Методическая статья

Продольная визуализация in vivo клеток сетчатки с адаптированными аденоассоциированными вирусными серотипами с помощью конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии

958 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67106

⸱

11 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование векторов аденоассоциированных вирусов (AAV) для клеточно-специфического мечения и визуализации in vivo с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа (CSLO). Этот метод позволяет исследовать различные типы клеток сетчатки и их вклад в функцию сетчатки и заболевание.

Аннотация

Динамическая природа клеточных процессов сетчатки обуславливает необходимость совершенствования методов доставки генов и мониторинга в реальном времени для улучшения понимания и лечения глазных заболеваний. В этом исследовании представлен оптимизированный подход к аденоассоциированному вирусу (AAV), использующий специфические серотипы и промоторы для достижения оптимальной эффективности трансфекции в целевых клетках сетчатки, включая ганглиозные клетки сетчатки (RGC) и глию Мюллера. Используя точность конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (CSLO), эта работа представляет собой неинвазивный метод визуализации in vivo , который фиксирует продольную экспрессию AAV-опосредованного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Такой подход избавляет от необходимости терминальных процедур, сохраняя непрерывность наблюдения и благополучие испытуемого. Кроме того, сигнал GFP может быть прослежен в инфицированных AAV RGC вдоль зрительного пути к верхнему холмику (SC) и латеральному коленчатому ядру (LGN), что открывает возможности для прямого картирования визуальных путей. Эти результаты представляют собой подробный протокол и демонстрируют применение этого мощного инструмента для изучения в режиме реального времени поведения клеток сетчатки, патогенеза заболевания и эффективности генных терапевтических вмешательств, предлагая ценную информацию о живой сетчатке и ее связях.

Введение

Будучи единственной оптически доступной частью центральной нервной системы, сетчатка служит ценной модельюдля исследований в области нейробиологии. Ганглиозные клетки сетчатки (РГК), выходные нейроны сетчатки, которые передают визуальную информацию в мозг, играют решающую роль в зрительной функции. Их потеря или дисфункция приводит к ухудшению зрения и необратимой слепоте, как это наблюдается при глаукоме и других оптических невропатиях2. Глия Мюллера, основные глиальные клетки сетчатки, необходимы для поддержания гомеостаза сетчатки, обеспечивая структурную и метаболическую поддержку нейронов, регулируя уровень нейротрансмиттеров и способствуя восстановлению и регенерации сетчатки3. Их дисфункция связана с различными заболеваниями сетчатки, включая диабетическую ретинопатию4, возрастную макулярную дегенерацию5 и глазной ишемический синдром6. РГК и глия Мюллера демонстрируют тесное взаимодействие и взаимозависимость; Глия Мюллера оказывает существенную поддержку РГК, в то время как активность РГК может влиять на функцию глии Мюллера 3,7. Изучение как РГК, так и глии Мюллера имеет решающее значение для понимания функции сетчатки и разработки эффективных методов лечения множественных заболеваний сетчатки.

В современных исследованиях сетчатки в основном используются такие методы, как оптическая когерентная томография (ОКТ) для измерения толщины слоя нервных волокон сетчатки или траекторий пучков аксонов 8,9. Хотя эти методы бесценны для выявления потери РГК, они не дают подробного представления о морфологии РГК и глиальных клетках из-за ограниченного разрешения. Аналогичным образом, несмотря на то, что передовые методы, такие как адаптивная оптика, сканирующая лазерная офтальмоскопия (AO-SLO), позволяют визуализировать РГК, фоторецепторы и глиальные клетки в живой сетчатке человека, их техническая сложность и ограниченная доступность ограничивают их использование в основном специализированными исследовательскими условиями. Учитывая эти ограничения, существует постоянная потребность в разработке более доступных и надежных методов углубленного изучения конкретных популяций клеток сетчатки in vivo.

Соответственно, этот протокол направлен на внедрение альтернативного подхода к визуализации, подходящего для исследовательских приложений в клетках сетчатки. Он сочетает в себе возможности AAV-опосредованного мечения по типу клеток с неинвазивным характером визуализации CSLO. Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются универсальными векторами доставки генов, известными своей низкой иммуногенностью и способностью трансдуцировать широкий спектр типов клеток, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки11. Это делает их идеальными инструментами для нацеливания на определенные клеточные популяции в сложной среде сетчатки. Используя векторы AAV с тщательно подобранными серотипами и промоторами, можно достичь селективной экспрессии флуоресцентных белков в нескольких типах клеток, представляющих интерес, таких как RGC и глия Мюллера. Например, AAV2 известен своей более высокой эффективностью трансдукции в RGC12,13, в то время как AAV8 заметно эффективен при нацеливании на фоторецепторы14, а AAV9 демонстрирует сильные возможности трансфекции в глии Мюллера15, демонстрируя широкую эффективность в различных слоях клеток сетчатки. Важно отметить, что эффективность AAV зависит не только от выбора серотипа, но и от промоторов, которые диктуют интенсивность и клеточную специфичность экспрессии трансгена, подчеркивая важность тщательного отбора для достижения оптимальной трансдукции.

Для мечения RGC в этом протоколе используется AAV2 с промотором синапсина человека (hSyn). AAV2 демонстрирует эффективную трансдукцию РГК после интравитреального введения13, а промотор hSyn, повсеместно распространенный промотор нейронов, стимулирует сильную и специфическую экспрессию трансгенов в этих клетках16. Для глии Мюллера в протоколе используются векторы AAV9, управляемые промотором17 GfaABC1D, который демонстрирует сильную экспрессию трансгенов в этихклетках 15. Этот подход к таргетной маркировке позволяет исследователям отличать эти клетки от окружающей ткани сетчатки и отслеживать их с течением времени, обеспечивая основу для наблюдения in vivo за клетками сетчатки и их реакцией на изменения биосреды.

Конфокальная сканирующая лазерная офтальмоскопия (CSLO) – это неинвазивный метод визуализации, который позволяет получать изображения живой сетчатки с высоким разрешением, позволяя визуализировать в режиме реального времени популяции флуоресцентно меченых клеток сетчатки 18,19,20. Сфокусированный лазерный луч сканирует сетчатку, улавливая излучаемый свет, проходящий через отверстие, чтобы устранить расфокусированные сигналы, что приводит к получению более четких изображений с повышенной контрастностью. В этом протоколе используется система Heidelberg Spectralis CSLO, которая широко используется для визуализации клеток сетчатки у живых животных, включая исследования визуализации меченых трансгенами RGC21,22 и микроглии23. Используя установку HRA CSLO с лазером 488 нм и соответствующими фильтрами, исследователи могут визуализировать флуоресцентно меченные RGC или глию Мюллера у живых животных после интравитреального введения векторов AAV, несущих флуоресцентные репортерные гены. Протокол продольной визуализации с еженедельными сеансами, охватывающими как центральную, так и периферическую сетчатку, отслеживает изменения с течением времени. Чтобы уделять приоритетное внимание благополучию животных, в протоколе используется автоматическая система отслеживания взгляда (ART) отделения HRA CSLO, позволяющая точно получать изображения без необходимости общей анестезии или контактных линз.

Этот протокол использует объединенную мощь AAV и CSLO для обеспечения продольного мониторинга определенных типов клеток сетчатки in vivo. Сочетая специфичность типа клеток AAV-опосредованного мечения с неинвазивными возможностями визуализации CSLO с высоким разрешением, этот метод позволяет исследователям изучать динамические изменения в RGC и глии Мюллера в ответ на различные стимулы или вмешательства. Эти выводы обладают значительным потенциалом для разработки новых диагностических и терапевтических стратегий лечения заболеваний сетчатки.

Протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Столичного медицинского университета в Пекине. Четырехнедельные взрослые самцы мышей C57BL/6J (весом от 15 до 20 г) использовались для всех экспериментов и содержались в помещениях с контролируемой температурой и 12-часовым циклом свет/темнота. Стандартная еда для грызунов и вода были доступны в неограниченном количестве. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Трансфекция AAV-опосредованных клеток сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для целенаправленной трансдукции РГК в этом протоколе используется AAV2-hSyn-eGFP, который включает в себя промотор hSyn для обеспечения надежной экспрессии усиленного GFP. Мюллеровская глия нацелена с помощью AAV9-GfaABC1D-eGFP. Для достижения оптимальной эффективности трансдукции и устойчивой экспрессии трансгенов для интравитреальных инъекций мышам13 рекомендуется минимальный титр AAV 1 x 1012 вирусных геномов (vg)/мл.

  1. Придерживайтесь строгих протоколов безопасности при проведении процедур трансфекции клеток сетчатки с помощью AAV, чтобы предотвратить случайное воздействие и обеспечить безопасную рабочую среду.
  2. Выполняйте все процедуры с вирусными векторами в сертифицированном кабинете биобезопасности (БСК). Снабдите персонал соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз, на протяжении всей процедуры.
  3. Утилизируйте все острые предметы и биологически опасные материалы надлежащим образом в соответствии с протоколами безопасности учреждения для соблюдения требований и защиты всего персонала лаборатории.

2. Получение вирусных векторов и животных

  1. Получите векторы AAV2-hSyn-eGFP или векторы AAV9-GfaABC1D-eGFP, хранящиеся при температуре -80 °C. Размораживайте векторы на льду непосредственно перед использованием, чтобы сохранить вирусную целостность.
  2. Обезболивайте мышей внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия в дозировке 50 мг/кг. Подтвердите глубину анестезии, проверив рефлексы задней стопы перед дальнейшими действиями.
  3. Подстригите усы, чтобы предотвратить вмешательство в операционную область во время процедуры. Продезинфицируйте глазницу 20% раствором повидон-йода в течение 2 с, затем тщательно промойте стерильным физиологическим раствором.
  4. Нанесите каплю 0,5% пропаракаина местно, чтобы свести к минимуму дискомфорт и предотвратить непроизвольные движения глаз.

3. Обработка и интравитреальное введение вирусных векторов

  1. Перенесите 1 мкл выбранного раствора AAV (AAV2-hSyn-eGFP или AAV9-GfaABC1D-eGFP) на кусок чистой, предварительно охлажденной парафиновой пленки, чтобы избежать колебаний температуры, которые могут повлиять на активность вируса.
  2. Аспирируйте раствор AAV с помощью стеклянного шприца Hamilton со скошенной иглой 33 G под офтальмологическим хирургическим микроскопом.
  3. Поместите мышь в брюшное лежачее положение под микроскопом. Слегка наклоните голову, чтобы приподнять глазную сторону, предназначенную для инъекции. Отрегулируйте и оптимизируйте увеличение микроскопа, чтобы четко определить верхнюю область орбиты мыши.
  4. Введите иглу на 1-2 мм позади лимба у верхнего склерального края глаза в полость стекловидного тела. Вводите растворы AAV медленно, чтобы избежать обратного потока или повреждений, вызванных давлением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение места инъекции: Выполняйте инъекцию в верхний височный квадрант глаза, примерно на 1 мм позади лимба. Выбирайте это место, чтобы избежать крупных кровеносных сосудов и свести к минимуму риск повреждения хрусталика. Избегайте мест инъекций слишком близко к лимбу, чтобы предотвратить проникновение радужной оболочки или истирание хрусталика. Избегание сосудистой сети: Используйте операционный микроскоп для тщательного осмотра запланированного места инъекции на предмет видимых кровеносных сосудов перед инъекцией. Если присутствуют сосуды, немного отрегулируйте точку входа, чтобы избежать их. Вводите иглу под небольшим углом, параллельно радужной оболочке, чтобы еще больше снизить риск повреждения сосудов. Избегайте повторных инъекций в одну и ту же область, чтобы снизить риск субретинального кровоизлияния.
  5. Удерживайте иглу на месте в течение 30 секунд, чтобы векторы рассеялись в камере стекловидного тела и осядли на поверхности сетчатки, тем самым максимизируя шансы на успешную трансдукцию.
  6. Медленно извлекайте иглу, чтобы свести к минимуму риск обратного кровотока стекловидного тела.
  7. Нанесите мазь с антибиотиком местного действия на место инъекции сразу после инъекции. Следите за тем, чтобы мазь наносилась равномерно, чтобы полностью покрыть поверхность глаза, предотвращая глазную инфекцию и воспаление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мазь с антибиотиком содержит 1 мг/г дексаметазона, 3500 МЕ/г сульфата неомицина и 6000 МЕ/г полимиксина B сульфата.
  8. Поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела во время восстановления после анестезии, и внимательно следите за ними на предмет любых признаков дистресса или отклонений. После полного выздоровления и отсутствия осложнений верните их в клетки с доступом к обычной пище и воде.

4. Визуализация in vivo с помощью CSLO

  1. Подготовка животных
    1. Выберите мышь, инфицированную AAV2-hSyn-eGFP или AAV9-GfaABC1D-eGFP после 4 недель интравитреального введения. Нанесите на поверхность глаза одну каплю глазного раствора, содержащего 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина, чтобы расширить зрачок примерно до 22 мм в диаметре.
      Примечание: Для оптимального флуоресцентного мечения клеток сетчатки после интравитреального введения рекомендуется интервал времени не менее 4 недель для трансдукции AAV. Кроме того, в наших экспериментах по раздавливанию зрительного нерва (ONC) сетчатка была визуализирована через 4 недели после инфекции, а также на 7 и 14 день после травмы. Эти временные точки были выбраны для того, чтобы зафиксировать как первоначальную экспрессию AAV, так и прогрессирование изменений сетчатки после ОНЦ.
    2. Накройте платформу для визуализации куском чистой прокладки, чтобы избежать возможного загрязнения экскрементов животных в процессе работы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанная платформа визуализации обеспечивает достаточно места для лежания животного, обеспечивая устойчивость и минимизируя движения во время ручного удержания для оптимального получения изображения.
    3. Осторожно перенесите мышь на платформу для визуализации и дайте период акклиматизации в течение 2-5 минут перед визуализацией, чтобы свести к минимуму стресс и облегчить адаптацию к среде визуализации.
    4. С помощью второго техника мягко удерживайте животное, сохраняя при этом сознательное состояние на протяжении всей процедуры. Обеспечьте 10-секундный интервал отдыха после 15 секунд визуализации, чтобы можно было моргать глазами и поддерживать влажность роговицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно потрите кожу головы, чтобы вызвать спонтанное поднятие век, избегая использования принудительного ограничения век или дополнительных приспособлений, таких как зажимы, тем самым снижая риск травмы глаз. Общая анестезия не используется для сохранения оптической прозрачности во время длительных сеансов визуализации, так как она может усугубить переходное помутнение хрусталика. Обеспечьте баланс между получением высококачественного изображения и комфортом и безопасностью животного на протяжении всей процедуры. Завершите всю процедуру в течение 5 минут, чтобы обеспечить благополучие животного и поддерживать качество визуализации.
    5. Отрегулируйте положение головы и выровняйте объектив камеры, точно настроив ручку фокусировки (рис. 1B) и микроманипулятор (рис. 1C), чтобы нацелить область интереса (ROI) для последующей визуализации in vivo .
  2. Конфигурация системы
    1. Прикрепите бесконтактный широкоугольный объектив с углом обзора 55° к камере, чтобы расширить поле зрения области глазного дна.
    2. Установите колесо фильтров в положение A (ангиография), чтобы обеспечить возможность получения инфракрасного (ИК) и флуоресцентного ангиографического (ФА) режимов визуализации (Рисунок 1A). Включите лазер и источник питания, чтобы активировать систему визуализации CSLO.
    3. Откройте программное обеспечение Heidelberg Eye Explorer и создайте новое обследование, нажав на значок «Новый пациент » в верхней части строки меню. Введите соответствующую информацию о животном и примите кривизну роговицы по умолчанию 7,7 мм во всплывающем окне.
    4. Выберите желтую кнопку «Пуск » (рисунок 1E) на экране панели управления, чтобы начать режим обработки изображений в реальном времени.
  3. Визуализация in vivo CSLO
    1. Выберите на панели управления ИК-режим (рис. 1G) с автофлуоресценцией на длине волны возбуждения 820 нм. Для получения изображений с высоким разрешением технология High Res. (HR) активируется либо через оконный интерфейс, либо через ручную панель управления (рис. 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасная визуализация (ИК) обычно является первым шагом в офтальмологической визуализации CLSO, полученной до флуоресцентной ангиографии (ФА), для получения исходного изображения. Равномерное освещение, минимальные артефакты и четкая фокусировка на основных сосудах сетчатки имеют решающее значение для надежности фокусировки в z-плоскости и получения высококачественных ИК-изображений.
    2. Переместите линзу по направлению к глазу мыши с помощью джойстика с микроманипулятором XYZ для точной настройки. Изучите оптическую прозрачность и поверните ручку чувствительности (Рисунок 1D) против часовой стрелки, чтобы уменьшить яркость изображения глазного дна до 40%-60%, тем самым избегая передержки глазного дна и улучшая визуализацию деталей сетчатки.
    3. Отрегулируйте ручку фокусировки и микроманипулятор до тех пор, пока на глазном дне не будут однозначно идентифицированы диск зрительного нерва и сосуды сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии оптимальной фокальной плоскости: (1) Равномерно освещенный вид глазного дна без темных углов. (2) Равномерное освещение вокруг диска зрительного нерва без очаговых темных пятен или искажений. (3) Четкая форма просвета крупных сосудов сетчатки с видимым движением кровотока.
    4. Переключитесь в режим FA (рисунок 1H) с помощью твердотельного синего лазера на длине волны возбуждения 488 нм и барьерного фильтра на длине волны 500 нм. Поверните ручку чувствительности (Рисунок 1D) по часовой стрелке, чтобы увеличить яркость изображения глазного дна до 50%-107% для освещения целевой области сетчатки.
    5. Установите среднее значение ART (синяя полоса в левом нижнем углу интерфейса программного обеспечения) как минимум 15, чтобы улучшить отношение сигнал/шум. Эта функция усредняет серию B-сканов, полученных в одном и том же месте, улучшая качество изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя более высокое значение усреднения ART обычно улучшает качество изображения за счет усреднения, оно также увеличивает продолжительность сканирования. Такая продолжительность может потенциально увеличить риск обезвоживания роговицы и усталости животных, факторы, которые необходимо тщательно учитывать, особенно при визуализации животных в сознании.
    6. Выровняйте по внутренней плоскости сетчатки, целенаправленно нацеливаясь на GFP, экспрессирующие RGC или глиальные клетки Мюллера. Тонкая регулировка производится для обеспечения четкого освещения желаемой популяции клеток, такой как сома и аксоны RGC или тело клетки Мюллера. Чувствительность визуализации сбалансирована для достижения оптимальной визуализации и предотвращения перенасыщения GFP-положительных клеток.
      Примечание: Для получения изображений с сопоставимой четкостью и яркостью сигнала GFP регистрация чувствительности должна быть постоянной для всех мышей в эксперименте.
    7. Нажмите ручку чувствительности (Рисунок 1D), чтобы запустить режим ART, который генерирует живое среднее изображение в режиме онлайн. Подождите, пока синяя полоса (представляющая среднее значение ART) в левом нижнем углу интерфейса программного обеспечения достигнет установленного значения ART (≥ 20 кадров), и нажмите кнопку «Получить» на интерфейсе управления, чтобы сделать снимок глазного дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме ART встроено отслеживание движения глаз для автоматической компенсации незначительных движений глаз во время визуализации in vivo , что обеспечивает постоянную фокусировку на выбранной фокальной плоскости сетчатки.
    8. После получения желаемых изображений выйдите из режима ART, нажав ручку чувствительности на сенсорной панели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить высыхание роговицы и обеспечить спонтанное моргание глаз, каждые 15 секунд в процессе визуализации были сделаны 10-секундные перерывы.
    9. Чтобы перемещаться по носовой и височной областям сетчатки, перемещайте головку камеры горизонтально, наблюдая за изображением в реальном времени на экране. Как только целевая область будет достигнута, выполните точную настройку фокусировки и начните процесс визуализации, как описано в шагах 2.3.1-2.3.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте медленные и контролируемые движения камеры, обеспечивая при этом равномерное и яркое освещение глазного дна. Если появляются темные участки, используйте микроманипулятор, чтобы отрегулировать положение камеры по вертикали и повторно центрировать сетчатку.
    10. Чтобы получить изображение верхней сетчатки, аккуратно отрегулируйте положение головы мыши в положение лицевой стороной вверх. Умеренно наклоните головку камеры вверх, чтобы выровнять верхнюю область сетчатки. При необходимости снова отрегулируйте фокус и продолжайте съемку.
    11. По завершении визуализации, все желаемые области сетчатки выходят из окна съемки, а изображения автоматически сохраняются. Нанесите местную смазку на визуализируемый глаз для поддержания увлажнения роговицы.
    12. Чтобы начать осмотр контралатерального глаза, переместите животное на противоположную сторону платформы и повторите шаги 2.3.1-2.3.11.

5. Обработка и анализ изображений

  1. Экспорт и подготовка изображений
    1. Откройте программное обеспечение Heidelberg Eye Explorer и выберите нужный сеанс визуализации CSLO с хорошим качеством. Выбирайте одно или последовательное изображение одного и того же положения сетчатки с постоянными настройками чувствительности в течение определенного времени.
    2. Исключите размытые изображения с плохой фокусировкой или четкостью роговицы, гарантируя, что для анализа будут использоваться только изображения с четкой визуализацией структур сетчатки. Экспортируйте эти изображения в формат TIFF для дальнейшей обработки.
  2. Выравнивание и обрезка изображений
    1. Группируйте изображения для каждого глаза мыши на основе одной и той же области сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные изображения, полученные из системы CSLO, сохраняются в следующем формате: TIFF с размером 1536 x 1536 пикселей, разрешением 5,69 мкм/пиксель и значением ART ≥15.
    2. Для последующих обследований импортируйте изображения в подходящее программное обеспечение для обработки изображений. Поворачивайте и выравнивайте изображения по мере необходимости, чтобы они соответствовали ориентации базового изображения. При сохранении или экспорте обработанных изображений используйте настройки, которые поддерживают максимально возможное качество изображения, чтобы свести к минимуму потенциальные артефакты сжатия.
    3. Выровняйте изображения CSLO из временного ряда одного и того же глаза, повернув их в соответствии с соответствующим базовым изображением, используя сосудистую сеть и диск зрительного нерва в качестве ориентиров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно изучите каждое выровненное изображение, и прежде чем приступать к кадрированию, убедитесь, что оно соответствует следующим критериям: (1) Полный захват области сетчатки: изображение должно полностью охватывать предполагаемую область сетчатки, включая ключевые ориентиры, такие как диск зрительного нерва и основные кровеносные сосуды; (2) Отсутствие артефактов движения: изображение должно быть без размытия, полос или дублирования структур, вызванных движением глаз во время визуализации; (3) Минимальное искажение: изображение должно точно отображать структуру сетчатки без деформации, растяжения или артефактов сжатия, которые могут возникнуть из-за углов изображения или эффектов линзы. (4) Баланс показателей качества изображения: оценка уровней фонового шума (стандартное отклонение интенсивности пикселей в областях без структуры < 5 (масштаб 0-255)); отношение сигнал/шум (SNR >20), постоянство освещения (коэффициент вариации между шестью квадрантами изображения <10%) и однородность изображения (коэффициент вариации в однородных областях <15%).
    4. Выделите повернутое изображение и экспортируйте его в формат TIFF. Для каждой временной точки используйте инструмент обрезки, чтобы случайным образом выбрать и обрезать 5–10 областей (300 x 300 пикселей каждая), содержащих GFP-положительные ячейки, из изображений с одобренным качеством. Экспортируйте каждое обрезанное изображение по отдельности в формат TIFF для дальнейшего анализа.
  3. Измерение интенсивности флуоресценции
    1. Откройте обрезанные изображения CSLO (8-битные оттенки серого, 300 x 300 пикселей) в ImageJ/Fiji.
    2. Чтобы изучить общие изменения флуоресцентных сигналов, измерьте общую интенсивность флуоресценции для каждого обрезанного изображения с помощью функции «Анализ > измерение » (или Ctrl + M). Запишите значение «Среднее», представляющее среднюю интенсивность флуоресценции GFP всего обрезанного изображения.
  4. Количественная оценка RGC
    1. В ImageJ/Fiji отрегулируйте порог интенсивности обрезанных изображений CSLO с помощью Image > Adjust > Brightness/Contrast, чтобы добиться оптимальной визуализации отдельных белых тел сомы на черном фоне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите индивидуальный порог после просмотра партии обрезанных изображений или примените последовательный алгоритм порогового значения (например, метод5 Хуанга в ImageJ/Fiji). Для метода Хуанга: (1) Преобразуйте изображения в 8-битные оттенки серого (Image > Type > 8-bit). (2) Откройте инструмент порогового значения (Изображение > Настроить > порог). (3) Выберите Хуан в качестве метода порогового значения. (4) Просмотрите сегментацию и нажмите « Применить». Порог будет автоматически рассчитан и отображен на гистограмме изображения.
    2. Активируйте плагин Cell Counter и нажмите на каждую GFP-положительную RGC soma для подсчета. Запишите общее количество помеченных ячеек в анализируемой области. Повторите этот процесс для всех обрезанных изображений с каждой последующей временной точки.
  5. Анализ данных
    1. Экспортируйте данные о количестве клеток и интенсивности флуоресценции в электронную таблицу или статистическое программное обеспечение (например, GraphPad Prism).
    2. Проведение соответствующих статистических тестов на основе соответствующего плана эксперимента и гипотез. Интерпретируйте результаты и сделайте вывод.

Результаты

В соответствии с представленным протоколом различные клетки сетчатки были успешно визуализированы и отслежены in vivo с использованием комбинации AAV-опосредованной доставки генов и CSLO. AAV2-hSyn-eGFP эффективно трансдуцирует RGC, что приводит к устойчивой экспрессии eGFP по всей сетчатке, что подтверждается CSLO и колокализацией с RGC-специфичным маркером, РНК-связывающим белком с множественным сплайсингом (RBPMS), специфически обнаруженным в слое ганглиозных клеток (рис. 2 и рис. 3). Протокол также подтвердил возможность нацеливания на глию Мюллера с помощью AAV9-GfaABC1D-eGFP. Визуализация CSLO выявила широко распространенную экспрессию eGFP, особенно во внутренних слоях сетчатки, что согласуется с известным основным сегментом распространения глии Мюллера. Положительный сигнал GFP также сильно колокализовался с маркером глии Мюллера глутаминсинтетазой (GS), что еще раз подтверждает специфичность этого подхода (рис. 2E, F и рис. 3B). Эти результаты подтвердили универсальность доставки генов с помощью AAV для изучения различных типов клеток сетчатки. Для подтверждения возможности наведения на глию Мюллера использовали AAV9-GfaABC1D-eGFP. Визуализация CSLO выявила широко распространенную экспрессию eGFP, особенно во внутренних слоях сетчатки, что согласуется с известным распределением глии Мюллера (рис. 2E, F). Этот селективный паттерн экспрессии был дополнительно подтвержден высокой степенью колокализации, наблюдаемой между сигналом GFP и глиа-маркером глутаминсинтетазы (GS) глии Мюллера (Рисунок 3B).

Для количественной оценки специфичности и эффективности подхода к таргетированию вируса как для РГК, так и для глии Мюллера, был проведен анализ кололокализации для сравнения флуоресценции GFP со стандартными маркерами клеточного типа (рис. 3B, D). Всего было проанализировано 6 глаз мыши. Для РГК, на которые нацелены AAV2-hSyn-GFP, эффективность трансдукции составила 64% ± 3%, в то время как специфичность трансдукции составила 68% ± 3%. Для глии Мюллера, на которую нацеливался AAV9-GfaABC1D-GFP, эффективность трансдукции составила 58% ± 2%, а специфичность трансдукции составила 71% ± 2%. Эти результаты демонстрируют, что этот AAV-опосредованный подход к доставке генов позволяет селективно мечить различные типы клеток сетчатки, подчеркивая его универсальность для изучения клеточных и молекулярных процессов в сетчатке.

Для оценки пригодности CSLO для лонгитюдного мониторинга возмущений клеток сетчатки была проведена транзиентная модель ONC на мышах, инфицированных AAV2-hSyn-eGFP. В течение двух недель наблюдалось прогрессирующее снижение сигнала eGFP и количества RGC (Рисунок 4). Выживаемость RGC количественно оценивали с помощью трех показателей: интенсивность флуоресценции CSLO, количество клеток in vivo для изображений CSLO и количество RBPMS-положительных клеток ex vivo RGC. После обработки изображения, как описано на шаге 4, по крайней мере 10 областей интереса (ROI) были обрезаны из каждой сетчатки (всего 6 глаз), что гарантировало, что каждый ROI охватывает одно и то же расположение сетчатки и демонстрирует сигналы четких клеток в каждый момент времени. Затем интенсивность флуоресценции CSLO количественно оценивали путем измерения средней интенсивности в пределах каждого обрезанного ROI в каждой временной точке. In vivo количество клеток было получено путем ручного подсчета отдельных GFP-положительных RGC в пределах одного и того же обрезанного ROI в каждый момент времени. Наконец, сетчатку собирали для иммуноокрашивания RBPMS, и RBPMS-положительные клетки подсчитывали в пределах 24 определенных областей, визуализированных в каждом секторе сетчатки для каждой сетчатки. Были обнаружены значимые отрицательные корреляции между всеми тремя показателями выживаемости РГК (интенсивность флуоресценции CSLO, количество клеток in vivo и количество RBPMS-положительных клеток ex vivo ) и временем после ОНК (p < 0,001 для всех, рисунок 4C), демонстрируя прогрессирующую потерю РГК и дегенерацию. Важно отметить, что не наблюдалось существенных различий между различными экспериментальными группами с точки зрения исходной плотности RGC или скорости снижения, что указывает на общую согласованность модели ONC и подхода к визуализации. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями повреждения РГК после ОНК и подтверждают эффективность этого протокола на основе CSLO в качестве неинвазивного и надежного инструмента для мониторинга здоровья РГК.

Для дальнейшего исследования проекций аксонов RGC в зрительном пути был использован подход с двойным мечением с комбинацией AAV-опосредованного мечения eGFP с субъединицей антероградного индикаторного холерного токсина B (CTB)24. Мышам вводили интравитреальную инъекцию СТВ и через 2 дня умерщвляли для гистологического анализа. Колокализация сигналов eGFP и CTB в зрительных нервах подтвердила положительное отслеживание аксонов RGC (рис. 5A). Для дальнейшего изучения изменений сигналов после аксонального повреждения мышам проводили одностороннее сдавливание зрительного нерва (ОНЦ) на модели острого повреждения РГК25. На короткое время мышам была сделана анестезия, а один зрительный нерв был обнажен и раздавлен примерно на 1 мм позади глазного яблока с помощью тонких щипцов в течение 5 с, что вызвало значительную аксотомию RGC и последующую дегенерацию. После повреждения ОНК наблюдалось заметное снижение интенсивности как eGFP, так и CTB, что указывает на значительную потерю нервных волокон и нарушение транспорта аксонов. Дальнейший анализ срезов мозга выявил проекции РГК на верхнюю колликулус (СК), структуру среднего мозга, участвующую в сенсомоторной интеграции и движениях глаз, и на латеральное коленчатое ядро (ЛГН), основной ретрансляторный центр визуальной информации в зрительную кору. После ОНЦ было выявлено снижение интенсивности GFP на контралатеральной стороне травмы (Рисунок 5B-E). Эти результаты демонстрируют полезность данного метода для изучения аксональной дегенерации РГК и картирования их проекционных паттернов in vivo, предлагая потенциальную альтернативу традиционным инвазивным методам трассировки.

figure-results-1
Рисунок 1: Система визуализации конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа (CSLO) и интерфейс панели управления для визуализации сетчатки в реальном времени. (A-D) Компоненты системы визуализации: На этих изображениях изображены ключевые компоненты устройства HRA CSLO. (A) Рычаг фильтра установлен в положение «A» для комбинированной инфракрасной отражательной (ИК) и флуоресцентной ангиографии (ФА). (B) Ручка фокусировки регулирует точную фокусировку объектива. (C) Микроманипулятор обеспечивает точное позиционирование, выравнивание и освещение светового луча на сетчатке с помощью нескольких степеней свободы (например, по осям X, Y, Z) и вращения. (D) Ручка чувствительности управляет яркостью ИК- и ФА-изображений, регулируя усиление обнаруженного светового сигнала. Нажатие на ручку инициирует усреднение изображения, которое объединяет несколько кадров для снижения шума и улучшения отношения сигнал/шум. (Э-Х) Интерфейс панели управления: На скриншотах показана панель управления CSLO с настройками, используемыми для получения и визуализации изображений в реальном времени. (E) Запускается панель управления сбором данных. (F) Для оптимального качества изображения рекомендуется использовать режим высокого разрешения. (G) Настройки ИК-визуализации подсвечиваются, что позволяет визуализировать структуры сетчатки и кровеносные сосуды. (H) Настройки визуализации FA отображают опции как для одноточечной, так и для многоточечной флуоресцентной визуализации, что позволяет обнаруживать флуоресцентные сигналы в клетках сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Визуализация in vivo CSLO флуоресцентно меченых клеток сетчатки после трансфекции AAV у мышей C57. (A) Экспериментальная хронология продольной визуализации с помощью CSLO после трансфекции AAV в глазу мыши. (B) Репрезентативные CSLO-изображения верхней и центральной областей сетчатки мыши C57 после 4 недель экспрессии AAV2-hSyn-eGFP. Масштабная линейка: 500 мкм. (C) Вручную сшитый монтаж сетчатки из (B) демонстрирует распределение eGFP-экспрессирующих клеток сетчатки. Масштабная линейка: 500 мкм. (D) Увеличенное CSLO-изображение прямоугольной области на рисунке (C) и соответствующее конфокальное микроскопическое изображение плоской сетчатки. Колокализация eGFP (зеленый) с маркером RGC RBPMS (красный) подтверждает AAV-опосредованную экспрессию в ганглиозных клетках сетчатки (примеры обведены). Масштабная линейка: 50 мкм. (E) Вручную сшитый монтаж сетчатки мыши C57 через 4 недели после инъекции AAV9-GfaABC1D-eGFP, демонстрирующий экспрессию eGFP, специфичную для глии Мюллера. Масштабная линейка: 500 мкм. (F) Увеличенное изображение ограниченной области в формате CSLO на рисунке (E) и соответствующее конфокальное микроскопическое изображение плоской сетчатки. Колокализация eGFP (зеленый) с глиа-маркером глутаминсинтетазы Мюллера (GS, красный) подтверждает AAV-опосредованную экспрессию в глиальных клетках Мюллера (примеры обведены). Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Специфичность типа клеток AAV-опосредованной доставки гена в сетчатку мыши. (A) Иммуногистохимический анализ среза сетчатки и плоского маунта у мышей C57 после 4 недель инфекции AAV2-hSyn-eGFP. Колокализация GFP (зеленый) с RBPMS (красный) подтверждает специфичную для RGC экспрессию. Масштабная линейка: 50 мкм. (B) Количественная оценка эффективности и специфичности трансдукции AAV2-hSyn-GFP в РГК. Эффективность представлена в процентном соотношении RBPMS-положительных РГК, которые также экспрессируют GFP в плоскостной сетчатке. Специфичность представлена в процентном соотношении GFP-положительных клеток, которые также положительны на RBPMS в отделе сетчатки (n = 6 глаз от 4 мышей). (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание среза сетчатки и плоского маунта у мышей C57 после 4 недель инфекции AAV9-GfaABC1D-eGFP. Колокализация GFP (зеленый) с GS (красный) подтверждает экспрессию, специфичную для глии Мюллера. Масштабная линейка: 50 мкм. (D) Количественная оценка эффективности и специфичности трансдукции AAV9-GfaABC1D-GFP в глии Мюллера. Эффективность представлена в процентном соотношении GS-положительной глии Мюллера, которая также экспрессирует GFP в плоской сетчатке. Специфичность представлена в процентном соотношении GFP-положительных клеток, которые также положительны на GS в отделе сетчатки (n = 6 глаз от 3 мышей). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Лонгитюдный мониторинг выживаемости RGC после острого повреждения зрительного нерва (ONC) у мышей AAV2-hSyn-eGFP. (A) Принципиальная диаграмма экспериментальной временной шкалы острого повреждения зрительного нерва после инфицирования AAV. (B) Продольная визуализация CSLO той же сетчатки у мыши AAV2-hSyn-eGFP на исходном уровне, через 7 и 14 дней после ОНЦ, с визуализацией РГК, экспрессирующих сигналы GFP. Увеличенные изображения прямоугольных областей показаны справа, наряду с репрезентативными конфокальными микроскопическими изображениями плоских маунтов сетчатки, демонстрирующими морфологию и распределение RGC. Масштабные линейки: 100 мкм. (C) Количественная оценка выживаемости РГК в течение двух недель после ОНК оценивалась путем измерения процентного изменения как количества клеток, так и интенсивности флуоресценции CSLO по отношению к исходному уровню (среднее значение ± SEM). Существенных различий между группами в каждый момент времени не наблюдалось (односторонняя ANOVA). Линейный регрессионный анализ выявил значимые отрицательные корреляции между временем после травмы и показателями выживаемости RGC на основе флуоресценции GFP (r² = 0,945, p < 0,001), окрашивания RBPMS (r² = 0,888, p < 0,001), количества клеток CSLO (r² = 0,511, p < 0,001) и интенсивности флуоресценции CSLO (r² = 0,7486, p < 0,001). n = 6 мышей/группа/временная точка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Картирование аксональных проекций RGC вдоль визуального пути с помощью AAV. (A) Репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения пары зрительных нервов мыши AAV2-hSyn-eGFP, демонстрирующие меченые GFP аксоны RGC (зеленые) и колокализацию с антероградным аксональным индикатором холерного токсина B (CTB, пурпурный). Верхняя панель обеспечивает обзор всех зрительных нервов (масштабная линейка: 1000 μм), в то время как нижняя панель предлагает увеличенное изображение прямоугольных областей (масштабная линейка: 100 μм). Через две недели после травмы ОНК сигналы GFP и CTB показывают заметное уменьшение по всему зрительному нерву (левая сторона), что указывает на потерю аксонов RGC и нарушение по зрительному пути. (B) Проекции аксонов RGC в верхнюю колликулусную область (SC). Корональные срезы мозга мыши AAV2-hSyn-eGFP через 2 недели после ONC выделяют GFP-меченые аксоны RGC (зеленые) и окрашивание CTB (пурпурное) в пределах SC. Слева (L): контралатеральный SC; Справа (справа): ипсилатеральная сторона SC (сторона с травмой ONC). Масштабная линейка: 1000 мкм. (C) Увеличенное изображение прямоугольной области на рисунке (B) демонстрирует колокализацию сигналов GFP и CTB (объединенное изображение), выделяя аксональные пучки RGC и их проекционные паттерны в пределах SC. Масштабная линейка: 100 мкм. (D) Проекции аксонов RGC на латеральное коленчатое ядро (LGN) вслед за ONC, выявляя меченые GFP аксоны RGC (зеленый) и окрашивание CTB (пурпурный) в пределах LGN. Слева (L): контралатеральная ЛГН; Справа (справа): ипсилатеральная LGN (сторона с травмой ONC). Масштабная линейка: 1000 мкм. (E) Увеличенное изображение прямоугольной области на рисунке (D) выделяет аксональные пучки RGC и их проекционные паттерны в пределах LGN. Масштабная линейка: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Представленный протокол подробно описывает надежный и доступный метод эпиднадзора in vivo за конкретными популяциями клеток сетчатки, использующий возможности как AAV-опосредованной доставки генов, так и визуализации CSLO. Этот подход имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами, облегчая лонгитюдные исследования динамики клеток сетчатки и их реакции на травму или заболевание в физиологических или патологических условиях.

Успех этого метода зависит от нескольких важных шагов. Во-первых, достижение оптимальной эффективности трансдукции AAV имеет решающее значение для устойчивой и специфической экспрессии флуоресцентного репортера в популяции клеток-мишеней. На это могут влиять такие факторы, как выбор серотипа AAV, титр вируса и техника инъекции 13,15,16. Во-вторых, правильное обращение с животными и удержание их во время визуализации CSLO имеют важное значение для минимизации артефактов движения и поддержания качества изображения. Использование специально разработанной платформы визуализации и отказ от общей анестезии способствуют достижению четкой и последовательной визуализации структур сетчатки. В-третьих, необходима тщательная оптимизация параметров изображения CSLO, включая параметры фокусировки, чувствительности и усреднения, для получения изображений с высоким разрешением с минимальным уровнем шума и оптимальным соотношением сигнал/шум26. Наконец, чтобы устранить потенциальные ограничения и обеспечить надежность данных, мы внедрили строгие меры контроля качества изображений и увеличили количество животных в нашем дизайне исследования.

Система Spectralis HRA CSLO оснащена функцией автоматического отслеживания взгляда, что улучшает клиническую продольную визуализацию. Его функция автоматического отслеживания в реальном времени (ART) может фиксироваться на определенной области сетчатки во время визуализации, уменьшая артефакты движения. Для клинической визуализации человека система также включает алгоритм долгосрочного отслеживания одного и того же анатомического местоположения сетчатки27. Однако эти технологии не оптимизированы для изучения на грызунах из-за значительных анатомических различий между глазами человека и грызуна. Глаза грызунов намного меньше (3-4 мм в диаметре по сравнению с 24 мм у человека) и не имеют определенных ориентиров, таких как макула, что создает уникальные проблемы для автоматизированногослежения. Следовательно, исследователи, изучающие модели грызунов, в первую очередь полагаются на мануальные методы, используя анатомические ориентиры, такие как узоры сосудов и диск зрительного нерва, для определения местоположения конкретных областей сетчатки и поддержания постоянной плоскости визуализации напротяжении сеансов. Этот подход необходим не только из-за ограниченных ориентиров в глазах грызунов, но и из-за потенциально существенных изменений сетчатки, вызванных экспериментальными манипуляциями, которые могут сбить с толку автоматизированные системы, не предназначенные для этих конкретных задач. Таким образом, разработка специализированных алгоритмов отслеживания и выравнивания глаз для визуализации сетчатки у грызунов представляет собой важнейшее направление в будущем. В частности, адаптация алгоритмов долгосрочного отслеживания для использования в мелких животных может значительно повысить точность и воспроизводимость лонгитюдных исследований.

В то время как традиционные гистологические методы требуют жертвоприношения животных и исключают продольные исследования, этот метод визуализации CSLO с помощью AAV предлагает неинвазивный подход к мониторингу динамики клеток сетчатки in vivo. Этот подход основан на предыдущей работе, демонстрирующей полезность визуализации cSLO для отслеживания продольных изменений в конкретных клетках сетчатки после травмы, особенно в животных моделях, использующих мечение трансгенных флуоресцентных белков 19,21,22,29. Эти исследования показали способность CSLO визуализировать ряд событий в клетках сетчатки in vivo, включая гибель клеток, выживание и потенциально даже миграцию или отрастание процессов. Этот протокол расширяет возможности применения этого метода для изучения AAV-опосредованной трансдукции конкретных популяций клеток сетчатки, что позволяет нам отслеживать долгосрочные эффекты доставки AAV и экспрессии трансгенов в сетчатке, а также дает решающее представление о прогрессировании заболеваний сетчатки и эффективности терапевтических вмешательств. Современные клинические оценки с использованием ОКТ в первую очередь сосредоточены на потере аксонов РГК путем измерения толщины слоя нервных волокон сетчатки9, но им не хватает разрешения для оценки индивидуальной морфологии РГК или вовлечения глиальных клеток. Несмотря на то, что AO-SLO позволяет получать изображения на клеточном уровне в живой сетчатке глазачеловека10, его сложность и ограниченная доступность ограничивают его использование в основном в исследовательских условиях. Кроме того, дифференцировка типов глиальных клеток в пределах AO-SLO часто требует дополнительных методов мечения30. Этот метод позволяет обойти эти ограничения, обеспечивая более комплексный и доступный подход к визуализации и отслеживанию отдельных РГК и других флуоресцентно меченных популяций клеток сетчатки с течением времени. Это открывает возможности для исследования клеточных реакций в различных условиях, способствуя разработке таргетной терапии. Кроме того, сочетание визуализации CSLO с помощью AAV с оптогенетикой31 или визуализацией кальция32 может еще больше углубить понимание функции клеток сетчатки и их роли в визуальной обработке, развитии цепей и регенерации.

Несмотря на сильные стороны этого подхода, следует признать некоторые ограничения и потенциальные соображения по устранению неполадок. Может наблюдаться вариабельность эффективности трансдукции AAV, что требует оптимизации параметров инъекции или титра вируса для конкретных типов клеток или экспериментальных условий. На визуализацию CSLO могут влиять такие факторы, как помутнение роговицы, нестабильность слезной пленки и движения глаз, что требует тщательного мониторинга и корректировки во время получения изображения. Кроме того, ограниченная глубина проникновения CSLO ограничивает визуализацию внутренними слоями сетчатки, потенциально исключая более глубокие структуры, такие как фоторецепторы33. Система Spectralis cSLO позволяет четко визуализировать различные клеточные особенности и паттерны в сетчатке34. В то время как этот метод визуализации может облегчить наблюдение за отдельными клетками при определенных условиях, как было продемонстрировано в предыдущей работе по визуализации отдельных RGC у мышей с разреженной меткой Thy1-YFP22, он может создать проблемы для количественной оценки отдельных клеток в сценариях с плотной меткой. Например, в этом исследовании массовое мечение РГК с помощью eGFP после AAV-опосредованной инфекции сетчатки иногда может препятствовать четкой визуализации отдельных клеток, особенно в областях с вариациями уровней экспрессии и наложения клеток. Эта проблема еще больше усложняется при визуализации глии Мюллера, поскольку их удлиненная морфология, охватывающая всю толщину сетчатки35, затрудняет захват одной клетки в одной фокальной плоскости с помощью cSLO. Таким образом, оценка эффективности инфекции глии Мюллера, опосредованной AAV9, основывается в первую очередь на оценке общих паттернов трансдукции и ее распределения с помощью визуализации CSLO.

Кроме того, в то время как усреднение АРТ в системе HRA улучшает качество изображения, увеличенная продолжительность сканирования имеет практические ограничения, особенно при визуализации животных в сознании. Выбранное среднее значение ART 15 обеспечивает баланс между качеством изображения и временем сканирования, обеспечивая достаточное шумоподавление при сохранении разумной продолжительности сканирования. Чтобы свести к минимуму дискомфорт и стресс у животных, необходимо оптимизировать процедуры визуализации для повышения эффективности, нанять обученный персонал, обладающий навыками работы с животными и визуализации бодрствующих животных, а также тщательно контролировать животных на предмет признаков дискомфорта или сухости роговицы во время сеансов визуализации. Эти меры имели решающее значение для обеспечения как качества данных, так и благополучия животных, подчеркивая важность учета обоих факторов при использовании усреднения АРТ для визуализации сетчатки in vivo на моделях животных в сознании.

Признавая эти ограничения и потенциальные источники изменчивости, исследователи могут предпринять соответствующие шаги для оптимизации протоколов визуализации, минимизации артефактов и обеспечения надежности и воспроизводимости своих данных.

В целом, этот доступный и легко реализуемый метод предлагает мощное средство для исследования сложного взаимодействия между РГК и глией Мюллера, особенно в ответ на травму или заболевание. Позволяя исследователям визуализировать и количественно оценить эти динамические взаимодействия, этот подход способствует открытию новых клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе патологий сетчатки. Это, в свою очередь, проливает свет на разработку целевых терапевтических стратегий и совершенствование мер противодействия заболеваниям.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (82130029). Рисунок 2A и рисунок 4A были созданы с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 33 калибраHamilton Corp., Рино, Невада, США7803-05Для интравитреального введения
0,5% пропаракаина Сантэн Фармасьютикал Ко., Лтд.Местные анестетики
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., КитайТитр вируса: 2,7 x 1012 вирусных геномов (vg)/мл 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., КитайТитр вируса: 4,5 x 1012 вирусных геномов (vg)/мл 
БетадинЗдоровая медицинская компания001651Топические антисептики
Роговичные щипцы (зубчатые)Mingren Eye Instruments, КитайMR-F301AДля безопасного век во время интравитреального введения
Дюмонт 05# щипцыFST51-AGT5385Для сдавливания зрительного нерва
Графпад призма ГрафПадПризма, СШАПостроение графиков и статистический анализ
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Германия"IR" и "FA" режим для визуализации CSLO
Image J/Fiji National Institutes of Health, СШАОбработка изображений
Мазь с антибиотиком макситролаAlcon Laboratories, INC. США0065-0631Антибиотики для местного применения
Микролитровый шприцHamilton Corp., Рино, Невада, США7633-01Для интравитреального введения
Mydrin-P Офтальмологический растворSanten Pharmaceutical Co., Ltd, Япония
Офтальмологический хирургический микроскоп для расширения зрачка Leica AG, Хеербругг, ШвейцарияM220Для хирургических операций
Пенторбарбитол НатрияСигма Олдрич, США57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, СШАВыравнивание изображения и обрезка
VISCOTEARS Жидкий гель (Carbomer)Д-р Герхард Манн, Chem.-Pharm. Fabrik, ГерманияСмазочные материалы для наружного применения 

Ссылки

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

Перепечатки и разрешения

Теги

AAVGFP

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.