Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Альтернативная стратегия анализа инвазии клеток in vitro в 3D-культурах

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67114

⸱

9 августа 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Diagnosis and Surgery - São Paulo State University (UNESP), School of Dentistry, Araraquara, 2Department of Periodontics and Oral Medicine, School of Dentistry, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Инвазия является основным биологическим явлением в развитии и прогрессировании рака. На этот процесс влияют неопухолевые клетки и компоненты опухолевого микроокружения. Целью данного исследования является описание альтернативного метода анализа инвазии опухолевых клеток in vitro с использованием трехмерных (3D) культур.

Аннотация

Сфероидальная культура представляет собой 3D-модель, которая обеспечивает улучшенную репликацию микроокружения in vivo по сравнению с традиционными двумерными (2D) культурами. Инвазия является клеточным результатом, представляющим наибольший интерес для биологии рака. В этом протоколе мы разработали альтернативную стратегию оценки инвазии раковых клеток in vitro с использованием гетеросфероидов, состоящих из плоскоклеточного рака полости рта (OSCC), раковых фибробластов (CAF) и моноцитов. Эти гетеросфероиды стремятся имитировать микроокружение опухоли (TME), включая два соответствующих типа неопухолевых клеток наряду с раковыми клетками. Каждый тип клеток был помечен жизненно важными флуоресцентными маркерами, излучающими различные длины волн до образования сфероида. После формирования гетеросфероиды были засеяны на слой внеклеточного матрикса, полученного из лейомиомы человека, в верхнем отсеке микропористой мембраны. Инвазию оценивали по оси z с помощью конфокальной микроскопии. Цифровые изображения были получены в соответствующих флуоресцентных каналах с интервалом 10 мкм, покрывая глубину 90 мкм по оси z. Анализ проводился с использованием бесплатного программного обеспечения для обработки изображений путем вычисления интегральной интенсивности флуоресценции в каждом изображении и канале флуоресценции. Этот подход позволяет проводить более динамичный анализ паттернов клеточной инвазии в многослойном контексте, а также изучать пространственную колокализацию различных типов клеток во время инвазии.

Введение

Инвазия — это процесс, при котором опухолевые клетки мигрируют через внеклеточный матрикс в окружающие ткани 1,2. По мере прогрессирования опухоли опухолевые клетки подвергаются воздействию все более сложных микроокружений. Микроокружение опухоли включает в себя различные компоненты внеклеточного матрикса и неопухолевые типы клеток. Стромальные клетки, включая фибробласты и резидентные макрофаги, ремоделируют микроокружение путем секреции компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, а также цитокинов, которые, в свою очередь, влияютна функции опухолевых клеток. Стромальные и инфильтрирующие лейкоцитарные клетки также напрямую взаимодействуют с опухолевыми клетками, друг с другом и с внеклеточным матриксом в трехмерном микроокружении. В целом, состав ТМЭ влияет на эффективность и характер инвазии опухолевых клеток4.

Сложный характер опухолевого микроокружения требует внедрения эффективных методологий для понимания межклеточных взаимодействий внутри опухолевой ткани. Большинство анализов in vitro, используемых для оценки инвазии, в основном проводились в традиционных 2D-моделях и/или культурах одного клеточного типа 5,6,7,8, что чрезмерно упрощает сложный процесс инвазии и имеет множество ограничений, таких как отсутствие тканевой архитектуры, стромальных компонентов и воспроизводимости in vivo. Сфероидные культуры представляют собой одну из моделей 3D-культур in vitro, которая имитирует морфологию опухолевой массы, позволяя осуществлять межклеточные и клеточные матриксные взаимодействия, включающие физические и биохимические особенности9. Использование 3D-моделей культур выросло в последние десятилетия, и есть доказательства того, что различные биологические результаты, такие как реакция на лечение, морфология клеток и экспрессия генов, отличаются по сравнению с 2D-моделью 9,10.

В этом протоколе демонстрируется метод оценки in vitro инвазии во внеклеточный матрикс человека с использованием 3D-культуры сфероидных клеток. Кроме того, мы использовали гетеросфероиды, состоящие из неопластических клеток, фибробластов и моноцитов, чтобы имитировать микроокружение опухоли с помощью двух соответствующих типов неопухолевых клеток. Визуализация клеток с помощью конфокальной микроскопии вдоль различных плоскостей инвазии по направлению к микропористой мембране позволяет визуализировать этот процесс в более динамичном и многослойном контексте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование первичных клеток человека было одобрено Институциональным комитетом по этике исследований человека (CAAE 57895822.0.0000.5416) Школы стоматологии в Араракуаре - UNESP. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток к 3D культуре клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, описанные в этом разделе, должны выполняться в пределах колпака с ламинарным потоком.

  1. Получите одноклеточные суспензии клеток, которые будут образовывать гетероссфероид.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мы получили сфероиды (см. шаг 2), состоящие из клеточной линии OSCC (SCC9), фибробластов (первичных фибробластов, ассоциированных с раком, полученных в биопсии рака языка) и моноцитов (первичных моноцитов здоровых доноров). Выберите тип клеток в соответствии с экспериментальными интересами.
  2. Проверьте количество клеток и жизнеспособность с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим.
    Примечание: Соотношение клеток в этом протоколе составляет 5:3:2 (5000 неопластических: 3000 фибробластов: 2000 моноцитов), всего 10000 клеток на сфероид. Оптимизируйте соотношение и общее количество клеток в соответствии с экспериментальными интересами.
  3. Отдельно разведите клетки в пробирках объемом 1,5 мл с недобавленной средой, подходящей для каждого типа клеток (например, для опухолевых клеток - DMEM/F12; для фибробластов - DMEM; для моноцитов - RPMI) для достижения соответствующей плотности посева 5000 неопластических клеток на лунку, 3000 фибробластов на лунку и 2000 моноцитов на лунку, или 5000000 клеток на миллилитр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить достаточное количество клеток для эксперимента, используйте на 20% больше требуемого количества, учитывая возможные потери на этапах окрашивания и центрифугирования.
  4. Пометьте различные типы клеток отдельно, используя различные флуоресцентные витальные красители, которые остаются в живых клетках на протяжении нескольких поколений. Добавьте оптимизированные концентрации флуоресцентного красителя в среду, содержащую клетки (например, неопластические: CFSE - зеленый краситель; фибробласты: CMTPX - красный краситель; моноциты, фиолетовый BMQC - синий краситель) и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте флуоресцентные зонды с различными спектрами возбуждения и излучения, чтобы избежать наложения спектров в соответствии со спецификациями используемого конфокального микроскопа.
  5. Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу. Аспирируйте среду с помощью пипетки объемом 200 мкл и повторно суспендируйте в 1 мл 1x PBS.
  6. Центрифугируют при 400 х г в течение 5 мин для получения клеточной гранулы и ресуспендирования общего количества клеток в 1 мл дополненной питательной среды в соответствии с типом клеток/используемой клеточной линией (например, неопластические - 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина, 10% (об.) FBS и 400 мкг/мл гидрокортизона; фибробласты и моноциты - 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина, 10% (об.) FBS). Проверьте интенсивность флуоресценции на микроскопе и подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипановым синим.

2. 3D клеточных культур

Примечание: В этом исследовании использовался метод магнитного полябиопечати 11 для создания гетероссфероидов. Здесь клетки намагничиваются с помощью биосовместимых магнитных наночастиц и подвергаются воздействию мягких магнитных сил. Оптимизируйте соотношение наночастиц к клеткам в соответствии с типом клетки. Также могут быть использованы альтернативные методы создания сфероидальных культур. Выполните действия, описанные в этом разделе, в колпаке с ламинарным потоком.

  1. Добавьте магнитные наночастицы в соотношении 1 мкл наночастиц на 20 000 клеток и тщательно повторно суспендируйте, перемешав 10 раз.
  2. Центрифугируйте клетки при температуре 400 x g комнатной температуры в течение 5 минут и повторно суспендируйте путем 10-кратного перемешивания. Повторите этот цикл центрифугирования/ресуспендирования еще два раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Намагниченные элементы образуют гранулу коричневатого цвета.
  3. После завершения последнего цикла центрифугирования аспирируйте среду и повторно суспендируйте клетки в дозе 34 мкл на лунку (34 мкл/5000 неопластических клеток; 34 мкл/3000 клеток фибробластов; 34 мкл/2000 моноцитарных клеток) добавленной питательной среды (DMEM/F12, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и 5% (объем) FBS) для опухолевых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте объем на основе размера скважины. В этом протоколе использовались 96-луночные планшеты, в общей сложности 100 мкл среды на лунку.
  4. Смешайте все клетки в новую пробирку для совместного выращивания, а затем повторно присунзируйте.
  5. Перенесите 100 мкл совместно культивируемых клеток в каждую лунку планшета со сверхнизким уровнем прикрепления.
  6. Вставьте магнитное поле привода сфероида под пластину, чтобы вызвать агрегацию и образование сфероида, и поместите его в инкубатор (5% CO2, 37 °C) на 3 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия магнитного поля может варьироваться в зависимости от размера или состава сфероида.
  7. Удалите магнитное поле и поместите планшет в инкубатор (5%CO2, 37 °C) не менее чем на 24 часа, чтобы обеспечить выработку белков внеклеточного матрикса и взаимодействие между клетками/межклеточными.

3. Получение микропористой мембраны, покрытой внеклеточным матриксом

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте действия, описанные в этом разделе, в колпаке с ламинарным потоком.

  1. Добавьте 50 мкл коммерчески доступного внеклеточного матрикса в центр 24-луночной микропористой мембраны с помощью наконечника объемом 200 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите внеклеточный матрикс на влажном льду. Не прикасайтесь к микропористой мембране при размещении матрицы сверху.
  2. Удалите пузырьки с помощью стерильной иглы и убедитесь, что матрица покрывает всю поверхность мембраны.
  3. Поместите мембрану в инкубатор (37 °C) на 1 час, чтобы обеспечить образование геля во внеклеточном матриксе.

4. Инвазионный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте действия, описанные в этом разделе, в колпаке с ламинарным потоком.

  1. Добавьте 500 мкл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в нижнюю камеру микропористой мембраны в качестве хемоаттрактанта.
  2. Осторожно удалите среду из образовавшихся сфероидов и аккуратно добавьте 50 мкл/лунку свежей недобавленной среды DMEM/F12 поверх гетеросфероида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен с помощью удерживающего привода для биопечати методом магнитного поля.
  3. Обрежьте стерильными ножницами край наконечника объемом 200 мкл с низким уровнем удерживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер кончика будет зависеть от размера сфероида.
  4. Соберите сфероид и 50 μл среды с наконечником с низким удерживающим наконечником.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг медленно и осторожно, чтобы избежать разукрупнения сфероида.
  5. Аккуратно поместите сфероид поверх внеклеточного матрикса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к желеобразному внеклеточному матриксу.
  6. Осторожно добавляйте 150 мкл недобавленного DMEM/F12 по каплям, чтобы общий объем составил 200 мкл.
  7. Поместите планшет в инкубатор (5%CO2, 37 °C) на 48 часов.
    Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от клеточной линии или протокола.

5. Получение изображения

  1. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации.
  2. Настройте микроскоп на основе характеристик возбуждения и излучения используемых жизненно важных флуоресцентных красителей (например, красителя CFSE, лазера 488 нм и длины волны детектирования 520 нм; фибробластов: красителя CMTPX, лазера 561 нм и длины волны детектирования 610 нм; моноцита, фиолетового красителя BMQC, лазера 405 нм и длины волны детектирования 516 нм).
  3. Загрузите пластину на предметный столик микроскопа.
  4. Находите сфероиды/клетки с помощью светлого поля с 10-кратным увеличением.
  5. Отрегулируйте зум до 40-кратного увеличения.
  6. Установите мощность лазера и усиление детектора для каждого флуоресцентного канала.
  7. Определите начальную точку Z-Stack в качестве фокальной плоскости мембраны, определив поры мембраны с помощью светлого поля.
  8. Сделайте три изображения ниже и пять-восемь изображений над мембраной вдоль оси z для каждого канала, включая светлое поле. Обеспечьте интервал между изображениями 10 мкм, охватывающий общую глубину 90-120 мкм по оси z.
  9. Сохраните проект в виде файла с расширением .czi после создания изображений.

6. Извлечение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование программного обеспечения для работы с изображениями описано ниже.

  1. Откройте файл .czi с помощью программы для редактирования изображений (см. Таблицу материалов).
  2. Нажмите « Обработка» в правом верхнем углу, затем выберите «Одиночный». Затем нажмите « Метод » и выберите «Экспорт изображений».
  3. Выберите файл в разделе Ввод.
  4. Нажмите на кнопку «Параметры », затем выберите следующие настройки: Тип файла (Tagged Image File Format - . TIFF), Сжатие (LZM), Изменение размера (100%), Применение кривой отображения и цвета канала, Изображения отдельных каналов, Использование имен каналов, Определение подмножеств (Канал, выбор всех каналов), Z-позиция (извлечение всех), Область (Полный), Плитки (Экспорт выбранных плиток) и Экспорт в (выбор файла назначения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь объединенные изображения канала, выберите следующие настройки: Тип файла (Tagged Image File Format - . TIFF), Сжатие (LZM), Изменение размера (100%), Применение кривой отображения и цвета канала, Объединение изображений каналов, Использование имен каналов, Определение подмножеств (Канал, выбор конкретных каналов для наложения), Z-позиция (извлечение всех), Регион (Полный), Плитки (Экспорт выбранных плиток) и Экспорт в (выбор файла назначения).
  5. Нажмите на значок «Применить », расположенный в правом верхнем углу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге изображения будут экспортироваться одновременно из разных каналов.

7. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование свободного программного обеспечения объясняется на этом шаге.

  1. Нажмите «Файл» в верхнем левом углу, выберите «Открыть», выберите изображение, а затем нажмите «ОК».
  2. Нажмите «Анализ», затем «Установить измерения» и выберите «Площадь», «Интегрированная плотность» и «Отобразить метку». Нажмите на OK.
  3. Нажмите « Анализировать», а затем «Измерить».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что площадь всех изображений одинакова. "Integrated Density" отображает два значения: (1) Raw Integrated Density (RawIntDen): сумма всех значений пикселей на изображении; (2) Интегрированная плотность (IntDen): произведение среднего значения серого на площадь. Поскольку изображение имеет цвет RGB и площадь всех изображений одинакова, рассмотрите возможность использования RawIntDen в качестве значения измерения флуоресценции. Различия в значениях флуоресценции (интенсивности и количестве) между изображениями могут указывать на различия в интенсивности клеточной инвазии и пролиферации. Еще одним методом нормализации характера инвазии во внеклеточном матриксе по направлению к микропористой мембране с использованием сокультур разных типов клеток является расчет соотношения значений RawIntDen:
    Коэффициент RawIntDen =figure-protocol-1
    Отношение 1 представляет изображение/расположение вдоль оси z с наибольшей инвазией/локализацией клеток для этого конкретного типа клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В данном исследовании представлен альтернативный метод оценки клеточной инвазии in vitro с использованием сфероидов, состоящих из различных типов клеток. Это позволяет анализировать паттерны клеточной инвазии в многослойном контексте и изучать динамику колокализации клеток во время инвазии (рис. 1).

Изображения в светлом поле представляют собой сфероидную/клеточную локализацию, идентифицированную темными/черными агломератами (рис. 2A<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Трехмерные сфероидные культуры являются мощным подходом к исследованию различных аспектов клеточной биологии. В этом исследовании мы представляем протокол оценки инвазии опухолевых клеток с использованием гетеросфероидов, которые имитируют микроокружение опухоли в многослойном и более динамичном подходе. Этот метод позволяет оценить ко-кализацию и паттерны инвазии в присутствии неопухолевых стромальных клеток.

Есть несколько важных шагов, которые заслуживают рассмотрения. Во-первых, важно подо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP 20/10544-1 и 20/10664-7). Некоторые изображения были сгенерированы с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для биопечати 96 скважинGreiner Bio-one  655840Магнитное поле привода сфероида. Удержание привода. 96 луночный микропланшет, репеллентная поверхность
CellTrace CFSE Набор для пролиферации клетокInvitrogen, ThermoFisher ScientificC34554
CellTracker Red CMTPXInvitrogen, ThermoFisher ScientificC34552
CellTracker Violet BMQC DyeInvitrogen, Thermo FisherC10094
DMEMGibco, ThermoFisher Scientific31600-034
DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific12400-024
Внеклеточный матрикс с миогелемdoi: 10.1186/s12885-015-1944-zСмесь, состоящая из миогеля (2,4 мг/мл), коллагена (0,8 мг/мл) и недополненной среды неопластических клеток;
FBSGibco, ThermoFisher Scientific12657-029
ГидрокортизонSigmaH088
ImageJПрограммное обеспечениеНациональных институтов здравоохранения
Nanoshuttle-PLGreiner Bio-one657841Игла для магнитных наночастиц
23 GMedixAHMD00425 x 0,60 мм (23 G x 1)
PBS pH 7,2 (1x)Gibco, ThermoFisher Scientific2012-027
Пенициллин-стрептомицин (5,000 Ед/мл)Gibco, ThermoFisher Scientific15070063
Pipet TipsAxygen, Corning Inc.TF-200-L-R-SНаконечник для дозатора с барьером (фильтром), 200 &; L Фильтр с низким удержанием, короткий, максимальное восстановление
RPMIGibco, ThermoFisher Scientific31800-022
TransWell 24 скважиныCostar, Corning Inc.3422Transwell проницаемые опоры 6,5 мм, 24-луночная пластина; 0,8 и микро; m Поликарбонатная мембрана
Zen 3.4 (синяя версия)Zeiss GroupSoftware

Ссылки

  1. Steeg, P. S. Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges. Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  3. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  4. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
  5. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).
  6. Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy. Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).
  7. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. (88), e51046(2014).
  9. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - A comparison of different. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).
  10. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 1-15 (2022).
  11. Trindade, J., et al. Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances. Life Sci. 286, 1-8 (2021).
  12. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).
  13. Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. (160), e61392(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

3D-культура клетоккультура сфероидовмодель гетеросфероидовмикроокружение опухоликонфокальная микроскопиявнеклеточный матриксфлуоресцентная визуализациярак-ассоциированные фибробластыплоскоклеточный рак полости рта
Альтернативная стратегия анализа инвазии клеток in vitro в 3D-культурах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.