени и культивируемых клеток. Дальнейшие модификации могут быть сделаны для выделения митохондрий из тканей и других животных, не перечисленных здесь. Предоставляются буферные рецепты, используемые для всех изоляций, которые при необходимости могут быть изменены. Как и в других опубликованных протоколах, реализованы моторизованная гомогенизация и дифференциальное центрифугирование; Тем не менее, корректируются как время сдвига, так и сила, с которой образцы центрифугируются, чтобы стабильно доставлять высококачественные митохондриальные изоляты, в зависимости от источника изоляции. Примечательно, что этот протокол отличается от других тем, что для ресуспендирования гранулированных митохондрий используется щадящее промывание с помощью пипетирования, что помогает сохранить целостность митохондриальной мембраны и поддерживать общую функциональность органелл. Митохондриальный белок количественно определяется либо путем определения общего белка, либо путем измерения активности цитратсинтазы. Полезность и широкая применимость этого метода изоляции также подтверждаются значениями коэффициентов респираторного контроля (RCR), достигаемыми в различных организмах и тканевых источниках.

Протокол

Использование и лечение всех позвоночных животных проводилось в соответствии с утвержденными протоколами, рассмотренными и принятыми Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете штата Мичиган. Этот протокол был разработан с использованием как самцов, так и самок морских свинок Хартли и крыс Sprague Dawley (SD). Для выделения сердечных митохондрий от морских свинок животных умерщвляли в возрасте от 4 до 6 недель (300-450 г). Сердечные митохондрии от крыс с СД обоего пола были получены в возрасте 10-13 недель (250-400 г). Рецепты буферов описаны в таблице 1 и должны быть подготовлены заранее. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

1. Перед началом изоляции пометьте две центрифугирующие пробирки объемом 50 мл как «Spins 1 и 2» и «Spin 3».
2. Поместите на лед пробирки, только что размороженный изоляционный буфер (IB), острые ножницы для измельчения, собранный гомогенизационный зонд и стакан объемом 5 мл или контейнер аналогичного размера.
3. Поместите только что размороженный дыхательный буфер (ОРД) в инкубатор, чтобы он согрелся для последующих дыхательных анализов.
4. Предварительно охладите охлаждаемую центрифугу до 4 °C.
5. Убедитесь, что все оборудование расставлено по местам и в пробирку с маркировкой «Спины 1 и 2» добавлено 20 μл 7-15 ЕД/мг протеазы из Bacillus licheniformis .
6. Настройте гравитационно-зависимую систему давления для перфузии с помощью канюляции с использованием буфера для кардиоплегии (CB, таблица 1), стеклянной канюли и пластиковой трубки с прикрепленным клапаном запорного крана.
7. Разложите хирургические инструменты и приложите к себе подходящие ножницы и щипцы для рассечения и канюляции сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся вода должна быть чистого качества (18,2 МОм·см)

2. Диссекция тканей

1. Вводить животным стерильный гепарин сульфат внутрибрюшинно в дозе 500 ЕД/кг.
2. Дайте животному посидеть в индукционной камере в течение 15 минут после введения гепарина. В течение этого времени подайте 2 л/мин чистого газа_O2 , чтобы полностью насытить животных кислородом, успокоить их и свести к минимуму любой стресс, который может иметь неблагоприятные последствия для представляющих интерес тканей.
3. Начните индукцию анестезии непрерывным потоком изофлурана в дозе 0,5%. Через 1 минуту увеличьте до 1%. Продолжайте увеличивать на 1% каждую минуту, пока не будет достигнуто 5%. Как только температура достигнет 5%, подождите 1 минуту и следите за дыханием животного.
4. Как только дыхание замедлится и станет затрудненным (примерно на отметке 6,5 минут), выключите поток изофлурана и кислорода.
5. Быстро извлеките животное из индукционной камеры и проверьте подходящую глубину анестезии, сжимая лапу и проверяя роговичный рефлекс. Если животное реагирует на любой из стимулов, поместите его обратно в индукционную камеру, повторно внесите анестезию и повторите проверку глубины анестезии.
6. Как только будет достигнута надлежащая глубина анестезии, быстро обезглавьте с помощью гильотины, чтобы повредить шейный отдел позвоночника, и положите лежащее тело на лед.
7. Сделайте два параллельных вертикальных разреза от ключиц, идущие вдоль боковой грудной клетки вниз по длине грудной клетки. Убедитесь, что разрезы достаточно глубокие, чтобы разрезать ребра на боковой стороне грудной клетки, но избегайте повреждения внутригрудных структур, таких как сердце или магистральные сосуды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры вертикальных разрезов зависят от используемого животного. Если вы используете морских свинок и крыс, режьте до диафрагмы (примерно 6,35 см для крыс и 11 см для морских свинок). При использовании мышей выполните стандартную торакотомию²⁷.
8. Обнажите сердце с помощью гемостата, чтобы сместить переднюю грудную клетку, и запачкайте обнаженную грудную полость льдом. Этот этап сводит к минимуму время теплой ишемии и повышает жизнеспособность изолированных органелл.
9. С помощью пинцета можно тупо рассечь вилочковую железу и перикард и полностью обнажить сердце.
10. С помощью щипцов наложите мягкое нижнее вытяжение на сердце, чтобы обнажить и идентифицировать аорту. Аорта – это самый толстый большой сосуд, отходящий от основания сердца. Другие крупные сосуды, такие как легочная вена, заметно более прозрачны, чем аорта.
11. Разрежьте аорту примерно на 4-6 мм выше корня аорты, но ниже точек разветвления сонной артерии.
12. Канюлировать аорту и перфузировать сердце ^28,29 ледяным раствором кардиоплегии (КБ) с использованием гравитационно-зависимой головки давления до тех пор, пока коронарные артерии не очистятся от крови и орган не побледнеет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупных грызунов хорошо подходит диаметр канюли 1,8-2,2 мм, в то время как для более мелких грызунов рекомендуется диапазон диаметров 1,4-1,8 мм. Ретроперфузия должна занимать не более 15-30 с, чтобы коронарные сосуды очистились от крови.
13. Изолируйте миокард желудочков, рассекая предсердия, хрящевую клапанную ткань и жировые ткани.
14. Поместите желудочки в предварительно охлажденный стакан объемом 10 мл, содержащий 0,1-0,2 мл ледяного IB.
15. Острыми хирургическими ножницами измельчите ткань до тех пор, пока кусочки не станут примерно 1 мм³.

3. Очистка митохондрий и количественное определение белка

1. Переложите измельченную салфетку в предварительно охлажденную центрифужную пробирку с маркировкой «Spins 1 and 2», содержащую раствор протеазы.
2. Добавьте ледяной IB до конечного объема 25 мл.
3. С помощью моторизованного ручного роторно-статорного гомогенизатора диспергируйте ткань при 18 000 об/мин на льду в течение 20-25 с.
4. Центрифугируйте гомогенизированную ткань в пробирке с маркировкой «Spins 1 и 2» при 8 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
5. Выбросьте надосадочную жидкость (которая содержит протеазу), насыпав ее в контейнер для отходов, и аккуратно промойте гранулу 5 мл IB, чтобы удалить остатки протеазы.
6. После удаления ополаскивателя повторно суспендируйте гранулу свежим ледяным IB до конечного объема 25 мл с помощью мягкого вихря.
7. Центрифугируйте при 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
8. Удалите надосадочную жидкость (содержит митохондрии), аккуратно налив ее в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл с надписью «Spin 3». Во время заливки следите за тем, чтобы не сместить рыхлую верхнюю часть гранулы. В качестве альтернативы для сбора надосадочной жидкости можно использовать переводную пипетку или полоску.
9. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 8000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
10. Откажитесь от образовавшейся надосадочной жидкости и сохраните митохондриальную гранулу.
11. Используйте безворсовую салфетку, чтобы впитать излишки надосадочной жидкости с внутренней стенки трубки, стараясь не повредить гранулу. Держите гранулу на льду при температуре 4 °C как можно дольше.
12. Чтобы ресуспендировать митохондрии, добавьте 80 мкл ледяного IB на дно трубки. Аккуратно ресуспендируйте гранулу, многократно промывая IB над гранулой.
13. Чтобы избежать образования пузырьков, установите микропипетку на аспирацию и подачу объема от 40 до 60 μл.
14. По мере диспергирования митохондриальных гранул увеличивайте объем микропипетки, чтобы эффективно ресуспендировать гранулированные митохондрии. Не прикасайтесь к грануле кончиком пипетки и избегайте образования пузырьков.
15. После ресуспензии перенесите митохондрии в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку и пометьте ее как стоковые митохондрии. Запишите общий объем ресуспензии.
16. Чтобы определить концентрацию митохондриального белка в образце, проведите анализ общего белка с использованием хорошо известных анализов белка BCA или Брэдфорда, как определено в инструкции производителя.
    Примечание: Альтернативной или дополнительной стратегией для оценки выхода является определение активности цитратсинтазы. Для справки, содержание митохондрий может быть количественно определено в соответствии с протоколом, описанным в Vinnakota et ^al.30.

4. Проверки контроля качества

1. В предварительно охлажденной микроцентрифужной пробирке разбавьте митохондриальный запас до желаемой рабочей концентрации с IB.
   Примечание: Митохондриальные запасы разбавляют до 40 мг/мл для работы в конечной концентрации 0,1 мг/мл для респирометрических анализов при использовании изолятов из сердечной ткани.
2. Промойте оксиграфические камеры, пробки и микролитровые шприцы десять раз дистиллированной водой, чтобы очистить их перед использованием в респирометрических анализах.
3. Чтобы проверить жизнеспособность и качество митохондриальных изолятов, загрузите 2,3 мл дыхательного буфера (RB) в камеры оксиграфа и дайте сигналу потребления кислорода уравновеситься при 37 °C в течение примерно 10 минут или когда скорость близка к 0.
4. Как только сигнал уравновесится, нажмите на стопоры и втяните избыточный буфер, который выходит из капилляра пробки.
5. Добавьте 1 мМ EGTA с помощью микролитрового шприца, чтобы хелатировать остаточный кальций в буферах или митохондриальном образце.
6. Чтобы улучшить дыхание, добавьте 5 мМ пирувата натрия и 1 мМ L-малата.
7. После добавления субстратов добавьте болюс разбавленных митохондрий для достижения рабочей концентрации и дайте дышать в течение 5 минут. Этот период называется LEAK или дыханием состояния 2.
8. На отметке 5 минут добавьте болюс 500 мкМ АДФ, чтобы начать дыхание в состоянии 3, также называемом OXHPOS, и дайте митохондриям дышать до аноксии.
9. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания (RCR), разделив максимальную скорость потребления кислорода в состоянии 3 на скорость потребления кислорода непосредственно перед добавлением ADP в состоянии 2 (см. рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативное выражение RCR 1 - 1/RCR также может быть использовано в качестве метрики качества, которая ограничена от 0 до 1; однако это затрудняет дифференциацию качества с помощью этой метрики, когда RCR > 10 (см. рис. 2).
10. Промойте камеры и пробки 10 раз чистой водой, чтобы очистить оксиграф для последующих анализов. Если респирометрия завершена, заполните камеры 70% этанолом и поместите пробки в камеры до следующего использования.

Результаты

После завершения митохондриальной изоляции качество и функциональность изолятов должны быть проверены путем количественной оценки скорости потребления кислорода (J_O2) с помощью респирометрии с высоким разрешением. Для этого митохондриальные запасы разбавляли до 40 мг/мл, чтобы обеспечить рабочие концентрации 0,1 мг/мл в 2 мл RB для всех анализов респирометрии с использованием изолированных сердечных митохондрий. Дыхание подпитывали 5 мМ пирувата натрия и 1 мМ L-малата в присутствии 1 мМ EGTA, хелатора кальция, и позволяли уравновеситься в течение 5 мин для установления дыхания Состояния 2. В этом состоянии нормы потребления кислорода должны составлять в среднем 45-55 пмоль/мл/с или 27-33 нмоль/мг/мин. Следите за электродозависимой скоростью потребления кислорода и при необходимости выполняйте соответствующие коррекции фона. Окислительное фосфорилирование (состояние 3) инициируется на отметке 5 мин болюсом 500 мкМ АДФ. Добавление субстрата и репрезентативная трассировка подробно описаны на рисунке 1. Функциональные митохондрии будут иметь немедленное увеличение J_O2 после добавления АДФ, которое варьируется в зависимости от источника ткани, как показано на рисунке 2. Без использования EGTA остаточный кальций оказывает переменное влияние на максимальные нормы J_O2 во время OXPHOS, в зависимости от концентрации митохондрий, доступности субстрата и других факторов окружающей среды. Буферный состав важен для сохранения целостности и функциональности митохондриальных мембран. Все рецепты буферов, упомянутые в протоколе, более подробно описаны в таблице 1 и могут быть использованы для всех митохондриальных препаратов, описанных в настоящем документе.

Успешное выделение митохондрий обозначается получением значений RCR, лежащих в заданном диапазоне для каждого вида и источника ткани, как показано в таблице 2. Основываясь на данных, собранных с использованием этого протокола, при выделении сердечных митохондрий у морских свинок, крыс или мышей RCR должны составлять ≥16, ≥8 и ≥5 соответственно. При выделении из печени или почек крысы RCR должны быть ≥6, в то время как RCR из клеток считаются приемлемыми, если выше 3,8. Если значения RCR падают ниже этих диапазонов или если есть качественные различия в повторных исследованиях, рекомендуется провести дополнительный анализ с новым RB и субстратами для исключения проблем, связанных с загрязнением. Несмотря на то, что преобразование 1-1/RCR ограничивает значения от 0 до 1, эта метрика не рекомендуется при сравнении качества митохондрий у разных полов или видов, когда значение RCR больше 10. По этой причине стандартные значения RCR (состояние 3/состояние 2 или OXPHOS/LEAK) количественно оценивались во время всех экспериментов. Информация о модуляциях, которые могут быть сделаны в этом протоколе для лучшей изоляции митохондрий от сердца, печени, почек и клеток мышей, подробно изложена в таблице 3.

Рисунок 1: Области интереса для контроля качества с использованием респирометрии высокого разрешения. Дыхательные камеры нагружали 2 мл RB и позволяли уравновеситься при 37 °C до тех пор, пока уровень потребления кислорода не приближался к 0. После уравновешивания добавляли 1 мМ EGTA, кальциевый хелатор, вместе с 5 мМ пируватом натрия и 1 мМ L-малатом. После добавления этих субстратов митохондрии добавляли в желаемой рабочей концентрации (0,1 мг/мл) и давали им дышать в течение 5 минут для достижения состояния дыхания 2 (желтый). На отметке 5 мин добавляли 500 мкМ АДФ, чтобы начать дыхание в состоянии 3 (красный). RCR определялись путем усреднения по времени темпов потребления кислорода, обозначенных красными и желтыми прямоугольниками, для сравнения состояния 3 с состоянием 2. Состояние 4 обозначено зеленым прямоугольником и представляет собой период экстрамитохондриальной гидролизации АТФазы АТФ и может быть использовано для оценки целостности внешней мембраны в анализах цитохрома С. Отображаемые данные были собраны с использованием сердечных митохондрий SD крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативные прослеживаемости_{J O2} и коэффициенты контроля дыхания среди животных и тканевых источников. Качество изолированных митохондрий было проверено путем количественной оценки скорости потребления кислорода с помощью респирометрии высокого разрешения. Дыхание осуществлялось с помощью 5 мМ пирувата натрия и 1 мМ L-малата в присутствии 1 мМ EGTA. Митохондриям и субстратам давали дышать в течение 5 минут, чтобы дыхание состояния 2 стабилизировалось. Максимальные скорости потребления кислорода после добавления АДФ сравнивались со скоростями потребления кислорода в состоянии 2 до АДФ для расчета коэффициентов респираторного контроля (RCR) для каждой ткани. Качество митохондрий дополнительно оценивали путем расчета значений 1-1/RCR в соответствии со стандартами эффективности контроля P-L. Столбчатые диаграммы справа от каждой трассировки обозначают средние значения RCR у мужчин (синий) и у женщин (зеленый) и 1-1/RCR ± SD для данной ткани. (A), (B) и (C) относятся к данным, собранным с использованием сердец морских свинок, крыс Sprague Dawley (SD) и мышей с вирусом лейкемии Friend B (FVB) соответственно. (D) и (E) подробно описывают результаты исследования печени и почек крысы SD, в то время как (F) относится к клеткам HEK293. Были собраны три большие доли печени, в то время как обе почки были использованы для выделения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Буферные рецепты. Буфер для кардиоплегии (CB), изоляционный буфер (IB) и буфер для дыхания (RB), используемые на протяжении всего процесса изоляции, должны быть приготовлены заранее в соответствии с приведенными инструкциями. CB может храниться до месяца при температуре 4 °C, в то время как IB и RB могут храниться в течение 4 месяцев при температуре -80 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Анализ соотношения контроля дыхания. Митохондриальная изоляция для функционального анализа проводилась на широком спектре видов и источников тканей как у самцов, так и у самок грызунов, а также в клетках HEK293. Размер выборки каждого пола, источника ткани и вида подробно описан вместе со средними значениями RCR и 1-1/RCR ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Рекомендуемые модуляции протокола выделения митохондрий для различных тканей для увеличения выхода белка. Изменения в количестве протеазы и центрифугирования отображаются в зависимости от источника ткани. Средние количества общего белка (мг) рассчитывали по результатам анализа белка БСА и объему ресуспендирования конечной митохондриальной гранулы. Значения указываются как среднее значение ± SD. Жирным шрифтом выделены инструкции, включенные в колонку центрифугирования, о том, следует ли выбросить, сохранить или объединить надосадочную жидкость. Отбрасывание относится к утилизации надосадочной жидкости в контейнере для биологических отходов, в то время как удержание и объединение относятся к переносу надосадочной жидкости в следующую центрифугирующую пробирку или сбору его для окончательного отжима, соответственно. Более подробную информацию об изменениях в протоколе можно найти в разделе обсуждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Следование методам, кратко описанным в этом протоколе, обеспечит выделение хорошо связанных митохондрий из сердечной ткани мелких грызунов, в дополнение к другим типам тканей и источникам. В целом, процесс должен занять в общей сложности 3-3,5 часа, в течение которых все ткани животных, образцы и изоляты должны оставаться на льду при температуре 4 °C, насколько это возможно, чтобы ограничить деградацию. Эта процедура надежна и может быть изменена несколькими способами, чтобы лучше соответствовать экспериментальным целям и используемым моделям. Одной из модуляций, которая может быть выполнена в процессе рассечения тканей, является исключение гепарина. Гепарин вводится для предотвращения образования тромбов³¹ , но не является необходимым, если сердце канюлировано и перфузировано достаточно быстро (в течение 1,5 мин после обезглавливания). Кроме того, перфузия сердца с использованием CB рекомендуется для более крупных грызунов, поэтому при работе с мышиными сердцами или другими органами рекомендуется включать промывку IB перед измельчением и первоначальной гомогенизацией. Этот этап позволяет удалить кровь, оставшуюся в процессе вскрытия. Другие изменения включают изменения в скорости гомогенизации и центрифугирования для увеличения выхода митохондриального белка. Описанные выше рекомендации предназначены для выделения сердечных митохондрий от морских свинок и крыс. Важно отметить, что этот протокол может быть адаптирован для выделения митохондрий из печени, почек, сердца и клеток мышей грызунов. Рекомендуемые изменения объема протеазы, гомогенизации и центрифугирования в зависимости от конкретных типов тканей и животных более подробно описаны в таблице 3.

После образования очищенной митохондриальной гранулы на заключительной стадии центрифугирования, митохондрии должны быть ресуспендированы в предварительно охлажденном IB. Объем добавляемого IB зависит от размера митохондриальной гранулы, но составляет около 80 мкл для морских свинок и крыс. При выделении из сердцевин мышей добавляют 60 мкл IB для ресуспензии. При первом выделении митохондрий рекомендуется добавлять IB меньших объемов, чтобы не разбавлять исходный раствор. Из-за консистенции митохондриальных гранул, образующихся после очистки образцов из печени и почек, для ресуспензии следует добавлять гораздо меньше IB (20 μL). Другие методы предполагают использование механической ресуспензии путем соскабливания, которое может быть абразивным для митохондриальных мембран и снижать общую целостность^32,33. При использовании этого протокола рекомендуется аккуратно промывать гранулу с IB для улучшения качества митохондрий. Во время этого процесса будьте осторожны, чтобы не образовывать пузырьки или не потревожить гранулу кончиком пипетки, так как это может привести к разрыву мембраны и неправильному сворачиванию белка³⁴. Только нажатие на первую точку пипетки может помочь снизить вероятность образования пузырьков. Щадящую промывку пипеткой следует проводить до тех пор, пока гранула полностью не окажется во взвешенном состоянии. Общий выход ресуспендирования должен составлять 150-200 мкл для сердечных митохондрий морских свинок и крыс и иметь светло-коричневый цвет. Более концентрированные образцы будут иметь более темный оттенок коричневого и могут быть разбавлены до желаемого рабочего диапазона концентраций после количественного определения митохондриального белка.

Стандартные анализы белков с использованием БСА являются оптимальными для количественного определения митохондриальных белков³⁵. Анализ белка следует отложить и инкубировать в течение рекомендуемой продолжительности и температуры, как определено протоколом производителя. Для изолированных митохондрий инкубация при 37 °C в течение 30 минут позволяет обеспечить равномерное развитие цвета и точное количественное определение белка. При количественном определении общего количества белка рекомендуется сначала разбавлять ресуспендированные митохондрии и IB в соотношении 1:50, 1:100 и 1:200, чтобы гарантировать, что результаты анализа белка будут находиться в пределах калибровочного диапазона. Более подробная информация о том, как проводить анализ белка с использованием BSA в качестве стандарта, предоставлена в комплекте производителя, поэтому рекомендации, перечисленные здесь, могут быть неприменимы. Также следует провести анализ CS для определения содержания митохондрий в каждом образце. Этот анализ хорошо зарекомендовал себя и позволяет провести дальнейшую нормализацию при изучении биологических различий между митохондриальными подтипами³⁶.

После определения белка митохондриальный запас должен быть разбавлен для достижения желаемой конечной рабочей концентрации для респирометрических анализов. Митохондрии, выделенные из сердца морских свинок и крыс, разбавляют до 40 мг/мл, и 5 мкл этого запаса добавляют в дыхательную камеру, чтобы получить рабочую концентрацию 0,1 мг/мл. При выделении из одного сердца мыши или из почек и печени разведение митохондриального запаса может не потребоваться. Также можно добавить большие объемы митохондрий для получения желаемых концентраций. Нормы потребления кислорода в состоянии 2, которые находятся в пределах 35-55 пмоль/мл/с, приемлемы для большинства респирометрических анализов²⁸. Подробности, относящиеся к тому, как проводятся и анализируются RCR, объясняются на рисунке 1 и в разделе репрезентативных результатов; Однако важно отметить, что дыхание подпитывается пируватом и малатом. Другие условия субстрата, такие как сукцинат и ротенон, приведут к различным значениям RCR, поскольку отношение P/O и другие биоэнергетические переменные различаются³⁷. Использование пирувата и малата в качестве топлива для дыхания позволяет достичь почти максимального оборота цикла ТСА и производства восстановительных эквивалентов; однако максимальная активность цикла ТСА и связанная функция ETS достигаются при использовании 5 мМ пирувата, 1 мМ L-малата и 20 мМ сукцината. При стимуляции окислительного фосфорилирования для количественной оценки скоростей потребления кислорода в состоянии 3 АДФ добавляют в концентрациях, по меньшей мере в 10 раз превышающих расчетное K_D для АДФ транслокатора³⁸ адениновых нуклеотидов. Это может быть достигнуто с помощью болюсов более 350 мкМ АДФ, и именно поэтому 500 мкМ использовалось во всех экспериментальных анализах. Если продолжительность состояния 3 слишком коротка, для его продления можно использовать более низкие концентрации в митохондриях. Для дальнейшего анализа дыхания может быть проведена модуляция концентрации АДФ, которая вводится в систему, чтобы лучше соответствовать экспериментальным параметрам³⁹. При разработке этого протокола был использован анализ цитохрома С для оценки целостности внешней мембраны митохондриальных изолятов⁴⁰. Если значения RCR ниже ожидаемых диапазонов, проведите тест на цитохром С, чтобы оценить, является ли повреждение внешней мембраны значительным. Для этого добавьте 10 мкМ цитохрома С в дыхательную камеру и подтвердите, что увеличение дыхания ниже 5 или 10% от показателя Состояния 4. Ожидаемые диапазоны получены из ранее опубликованных исследований и являются специфичными для видов, тканей и субстрата. Если добавление цитохрома с стимулирует дыхание состояния 4 выше 10%, то последние 8000 x g спины могут быть повторены для удаления поврежденных митохондрий. Тем не менее, повреждение внешней мембраны может быть частью фенотипа заболевания, и, таким образом, тест на цитохром С следует интерпретировать с учетом этого⁴¹. После получения стабильно высоких значений RCR с низкими (<10%) эффектами, стимулированными цитохромом С, этот тест становится необходимым и рекомендуется только в том случае, если значения RCR выходят за пределы допустимых диапазонов. Если тест на цитохром С составляет <10% и значения RCR выходят за пределы ожидаемого диапазона, как подробно описано в таблице 2, повторите респирометрический анализ с новым RB после промывки дистиллированной водой 10 раз. Если снижение показателя все еще наблюдается, необходимо использовать новые реагенты (пируват, малат, ЭГТА и АДФ) для диагностики проблемы. Кроме того, анализ цитохрома С может быть проведен с помощью иммуноферментного анализа и с использованием митохондриальных красителей, таких как TMRE^33,42. В зависимости от типа ткани и источника, эти варианты могут лучше подходить для определения целостности внешней мембраны.

Несмотря на то, что этот протокол не имеет существенных ограничений для выделения сердечных митохондрий, важно отметить, что при использовании этих методов следует учитывать определенные соображения. Качество митохондриальных изолятов в значительной степени зависит от температуры и времени, затрачиваемого как на перфузию сердца, так и на ресуспендирование очищенной гранулы. Таким образом, для получения RCR, сопоставимых с описанными здесь, может потребоваться знакомство с этими процессами. Кроме того, важен состав буферов и растворов, используемых в процессе выделения, поскольку он напрямую влияет на целостность^{и функцию} митохондрий. Буферы, перечисленные в таблице 1, приведены в качестве справочных материалов и позволили выделить хорошо связанные митохондрии в различных тканевых источниках, но могут быть внесены изменения для ограничения количества хлорида при анализе дыхания, поскольку это может препятствовать транслокации нуклеотидов аденина и функции ETS²⁸. Состав буфера также может быть изменен для лучшей изоляции митохондрий печени. Поскольку в печени высокие концентрации жирных кислот, рекомендуется промывать орган и измельченную ткань буфером, содержащим повышенные концентрации БСА, если наблюдаются RCR за пределами ожидаемого диапазона. Несмотря на то, что качество митохондриальных изолятов, полученных из срезов печени, хорошо связано и стабильно, это изменение может привести к улучшению функции органелл. Следует также признать, что выделение митохондрий из клеток с помощью этих методов требует большого количества культивируемых клеток, что представляет собой потенциальное ограничение. Кроме того, этот протокол не предназначен специально для клеточных изолятов, но оказался успешным при внедрении. Таким образом, методы таргетной изоляции культивируемых клеток могут быть более эффективными. В качестве альтернативы, чтобы оценить качество митохондрий, исследователи могут выбрать флуоресцентные зонды для расчета RCR. Спектрофлуориметрические методы являются популярным выбором, особенно если извлекаются меньшие количества белка^44,45.

В целом, этот протокол может быть использован для последовательной изоляции хорошо связанных сердечных митохондрий от мелких животных, таких как морские свинки и крысы. Его можно легко модифицировать для увеличения выхода белка путем изменения скорости гомогенизации, времени центрифугирования и количества спинов, чтобы обеспечить митохондриальную изоляцию из сердца, печени, почек и клеток мышей. Более того, этот протокол является общим и достаточно надежным, чтобы его можно было использовать для исследования митохондриальной функции у видов, не являющихся млекопитающими, таких как морская минога⁴⁶, а также для выполнения структурного анализа с использованием классической и криоэлектронной микроскопии ^40,47. В то время как многие недавние исследования сосредоточены на изучении митохондриального поведения в интактных клетках и тканевых системах, широта и глубина информации, извлеченной из изолированных митохондрий с использованием этих методов, показывают влияние на метаболомику, окислительный стресс и производство АТФ, которое никогда не будет лишено достоинств. Выделение хорошо связанных митохондрий позволяет исследователям исследовать ключевые аспекты развития и прогрессирования заболевания, которые в противном случае были бы невозможны в полноклеточных моделях. Благодаря универсальности этого протокола, изменения в митохондриальной энергетике, наблюдаемые при таких патологиях, как сердечно-сосудистые заболевания, диабет и неврологические расстройства, могут быть изучены с помощью методологии, описанной в настоящем документе.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки
1,7 мл Стеклянный стакан			Для диссекции органов и измельчения
		50 мл Центрифуга	Центрифуга
Аденозин 5'-дифосфат монокалия соль дигидрат	Sigma	A5285	Респирометрические анализы
BSA Набор для анализа белка	Thermo Scentific	PI23225	количественное определение митохондриального белка
Dextrose	Sigma	DX0145	Для буфера (CB)
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота	Сигма	E4378	Для буферов (CB и IB) и респирометрических анализов
Стеклянная канюля	Radnoti		Перфузия сердца морской свинки и крысы
Гепарин натрия слизистая свинья	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
Респирометр			Электрод типа Кларка; оксиграф с камерами 2 мл
Индукционная камера
Изофлуран	Sigma	792632	Обезболивающее
L-яблочная кислота	Sigma	02288-50G	Респирометрические анализы
Магния хлорид гексагидрат	Sigma	M9272	Для буфера (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	Для буферных (IB)
Микролитровые шприцы			Размеры от 5– 50 & микро; L
Считыватель			должен быть способен к инкубации при 37 °°; С
MOPS	Sigma	475898	Для всех буферов
O2 бак
OMNI THQ Гомогенизатор	OMNI International	12-500	Аналогичные роторные статорные гомогенизаторы будут работать
пипетками			объемом от 2  20 &микро; L; 20– 200 &микро; L; 200– 1000 &микро;
L Хлорид калия	Sigma	P3911	Для буферов (RB и CB)
Двухосновной фосфат калия	Sigma	795496	Для буферов (IB и RB)
Протеаза из Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Натрия хлорид	Sigma	S9888	Для буфера (CB)
Пируват натрия	Биореагенты Фишера	BP356-100	Респирометрические анализы
Сахароза	Sigma	8510-OP	Для буфера (IB)
		для хирургического вскрытия	Зависит от животного и источника тканей
Настольная			Должна охладиться до 4°°; С