Профилирование реакций материнского поведения во время визуализации всего мозга

Краткое содержание

Здесь представлен конвейер анализа видео, который преодолевает трудности поведенческого мониторинга в условиях МРТ, позволяя обнаруживать необученные поведенческие реакции на внешние сигналы. Этот анализ будет способствовать более полному пониманию вызванных изменений внутреннего состояния и активности мозга в целом.

Аннотация

Последние достижения в области инструментов визуализации всего мозга позволили нейробиологам исследовать, как скоординированная активность мозга обрабатывает внешние сигналы, влияя на изменения внутреннего состояния и вызывая поведенческие реакции. Например, функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) — это неинвазивный метод, который позволяет измерять активность всего мозга у бодрствующих мышей с использованием реакции, зависящей от уровня оксигенации крови (BOLD). Однако, чтобы полностью понять СМЕЛЫЕ реакции, вызванные внешними стимулами, крайне важно, чтобы экспериментаторы также оценивали поведенческие реакции во время сканирования. Среда МРТ создает проблемы для достижения этой цели, делая широко используемые методы поведенческого мониторинга несовместимыми. Эти проблемы включают в себя (1) ограниченное поле зрения и (2) ограниченную доступность оборудования без ферромагнитных компонентов. Здесь представлен конвейер поведенческого анализа видео, который преодолевает эти ограничения, извлекая ценную информацию из видео, полученных в условиях этих ограничений окружающей среды, что позволяет оценивать поведение во время получения нейронных данных всего мозга. Используя такие методы, как оценка оптического потока и уменьшение размерности, можно обнаружить устойчивые различия в поведенческих реакциях на стимулы, представленные во время сканирования фМРТ. Например, репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что вокализации детенышей мышей, но не чистые тона, вызывают значительно отличающиеся поведенческие реакции у матерей и девственных самок мышей. В дальнейшем этот конвейер поведенческого анализа, изначально предназначенный для преодоления трудностей в экспериментах с фМРТ, может быть расширен до различных методов нейронной записи, обеспечивая универсальный поведенческий мониторинг в ограниченных условиях. Скоординированная оценка поведенческих и нейронных реакций обеспечит более полное понимание того, как восприятие стимулов приводит к координации сложных поведенческих выходов.

Введение

Мониторинг поведенческих реакций во время нейронных записей имеет важное значение для понимания вызванной стимулами скоординированной активности в мозге. В том случае, если животные не прогнозируют реакцию на стимулы специфическим и целенаправленным образом, наблюдение за поведением без инструкций может дать представление о том, как внешние сигналы информируют их^{внутренние состояния.} Последние достижения в области инструментов нейровизуализации, таких как широкоугольная визуализация кальция и функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ), позволили нейробиологам расширить исследования за пределы отдельных областей мозга. Однако для достижения более полного понимания таких многомерных нейронных данных способность оценивать поведенческие результаты этих сложных паттернов также должна развиваться соответствующим образом.

Современные методы определения характеристик поведения, выдаваемого за выполнение задачи, широко используются в исследованиях в области нейробиологии, в том числе датчики температуры и давления для обнаружения сопения ^3,4, световые лучи для обнаружения облизывания⁵ и оценка безмаркерной позы для отслеживания заранее определенных частей тела⁶. Тем не менее, оценка неуправляемых поведенческих моделей на основе данных остается проблемой в этой области⁷. В то время как методы поведенческого анализа, основанные на данных, быстро развиваются, существующие методы обычно требуют значительных вычислительных мощностей, специализированного оборудования или особенно четкого представления о животном 2,6,8,9. Здесь представлен конвейер поведенческого анализа видео, который легко поддается обработке любых данных видеосъемки и позволяет извлекать ценные поведенческие показатели из видео, полученных во время пассивной стимуляции.

Этот конвейер поведенческого анализа был разработан таким образом, чтобы быть совместимым с скоординированным получением нейронных и видеоданных у животных с фиксированной головой, подвергающихся воздействию широкого спектра внешних стимулов и множественных условий записи, даже со значительными ограничениями. Например, среда МРТ создает определенные проблемы для поведенческого мониторинга, включая ограниченное поле зрения и ограниченную доступность оборудования без ферромагнитных компонентов. Эти ограничения делают широко используемые методы несовместимыми, в результате чего такие измерения, как движение головы (т.е. как мозг перемещается между объемами сканирования), остаются одними из наиболее доступных, но ограниченных способов оценки реакций организма во время^{сканирования.} Преодолевая эти ограничения, этот протокол облегчил анализ данных МР-совместимой видеосъемки, показав, что самки мышей с разным материнским опытом демонстрируют различные поведенческие реакции на слуховые стимулы. Матерям и девственницам во время фМРТ предъявлялись слуховые стимулы, в том числе тревожные вокализации щенков («крики щенков») и чистые тона. Эти стимулы представлялись пассивно, то есть без каких-либо инструктивных поведенческих выходов. В то время как прогнозировалось, что матери будут демонстрировать повышенную реакцию на крики детенышей по сравнению с девственницами, существует мало литературы о том, как самки мышей реагируют на сигналы младенцев в неподвижной среде. Таким образом, не было никаких конкретных поведенческих выходных данных, которые можно было бы отслеживать априори, что делает этот эксперимент идеальным тестом для предложенного поведенческого анализа, основанного на данных. С помощью таких методов, как оценка оптического потока и уменьшение размерности, были обнаружены групповые различия в поведенческих реакциях, как по величине, так и по пространственному проявлению.

В дальнейшем скоординированная оценка поведенческих и нейронных реакций может быть использована для достижения более полного понимания того, как внешние стимулы изменяют внутренние состояния и формируют сложные поведенческие результаты. Это понимание должно распространяться на стимулы, представленные в отсутствие навязанных задач и инструктированного поведения. Представленный здесь конвейер анализа может быть расширен до различных методов нейронной записи, обеспечивая универсальный поведенческий мониторинг даже в ограниченных средах.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета, а все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами, правилами и рекомендациями. Подробная информация об используемом оборудовании и программном обеспечении приведена в Таблице материалов.

1. Программное обеспечение

1. Загрузите MATLAB с веб-сайта Mathworks.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Код, составляющий этот конвейер анализа, может быть выполнен исключительно через MATLAB и был специально написан для совместимости с MATLAB 2023a.
2. Для этого конвейера требуются Computer Vision Toolbox и Image Processing Toolbox в MATLAB. Добавьте наборы инструментов в дополнения MATLAB, нажав на «Управление дополнениями», «Получить дополнения», а затем найдите и добавьте их.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пять скриптов MATLAB предоставляются в виде дополнительных файлов, озаглавленных следующим образом: script1_videocoreg.m (Дополнительный файл кодирования 1), script2_optflow_roiselect.m (Дополнительный файл кодирования 2), script3_optflow_analysis.m (Дополнительный файл кодирования 3), script4_optflow_pca.m (Дополнительный файл кодирования 4) и script5_optflow_pca_analysis.m (Дополнительный файл кодирования 5). Также предоставляются два примера видео (Видео 1 и Видео 2) и соответствующие им файлы времени событий (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Рекомендуется сначала выполнить конвейер с данными примера.
   ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь любых комментариев в коде, содержащих восклицательный знак, так как это области, требующие действий перед выполнением. Например, есть комментарии, такие как «редактировать блок кода ниже!», чтобы указать, где необходимо внести изменения в соответствии со структурой файла, деталями эксперимента или потребностями анализа. Эти варианты установлены по умолчанию в соответствии с двумя представленными примерами видео, но потребуют корректировки, как только кто-то начнет запускать конвейер со своими собственными данными.
3. Чтобы запустить каждый раздел каждого скрипта, нажмите « Выполнить и продвинуться » в меню «Редактор ».

2. Видео-корегистрация

ПРИМЕЧАНИЕ: Первым предоставленным скриптом в этом конвейере анализа является script1_videocoreg.m (Supplementary Coding File 1), который пространственно выравнивает все видео друг относительно друга с помощью совместной регистрации. Входными данными для этого скрипта являются необработанные видео, а основными выходными данными являются преобразованные видео.

1. Отредактируйте разделы 1, 2, 3, 4, 5 и 6 скрипта там, где они указаны, чтобы они соответствовали структурам данных.
2. Запустите раздел 1.
3. Выберите три точки в каждом видео для маркировки, как показано на рисунке 1A. Эти три точки будут использоваться для совместной регистрации всех кадров друг с другом. Запустите раздел 2 сценария, чтобы открыть первый кадр каждого видео и с помощью мыши щелкните один раз по первым двум точкам, а затем дважды щелкните по третьей. После того, как точки последнего видео будут выбраны, нажмите Enter.
4. Выполните раздел 3 и раздел 4.
5. Установите флаг на 0 и запустите раздел 5. Затем установите флаг на 1 и снова запустите раздел 5.
6. Запустите раздел 6 и сравните полученный рисунок рядом с рисунком 1B. Любые аберрации, наблюдаемые на невыровненном среднем изображении слева, должны быть уменьшены на выровненном среднем изображении справа.

3. Оценка оптического потока: полное поле зрения

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить движение по сканируемым видео, необходимо оценить оптический поток для каждого преобразованного видео. Это можно сделать для полного поля зрения (FOV) каждого видео с предоставленным сценарием script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2). Входными данными для этого скрипта являются преобразованные видео, а выходными данными являются 3D-матрицы, показывающие величину оптического потока каждого пикселя во времени для каждого видео. На рисунке 2A показан пример кадра с векторами оптического потока, наложенными синим цветом, где длина каждого вектора представляет относительную величину оптического потока этого пикселя. Сохранение выходных данных в виде видео оказалось более эффективным, чем сохранение их в виде 3D-матриц.

1. Отредактируйте раздел 1 скрипта, где указано, чтобы он соответствовал структурам данных.
2. Запустите раздел 1.

4. Выбор ROI

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги анализа становятся гораздо более управляемыми с точки зрения вычислительной нагрузки и потребностей в хранении данных за счет выбора области интереса (ROI) в пределах полного поля зрения, на которой следует сосредоточить анализ. Рентабельность инвестиций может быть выбрана в соответствии с экспериментом и интересующим поведением или с помощью подхода, в большей степени основанного на данных. Для репрезентативных результатов, представленных здесь, стандартное отклонение величины оптического потока каждого пикселя в полном поле зрения было рассчитано с помощью скрипта script2_optflow_roiselect.m, раздел 2 (Файл дополнительного кодирования 2). Входными данными для этой части сценария являются выходные данные раздела 1, а основными выходными данными является визуализация стандартного отклонения величины оптического потока по всем пикселям всех видео. В представленных репрезентативных результатах зеркальное поле зрения показало относительно высокое стандартное отклонение оптического потока, что повлияло на продемонстрированный выбор ROI.

1. Отредактируйте раздел 2 скрипта там, где указано, чтобы он соответствовал структурам данных.
2. Запустите раздел 2 и используйте полученное изображение, чтобы увидеть, где оптический поток колеблется наиболее резко в анализируемых видео. Пример этого изображения показан на рисунке 2B.

5. Количественная оценка оптического потока: ROI

ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 3 скрипта script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) позволяет пользователю выбрать ROI с помощью инструмента рисования и сохранить координаты границ. Входными данными для этой части сценария являются выходные данные раздела 1, а выходные данные — одномерными векторами, указывающими среднюю величину оптического потока ROI с течением времени для каждого видео.

1. Отредактируйте раздел 3 скрипта там, где указано, в соответствии со структурами данных и потребностями анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько вариантов того, как продолжить выбор ROI. Выберите один из вариантов:
   1. Вариант 1: Проанализируйте полное поле зрения видео.
      1. Установите флаг selectROI равным 0 и установите provideROI равным 0.
   2. Вариант 2: Проанализируйте новый ROI.
      1. Установите флаг selectROI в 1 и установите provideROI в 0. Затем отредактируйте newCoordsName.
   3. Вариант 3: Проанализируйте ранее нарисованный ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте этот вариант только в том случае, если вы ранее запускали этот код и создали ROI.
      1. Установите флаг selectROI равным 0 и установите provideROI равным 1. Затем отредактируйте inputCoords , чтобы предоставить предопределенный набор координат.
2. Запустите раздел 3.

6. Сравнение величин оптического потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный скрипт script3_optflow_analysis.m (Supplementary Coding File 3) требует максимальной специализации, чтобы соответствовать данным пользователя. Основными входными данными являются 1D-векторы, показывающие среднюю величину ROI оптического потока с течением времени для каждого видео, а при правильном сочетании с началом событий и информацией о группах/условиях основными выходными данными являются статистические сравнения, которые могут быть адаптированы к интересам анализа.

1. Отредактируйте разделы 1–3 скрипта в соответствии со структурами данных и потребностями анализа.
2. Установите флаги параметров анализа zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial и applyLPfilter в значение 0 или 1 в соответствии с разделом 1. В представленных репрезентативных результатах zsc, blrm и applyLPfilter были установлены в 1, а все остальные параметры были установлены в 0.
3. Установите для параметра LPfilter число, представляющее желаемый фильтр нижних частот в герцах (Гц). В представленных репрезентативных результатах был применен фильтр нижних частот 5 Гц, поскольку не ожидалось, что поведенческие реакции будут колебаться со скоростью быстрее 5 Гц.
4. Выполните разделы 1-3. В разделе 3 должны быть построены графики для временных рядов среднего оптического потока, среднего кумулятивного оптического потока группы и суммарного кумулятивного оптического потока, включая графики, подобные показанным на рисунке 3. Раздел 3 может быть запущен для любой комбинации сравнений групп и состояний.

7. Оптический поток PCA

ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на оценке величины оптического потока, выходные данные script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) также содержат информацию о пространственном распределении оптического потока кадр за кадром на видео. Чтобы уменьшить размерность этой пространственной информации, предоставленный скрипт script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4)  выполняет анализ главных компонент (PCA) на оцененном оптическом потоке. Основными входными данными являются матрицы 3D-оптического потока, ранее сохраненные в виде видео для каждого поведенческого видео, а основным выходом является один файл .mat для каждого видео, содержащий информацию о ПК и объясненной дисперсии.

1. Отредактируйте раздел 1 скрипта в соответствии со структурами данных и потребностями анализа.
2. Установите флажки параметров анализа stimnum, dsfactor и fnfactor в соответствии с требованиями в разделе 1. В представленных репрезентативных результатах каждый тип стимула был проанализирован отдельно, и значение по умолчанию 1 было сохранено для dsfactor и fnfactor, что привело к отсутствию понижения дискретизации в пространстве или времени.
3. Запустите раздел 1.

8. Сравнение оптического потока PCA

ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный скрипт script5_optflow_pca_analysis.m (Supplementary Coding File 5) выполнит исследовательское сравнение результатов PCA по группам. Основными входными данными являются специфичные для стимула ПК и объяснимая дисперсионная информация, полученная из script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4), а основными выходами являются статистически пороговые тепловые карты, отображающие нагрузки первого ПК, хотя другие ПК также могут быть проанализированы с помощью этого скрипта.

1. Отредактируйте раздел 1 скрипта в соответствии со структурами данных и анализом.
2. Запустите раздел 1 и раздел 2.
3. Отредактируйте входные данные раздела 3 , в частности переменные group и myTitle , чтобы отразить желаемый анализ группы, а также threshT. threshT представляет собой порог T-статистики, выше которого результаты будут считаться значимыми, которые могут быть рассчитаны на основе общедоступных таблиц T-статистики до p-значений и степеней свободы.
4. Выполните раздел 3 для каждой группы интересов. Код должен создавать карту групповой сводной статистики, подобную показанной на левой и центральной панелях рисунка 4. Отрегулируйте диапазон каксиси и, таким образом, пределы цветовой полосы, по мере необходимости для визуализации.
5. Отредактируйте входные данные раздела 4 , в частности переменные mag и myTitle , чтобы отразить желаемое сравнение групп, а также threshT. threshT представляет собой порог T-статистики, выше которого результаты будут считаться значимыми, которые могут быть рассчитаны на основе общедоступных таблиц T-статистики до p-значений и степеней свободы.
6. Выполните раздел 4 для сравнения каждой интересующей вас группы. Код должен создать карту статистики сравнения групп, как показано на правой панели рисунка 4. Отрегулируйте диапазон каксиси и, таким образом, пределы цветовой полосы, по мере необходимости для визуализации.

Результаты

Чтобы продемонстрировать потенциал этого аналитического конвейера, были получены поведенческие видео самок мышей с фиксированной головой, в частности, матерей и девственниц, в то время как мышам были представлены слуховые стимулы во время функциональной магнитно-резонансной томографии (МРТ). Стимулы состояли из криков детенышей и чистых тонов, подаваемых пассивно, то есть без каких-либо инструктированных поведенческих выходов. Крики детенышей представляли собой записи ультразвуковых вокализаций, издаваемых 6-дневными детенышами мышей, временно изолированными от своего гнезда. Эти крики детенышей обычно вызывают материнский акт вытягивания детеныша, в котором мать находит, движется к нему, исследует, затем поднимает детеныша и возвращает его в безопасное гнездо — поведение, которое девственные самки обычно не проявляют^. Предыдущая работа показала, что крики детенышей вызывают устойчивую вызванную активность в первичной слуховой коре матерей, но не девственниц, в то время как чистые тональные реакции не показывают групповых^{различий}. Таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что будут выявлены групповые различия в поведенческих реакциях на крики щенков, но не чистые тона. Тем не менее, существует мало литературы о специфическом поведении самок мышей в ответ на сигналы детеныша в неподвижной среде. Таким образом, не ожидалось никаких конкретных поведенческих результатов, что делает этот эксперимент идеальным тестом для предложенного поведенческого анализа, основанного на данных.

В течение восьми дней все животные постепенно привыкали к работе с экспериментатором, фиксации головы и среде МРТ. Привыкание к фиксации головы и экспериментальной среде имеет решающее значение для оценки поведенческих реакций на предъявленные стимулы. Если животные не приучены к окружающей среде должным образом, они могут проявлять только стрессовые реакции, стирая любые эффекты, вызванные стимулами, которые в противном случае можно было бы проанализировать с помощью видеосъемки.

В то время как настройка поведенческого аппарата была в целом одинаковой для каждого сеанса сбора данных, возможно, что поле зрения камеры немного смещалось каждый раз, когда животное фиксировало голову для сканирования с помощью фМРТ (см. примеры полей зрения на рисунке 1A). Вероятно, это было связано с небольшими изменениями в расположении крепления камеры, а также с индивидуальными вариациями крепления черепа на головном столбе для каждого животного. Таким образом, видео со сканов должны были быть выровнены друг с другом с помощью линейной корегистрации, чтобы можно было сравнивать пространственную информацию, которую они содержали на сканах и животных. Корегистрация была адаптирована к репрезентативным данным. Например, в стандартный день сканирования было получено 3–4 сканирования на одно животное, в результате чего было получено 3–4 видео на животное в день. Между каждым сканированием не происходило никакого движения компонентов люльки, включая компоненты камеры и фиксации головы. Таким образом, после того, как было определено преобразование корегистрации для одного видео для каждого животного в день, оно может быть применено к другим 2–3 видео с этим животным в тот же день. Несмотря на то, что это сэкономило время на этапе совместной регистрации этого конвейера, при необходимости пространственные преобразования также можно рассчитать для каждого видео отдельно. Три объекта, присутствующие в каждом видео, были выбраны в качестве точек для надписывания и вычисления пространственного преобразования. На показанных репрезентативных данных эти три точки были центром головного столба, фронтальным видом правого глаза животного и профильным видом правого глаза животного (видимым в зеркале, расположенном под углом 45 градусов). Примеры совместной регистрации видео показаны на рисунках 1A, B, где показан средний кадр, рассчитанный на основе всех видео, снятых во время этого эксперимента, как до, так и после совместной регистрации, чтобы продемонстрировать эффект этого шага.

Этот конвейер в значительной степени опирается на оптический поток, метод компьютерного зрения, используемый для оценки движения объектов на видео путем оценки их видимых скоростей между последовательными кадрами¹³. Оптический поток был выбран потому, что он позволяет количественно оценить движение — показатель поведенческих реакций — без каких-либо заранее определенных частей тела или действий, представляющих интерес. Кроме того, этот метод был подвержен ограниченному качеству изображения репрезентативных видео, которые были получены с помощью единственной МР-совместимой камеры, доступной на момент эксперимента. В этом конвейере используется алгоритм Хорна-Шунка для оценки глобального, плотного оптического потока; однако другие алгоритмы, такие как алгоритм Лукаса-Канада, могут быть легко использованы с небольшими изменениями в предоставленных сценариях MATLAB 14,15,16. На рисунке 2A показан пример видеокадра с наложенными на каждый пиксель векторами относительной скорости оптического потока. Обратите внимание, что более крупные векторы появляются в областях, где можно было бы ожидать движения, таких как морда и лапы животного.

В то время как конвейер оценивал оптический поток для всех видео по всему полю зрения, остальные шаги анализа были значительно более управляемыми с точки зрения вычислительной нагрузки и потребностей в хранении данных за счет выбора области интереса (ROI) в поле зрения. Рентабельность инвестиций может быть выбрана в соответствии с экспериментом и заранее определенными моделями поведения, представляющими интерес, или с помощью подхода, в большей степени основанного на данных. Учитывая, что репрезентативные данные не включали в себя никаких конкретных поведенческих выходных данных для отслеживания априори, был использован подход, основанный на данных. Стандартное отклонение величины оптического потока было рассчитано для всех видео в каждом пикселе, как показано на рисунке 2B. Области с наибольшим стандартным отклонением включали контуры животного, такие как вокруг глаза и морды, что вселяет уверенность в том, что наблюдаемые колебания оптического потока были вызваны движением животного, а не шумом на видео. Области с меньшим стандартным отклонением включали контуры люльки, которые могли быть результатом небольших вибраций в камере и люльке, возникающих во время сканирования. Среда МРТ неизбежно подвергается вибрациям во время сбора данных из-за переключения градиентов, что может проявляться в флуктуациях оптического потока, наблюдаемых в отражающих компонентах люльки. К счастью, эти вибрации постоянны на протяжении всего процесса сбора данных, поэтому не зависят от условий стимула и не влияют на результаты поведенческого анализа. Особенно повышенные стандартные отклонения оптического потока наблюдались в пикселях зеркала, соответствующих профильному виду лица животного, что послужило ориентиром для выбора ROI для репрезентативных данных. Это также была область, где поведенческие реакции, такие как взмах и обнюхивание, можно было ожидать как часть типичного поведенческого репертуара самок мышей, ищущих изолированного щенка, издающего щенячьи крики.

После выбора ROI и извлечения средней кадровой величины оптического потока для всех видео можно сравнить оптический поток в течение интересующих эпох по группам и условиям. Обратите внимание, что первые 20 секунд (секунд) вектора оптического потока каждого видео были замаскированы для стабилизации яркости; Тем не менее, это может быть скорректировано в соответствии с экспериментальными потребностями. Для каждого видео вектор покадрового оптического потока для выбранного ROI был оценен по Z, затем, после предыдущей работы по классификации выражения лица, он был отфильтрован по низкочастотным частотам 5 Гц (Гц), чтобы учесть, что частота кадров камеры 30 Гц была выше, чем любые ожидаемые поведенческие флуктуации^. Наконец, Z-оценка и фильтрация векторов были разделены на эпохи предъявления стимула для оценки влияния предъявления стимула на оптический поток. Для каждой эпохи средний базовый сигнал до стимула вычитался, чтобы нормализовать оптический поток до периода до стимула. На рисунке 3A показаны примерные временные ряды оптического потока для двух видео, одного материнского и одного девственного, с суммарными групповыми данными на рисунке 3B-E. На рисунках 3B и 3D показан кумулятивный оптический поток во времени во время предъявления стимула относительно исходного уровня, в то время как на рисунках 3C и 3E суммируется кумулятивный оптический поток через 2,5 с после появления стимула. Кумулятивный оптический поток был рассчитан таким образом, чтобы зафиксировать общее движение с течением времени, не предполагая, что спонтанные поведенческие реакции будут происходить по времени. В целом, эти репрезентативные результаты демонстрируют, что крики детенышей, но не чистые тона, вызывали значительно отличающиеся поведенческие реакции у матерей и девственных самок мышей, как и прогнозировалось (межгрупповой U-критерий Манна-Уитни: крики детенышей: p = 0,026; чистые тона: p = 0,093). Тем не менее, этот стимульный эффект не выжил при 2-факторном ANOVA, в то время как групповой эффект выжил (стимул: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; группа: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что матери демонстрировали более высокие стимулы по сравнению с девственницами, при этом материнская реакция на крики щенков была более последовательной, чем на чистые тона. Это может отражать повышенную внимательность или стресс у матерей, а также поведенческую значимость криков щенков, которые, в отличие от чистых тонов, вызывают реакцию на извлечение щенка у матерей в естественных условиях. В совокупности эти репрезентативные результаты позволяют предположить, что оценка оптического потока во время предъявления внешнего стимула может извлечь информацию о нюансах, спонтанных поведенческих реакциях.

Наконец, был проведен более исследовательский анализ, чтобы выявить пространственные характеристики поведения, зафиксированного в репрезентативных данных. Чтобы исследовать, какие пиксели в ROI координированно колеблются во время предъявления стимула, был проведен анализ главных компонент (PCA) пространственной оптической информации с течением времени. Этот анализ выявил пиксели, которые внесли наибольший вклад в первый ПК, а также пиксели, которые показали групповые различия для каждого стимульного условия, как показано на рисунке 4. Крайние правые панели на рисунках 4A, B позволяют предположить, что матери демонстрировали больше движений носом по сравнению с девственницами во время предъявления обоих типов стимулов. В двух группах и двух стимульных условиях первый ПК объяснил 5,41% ± 0,59% от общей дисперсии в анализе оптического потока. В то время как зеркальный ROI был сохранен для этой части нашего анализа, будущие анализы могут быть расширены на более широкую часть поля зрения, чтобы охарактеризовать скоординированные движения за пределами лица в ответ на стимулы. Например, сравнение движений лап может выявить более значимые групповые различия, учитывая, что крики щенков обычно инициируют возвращение щенка у матерей, но не у девственниц, и что лапы могут двигаться более свободно, чем голова животного.

В то время как репрезентативные результаты до сих пор предполагали, что этот конвейер может оценивать неуправляемые поведенческие реакции на внешние стимулы в ограниченных условиях видеосъемки, оставался вопрос о том, действительно ли наблюдаемые колебания оптического потока отражают значимое поведение животных. Чтобы ответить на этот вопрос, с помощью того же конвейера был проанализирован отдельный валидационный набор данных. В отдельном эксперименте самцы мышей с ограниченным доступом воды были обучены ассоциировать световой сигнал с доставкой воды объемом 6 мкл («высокая награда») или 1 μл («низкая награда»). Примечательно, что в отличие от эксперимента со слуховой стимуляцией, этот эксперимент имел априорное поведенческое считывание: скорость облизывания. Лизометр был создан на основе видеообнаружения лизунов, чему способствовал анализ яркости пикселей вблизи водяного носика. Таким образом, поведенческие показания, полученные с помощью ликометра, могут быть использованы для сравнения поведенческих показаний этого конвейера, полученных с помощью оптической оценки потока, что подтверждает его достоверность в обнаружении спонтанного поведения. После совместной регистрации видео, оценки оптического потока, выбора ROI (снова с учетом зеркального поля зрения) и количественной оценки оптического потока, сравнение величины оптического потока выявило значительную разницу между поведенческими реакциями на высокие и низкие вознаграждения. Результаты этого анализа представлены на рисунках 5A, B, где на рисунке 5A показаны усредненные по группе временные ряды, а на рисунке 5B обобщен кумулятивный оптический поток через 2,5 с после появления стимула (промежуточный парный критерий Вилкоксона: p = 0,031). Обратите внимание, что значения оптического потока были больше по сравнению со спонтанным поведением, зарегистрированным в репрезентативных данных, что еще больше подчеркивает сложность оценки необученных, тонких поведенческих реакций. На рисунке 5C показана фактическая частота облизывания, зарегистрированная лизометром для каждого из двух условий вознаграждения, в то время как на рисунке 5D показано, что при условии высокого вознаграждения регистрируется больше облизываний по сравнению с условием низкого вознаграждения в течение 2,5 с после доставки вознаграждения (промежуточный парный критерий Вилкоксона со знаком: p = 0,031). В целом, оба анализа выявили схожую тенденцию в сравнении высоких и низких реакций на вознаграждение, подтвердив представленный конвейер видеоанализа для фиксации значимых различий в поведении животных в разных условиях.

Взятые вместе, репрезентативные результаты, показанные здесь, позволяют предположить, что представление криков детенышей вызывало значительно разные реакции у матерей и девственных самок мышей, в то время как чистые тона этого не вызывали. Анализ валидационного набора данных дает уверенность в том, что наблюдаемые различия в оптическом потоке отражают значимые различия в поведенческих реакциях на внешние стимулы.

Рисунок 1: Видео-корегистрация. (A) Примеры видео-корегистрации, изображающие заранее определенные черты (центр головного столба, фронтальный вид правого глаза, профиль правого глаза), помеченные в трех кадрах, каждый из которых взят из разных видео разных животных. Обратите внимание на то, что три точки не были выровнены, демонстрируя, как поведенческая установка немного изменилась между сеансами сбора данных. (B) Среднее количество кадров за последние 10 секунд каждого видео до (слева) и после (справа) выполнения совместной регистрации видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Оценка оптического потока. (A) Пример кадра с относительными векторами оптического потока, наложенными синим цветом. (B) Среднее попиксельное стандартное отклонение оптического потока по всем видео. Выбранный ROI вокруг профильного вида морды животного через зеркало обведен пурпурным цветом. Цветовая полоса соответствует стандартному отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Визуализация и сравнение оптического потока по группам и условиям. (A) Примерный Z-score и фильтрованный по низким частотам 5 Гц временные ряды оптического потока для одного видео матери и одного видео девственницы. (B) и (D) Кумулятивный оптический поток, измеренный в период стимуляции криков детенышей (B) и чистых тонов (D). Затенение представляет собой стандартную ошибку среднего значения (SEM). (C) и (E) Кумулятивный оптический поток в течение первых 2,5 с предъявления стимула для криков щенка (C) и чистых тонов (E). * Указывает на p < 0,05, межгрупповой U-тест Манна-Уитни (крики щенка: p = 0,026; чистые тона: p = 0,093), N = 6 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение ПК₁ между группами. (A,B) Карты, отображающие нагрузки первого главного компонента (ПК₁) оптического потока во время криков детенышей (A) и чистых тонов (B) в группах, статистически пороговые значения при p < 0,05 без поправки для множественных сравнений. Тепловая карта показывает степень, в которой флуктуация оптического потока каждого пикселя повлияла на ПК₁ по сравнению с другими пикселями. Мелким черным текстом указан процент дисперсии, объясняемой ПК₁ (крики девственниц: 4,95% ± 0,72%; крики девственниц: 4,44% ± 0,59%; чистые тона матерей: 4,95% ± 0,39%; чистые тона девственниц: 4,72% ± 1,24% (среднее ± стандартное отклонение)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Валидация конвейера поведенческого анализа. (A) Средний Z-оценка, вычитание исходного уровня до стимула и фильтрация нижних частот 5 Гц временных рядов оптического потока при высокой и низкой доставке вознаграждения. Затенение представляет SEM, белая вертикальная линия указывает на доставку вознаграждения, а красные звездочки указывают на временные артефакты оптического потока, вызванные началом и смещением светового сигнала. (B) Сводка кумулятивного оптического потока в течение первых 2,5 с после доставки вознаграждения. * Указывает на p < 0,05, промежуточный парный тест Вилкоксона со знаком (p = 0,031). (C) Средняя скорость облизывания, полученная с помощью ликометра, при высокой и низкой доставке вознаграждения. Затенение обозначает SEM, а белая вертикальная линия указывает на доставку вознаграждения. (D) Количество облизываний, зарегистрированных в течение первых 2,5 с после вручения награды. * Указывает на p < 0,05, промежуточный парный тест Вилкоксона со знаком (p = 0,031), N = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Видео 1: Пример видео 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Пример видео 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: Файл времени события для видео 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Файл времени события для Видео 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 1: script1_videocoreg.m. Этот скрипт пространственно выравнивает все видео друг относительно друга с помощью совместной регистрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 2: script2_optflow_roiselect.m. Этот сценарий оценивает оптический поток для полного поля зрения каждого преобразованного видео и позволяет выбрать ROI для остальной части конвейера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 3: script3_optflow_analysis.m. Этот скрипт сравнивает величину оптического потока в различных группах/условиях для выбранной ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 4: script4_optflow_pca.m. Этот скрипт выполняет PCA на предполагаемом оптическом потоке выбранного ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кодирования 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Этот скрипт сравнивает результаты PCA по группам/условиям для выбранного ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Представленный конвейер поведенческого анализа позволяет извлекать ценную информацию из видеозаписей животных, демонстрирующих неинструктированное поведение в ответ на пассивно представленные стимулы. Эти репрезентативные поведенческие видео были получены в сочетании с данными функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) всего мозга, для которых были преодолены многочисленные ограничения для фиксации поведенческих реакций в среде МРТ. С помощью метода оценки оптического потока были выявлены различия в том, как матери и девственницы реагируют на крики щенков, но не на чистые тона, что подтверждает первоначальную гипотезу 13,14,15,16. Используя преимущества уменьшения размерности информации об оптическом потоке, этот вывод был расширен до исследовательского анализа пространственного распределения этих поведений.

Этот конвейер анализа широко поддается различным экспериментальным парадигмам. Он полностью независим от типа получаемых нейронных данных и не требует чрезмерной вычислительной мощности или специализированного оборудования. Основное экспериментальное требование заключается в том, что данные видеосъемки должны быть записаны с соответствующими временными метками начала предъявления стимула. Кроме того, благодаря предоставлению скриптов MATLAB, используемых для выполнения продемонстрированного анализа, реализация этого конвейера должна быть довольно простой, даже для тех, кто имеет минимальный опыт работы с MATLAB. Общие шаги, описанные в протоколе, включают совместную регистрацию видео, оценку оптического потока, выбор области интереса (ROI), количественную оценку оптического потока для конкретного ROI, сравнение величины оптического потока, анализ главных компонент (PCA) и сравнение PCA. На каждом этапе конвейер может быть изменен в соответствии с экспериментальными и аналитическими потребностями, как указано в протоколе и выделено комментариями по всему коду.

Существует несколько ограничений, о которых следует помнить при использовании представленного конвейера анализа видео. Во-первых, следует тщательно продумать конструкцию поведенческого аппарата. Если неясно, какие поведенческие реакции можно ожидать, возможно, в будущем анализе будет полезно иметь как можно больше точек зрения на животное. Поэтому рекомендуется установить одно или несколько зеркал для одновременной съемки фронтального и профильного вида животного, как показано в примере видеокадров на рисунке 1A. Во-вторых, рекомендуется, чтобы освещение, предусмотренное для получения видео, было достаточно ярким, чтобы были видны все соответствующие особенности поля зрения (FOV), но не настолько ярким, чтобы достичь насыщенности. На рисунке 1А видно, что фронтальный вид носа мыши находится в точке, близкой к насыщенной, что затрудняет захват любых колебаний яркости, которые указывали бы на движение. Это могло способствовать отсутствию вариаций оптического потока, наблюдаемых в этой части поля зрения, как показано на рисунке 2B. К счастью, вид носа в профиль не столкнулся с этой проблемой, что позволило проанализировать ROI зеркала. Кроме того, следует учитывать возможность сатурации, если в эксперименте задействованы визуальные стимулы. В эксперименте с валидационным набором данных световой сигнал, используемый для сигнализации о доставке воды, вносил временное насыщение в полученные видео, создавая временный артефакт в оценке оптического потока. Этот артефакт можно наблюдать на рисунке 5А, где два резких пика в оптических трассах потока для обоих условий вознаграждения точно совпадают с моментом включения и выключения светового сигнала. Этот артефакт затруднял анализ этих коротких временных окон с помощью представленного конвейера, и если бы его не было, результаты, представленные на рисунке 5B, могли бы быть еще более значимыми. Постоянное освещение сцены является необходимым допущением для большинства алгоритмов оптического потока^14,16. Поэтому этот конвейер анализа видео не рекомендуется для экспериментов, в которых освещение окружающей среды резко меняется как внутри, так и между испытаниями. В-третьих, и наконец, достаточное привыкание животных к регистрирующей среде является ключевым компонентом любого эксперимента, который будет использовать преимущества этого конвейера. При неправильном приучении животные могут проявлять значительные реакции на стресс, стирая любые тонкие эффекты, вызванные стимулами, которые в противном случае можно было бы разобрать с помощью видеоанализа.

В дальнейшем этот конвейер поведенческого анализа может быть использован для облегчения скоординированной оценки одновременно регистрируемых поведенческих и нейронных реакций. Как показано, количественная оценка необученного поведения позволяет оценить значимость стимулов в сложной среде записи, а также протестировать различные поведенческие реакции в экспериментальных группах и условиях. Дальнейший анализ может быть проведен для изучения индивидуальных различий или тенденций в поведенческих реакциях от испытания к испытанию, чтобы можно было изучить соответствующую нейронную активность. Кроме того, включение PCA для получения пространственной информации о движении, вызванном стимулом, может быть использовано для дальнейшего изучения того, различаются ли конкретные типы поведенческих последовательностей, наблюдаемых во время предъявления стимула, в разных группах и условиях. Этот конвейер анализа может быть легко расширен до различных методов нейронной записи, обеспечивая универсальный мониторинг поведения в ограниченных средах. Исследуя, как внешние стимулы представлены как в мозге, так и в поведении, исследователи стремятся получить более полное представление о том, как восприятие стимулов влияет на внутренние состояния и их внешние проявления.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
программное обеспечение MATLAB MathWorks			https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MR-совместимая камера» 12М-и" со встроенным светодиодным освещением	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf