Определение ресничной функции и мембранной проницаемости псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей легких

Summary

Культура на границе между воздухом и жидкостью обычно используется для развития псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей путем дифференцировки первичных нормальных эпителиальных клеток бронхов человека, которые имитируют апикальную сторону дыхательных путей легких. В этой статье мы описываем простой протокол для определения его качества путем мониторинга его биофизических свойств, таких как цилиарная функция и целостность мембраны.

Abstract

Дифференцировка первичных эпителиальных клеток дыхательных путей легких в воздушно-жидкостном интерфейсе (ОПЛ) является популярным методом разработки многоклеточного псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей, который имитирует апикальную сторону дыхательных путей легких. В то время как дифференцировка первичных клеток дыхательных путей легких ожидается, оценка биофизических свойств, таких как ресничная функция и непроницаемость мембраны, обеспечивает качественную оценку эпителия дыхательных путей и обеспечивает надежность эксперимента. В данной работе мы описываем простой протокол развития многоклеточного псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей в культуре ALI и оцениваем два важных биофизических свойства: ресничную функцию и непроницаемость мембраны. Чтобы определить цилиарную функцию, мы зафиксировали движение ресничек 4-недельного дифференцированного эпителия дыхательных путей с помощью высокоскоростной камеры, прикрепленной к инвертированному микроскопу, с последующей количественной оценкой частоты биения ресничек (CBF) с помощью системы видеоанализа Саймона Амона (SAVA). Мы также измерили трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) с помощью вольт-омметра для определения целостности эпителиального барьера эпителия дыхательных путей.

Introduction

Хронические респираторные заболевания, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и муковисцидоз, являются одними из основных проблем здравоохранения во всем мире¹. Распространенность респираторных заболеваний, вызываемых такими вирусами, как вирус гриппа А человека, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), также является бременем для экономики и общественного^{здравоохранения2}. В связи с этим существует огромная потребность в разработке схем лечения респираторных заболеваний, которые приводят к необ....

Protocol

Протокол должен быть выполнен в стерильном состоянии в колпаке с ламинарным потоком уровня биобезопасности 2 (шкаф биобезопасности). Перед использованием все среды и растворы должны быть разморожены при 37 °C. Центрифугирование следует проводить при температуре 4 °C. Все материалы, используемые в эксперименте, должны быть стерильными. Первичные клетки (деидентифицированный донор) были получены в сотрудничестве с доктором Кристиной Бейли в Медицинском центре Университета Небраски (UNMC), Омаха, штат Небраска. Первичные клетки получены от обезличенных доноров, и эти клетки не подпадают под категорию «Человек-субъект» NIH. Элементы были....

Results

Мы оценили как ресничную функцию, так и мембранную непроницаемость эпителия дыхательных путей, полученную путем дифференцировки первичных клеток NHBE от двух независимых деидентифицированных доноров (двух некурящих, здоровых взрослых или взрослых с ХОБЛ, старше 50 лет). Для определения цилиарной функции определяли КБК 28-дневного дифференцированного эпителия дыхательных путей. Мы наблюдали, что ОГБ достиг не менее 3 Гц для обоих эпителий дыхательных путей, что было сопоставимо с ранее опубликованными результатами (

Discussion

Первичный эпителий дыхательных путей человека (культура ALI) все чаще используется в качестве модели легких in vitro для биологических оценок с целью изучения функций и механизмов, а также для сокращения использования животных¹⁴. АЛИ имеет ряд преимуществ перед любой однослойной погружной культурой. Например, он обеспечивает тканеподобный псевдостратифицированный эпителий дыхательных путей, который имитирует апикальную сторону дыхательных путей легких

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, США	14190-144
Среда для роста эпителиальных клеток дыхательных путей	PromoCell, Германия	C-21060
Амфотерицин B	Thermo Fisher Scientific, США	15290-026
EVOM2 вольтовый омметр	World Precision Instruments, США	Неприменимо
Гепариновый раствор	Технологии стволовых клеток, США	07980
Гидрокортизон стоковые	технологии стволовых клеток, США	07926
Микроскоп: Leica DMI8 (Leica Microscope) с высокоскоростной камерой со скоростью 120 кадров в секунду (Basler), связанной с микроскопом. Microsope также фиксируется со сценическим камерным инкубатором i8.	Leica, США	Неприменимо
Пенициллин-стрептомицин	Corning, США	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, США	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, США	5005
система видеоанализа (SAVA) Sisson-Ammons. Программное обеспечение V.2.1.15	Amson Engineering, США	Не применимо