Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение ресничной функции и мембранной проницаемости псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей легких

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67094

⸱

21 февраля 2025 г.

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

В этой статье

Краткое содержание

Культура на границе между воздухом и жидкостью обычно используется для развития псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей путем дифференцировки первичных нормальных эпителиальных клеток бронхов человека, которые имитируют апикальную сторону дыхательных путей легких. В этой статье мы описываем простой протокол для определения его качества путем мониторинга его биофизических свойств, таких как цилиарная функция и целостность мембраны.

Аннотация

Дифференцировка первичных эпителиальных клеток дыхательных путей легких в воздушно-жидкостном интерфейсе (ОПЛ) является популярным методом разработки многоклеточного псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей, который имитирует апикальную сторону дыхательных путей легких. В то время как дифференцировка первичных клеток дыхательных путей легких ожидается, оценка биофизических свойств, таких как ресничная функция и непроницаемость мембраны, обеспечивает качественную оценку эпителия дыхательных путей и обеспечивает надежность эксперимента. В данной работе мы описываем простой протокол развития многоклеточного псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей в культуре ALI и оцениваем два важных биофизических свойства: ресничную функцию и непроницаемость мембраны. Чтобы определить цилиарную функцию, мы зафиксировали движение ресничек 4-недельного дифференцированного эпителия дыхательных путей с помощью высокоскоростной камеры, прикрепленной к инвертированному микроскопу, с последующей количественной оценкой частоты биения ресничек (CBF) с помощью системы видеоанализа Саймона Амона (SAVA). Мы также измерили трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) с помощью вольт-омметра для определения целостности эпителиального барьера эпителия дыхательных путей.

Введение

Хронические респираторные заболевания, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и муковисцидоз, являются одними из основных проблем здравоохранения во всем мире1. Распространенность респираторных заболеваний, вызываемых такими вирусами, как вирус гриппа А человека, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), также является бременем для экономики и общественногоздравоохранения2. В связи с этим существует огромная потребность в разработке схем лечения респираторных заболеваний, которые приводят к необратимому повреждению дыхательных тканей. Эпителиальная ткань дыхательных путей сама по себе не только участвует в поглощении кислорода, но и обеспечивает барьер для защиты организма от вторжения патогенов и опасных химическихвеществ. Респираторный эпителий имеет сложную клеточную организацию, состоящую из трех основных типов клеток: реснитчатых клеток, бокаловидных клеток и базальных клеток. Недавно появилось сообщение о присутствии новых, но редких ионоцитарных клеток в эпителии дыхательных путей4. Сложная ткань функционирует скоординированным образом, обеспечивая врожденные иммунные реакции, такие как секреция антимикробных пептидов, высвобождение цитокинов для активации адаптивного иммунного ответа и мукоцилиарный клиренс5. Отсутствие подходящей модели дыхательных путей является одним из препятствий для изучения респираторных инфекций и разработки методов лечения.

Модель воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) становится ключевым инструментом для исследований респираторных заболеваний6. Это эффективная модель дыхательных путей легких in vitro, поскольку первичные клетки дыхательных путей легких дифференцируются в псевдостратифицированный эпителий дыхательных путей, состоящий по меньшей мере из трех типов клеток, которые обычно находятся на апикальной стороне дыхательных путей. Во-первых, реснитчатые клетки покрывают большую часть апикальной стороны дыхательных путей и способствуют мукоцилиарному клиренсу. Во-вторых, бокаловидные клетки вырабатывают слизь и являются крупнейшими клетками, которые находятся вместе с цилиарными клетками на апикальной стороне дыхательных путей. В-третьих, базальные клетки находятся в базальном слое дыхательных путей и являются клетками-предшественниками, которые дифференцируются в различные эпителиальные клетки 5,7. Хотя ионоциты и пучковые клетки редко встречаются в эпителии дыхательных путей, они также могут играть роль в функции ресничек и проницаемости мембран4. Эта методика отличается от традиционной погружной клеточной культуры, которая не имитирует легочную среду in vivo. Поскольку ОПЛ производится из первичных эпителиальных клеток, полученных от здоровых людей, пациентов с астмой и ХОБЛ, он предлагает более разнообразную платформу для изучения реакции на инфекцию и патофизиологию заболевания.

Оценка состояния здоровья культур, разработанных с помощью ALI, является важным аспектом мониторинга, обеспечивающим жизнеспособность, функциональность и физиологическую значимость культивируемых клеток. Это повышает уверенность в целостности, надежности и воспроизводимости культур ALI. Как было опубликовано ранее, наша группа оценивала целостность культуры ALI путем оценки двух биофизических параметров: цилиарной функции путем количественной оценки частоты биения ресничек (CBF) и целостности эпителиального барьера путем определения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)6,7,8. Мукоцилиарный клиренс (МКК) является одним из важных признаков эпителия дыхательных путей, переносимого реснитчатыми клетками. Специализированные органеллы, называемые ресничками на поверхности реснитчатых клеток, бьются метахрональными волнами, очищая дыхательные пути от инфекций и вдыхаемых частиц, застрявших в слизистом слое эпителия дыхательных путей. Эффективность МКК полностью зависит от правильной деятельности ресничек9. Хороший КБН свидетельствует о здоровом, неповрежденном эпителии дыхательных путей; следовательно, мониторинг КБК для культур ОЛИ дает ценную информацию о целостности эпителия10. Несмотря на то, что существует несколько способов количественного определения НБВ, например, высокоскоростная видеомикроскопия11 и допплеровская оптическая когерентная томографияс фазовым разрешением12, каждый метод требует технических знаний и специализированного оборудования. В этом протоколе мы предлагаем более простой и менее технический способ количественного определения КБН дифференцированного эпителия дыхательных путей. Описан метод количественной оценки TEER того же эпителия, который указывает на целостность эпителиальных тканей и барьерную функцию13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол должен быть выполнен в стерильном состоянии в колпаке с ламинарным потоком уровня биобезопасности 2 (шкаф биобезопасности). Перед использованием все среды и растворы должны быть разморожены при 37 °C. Центрифугирование следует проводить при температуре 4 °C. Все материалы, используемые в эксперименте, должны быть стерильными. Первичные клетки (деидентифицированный донор) были получены в сотрудничестве с доктором Кристиной Бейли в Медицинском центре Университета Небраски (UNMC), Омаха, штат Небраска. Первичные клетки получены от обезличенных доноров, и эти клетки не подпадают под категорию «Человек-субъект» NIH. Элементы были получены в соответствии с утвержденным Соглашением о передаче материалов (MTA) между Университетом Северной Дакоты, Гранд-Форкс, Северная Дакота, и UNMC, Омаха, Небраска. Здесь мы использовали проходные 4 ячейки NHBE. Несмотря на то, что было показано, что клетки NHBE с более высоким пассажем (до пассажа 8) также дифференцируются в эпителий дыхательных путей, мы обычно используем клетки NHBE четвертого пассажа, поскольку нет очевидной разницы в профилях транскрипции всего генома между пассажами с 1 по 4 6,14.

1. Первичная клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Бережное обращение с первичными клетками имеет решающее значение. Весь протокол должен избегать жесткого лечения и чрезмерного пипетирования первичных клеток.

  1. С помощью стерильной серологической пипетки добавьте 5 мл коллагена в чашку для культуры тканей (ТК) диаметром 100 мм, чтобы предварительно покрыть чашку. Инкубируйте чашку TC с коллагеном при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
  2. С помощью стерильной серологической пипетки аспирируйте коллаген из чашки TC и замените его 8 мл предварительно размороженной полной среды эпителиальных клеток дыхательных путей (AEC) с добавлением 2% (v/v) пенициллин-стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицина B (Таблица 1).
  3. Разморозьте один флакон (содержащий 5 x 10-5 клеток) первичных нормальных клеток бронхиального эпителия человека (NHBE) на водяной бане при 37 °C.
  4. С помощью стерильной серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 1 мл предварительно размороженной полной среды AEC в клетки по каплям для акклиматизации клеток NHBE и соберите все клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
  5. Гранулируйте клетки центрифугированием при 212 x g в течение 5 минут при 4 °C. Аккуратно слейте среду из пробирки и восстановите суспендию клеток в оставшейся среде капель в пробирке легкими постукиваниями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать чрезмерного и резкого постукивания.
  6. С помощью стерильной серологической пипетки объемом 5 мл медленно добавьте 2 мл полной среды AEC к ресуспендированным клеткам и соберите все клетки.
  7. Добавьте ячейки в планшет, предварительно добавленный 8 мл полной среды AEC. Переместите чашку TC в сторону, чтобы равномерно распределить ячейки в чашке.
  8. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторедля клеточных культур с влажностью 85–95%. Через 24 ч наблюдайте за клетками NHBE под микроскопом в 10 или 20 раз на предмет их прикрепления к чашке TC и роста. Если клетки подвешены в среде, то это показывает мертвые клетки.
  9. Через 48 ч отсасывайте старую среду из чашки ТС с помощью стерильной серологической пипетки.
  10. С помощью стерильной серологической пипетки добавьте в клетки 10 мл предварительно подогретой полной AEC-среды. Медленно добавьте носитель в один угол; Избегайте прямого выливания поверх ячеек.
  11. Меняйте полную среду AEC каждые 48 часов до тех пор, пока конфлюенция ячеек не достигнет 95%-100%.

2. Культура взаимодействия воздух-жидкость

  1. С помощью пипетки P200 добавьте 100 μл коллагена в предварительно покрытую 6,5 мм вставку Transwell с 0,4 μm-порами полиэфирной мембраны (далее именуемые вставками) и инкубируйте при RT в течение 20 минут.
  2. С помощью стерильной серологической пипетки аспирируйте среду из сливающихся клеток NHBE.
  3. Добавьте 5 мл 1x фосфатного буферного раствора Дульбекко (DPBS) с помощью стерильной серологической пипетки в один угол чашки TC.
  4. Аккуратно покрутите пластину, чтобы промыть клетки, и аспирируйте 1x DPBS с помощью стерильной серологической пипетки. Следите за тем, чтобы клетки не высыхали ни на одном этапе протокола.
  5. С помощью серологической пипетки добавьте 5 мл TrypsinLE в клетки и инкубируйте при 37 °C во влажном инкубаторе для клеточных культур CO2 до тех пор, пока все клетки не будут диссоциированы с нижней поверхностью планшета.
  6. С помощью стерильной серологической пипетки соберите все клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. С помощью стерильной серологической пипетки добавьте 3 мл трипсина в чашку для ТС и соберите все остаточные клетки.
  7. Гранулируйте клетки центрифугированием при 212 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте среду и осторожно постучите по пробирке, чтобы восстановить суспендию клеток в оставшихся каплях трипсина в пробирке.
  8. С помощью серологической пипетки добавьте 2 мл полной AEC-среды к ресуспендированным клеткам.
  9. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра или автоматического счетчика клеток.
  10. Разбавляют ячейки полным фильтрующим материалом AEC, при этом каждая вставка получает 5 x 104 ячеек в объеме 200 мкл.
  11. С помощью стерильных щипцов перенесите вкладыши в пустую лунку в 24-луночной чашке для культивирования.
  12. С помощью пипетки P1000 добавьте 500 мкл полного фильтрующего материала AEC в базальную лунку планшета.
  13. С помощью стерильных щипцов перенесите вкладыши обратно в базальную лунку с добавлением полной AEC-среды.
  14. С помощью пипетки P200 добавьте 5 x 104 ресуспендированных элемента NHBE в 200 мкл полной среды AEC на апикальную сторону вставки. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторедля клеточных культур с влажностью 85% - 95%.
  15. Через 24 ч понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы увидеть, образовали ли они сливающийся слой в лунке.
    Примечание: Если клетки не образуют сливающийся слой, меняйте базальную среду AEC каждые 48 ч на свежую, полную среду AEC до тех пор, пока клетки не сформируют сливающийся монослой. Во время смены базальных сред перенесите вкладыши в пустую лунку стерильными щипцами. Отсадите старую среду с помощью пипетки P1000, добавьте свежую среду и поместите вставки обратно в свежую, полную среду AEC.
  16. Как только клетки сливаются, перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов. С помощью пипетки P1000 аспирируйте всю базальную AEC-среду.
  17. С помощью пипетки P1000 добавьте в базальную лунку 500 μл свежей среды полной воздушно-жидкостной дифференцировки (ALI) с добавлением 2% (v/v) пенициллин-стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицина B.
  18. Перенесите вставки в базальную лунку с добавлением полной среды ALI с помощью стерильных щипцов. С помощью пипетки P200 осторожно отсасывайте апикальную AEC-среду из лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На апикальную сторону не следует добавлять всю среду ALI. Осторожно отсасывайте среду AEC с апикальной стороны, чтобы избежать отслоения клеток.
  19. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C во влажном инкубаторе для клеточных культур CO2 . Через 48 ч перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов.
  20. С помощью пипетки P1000 отсадите старую среду и добавьте свежие 500 мкл полной среды ALI.
  21. С помощью стерильных щипцов поместите вкладыши обратно в лунку со свежей средой. Продолжайте полностью менять среду ALI каждые 48 часов до 28 дня (четыре недели).
  22. На 28-й день с помощью пипетки P200 добавьте 100 мкл 1x DPBS на апикальную сторону вкладышей и инкубируйте при температуре 37 °C во влажном инкубаторе для клеточных культур CO2 в течение 30 минут. Аспирируйте 1x DPBS с помощью пипетки P200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DPBS следует добавлять, заливая на стену, а не непосредственно в ячейки. При аспирации DPBS избегайте прикосновения к эпителию и энергичного пипетирования, поскольку любое повреждение эпителия может нарушить целостность эпителия (тканеподобного).
  23. Начиная со2-й недели дифференцировки, оцените выработку слизи, наблюдая под микроскопом за возможным более темным слоем из-за слизи на эпителии. Излишки слизи можно удалить с помощью промывания DPBS. Вкратце, добавьте 200 мкл 1x DPBS на апикальную сторону вкладышей на 24-луночном планшете и инкубируйте планшет при температуре 37 °C во влажном инкубаторе для клеточных культур CO2 в течение 30 минут. Удалите DPBS и держите планшет при температуре 37 °C во влажном инкубаторе для клеточных культур CO2 .

3. Определение частоты биения ресничек

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения КБВ при 37 °C (при необходимости) микроскоп должен иметь камерный инкубатор, обеспечивающий 5%CO2 при 37 °C и влажности.

  1. Включите микроскоп с подключенным к нему компьютером и камерой окружающей среды. Откройте дверцу камеры, чтобы поместить пластину со вставками на предметный столик микроскопа.
  2. Как только тарелка будет поставлена на сцену, закройте камеру. С помощью ручки управления столиком микроскопа переместите пластину, чтобы вставки оказались в поле зрения.
  3. Выберите объектив с 20-кратным увеличением в фазово-контрастном режиме. Наблюдайте за пластиной через окуляр микроскопа и фокусируйте ячейку с помощью ручки настройки.
  4. На экране компьютера нажмите на значок системы SAVA . На компьютер, подключенный к микроскопу, должна быть установлена программа SAVA.
  5. В интерфейсе программного обеспечения нажмите « Настроить эксперимент». На следующей вкладке нажмите « Создать эксперимент».
  6. Появится новая вкладка, в которой укажите сведения о каталоге, в котором будут храниться данные, в поле Введите имя каталога эксперимента и сведения об эксперименте в поле Введите описание эксперимента, затем нажмите OK.
  7. Нажмите на созданный эксперимент, который отображается в каталоге в разделе «Эксперименты».
  8. Нажмите « Изменить» и укажите детали образца в описании образца. Нажмите на кнопку Добавить , затем на кнопку Выход , чтобы выйти из этой вкладки.
  9. В главном программном интерфейсе в слоте эксперимента выберите созданный эксперимент в раскрывающемся меню главного интерфейса.
  10. Нажмите « Записать видео » и отслеживайте частоту биения ресничек (CBF) на экране компьютера. На экране будет отображаться сфокусированное движение ресничек.
  11. Для каждой вставки запишите 6 различных случайных полей в течение 2,1 с со скоростью 120 кадров в секунду. Нажмите « Сохранить видео », чтобы отслеживать данные CBF.
  12. Чтобы проанализировать данные, нажмите «Анализировать видео» в интерфейсе программного обеспечения. На следующей вкладке нажмите OK.
  13. На следующей вкладке нажмите « Проанализировать все». Загрузите электронную таблицу, созданную для каждого эксперимента, в папку сбора данных SAVA на компьютере.
  14. Возьмем среднюю частоту Гаусса для представления данных.

4. Количественная оценка трансэпителиального электрического сопротивления

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения TEER требуется жидкость на апикальной стороне эпителия дыхательных путей. Чтобы установить этот протокол, добавьте 100 мкл 1x DPBS на апикальной стороне эпителия дыхательных путей во вкладыши, которые уже содержат базальную среду (экспериментальный), или 500 мкл 1x DPBS.

  1. Включите вольт-омметр EVOM2 с помощью выключателя питания. Подключите тестовый резистор к EVOM2 в слоте INPUT.
  2. Следите за показаниями на экране EVOM2. Если он выше или ниже 1000, то он нуждается в калибровке. С помощью щипцов поверните переключатель ADJ на вольт-омметре EVOM2 до тех пор, пока он не покажет равномерное показание 1000.
  3. Возьмите пустую вставку для экспериментального контрольного считывания. С помощью пипетки P200 добавьте 100 мкл 1x DPBS на апикальную сторону пустого вкладыша, а 500 мкл 1x DPBS добавьте на базальную сторону с помощью пипетки P1000.
  4. Отсоедините тестовый резистор и подключите электрод STX2 к слоту INPUT на EVOM2. Аккуратно очистите электрод STX2 70% этанолом.
  5. Вставьте электрод STX2 в пустую вставку с помощью 1x DPBS, держа более короткую ножку электрода на апикальной части каждой вставки, а длинную ножку электрода на базальной части.
  6. Запишите стабильные показания на экране EVOM2, так как показания могут колебаться из-за движения или по другим неопределенным причинам.
  7. Вставьте электрод STX2 во вставку с 28-дневным дифференцированным эпителием, сохраняя более короткую ножку электрода на апикальной части каждой вставки, а длинную ножку электрода на базальной части в среде.
  8. Запишите стабильные показания на экране EVOM2. Проведите несколько независимых измерений, чтобы рассчитать надежное среднее значение. Вычтите фон (пустое чтение вставки) из экспериментального чтения вставки для расчета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы оценили как ресничную функцию, так и мембранную непроницаемость эпителия дыхательных путей, полученную путем дифференцировки первичных клеток NHBE от двух независимых деидентифицированных доноров (двух некурящих, здоровых взрослых или взрослых с ХОБЛ, старше 50 лет). Для определения цилиарной функции определяли КБК 28-дневного дифференцированного эпителия дыхательных путей. Мы наблюдали, что ОГБ достиг не менее 3 Гц для обоих эпителий дыхательных путей, что было сопоставимо с ранее опубликованными результатами (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первичный эпителий дыхательных путей человека (культура ALI) все чаще используется в качестве модели легких in vitro для биологических оценок с целью изучения функций и механизмов, а также для сокращения использования животных14. АЛИ имеет ряд преимуществ перед любой однослойной погружной культурой. Например, он обеспечивает тканеподобный псевдостратифицированный эпителий дыхательных путей, который имитирует апикальную сторону дыхательных путей легких

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет пилотного гранта NIH P20GM113123 и UND SMHS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x DPBSThermo Fisher Scientific, США14190-144
Среда для роста эпителиальных клеток дыхательных путейPromoCell, ГерманияC-21060
Амфотерицин BThermo Fisher Scientific, США15290-026
EVOM2 вольтовый омметрWorld Precision Instruments, СШАНеприменимо
Гепариновый растворТехнологии стволовых клеток, США07980
Гидрокортизон стоковыетехнологии стволовых клеток, США07926
Микроскоп: Leica DMI8 (Leica Microscope) с высокоскоростной камерой со скоростью 120 кадров в секунду (Basler), связанной с микроскопом. Microsope также фиксируется со сценическим камерным инкубатором i8.Leica, СШАНеприменимо
Пенициллин-стрептомицинCorning, США30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL technologies, США05002
PureColAdvanced BioMatrix, США5005
система видеоанализа (SAVA) Sisson-Ammons. Программное обеспечение V.2.1.15 Amson Engineering, СШАНе применимо

Ссылки

  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States. Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).
  3. LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae. Front Immunol. 11, 3(2020).
  4. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  5. Calven, J., Ax, E., Radinger, M. The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis. Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).
  6. Talukdar, S. N., et al. RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening. Virus Res. 327, 199060(2023).
  7. Osan, J., et al. Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease. Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).
  8. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  9. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).
  10. Rhee, C. S., et al. Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells. Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).
  11. Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues. Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).
  12. Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography. Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).
  13. Yuksel, H., Turkeli, A. Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood. Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).
  14. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  15. Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium. STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).
  16. Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. J Virol. 97 (7), e0039423(2023).
  17. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Front Pediatr. 2, 111(2014).
  18. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1, 14(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

интерфейс «воздух-жидкость»частота биения ресничектрансэпителиальное электрическое сопротивлениемногорядный эпителийбронхиальные эпителиальные клеткивысокоскоростная микроскопиясистема SAVA
Определение ресничной функции и мембранной проницаемости псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.