Методическая статья

Изготовление и определение характеристик микроигольчатых пластырей для загрузки и доставки экзосом

DOI:

10.3791/67109

⸱

12 июля 2024 г.

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомы обладают значительным клиническим потенциалом, но их практическое применение ограничено из-за легкого клиренса in vivo и плохой стабильности. Микроиглы представляют собой решение, обеспечивающее локализованную доставку путем прокола физиологических барьеров и сохранения в сухом состоянии, тем самым устраняя ограничения введения экзосом и расширяя их клиническую полезность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомы, как новые биотерапевтические средства «следующего поколения» и векторы доставки лекарств, обладают огромным потенциалом в различных областях биомедицины, начиная от доставки лекарств и регенеративной медицины и заканчивая диагностикой заболеваний и иммунотерапией опухолей. Однако быстрый клиренс при традиционной болюсной инъекции и плохая стабильность экзосом ограничивают их клиническое применение. Микроиглы служат раствором, который продлевает время пребывания экзосом в месте введения, тем самым поддерживая концентрацию препарата и способствуя длительному терапевтическому эффекту. Кроме того, микроиглы также обладают способностью поддерживать стабильность биоактивных веществ. Поэтому мы представляем пластырь с микроиглами для загрузки и доставки экзосом и делимся методами, включая выделение экзосом, изготовление и характеристику нагруженных экзосомами микроигольчатых пластырей. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием трегалозы и гиалуроновой кислоты в качестве материалов наконечника и поливинилпирролидона в качестве основного материала с помощью двухэтапного метода литья. Микроиглы продемонстрировали высокую механическую прочность, а наконечники были способны выдержать 2 Н. Для имитации человеческой кожи использовалась свиная кожа, и кончики микроигл полностью расплавились в течение 60 с после прокола кожи. Экзосомы, высвобождаемые из микроигл, демонстрировали морфологию, размер частиц, маркерные белки и биологические функции, сопоставимые с таковыми у свежих экзосом, что позволяло дендритным клеткам поглощать и способствовать их созреванию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомы, которые представляют собой небольшие везикулы, высвобождаемые клетками во внеклеточный матрикс, были предложены в качестве потенциальных биотерапевтических средств и векторов доставки лекарств для лечения ряда заболеваний и видоврака. В процессе биогенеза экзосомы инкапсулируют различные биологически активные молекулы из клеток, включая функциональные белки и нуклеиновыекислоты. В результате, поглощаемые клетками-реципиентами в процессе транспортировки, экзосомы обладают способностью модулировать экспрессию генов и клеточные функциив клетках-мишенях. В качестве своего рода естественного посланника информации экзосомы были в полной мере использованы в регенерации тканей, иммунной регуляции и вкачестве носителя доставки. С помощью инженерных методов специфические лиганды могут быть обогащены на поверхности экзосом, что позволяет индукционизировать или ингибировать сигнальные события в клетках-реципиентах или нацеливаться на определенные типы клеток. Химиотерапевтические агенты также могут быть загружены в экзосомы для лечения рака6. Кроме того, экзосомы обладают способностью пересекать гематоэнцефалический барьер для доставки терапевтического груза, что делает их весьма перспективными для лечения заболеваний головногомозга. По сравнению с липосомами, экзосомы демонстрируют повышенное поглощение клетками и улучшенную биосовместимость. Они способны эффективно проникать в другие клетки, демонстрируя при этом лучшую переносимость и меньшую токсичность9. Тем не менее, традиционная болюсная инъекция экзосом подвержена секвестрации и быстрому выведению печенью, почками и селезенкой вкровоток. Кроме того, экзосомы обладают плохой стабильностью in vitro и чувствительны к условиям хранения, которые ограничивают ихклиническое применение.

Микроиглы, представляющие собой массив наконечников игл микрометрического размера, обладают способностью проникать через физиологические барьеры для доставки низкомолекулярных лекарств12, белков13, нуклеиновых кислот14 и нанолекарств15. Микроиглы точно спроектированы для нацеливания на поражения на поверхности кожи, а их дисперсные кончики обеспечивают равномерное распределение лекарств в целевом участке, тем самым усиливая их терапевтическое воздействие16. Конструкция и состав материала микроигл облегчают сухое хранение биологически активных веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты, повышая их стабильность17. Традиционные инъекционные методы имеют относительно короткую продолжительность действия и могут вызывать боль, вызывая страх у пациентов18. Микрометровая длина микроиглы сводит к минимуму травмирование тканей и предотвращает стимуляцию нервов, тем самым устраняя боль и улучшая комплаентность пациента19. Кроме того, удобный в использовании характер микроигл позволяет пациентам самостоятельно проводить лечение без необходимости использования специализированного персонала16. Помимо кожи, микроиглы также могут быть использованы в таких тканях, как глаза20, слизистая оболочка полости рта21, сердце22 и кровеносные сосуды23. Применение микроигл для клинической доставки экзосом обеспечивает многообещающую и перспективную стратегию.

В связи с этим мы представляем пластырь с микроиглами (exo@MN), нагруженный экзосомами, и раскрываем метод его изготовления. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием двухэтапного метода литья, наряду с центрифугированием и вакуумной сушкой, что способствует агрегации экзосом на кончиках микроигл, тем самым повышая эффективность доставки. Как кончики игл, так и подложка были изготовлены с использованием материалов, которые демонстрируют превосходную биосовместимость и растворимость в воде. Трегалоза и гиалуроновая кислота (ГК) были включены в качестве материалов наконечника для обеспечения защиты экзосом, а поливинилпирролидон (ПВП), растворенный в абсолютном этаноле, был выбран в качестве основного материала. Морфологию микроигольчатого пластыря охарактеризовали с помощью микроскопии и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Механические испытания микроигл оценивались с помощью растяжителя, чтобы подтвердить их способность проникать в кожу, а скорость высвобождения из кожи свиньи была исследована как 60 с. Кроме того, морфология, размер и содержание белка как в свежих экзосомах, так и в экзосомах в exo@MN были охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA) и вестерн-блоттинга (WB). Интернализацию экзосом дендритными клетками (ДК) охарактеризовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), а созревание ДК оценивали с помощью проточной цитометрии. Морфологическая характеристика и биологические функции двух типов экзосом в основном согласуются.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование не требует этического разрешения, поскольку свиная кожа, использованная для экспериментов, описанных в разделе 3, была приобретена в качестве съедобных свиных ушей на рынке, а не получена от экспериментальных животных.

1. Выделение экзосом

  1. Культура клеток
    1. Культивировать эпителиальные клетки рака яичников мышей ID8 в культуральной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствор пенициллин-стрептомицина (100×) (см. Таблицу материалов) в чашках Петри диаметром 15 см.
    2. Инкубируйте клетки ID8 в инкубаторе сCO2 (см. Таблицу материалов) при 37 °C и 5% CO2 до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 90%.
  2. Выделение экзосом
    1. Удалите питательную среду из чашек Петри и дважды промойте фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS). Добавьте 20 мл DMEM без фетальной бычьей сыворотки (см. Таблицу материалов) и раствор пенициллин-стрептомицина (см. Таблицу материалов). Продолжайте инкубацию при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов.
    2. Соберите надосадочную жидкость клеточной культуры из 20 чашек Петри диаметром 15 см. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость для удаления свободных клеток.
    3. Центрифугируйте при 2000 x g в течение 10 мин 4 °C и соберите надосадочную жидкость для удаления клеточного мусора.
    4. Подключите одноразовую систему вакуумной фильтрации 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) к вакуумному насосу циркуляционной воды (см. Таблицу материалов). Создание вакуума, позволяющего надосадочной жидкости проходить через мембрану из полиэфирсульфонового слоя толщиной 0,22 мкм и попадать в нижнюю камеру системы фильтрации, эффективно удаляя из надосадочной жидкости везикулы или примеси размером более 0,22 мкм.
      1. Чтобы подключить вакуумный насос, включите переключатель насоса, а затем подключите его к воздухозаборнику системы вакуумной фильтрации. При закрытии сначала отсоедините соединение с насосом, а затем выключите вакуумный насос. Эта процедура помогает предотвратить обратный поток вакуумного насоса и загрязнение питательной жидкости.
    5. Добавьте 15 мл надосадочной жидкости во внутреннюю трубку ультрафильтрационной трубки с давлением 100 кДа (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте при 3500 x g в течение 10 минут при 4 °C и удалите жидкость из внешней пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживайте частицы с массой более 100 кДа на внутренней мембране трубки, в то время как белки с массой менее 100 кДа будут центрифугироваться во внешнюю пробирку вместе с раствором. Экзосомы имели размер более 100 кДа и агрегировались на мембране внутренней трубки.
    6. Повторяйте вышеуказанные действия до тех пор, пока общий объем жидкости не окажется в пределах 5 мл. Соберите жидкость из внутренней трубки и добавьте 1 мл DPBS. С помощью пипетки многократно проводите пипетку во внутреннюю трубку, обеспечивая ресуспендирование прикрепленных экзосом в DPBS, а затем соберите их.
    7. Центрифугируйте при давлении 10000 x g в течение 60 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в быстросъемную центрифужную пробирку объемом 6 мл (см. Таблицу материалов). Запечатайте трубку термосварщиком.
    8. Центрифугируйте при давлении 100 000 x g в течение 2 ч 4 °C с использованием ультрацентрифуги (см. Таблицу материалов). Разрежьте быстрозащелкивающуюся пробирку центрифуги, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в 100 μл DPBS. Это экзосомное решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе повторного взвешивания гранулы необходимо пипетировать и перемешивать стенку трубки не менее 200 раз с помощью пипетки.

2. Изготовление exo@MN

  1. Подготовка мастер-формы
    1. Постройте модель микроигл с матрицей 10 x 10 с помощью программного обеспечения CAD, с наконечниками конической формы со следующими параметрами: высота 1200 мкм, диаметр основания 400 мкм и шаг (расстояние между соседними микроиглами) 900 мкм.
    2. Используйте смолу HTL в качестве материала и напечатайте мастер-форму микроиглы с помощью 3D-принтера (см. Таблицу материалов).
    3. Погрузите мастер-форму в абсолютный этанол на 1 час, чтобы удалить смолу, прилипшую к поверхности.
    4. Подвергните форму воздействию ультрафиолета на 5 минут, чтобы она затвердела.
    5. Еще раз погрузите форму в абсолютный этанол на 1 ч, после чего высушите при 60 °C в сушильном шкафу в течение 1 ч. Мастер-форма готова.
  2. Подготовка производственной формы
    1. Смешайте компоненты А и В полидиметилсилоксана (ПДМС, см. Таблицу материалов) в соотношении 10:1. Хорошо перемешайте и вылейте смесь в мастер-форму.
    2. Поместите форму PDMS под давление 1 фунт на квадратный дюйм на 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси PDMS.
    3. Отверждите пресс-форму PDMS при 60 °C в течение 2 часов, а затем очистите до получения производственной формы микроиглы.
    4. Перед использованием очистите производственную форму сверхчистой водой.
  3. Приготовление раствора
    1. Количественно оцените содержание белка в растворе экзосомы с помощью набора для анализа BCA (см. Таблицу материалов). Добавьте соответствующее количество DPBS для достижения концентрации 10 мкг/мкл для раствора экзосомы.
    2. Приготовьте раствор трегалозы 200 мг/мл (см. Таблицу материалов) с использованием DPBS в качестве растворителя. Помешивайте в течение 20 минут, чтобы обеспечить полное растворение.
    3. Приготовьте раствор гиалуроновой кислоты (ГК) в концентрации 200 мг/мл (ГК, см. Таблицу материалов) с использованием DPBS в качестве растворителя. Перемешайте в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение.
    4. Приготовьте раствор поливинилпирролидона 150 мг/мл (ПВП, см. Таблицу материалов) с использованием абсолютного этанола в качестве растворителя. Перемешайте в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение.
    5. Смешайте раствор экзосомы (10 мкг/мкл) и раствор трегалозы (200 мг/мл) в соотношении 1:1 по объему. Затем добавьте равный объем раствора гиалуроновой кислоты (200 мг/мл). Тщательно перемешайте до получения кончика раствора.
  4. Изготовление exo@MN
    1. Обрабатывайте поверхность пресс-формы PDMS с помощью плазменного очистителя (см. Таблицу материалов) в течение 30 с при низком уклоне для повышения ее гидрофильности.
    2. Добавьте 40 μл раствора наконечника в форму PDMS. Центрифугируйте при комнатной температуре (RT) и 3000 x g в течение 3 минут, чтобы жидкость заполнила слой иглы формы.
    3. Удалите лишнюю жидкость из формы и высушите при температуре RT в вакуумной сушильной печи (см. Таблицу материалов) в течение 1 суток.
    4. Добавьте 200 μл раствора ПВП в форму PDMS. Центрифугируйте 3000 x g в течение 3 минут при RT, чтобы жидкость заполнила подкладочный слой формы.
    5. Высушите форму по RT в сушильном шкафу в течение 1 суток, затем демолд до получения exo@MN заплатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните пластырь exo@MN в сушильном шкафу до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

Схема процесса получения экзосом; центрифугирование, вакуумная сушка, добавление полимера для стабилизации.
Рисунок 1: Процесс изготовления exo@MN патчей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Характеристика exo@MN патчей

  1. Наблюдение за морфологией
    1. Наклейте подложку пластыря на наклонную под углом 45° поверхность и поместите ее под стереомикроскоп (см. Таблицу материалов).
    2. Включите осветитель и зафиксируйте морфологию пятна с помощью объектива с 4-кратным увеличением.
  2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
    1. Прикрепите пластырь к предметному столику с помощью проводящего клея и обработайте его автоматическим тонким покрытием (см. Таблицу материалов) в течение 30 секунд.
    2. Получение изображений exo@MN патча с помощью СЭМ (см. Таблицу материалов) с ускоряющим напряжением 1 кВ.
  3. Механические испытания
    1. Вырежьте из заплатки массив 3 х 3 и поместите его кончиками вверх на жесткую платформу измерителя натяжения (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте высоту щупа так, чтобы он приблизился к кончикам игл, не касаясь их.
    2. Установите параметры на автоматическую остановку, когда давление достигнет 20 Н. Сожмите кончики игл вертикально со скоростью 0,5 мм/мин и запишите профиль зависимости нагрузки от смещения.
  4. Растворение
    1. Купите свежие свиные уши на рынке и нарежьте их на кусочки (5 см х 5 см х 0,3 см). Расстелите свиную шкуру на столе и с помощью бумаги высушите поверхностную влагу.
    2. Подготовьте четыре сухих пластыря с микроиглами кончиками игл вниз на коже свиньи, слегка раздвинув каждый пластырь. Большим и указательным пальцами вертикально надавите вниз на каждый пластырь с микроиглами. Снимайте по одному пластырю каждые 15 с.
    3. Немедленно поместите снятую заплатку в сушильную духовку и сушите в течение 5 минут. Отрежьте столбик наконечников микроигл, поместите их горизонтально под микроскоп (см. Таблицу материалов) и используйте объектив с 4-кратным увеличением, чтобы наблюдать за растворением наконечников.

4. Характеристика экзосом в exo@MN участке

ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики микроигл exo@MN растворяют в 100 мкл раствора DPBS для выполнения следующей характеристики высвобождающихся экзосом.

  1. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. Обработайте медную сетку (см. Таблицу материалов) гидрофильной обработкой с использованием ионного очистителя (см. Таблицу материалов) в течение 5 минут.
    2. Вынесите 10 мкл образца на углеродную сторону медной сетки. Дайте постоять 1 минуту, затем удалите жидкость, промокнув ее фильтровальной бумагой с краев.
    3. Добавьте в образец 10 мкл 3% уранилацетата (см. Таблицу материалов). Дайте постоять 10 с, затем удалите жидкость, промокнув фильтровальной бумагой с краев.
    4. Добавьте в образец 10 мкл 3% уранилацетата. Дайте постоять 1 минуту, затем удалите жидкость, промокнув ее фильтровальной бумагой с краев, и высушите на воздухе при RT.
    5. Получение изображений экзосом с помощью ПЭМ (см. таблицу материалов) с ускоряющим напряжением 80 кВ.
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавьте раствор экзосомы DPBS до достижения концентрации частиц 1 x 107 частиц/мл. Медленно введите 1 мл раствора экзосомы в камеру для образцов NTA с помощью шприца объемом 1 мл (см. Таблицу материалов).
    2. Установите тип стандартной операционной процедуры (СОП) прибора на EV-488, чтобы определить распределение экзосом по размерам.
  3. Вестерн-блоттинг (WB)
    1. Приготовьте буфер для лизиса, смешав буфер для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA): фенилметансульфонилфторид (см. Таблицу материалов) в соотношении 100:1. Лизируйте экзосомы на льду в течение 20 минут, совершая вихревые операции каждые 10 минут.
    2. Центрифугируйте раствор при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, чтобы измерить концентрацию белка.
    3. Добавьте 5x буфер загрузки SDS-PAGE (см. Таблицу материалов) к надосадочной жидкости в объемном соотношении 1 : 4 и хорошо перемешайте. Нагрейте до 100 °C в течение 10 минут, чтобы денатурировать белки.
    4. Добавьте 5 мкл предварительно окрашенного белкового маркера с массой 180 кДа (см. Таблицу материалов) и 10 г денатурированного образца в 4%-20% сборный гель (см. Таблицу материалов). Запустите систему электрофореза (см. Таблицу материалов) при напряжении 60 В в течение 10 минут, а затем при напряжении 140 В в течение 50 минут.
    5. Перенесите белки из геля на мембрану из ПВДФ (см. Таблицу материалов), предварительно активированную метанолом. Выполните систему электрофореза при давлении 290 мА в течение 90 мин на льду.
    6. Мембрану PVDF инкубировать в 5% растворе обезжиренного молока в течение 1 ч. Трижды промыть трис буферным солевым раствором с подростком (TBST, см. Таблицу материалов) в течение 5 минут каждый.
    7. Вырежьте целевые полосы в зависимости от положения белка. Инкубируйте полосы с антителом против мыши CD63 и антителом против мыши Alix (см. Таблицу материалов), разведенными до соответствующей концентрации в соответствии с инструкциями производителя, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
    8. Промойте ленты три раза с TBST. Инкубировать с HRP-конъюгированным антикроличьим IgG (см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч. Затем снова трижды постирайте TBST.
    9. Нанесите реагент для обнаружения супер ECL (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть поверхность полос, и немедленно экспонируйте и захватывайте полосы с помощью гелевого имиджера (см. Таблицу материалов).
  4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM)
    1. Обработайте 5 x 105 DC в конфокальной чашке, используя 2 мл среды Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (см. Таблицу материалов). Добавьте экзосомы или exo@MN и инкубируйте при 37 °C в течение 24 часов.
    2. Добавьте каплю Hoechst 33342 в каждую конфокальную чашку и выдерживайте в темноте при температуре 37 °C в течение 20 минут.
    3. Выполняйте визуализацию с помощью CLSM (см. Таблицу материалов) с использованием объектива с 60-кратным увеличением. Нанесите каплю иммерсионного масла (см. Таблицу материалов) на линзу и поставьте конфокальную тарелку на сцену. Отрегулируйте оси x/y/z, чтобы найти соответствующую фокальную плоскость ячеек.
    4. Запустите изображение с помощью каналов DAPI/TRITC/TD, выберите разрешение 1024 пикселя и установите быстрый режим на 1/8 с.
  5. Проточная цитометрия
    1. Культивируйте ДК в 6-луночном планшете, каждая лунка содержит 5 x 105 клеток и 2 мл среды 1640. Добавьте равные объемы раствора DPBS, экзосом, микроигл без экзосом и exo@MN соответственно и инкубируйте при 37 °C в течение 24 ч.
    2. Переложите среду из каждой лунки в центробежные трубки. Центрифугируйте при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
    3. Добавьте 0,5 мкл антитела FITC-CD11c, 2,5 мкл антитела APC-CD80 и 0,5 мкл антитела Pacific Blue I-A/I-E (см. Таблицу материалов) в 100 мкл 5% раствора БСА (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте, ресуспензируйте ячейки и выдержите на шейкере во льду и в темноте в течение 20 минут.
    4. Добавьте 1 мл DPBS и центрифугируйте при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C, затем удалите надосадочную жидкость. Повторите промывку дважды, чтобы удалить несвязанные антитела, а затем перейдите к анализу соответствующих флуоресцентных каналов с помощью проточной цитометрии (см. Таблицу материалов).
      1. Во-первых, на диаграмме рассеяния FSC-A/SSC-A зарегистрируйте основную популяцию клеток как P1. На диаграмме рассеяния SSC-A/SSC-H популяции клеток P1 затворите квадратную область P2 вдоль диагонали, чтобы удалить агрегированные ячейки.
      2. Выполнение флуоресцентного анализа популяции P2-клеток с использованием каналов FITC, APC и Pacific Blue. Установите условие стопа, чтобы собрать 10 000 ячеек в вентили P2.

5. Статистический анализ

  1. Выражайте количественные данные в виде средств ± стандартных отклонений (SD). Оценивайте статистическую значимость с помощью анализа t-критерия с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных. Рассматривайте p-значения меньше 0,05 для указания статистической значимости. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол выделения экзосом, изготовления и характеризации exo@MN патча. На рисунке 1 показана технологическая схема изготовления exo@MN патча. Экзосомы смешивали с трегалозой и ГК, а затем смесь добавляли в форму для микроигл и центрифугировали. Этот процесс способствовал агрегации экзосом на кончиках игл, способствуя быстрому высвобождению. После сушки добавляли раствор ПВП и центрифугировали для полного заполнения формы. После полного высыхания плесень удаляли для получения exo@MN заплаток. Морфология микроигл была охарактеризована с помощью микроскопии и СЭМ, как показано на рисунке 2. Кончики в exo@MN участке имели коническую форму, расположенную в массиве 10 x 10 с острыми и неповрежденными кончиками игл. Кончик микроиглы может выдерживать усилие в 2 Н, что позволяет ему проникать через кожный барьер. Кроме того, свиная кожа использовалась в качестве суррогата человеческой кожи для имитации нанесения exo@MN пластырей. Пластыри прижимали к коже свиньи для наблюдения за временем высвобождения, при этом кончики микроигл полностью таяли в течение 60 секунд. Участки exo@MN растворяли в DPBS и охарактеризовали, как показано на рисунке 3. На изображениях ПЭМ запечатлены везикулы с типичными чашеобразными структурами, что согласуется с морфологией экзосом. Распределение частиц по размерам в растворе exo@MN NTA показало, что частицы были преимущественно сконцентрированы в диапазоне 50-250 нм. Тем не менее, присутствовали и некоторые более крупные частицы, которые можно объяснить адгезивными свойствами материала HA, вызывающими агрегацию экзосом. WB-анализ белков CD63/Alix в растворе exo@MN показал, что exo@MN способен частично удерживать белки экзосом. Биологическая функциональность экзосом, высвобождаемых из exo@MN, была подтверждена на рисунке 4, при этом основное внимание уделялось поглощению экзосом клетками и активации дендритных клеток по сравнению со свежими экзосомами. Изображения CLSM подтвердили эффективное поглощение как свежих экзосом, так и экзосом в exo@MN ДК. Репрезентативные изображения и пропорциональная статистика проточной цитометрии показывают, что экзосомы в exo@MN обладают биологическими функциями, которые способствуют активации ДК аналогично свежим экзосомам.

Схема изготовления микроигл, изображение СЭМ, график давления-перемещения, последовательность испытаний на проникновение.
Рисунок 2: Определение характеристик exo@MN участков. (A) Изображения exo@MN участков с помощью стереомикроскопа. Масштабная линейка = 400 мкм. (B) СЭМ-изображение exo@MN участков. Масштабная линейка = 200 мкм. (C) Зависимость нагрузки от профиля смещения exo@MN патче. (D) Микроскопические изображения exo@MN участков, вставленных в кожу свиньи в разное время. Масштабная линейка = 400 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Электронная микроскопия экзосом; график распределения по размерам; Вестерн-блоттинг белковых маркеров.
Рисунок 3: Характеристика свежих экзосом и экзосом в exo@MN. (А) Морфология экзосом с помощью ПЭМ. Масштабная линейка = 100 нм. (B) Распределение частиц по размерам экзосом по NTA. (C) CD63 и Alix экзосом от WB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты экзосомной микроскопии и проточной цитометрии; окрашивание клеток, анализ потока, экспрессия CD80 MHCII.
Рисунок 4: Биологическое тестирование свежих экзосом и экзосом в exo@MN. (A) CLSM-изображения экзосом, полученных ДК. Масштабная линейка = 10 мкм. (В) Репрезентативные графики активации ДК с помощью проточной цитометрии. (C) Количественная оценка процентного содержания CD11c+CD80+MHCII+ DCs. Данные представлены в виде среднего значения ± SD (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время основными методами выделения экзосом являются ультрацентрифугирование, центрифугирование с градиентом плотности, ультрафильтрация, преципитация, иммуноаффинные магнитные шарики и микрофлюидика24. Из-за ограниченной нагрузочной способности микроигл, вызванной их малым пространством на кончике иглы, необходимо увеличивать концентрацию экзосом для большей нагрузки. Поэтому мы выбрали ультрафильтрацию для концентрирования надосадочной жидкости клеточной культуры, а затем использовали ультрацентрифугирование для выделения экзосом. Концентрация экзосом была увеличена за счет небольшого количества жидкой ресуспензии, так что микроиглы могли быть загружены десятками и сотнями микрограммов экзосом. Однако этот метод приводит к значительному присутствию белков в изолированном растворе экзосом. Кроме того, в процессе центрифугирования происходит значительная потеря экзосом. В настоящее время одним из ограничений терапевтического применения экзосом является отсутствие эффективных методов выделения экзосом с высокой чистотой и в больших количествах. Поскольку клинический потенциал экзосом все больше изучается, в будущем существует необходимость в разработке более совершенных методов для решения проблем, связанных с их экстракцией.

Ключевой технологией в этом исследовании является разработка микроигл на основе экзосом. Чтобы свести к минимуму отходы экзосом и достичь более сильных терапевтических эффектов, для изготовления exo@MN пластырей был принят двухэтапный метод литья. Ранее сообщалось, что трегалоза является подходящим материалом для лиофилизированной консервации экзосом25, в то время как гиалуроновая кислота демонстрирует превосходную биосовместимость, гидрофильность и функции ингибирования воспаления и стимулирования восстановления кожи26. Изготовление кончиков игл, загруженных экзосомами, с использованием этих двух материалов помогает поддерживать биологическую активность экзосом, обеспечивая их быстрое растворение и высвобождение в коже. Более того, такой подход минимизирует риск инфицирования и способствует быстрому восстановлению кожи. С помощью центрифугирования и вакуумной сушки экзосомы концентрировались на кончиках микроигл. Учитывая несовместимость этанола и трегалозы, в качестве подложки был выбран ПВП, растворенный в абсолютном этаноле. Этот метод послойного изготовления эффективно повысил эффективность доставки экзосом.

Плохая стабильность экзосом in vitro, независимо от того, хранятся ли они при 4 °C, 37 °C или -80 °C, может привести к изменениям в структуре экзосом или деградации. Чтобы решить эту проблему, в нескольких исследованиях были изучены методы хранения экзосом, такие как сублимационная сушка. Технология микроигл предлагает еще одну новую стратегию. При сушке в режиме лучевой терапии технология микроигл может улучшить стабильность экзосом и может быть непосредственно использована для доставки экзосом без других методов лечения. Кроме того, процесс экстракции экзосом сложен и подвержен деградации, что затрудняет крупномасштабное применение. Хранение извлеченных экзосом с помощью технологии микроигл не упрощает этапы экстракции, но уменьшает количество необходимых экстракций. При одном извлечении может образоваться большое количество exo@MN участков, которые могут храниться в течение длительного периода времени. Использование микроигл экзосом из одной и той же партии для каждого лечения сводит к минимуму потенциальное влияние вариаций между различными партиями на терапевтические результаты, тем самым повышая повторяемость и надежность наноплатформыэкзосом27. Это дает больше возможностей для клинического применения экзосом.

В будущих исследованиях стоит изучить методы, которые позволяют точно контролировать полезную нагрузку и свести к минимуму различия между кончиками игл. Это может быть достигнуто за счет оптимизации процессов, внедрения мер контроля качества и использования передовых методов. Решение этих аспектов внесет значительный вклад в развитие надежных и последовательных систем доставки лекарств.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H.C., F.L.Q. и S.J.M являются изобретателями в патентной заявке, которая была подана на основе данных в этой рукописи. Х.К. является научным основателем компании Medcraft Biotech. Инк.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.L.Q. благодарит за поддержку, оказанную Новаторской программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2022C03031), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA0910103), Национальным фондом естественных наук Китая (22274141, 22074080), Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022ZD28) и Программой ученых Тайшань провинции Шаньдун (tsqn201909106). Х.К. выражает признательность за финансовую поддержку от Национального фонда естественных наук Китая (82202329). Авторы признают использование инструментов в Центре общего использования измерительных приборов в Институте медицины Ханчжоу (HIM) Китайской академии наук.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100x пенициллин-стрептомицин растворыJrunbio ScientificMA0110Клеточная культура
180 кДа предварительно окрашенный белковый маркерThermo26616Вестерн-блоттинг
3% уранил ацетатХэнань Жуйсинь Экспериментальные поставкиGZ02625Морфологическая характеристика экзосом
3D-принтерBMFnanoArch S130Mold Приготовление
4%– 20% сборный гельGenscriptExpressPlus PAGE GELвестерн-блоттинг
5 раз; SDS-PAGE загрузочный буферTitan04048254Western blotting
Anti-mouse Alix антителоBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-mouse CD63 антителоBiolegendab217345Western blotting
APC anti-mouse CD80 антителоBiolegend104713антитело
Auto fine coaterZIZHUJBA5-100Морфологическая характеристика микроигл
Набор для анализа BCABeyotimeP0012Анализ концентрации белка
ЦентрифугаThermo FisherMuitifuge X1R proКлеточная центрифуга
Циркуляционный водяной вакуумный насосYuhuaInstrument SHZ-D(III) Фильтрация
CO2EppendorfCellXpert C170Клеточная культура
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопNikonA1HD25Флуоресцентная визуализация
Медная сеткаBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Морфологическая характеристика экзосом
D- (+) -Трегалоза дигидратАладдин5138-23-4Изготовление микроигл 
Дульбекко s модифицированный Eagle' s средаMeilunbioMA0212Клеточная культура
Dulbecco' s фосфатно-солевой буферMeilunbioMA0010Клеточная культура
Система электрофорезаBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Фетальная бычья сывороткаJrunbio ScientificJR100Клеточная культура
FITC антимышиное антитело CD11cBiolegend117305антитела
Проточная цитометрияBDLSR FortessaФлуоресцентная детекция
Гелевый имидж-сканерCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-конъюгированный анти-кроличий IgGCST7074SWestern blotting
HTL смолаBMF технологияПрепарат плесени
Гиалуроновая кислота (MW = 300 кДа)Bloomage Biotechnology9004-61-9Изготовление микроигл 
Иммерсионное маслоNikonMXA22168Флуоресцентная визуализация
Ионный очистительJEOLEC-52000ICМорфологическая характеристика экзосом
МикроскопOlympusCKX53Наблюдение за процессом растворения кончика микроиглы
Эпителиальная раковая клетка яичника мыши ID8MeisenCTCC  CC90105Клеточная культура
Анализ отслеживания наночастицЧастица MetrixZetaViewАнализ размера экзосом Антитела
Pacific Blue против мышей I-A/I-EBiolegend107619Антитела
ФенилметансульфонилфторидBeyotimeST507Ингибиторы протеазы
Очиститель плазмыHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GИзготовление микроигл 
ПолидиметилсилоксанDow Corning9016-00-6Препарат пресс-формы
Поливинилпирролидон (MW = 40 кДа)Aladdin9003-39-8Изготовление микроигл 
Призма GraphPadVersion 9Статистический анализ
PVDF мембранаMilliporeIPVH00010Western Blotting
Quick-snap центрифугаBeckman344619Экстракция экзосом
RIPA лизис буферApplygenC1053Лизис мембраны
Мемориальный институт Розуэлл Парк 1640MeilunbioMA0548Клеточная культура
Сканирующий электронный микроскопJEOLJSM-IT800Морфологическая характеристика
микроиглы СтереомикроскопOlympusSZX16Характеристика морфологии
Супер ECL детектирующий реагентApplygenP1030Вестерн-блоттинг
ТензиметрInstron68SC-05Механические испытания
Просвечивающий электронный микроскопJEOLJEM-2100plusМорфологическая характеристика экзосом
Tris буферизованный физиологический растворSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Экстракция экзосом,
ультрафильтрационная трубкаMilliporeUFC910096Концентрация экзосом
Вакуумная сушильная печьShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Изготовление микроигл
Система вакуумной фильтрацииBiosharpBS-500-XTФильтрация
технология инкубатор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи