Методическая статья

Цеповидный анализ белков при репликации цепочек ДНК путём обогащения и секвенирования метода новорожденной ДНК, ассоциированной с белками

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было разработано обогащение и секвенирование белок-ассоциированной зарождающейся ДНК (eSPAN) для обнаружения относительного количества белка, ассоциированного с хроматином, на двух репликационных цепях ДНК, что позволило дать молекулярное понимание репликации хроматина и связанных процессов. Этот протокол описывает процедуры eSPAN в эмбриональных стволовых клетках дрожжей и мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дупликация генома координируется реплисомными белками, включая геликазы, которые разворачивают двухцепочечную ДНК в отдельные антипараллельные одиночные цепочки, каждая из которых требует различных способов репликации: непрерывного (ведущего) и прерывистого (отстающего). Понимание взаимодействий белков, ассоциированных с хроматином, с реплицирующими цепями ДНК in vivo имеет решающее значение для разъяснения механизмов сборки хроматина и ремонта ДНК в связи с репликацией ДНК. Этот протокол представляет собой метод обогащения и секвенирования белко-ассоциированной зарождающейся ДНК (eSPAN), предназначенный для количественной оценки относительных уровней белка на зарождающихся ведущих и отстающих цепях ДНК на реплицационных вилках. Процедура eSPAN начинается с иммунопреципитации хроматина (ChIP, у дрожжей) или расщепления под мишенями и маркировки (CUT&Tag; в клетках млекопитающих) интересующего белка, затем следует обогащение ассоциированной с белком зарождающейся ДНК с помощью иммунопреципитации бромодеоксиуридина (BrdU). К изолированной ssДНК применяется специфическая для цепей следующего поколения. Этот метод можно использовать для определения, обогащён ли белок на ведущих или отстающих репликационных вилках. eSPAN обеспечивает геномное предпочтение по цепочкам белков, ассоциированных с хроматином, включая гистоны на репликационных вилках.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У эукариотических организмов дупликация генома инициируется из нескольких участков, называемых репликационными истоками, где комплекс распознавания происхождения (ORC) связывается и запускает механизм рекрутационного белка, включая геликазу CMG, для запуска первой репликации ДНК. Реплисомный механизм в каждом начале репликации образует две репликационные вилки, которые движутся в обоихнаправлениях 2,3. Двойные репликационные вилки реплицируют две родительские цепи ДНК через непрерывный синтез ведущей цепи и прерывистая синтез отстающей цепи. Учитывая такую асимметричную природу каждой репликационной вилки, компоненты репликации, включая ДНК-полимеразы на ведущих и отстающих цепях, отличаются. Предыдущий генетический анализ, основанный на мутантных ДНК-полимеразах, показал, что ДНК Pol ε и DNA Pol δ являются основными полимеразами, ответственными за ведущую и отстающую репликацию цепочек соответственно 4,5. Разработано несколько методов для определения предпочтений цепочек ДНК-полимеразы, включая Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 и emRiboSeq или RiboSeq 9,10. Эти генетические методы рассечения специфичности цепи ограничены ДНК-полимеразами и требуют внесения мутаций на каждыйбелок 4,5,11,12. Отслеживание связи любого мишенного белка с ведущими и отстающими цепями вилок репликации ДНК даст ценные знания о репликации ДНК. В этой работе мы сначала разработали метод eSPAN (обогащение и секвенирование белковой зарождающейся ДНК, рисунок 1) в клетках дрожжей. В качестве исследования с доказательством принципа мы сначала показали, что Pol δ и Pol δ обогащаются соответственно на ведущих и отстающих нитях. Мы также выявили предпочтения по цепочкам ключевых компонентов репликации ДНК, включая репликативную ДНК-геликазу, одноцепочечный белок связывающего ДНК (репликационный белок A), а также лампу пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA) и её фактор загрузчика C (RFC)13. Важно, что мы и другие использовали этот метод для выявления механизмов родительского переноса гистонов — процесса, который был неразрешимым более 4 десятилетий 14,15,16,17.

Метод eSPAN включает два последовательных этапа: обогащение целевого белкаChIP18 или CUT&Tag19 и обогащение зарождающейся ДНК, связанной с белком, с помощью иммунопреципитации BrdU. В стандартном штаме дрожжей (W303 или S288C) внеклеточные BrdU или EdU не могут проникнуть в клетки и интегрироваться в хромосомы. Эти штаммы не имеют соответствующего нуклеозидного транспортера для поглощения тимидина, а также тимидинкинази, необходимой для фосфорилирования тимидина в ТМП, который превращает BrdU (или EdU) в BrdUMP (EdUMP). Экспрессия человеческого равновесного нуклеозидного транспортера 1 (hENT1) и тимидинкиназы простого герпеса (HSV-TK) способствует усваиванию тимидина и превращения BrdU (или EdU) в BrdUMP (EdUMP)20. Поэтому для проведения эксперимента eSPAN на дрожжах штаммы должны были быть вставлены с BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) структурой (HSV-TK и hENT1)13,21.

Ранее мы предоставляли протокол eSPAN для белков репликации ДНК вдрожжах 22. Недавно мы интегрировали метод CUT&Tag в протокол eSPAN в клетках млекопитающих, чтобы решить технически сложные этапы, требующие оптимизации, такие как перекрёстное сшивание, сдвиг хроматина, а также минимизировать количество стартовыхклеток 17,23. Здесь мы предоставили гистонный eSPAN для визуализации с использованием дрожжевых клеток (рисунок 2). Этот метод в первую очередь используется для анализа распределения модифицированных форм гистонов на реплицирующихся цепях ДНК. Во время тестирования нескольких гистонных меток мы использовали H3K4me3 — метку на родительском гистоне H3, в качестве примера. Для анализа компонентов реплисомов и факторов, участвующих в репарации ДНК на репликационных вилках, мы рекомендуем сдвигивать хроматин на мелкие фрагменты с помощью соникации, как описано в нашей первой публикации22. Для клеток млекопитающих мы внедрили модифицированные процедуры Cut&Tag, чтобы заменить шаг ChIP, описанный вдрожжах 23. Эта модификация уменьшает количество исходного материала (клеток) и, что самое важное, позволяет создавать библиотеки eSPAN для секвенирования без использования одноцепочечных наборов для подготовки ДНК. Для протокола дрожжей мы решили не использовать метод Cut&Tag, потому что количество исходного материала было достаточным. Что ещё важнее, мы обнаружили, что процедуры Cut&Tag не всегда эффективны для дрожжевых клеток в наших руках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Для рекомендаций по подготовке буферов и реагентов см. рекомендации по подготовке буферов и реагентов (Дополнительный файл 1).

1. Гистон eSPAN в цветущих дрожжах

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство штаммов дрожжей не имеют функционального нуклеозидного транспортера для усвоения тимидинов. Для эффективной маркировки ДНК BrdU или EdU для eSPAN требуется тимидинкиназно-положительный (TK+) штам21 . Кроме того, для остановки клеточного цикла с использованием альфа-фактора могут использоваться только штаммы дрожжей типа «A».

  1. Синхронизация дрожжевых клеток и маркировка BrdU (8 ч)
    1. Инокулируйте одну колонию соответствующего штамма дрожжей (TK+) в 10 мл среды YPD и выращивайте при 30 °C на встряхивающем инкубаторе на ночь при 220 об/мин.
    2. Измерьте оптическую плотность, OD600 нм, с помощью спектрофотометра и разведите культуру до свежих 200 мл среды YPD с OD600 ~0,2-0,3.
    3. Выращивайте культуру до OD600 ~0,4-0,5 (обычно 3-4 часа) при 30 °C в трясещем инкубаторе при 220 об/мин.
    4. Добавьте 300 мкл α-фактора (5 мг/мл) и высевайте 1,5 часа при 25 °C, 220 об/мин.
    5. Добавьте ещё одну дозу 300 мкл α-фактора (5 мг/мл) и выращивайте ещё 1,5 часа при 25 °C, 220 об/мин.
    6. Приготовьте раствор фиксации параформальдегидов с 37,5% и предварительно нагрейте среду (200 мл YPD + HU (гидроксимочевина)+ BrdU) до 30°C во время синхронизации клеток.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с BrdU с осторожностью, так как это потенциальный мутаген и тератоген. Приготовьте параформальдегидный раствор с содержанием 37,5% в химической выхлопной жидкости, чтобы избежать воздействия вредных паров, так как параформальдегид является потенциальным канцерогеном.
    7. Проверьте морфологию клеток (полосчатую форму) световым микроскопом, чтобы убедиться, что как минимум 90% клеток дрожжей находятся в фазе G1 за 15 минут до 3-часовой остановки G1. Альтернативно, проведите анализ сортировки клеток, активируемый флуоресценцией (FACS), чтобы подтвердить остановкуG1 24.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте морфологию клетки и подтвердите остановку G1 (90% с формой планки) на этом этапе.
    8. Собирайте клетки (гранулы) центрифугой при 1600 г в течение 5 минут при 4 °C и дважды промывайте гранулы 20 мл ледяной двойной дистиллированной воды.
    9. Суспензировать клетки в предварительно подогретых (30 °C) 200 мл YPD + HU+ BrdU.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель выделения HU — обеспечить, чтобы большинство клеток дрожжей находились на ранней стадии репликации S, что улучшит согласованность и обеспечит воспроизводимость результатов. Исключение HU допустимо, если требуется работа с логарифмическими элементами.
    10. Культивировать клетки на трясущем инкубаторе при 30 °C, 220 об/мин в течение 45 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ FACS может быть проведен для подтверждения ранней фазы S. Для анализа FACS важно включить образец лог-фазы в качестве контроля для точного определения популяции клеток G1. Для эффективного внедрения BrdU выгодно начинать с быстрорастущих клеток. Некоторые мутанты с дефектами медленного роста обычно демонстрируют низкую эффективность маркировки BrdU. Эффективность внедрения и эффективность BrdU-IP оцениваются с помощью количественной ПЦР путём сравнения реплицированных и нереплицированныхобластей 22 с использованием ДНК, выделенной на шаге 1.6.7.
  2. Фиксация и сбор образцов (1 ч)
    1. Добавьте свежеприготовленное 6 мл параформальдегида 37% до окончательной концентрации 1%, хорошо перемешайте и инкубуйте при 25 °C в течение 20 минут с лёгким встряхиванием 90 об/мин.
    2. Закалите фиксацию, добавив 12 мл глицина 2,5 М, хорошо перемешайте и инкубуйте при 25 °C в течение 5 минут с лёгким встряхиванием 90 об/мин.
    3. Пеллетируйте клетки при 1600 г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Затем промыйте клетки дважды 20 мл холодной воды, прокрутив при 1600 г в течение 5 минут.
    4. Соберите клетки в трубки с винтовыми крышками объемом 2 мл (50 мл клеток/трубку) и храните при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки можно хранить до года (точка паузы).
  3. Лизис дрожжевых клеток и фрагментация хроматина (5 ч)
    1. Разморозить клеточные гранулы, восстановить их с помощью мягкого вихря и промыть с 0,4 мл буфера ChIP с ингибиторами протеазы и смесью антибиотиков (предотвращая рост загрязняющих бактерий) и отварить при 5 000 г в течение 1 минуты.
    2. Добавьте 0,1 мл буфера лизиса ChIP, содержащего ингибиторы протеазы и смесь антибиотиков, затем примерно 100 мкл стеклянных шариков (0,5 мм).
    3. Лизировать с помощью бибишек в течение 3 циклов (30 секунд включённо/выключено, 1 минута перерыва) в холодной комнате при температуре 4 °C.
    4. Пробьите отверстия в нижней части трубки горячей иглой на 16 G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы поддерживать горячую иглу, старайтесь держать трубку близко к огне.
    5. Соберите лизат, вложив пробирку в пустую ДНК-пробирку объёмом 1,5 мл с низким уровнем связывания и центрифугу при 1600 г в течение 2 минут, RT.
    6. Аккуратно аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу (хроматин будет в фракции остатков клеток).
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы случайно не аспирировать клеточную гранулу при использовании вакуума.
    7. Суспензировать клеточные гранулы с помощью пипетирования в 0,35 мл буфера для пищеварения MNase, дополненного 0,5 мМ спермидином и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола.
    8. Добавьте 10 единиц MNase в реакции, аккуратно перемешайте, сразу перевернув 4-6 раз, и инкубируете при водяной бане при 37 °C в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия пищеварения должны быть оптимизированы для каждой партии фермента MNase с целью обогащения для моно-, ди- или тринуклеосомных фракций.
    9. Закалить расщепление MNase, добавив 5 мкл 0,5 M EDTA для конечной концентрации 10 мМ EDTA. Аккуратно перемешайте их инверсией и сразу держите трубки во льду минимум 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы можно хранить при 4 °C ночью. Условия пищеварения MNase должны быть оптимизированы для получения большинства моно-, ди- или тринуклеосом фракций (140-450 бп)
    10. Соникировали реакционную смесь с помощью биорупторных микротрубок (1,5 мл) в течение 3 минут (высокая мощность, 30 с включение/выключение). Вращайтесь при 10 000 г в течение 5 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта короткая звуковая обработка помогает выпустить хроматин в буфер.
    11. Перенесите супернатант в новые трубки и открутите ещё 10 минут при 10 000 г при 4 °C.
    12. Собрать супернатант (около 400 мкл), сохранить 30 мкл образца как входную ДНК и заморозить при -20 °C. Использовать оставшийся (~370 мкл) лизат клетки в следующем иммунопреципитации хроматина (шаг 1.4.1).
  4. Иммунопреципитация гистон-хроматина (ночью)
    1. Добавьте 0,5 мкг антитела H3K4me3 в лизат и нутат на ротор, 10 об/мин при 4 °C за ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь в качестве примера приводится H3K4me3. Количество антител следует экспериментально проверить.
    2. Вращайтесь при 15 800 × г в течение 10 минут при 4 °C и переведите супернатант в новую трубку на 1,5 мл.
    3. Добавьте 20 мкл предварительно промытых белковых бусинок G Сефароз (трижды промываются с буфером ChIP лизис, нутат на роторе по 3 минуты каждая, собирайте шарики центрифугой при 350 × г, 4 °C) и инкубируем при 4 °C в течение 2 часов.
    4. Отжимайте при 350 × г на RT и промывайте бусины в следующем порядке.
      1. Промывайте дважды с 1 мл ледяного буфера для лизисов по 3 минуты каждый раз вращаясь при 10 об/мин на ротаторе при RT.
      2. Промыйте один раз с 1 мл ледяного лизисного буфера с буфером 0,5 M NaCl в течение 3 минут вращением при 10 об/мин на ротаторе в RT.
      3. Постой один раз с 1 мл ледяного буфера Tris/LiCl для мытья в течение 3 минут по ротации при 10 об/мин на ротаторе при RT.
      4. Помой один с помощью 1 мл буфера для мытья RT Tris/EDTA (не TE буфера, а дополнительный файл 1 для рецепта). Выведите всю возможную жидкость из гранулы иглой 16 г 1/2.
  5. Экстракция ДНК (2 часа)
    1. Добавьте 0,1 мл хорошо смешанной 10% хелатирующей смолы для экстракции ДНК в промытые шарики (начиная с 1.4.4.4.4 шага), входный образец (с шага 1.3.12) и вихрь.
    2. Кипятите 10 минут на нагревательном блоке при 100 °C, затем охладите до RT для обратного перекрёстного соединения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания уплотнения затвора настоятельно рекомендуется использовать стоп-поп зажимы для трубок центрифуга.
    3. Добавьте 5 мкл протеазы K 20 мг/мл в шарики и инкубуйте при 55 °C в течение 30 минут, встряхивая при 400 об/мин.
    4. Прокипятите шарики на нагревательном блоке при 100 °C ещё 10 минут, чтобы инактивировать активность протеазы K.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания уплотнения затвора настоятельно рекомендуется использовать стоп-поп зажимы для трубок центрифуга.
    5. Прокрутите бусины при 6000 г на 2 минуты на RT и сохраните супернатант.
    6. Добавьте 100 мкл 2XTE в пеллет. Вихрь и вращение при 6000 г в течение 2 минут на RT.
    7. Смешайте и сохраняйте супернатанты (из шагов 1.5.5 и 1.5.6), взятых выше (около 180 мкл).
    8. Очистить образцы 30 мкл в 18 мкл буфера элюции (EB, поставляется с набором для очистки ПЦР) с использованием колонок для очистки ДНК для подготовки библиотеки ssDNA (начиная с шага 1.3.12 как вход и шаг 1.5.7 как образцы H3K4me3 ChIP-seq).
      ПРИМЕЧАНИЕ: образцы ДНК могут храниться при -20 °C до месяца (точка паузы).
  6. Иммунопреципитация BrdU (5 ч)
    1. Кипятите образцы (около 150 мкл входа и H3K4me3 ChIP от шага 1.5.7) в течение 5 минут на нагревательном блоке 100 °C, а затем сразу охлаждайте во льду на 5 минут. Добавьте 15 мкл 10x PBS и + 1,35 мл буфера BrdU IP + 0,5 мкл анти-BrdU Ab + 1 мкл тРНК E.coli (10 мг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Используйте центрифугные трубки с низким уровнем связывания ДНК, чтобы избежать неспецифического связывания ДНК.
    2. Нутате 2 часа на роторе при 4 °C при 10 об/мин.
    3. Переложите смесь в трубку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл белковых сефарозных шариков (промываемых три раза с 1 мл буфера BrdU IP и вращайте по 3 минуты каждую при 10 об/мин при каждой промывке при RT) и нутат в течение 1 часа при 4 °C на роторе при 10 об/мин.
    4. Отжимайте при 800 × г в течение 1 минуты при RT и промывайте по следующему принципу: три раза с 1 мл холодного BrdU IP-буфера, 3 минуты на роторе и один раз с 1 мл TE буфера на 3 минуты.
    5. Вращение при 800 × г в течение 1 минуты на RT и аспирировать супернатант.
    6. Добавьте 100 × мкл TE + 1% буфера SDS в оставшиеся шарики. Инкубировать при 65 °C в течение 5 минут. Крутите при 800 × г в течение 1 минуты на RT.
    7. Очистить супернатант до 18 мкл EB с помощью колонок для очистки ДНК (образцы BrdU IP и H3K4me3 eSPAN).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугные трубки с низким уровнем связывания, чтобы избежать неспецифического связывания ДНК. Образцы ДНК могут храниться при -20 °C до месяца (точка паузы).
  7. Подготовка и секвенирование библиотеки ssDNA (3 ч)
    1. Подготовьте одноцепочечные ДНК-библиотеки с 15 мкл очищенного входа, образцами BrdU IP, H3K4me3 ChIP и eSPAN (шаги 1.5.8 и 1.6.7) (включая этапы адаптазы, удлинения и лигации) согласно руководствам, предоставленным набором для подготовки библиотеки SSDNA и низковходной ДНК, и очистите полученный продукт лигации в 20 мкл буфера элюции с низким содержанием ЭДТА (предоставленный набором для подготовки ДНК библиотеки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В наборе есть два этапа очистки перевязки. Этот протокол следует процедуре 200 bp, <1 ng.
    2. Амплифицировать библиотеку ДНК с использованием общей смеси реакций 50 мкл (реагенты, предоставляемые набором для подготовки библиотеки SSDNA): 20 мкл очищенной библиотеки ДНК, 4 мкл реагента W2, 10 мкл реагента W3, 1 мкл фермента W4, 1,5 мкл праймеров индексов I7 (10 мкМ, см. Дополнительная последовательность олиго) и 1,5 мкл праймера индексов I5 (10 мкм, см. Дополнительная олигоно-последовательность), 16 мкл ДНКаз-свободногоddH 2O. Нагрейте ПЦР-смесь при 98 °C в течение 30 секунд, затем 18 циклов по 10 с при 98 °C, 30 с при 60 °C и 1 минуту при 68 °C, и один цикл по 10 минут при 68 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая библиотека должна использовать уникальную комбинацию i7 и i5 букваров. Количество циклов усиления следует корректировать в зависимости от объёма библиотеки, чтобы избежать чрезмерного усиления, которое может привести к появлению артефактов ПЦР. Учитывая обычно низкое количество ДНК в образцах eSPAN, используйте до 18 циклов.
    3. Очищайте продукты ПЦР, смешивая 60 мкл (1,0x объём) шариков (предварительно нагретых до 30 °C) (см. Таблицу материалов).
    4. Тщательно перемешайте продукты ПЦР и шарики.
      1. Дайте постоять на RT 5 минут. Перевязывайте бусины на магнитной подставке 3 минуты и дважды промывайте бусины (каждый раз 200 мкл) свежеприготовленным 80% этанолом.
      2. Сушите шарики на воздухе в течение 2 минут и элюируйте в буфер с низким содержанием ЭДТА объёмом 20 мкл (предоставлен в наборе для подготовки библиотеки ДНК).
    5. Измеряйте концентрацию библиотеки и распределение размеров фрагментов с помощью высокоразрешающих систем электрофореза (см. таблицу материалов).
    6. Объединяйте равное количество отдельных библиотек, включая входные, H3K4me3 ChIP, BrdU IP и eSPAN сэмплы, и выполняйте параллельное парное секвенирование с платформой секвенирования Illumina. Для процесса анализа данных см. раздел 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии оценки результатов контроля качества: (i) Пики адаптера/праймер-димера (ниже 180 bp) не обнаружены. (ii) Все библиотеки, подлежащие пулу, имеют аналогичное и узкое распределение размера (~300 bp ширина). Чрезмерная сушка бусины может привести к низкому урожаю; используйте ДНК-рабочую станцию, чтобы избежать загрязнения. Библиотеки можно хранить бесконечно при -20°C (точка паузы).

2. Histone eSPAN с мышиной ES ячейкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистонный eSPAN с мышиной ES-ячейкой по сути идентичен ранее опубликованномупротоколу 23.

  1. Маркировка BrdU и сбор образцов для клеток ES-клеток мыши (3 часа)
    1. Выращивать клетки ES-клетки мышей в среде для культуры ES-клеток при 37 °C с увлажнённой атмосферой с содержанием 5%CO2 для достижения совпадения 70%-80%. В целом для гистонного eSPAN требовалось около 1 миллиона клеток. Семена клеток за день до экспериментов, чтобы убедиться, что клетки растут экспоненциально.
    2. Заменить среду и инкубировать клетки с BrdU при конечной концентрации 50 мкм в течение 30 минут при 37 °C с увлажнённойатмосферой с содержанием CO2 5%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность маркировки BrdU можно контролировать с помощью количественного ПЦР-анализа. Альтернативно, для мониторинга эффективности внедрения BrdU можно использовать иммунофлуоресцентный или FACS-анализ. Немаркированные клетки могут использоваться как отрицательный контроль. Это стандартные условия маркировки клеток ES-клеток мыши. Рекомендуется корректировать условия маркировки для клеток с разной скоростью пролиферации и длительностью S-фазы.
    3. Ослабьте клетки дважды аккуратно с помощью ледяного PBS.
    4. Трипсинизируйте и собирайте клетки, гранулируя при 200 × г в течение 5 минут.
    5. Аккуратно пипетируйте клетки в среду, чтобы подвесить их, затем пересчитайте. Центрифугировать необходимое количество ячеек при 500 × г в течение 5 минут при RT.
    6. Суспензируйте ячеточную гранулу в 4 мл буфера для промывки с помощью пипетирования и сбросьте супернатант. Центрифуга при 500 × г в течение 5 минут на RT.
    7. Снова подвесьте гранулы с помощью 4 мл буфера для промывки и центрифугите при 500 × г на 5 минут при RT.
    8. Сбросьте супернатант и снова подвесьте ячейки в буфере промывки.
    9. Поместите магнитные шарики с покрытием ConA (используйте 10 мкл шариков для 250000 ячеек; масштабируйте при использовании большего количества ячеек) и повторно подвесьте в 1 мл буфера связывания. После нескольких инверсий установите трубки на магнитную подставку, чтобы шарики осели.
    10. Используя пипетку или низкоскоростной вакуум, сбросьте супернатанты. Повторите этап промывки дважды и подвесите бусины в буфере для связи.
    11. Добавьте в образцы заранее вымытые магнитные бусины с покрытием ConA. Хорошо перемешайте и поменяйте на RT 10-20 минут.
    12. Поставьте трубки на магнитную подставку, чтобы выбросить все супернатанты.
  2. Маркировка 19 для клеток ES-клетки мыши (2 дня)
    1. Подвесить шарики (магнитные шарики, покрытые ConA, связанные с клетками с шага 2.1.10) в 200 мкл ледяного буфера антител. Добавьте IgG как отрицательный контроль или соответствующие концентрации первичных антител к интересующих белкам.
    2. Хорошо перемешайте и натурайте при 4 °C на ночь.
    3. Смешайте 2 мкг вторичного антитела и правильное количество pA-Tn5 в молярном соотношении 1:2. Увеличите общий объём до 8 мкл на образец с 50% (v/v) глицерина. Несколько раз наносите пипетки для хорошего смешивания и инкубации на RT в течение 1 часа.
    4. Поместите образцы CUT&Tag на магнитную подставку на 30 секунд и уберите все супернатанты. Добавьте 1 мл буфера Dig-wash к грануле и несколько раз инвертируйте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После следующих этапов промывания (шаги 2.2.5-2.2.6) рекомендуется инкубировать шарики в буферах в течение 3-5 минут после этапа инвертирования, чтобы избежать неспецифического связывания.
    5. Поставьте трубки на магнитную подставку и удалите все супернатанты. Добавьте 200 мкл буфера Dig-300 для повторного суспензирования шариков и добавьте 8 мкл смеси вторичного антитела и pA-Tn5 в каждый образец. После тщательного смешивания с помощью пипетки несколько раз инкубировать в RT в течение 1 часа.
    6. Поставьте трубки на магнитную подставку и удалите все супернатанты. Добавьте 1 мл буфера Dig-300, чтобы подвесить шарики и несколько раз перевернуть.
    7. Поставьте трубки на магнитную подставку и удалите все супернатанты. Повторите этап стирки ещё три раза.
    8. Полностью удалите супернатанты и добавьте 250 мкл буфера для маркировки, чтобы снова подвесить шарики и инкубировать при 37 °C в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакционного этапа термомиксера рекомендуется мягкое встряхивание, так как шарики могут осадиться на дно трубок.
    9. Поставьте трубки на магнитную подставку и удалите все супернатанты. Используйте 1 мл буфера для мойки TAPS, чтобы подвесить шарики и несколько раз перевернуть.
    10. Поставьте трубки на магнитную подставку и уберите все супернатанты.
    11. Добавьте 250 мкл буфера Dig-300, содержащего 15 мМ ЭДТА, 0,1% (с в/в) SDS и 0,1 мг/мл протеиназы K в оставшиеся шарики. Вихрь для хорошего смешивания и инкубации при 37 °C ночью с лёгким встряхиванием.
  3. Геномная очистка ДНК и in vitro маркировка в клетках ЭС-клетки мыши (за ночь)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная ДНК из тех же клеток для eSPAN извлекается и готовится к метке in vitro , которая используется для BrdU-IP-ssSeq. Геномная ДНК-метка и её последующие BrdU-IP-ssSeq предназначены для целей нормализации eSPAN.
    1. Суспензировать клетки в 300 мкл геномного буфера лизиса и вихрь на максимальной скорости, пока не останутся видимы гранулы.
    2. Для каждого образца добавьте РНазу A при 100 мкг/мл. После объединения инкубировать при 37 °C в течение 10 минут.
    3. Добавьте 100 мкл раствора для белкового осадка в каждый образец. Хорошо перемешайте с помощью вихря и центрифугирования при 15 000 г при RT в течение 3 минут.
    4. Сэкономьте супернатант, переведя его в новые трубки по 1,5 мл. Добавьте изопропанол в 1x объём в образцы и хорошо перемешайте.
    5. Вращайтесь на максимальной скорости при RT в течение 3 минут, чтобы пеллетировать геномную ДНК. Аккуратно вылейте супернатанты.
    6. Добавьте 1 мл свежеприготовленного этанола 70% (v/v) в каждый образец и несколько раз инвертируйте. Центрифугу на максимальной скорости RT в течение 3 минут.
    7. Центрифугуйте при 15 000 г в течение 1 минуты при RT и удалите оставшийся этанол с помощью пипетки P20. Дайте высохнуть на воздухе 5-10 минут.
    8. Добавьте 50 мклddH 2O и кратковременно вооружите геномную ДНК. Растворить при 65 °C в течение 30 минут.
    9. Кратковременно центрифугировать и перенести супернатанты на новые трубки по 1,5 мл. Количественно измеряйте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
    10. Настройте реакцию помечения in vitro , как указано в таблице 1.
    11. Хорошо перемешайте и инкубуйте 30 минут при 37 °C с аккуратным встряхиванием.
    12. Добавьте в каждый образец 10 мМ ЭДТА, 0,1% (с в/в) SDS и 0,1 мг/мл протеиназы K. Хорошо перемешайте с помощью вихря и инкубируете ночью при 37 °C с встряхиванием.
  4. Экстракция ДНК и олигозамещение (3 ч)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции ДНК могут применяться как фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (PCI), так и очистка колонок. Здесь приведены подробные процедуры с использованием очистки колонок.
    1. Добавьте 1,25 мл (5x объём) буфера связывания (в комплекте с набором для очистки ПЦР) к образцам (шаги 2.2.11 и 2.3.12) и хорошо перемешайте, инвертируя несколько раз.
    2. Загрузить смесь в колонки для очистки ДНК (в сборных трубках объемом 2 мл) и центрифугу на 30 секунд при 10 000 × г при RT. Отбросить проток сквозного воздуха.
    3. Добавьте буфер элюции 600 мкл (в комплекте) в колонки и центрифугуйте на 1 минуту при 10 000 × г при RT. Отбросьте проток сквозного фильтра.
    4. Центрифугуйте на максимальной скорости 2 минуты, чтобы полностью удалить оставшийся буфер. Поместите колонки в новые трубки по 1,5 мл с открытыми крышками и высушите на воздухе 1 минуту.
    5. Добавьте 32 мкл ДНКаз-свободногоddH 2O (или 10 мМ Tris·HCl, pH = 8,0) в середину мембраны и дайте ей отдохнуть 1 минуту. Центрифугу на максимальной скорости 2 минуты — и ДНК CUT&Tag уже в растворе.
    6. Добавьте 32 мкл образца ДНК CUT&Tag в новую ПЦР-пробирку, затем добавьте 2 мкл смеси dNTP (по 2,5 мМ каждая), 4 мкл 10x амплигазного буфера и 2 мкл реп-B (10 мкм). Аккуратно постукивайте и смешивайте с помощью пипетки.
    7. Кратко запустите и запустите следующую программу для заменыолиго 23.
      50 °C, 1 минута
      45 °C, 10 мин
      Поднятие до 37 °C, 0,1 °C/с
      37 °C, сдержите
    8. В термоциклере добавьте 1 мкл ДНК-полимеразы T4 и 1 мкл амплигазы в каждую пробирку (конечный объём — 40 мкл/образец). Смешивайте с помощью аккуратной пипетки.
    9. Продолжайте реакцию при 37 °C в термоциклере в течение 30-60 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК может храниться при -20 °C, если сразу после этого этапа (безопасная точка паузы) не переходит к IP BrdU.
  5. Иммунопреципитация BrdU (по сути такая же, как протокол дрожжей) (2 часа)
    1. Перенесите образцы в пробирки с низким уровнем связывания ДНК объёмом 1,5 мл. Прокипятите пробы 5 минут на нагревательном блоке при 100 °C и сразу охладите во льду на 5 минут. Добавьте 15 мкл 10x PBS и + 1,35 мл буфера BrdU IP + 0,5 мкл анти-BrdU Ab + 1 мкл тРНК E.coli (10 мг/мл).
    2. Нутате 2 часа на роторе при 4 °C.
    3. Переместить смесь в пробирку с 20 мкл белковых сефарозных бусинок (промыть три раза с 1 мл буфера BrdU IP, каждую по 3 минуты).
    4. Инкубировать при 4 °C в течение 1 часа.
    5. Отжимайте при 800 × г в течение 1 минуты и промывайте по следующим условиям: три раза с 1 мл холодного BrdU IP-буфера, 3 минуты на роторе; один раз с 1 мл буфера TE на 3 минуты.
    6. Открутите при 800 × г в течение 1 минуты и аспирируйте супернатант.
    7. Добавьте 100 мкл TE + 1% буфера SDS в оставшиеся шарики. Инкубировать при 65 °C в течение 15 минут. Вращайте при 800 × г в течение 1 минуты.
    8. Очистите супернатант в 18 мкл буфера элюции (в комплекте) с использованием колонок для очистки ДНК (образцы BrdU IP и H3K4me3 eSPAN).
  6. Усиление и секвенирование ПЦР (1,5 ч)
    1. Амплифицировать и маркировать образцы одноцепочечной библиотеки ДНК с помощью различных комбинаций индексов. Подготовьте ПЦР-реакцию, добавив следующие компоненты ((очищенная ДНК [ChIP или ESPAN], праймер I5-индексирования [1 мкл], I7-индексирующий праймер [1 мкЛ], NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 мкл],ddH 2O до 20 мкл), смешивание образцов с помощью пипетирования и кратковременное вращение.
    2. Нагрейте ПЦР-смесь при 98 °C в течение 30 секунд, затем 12-14 циклов по 10 с при 98 °C и 20 с при 63 °C, и один цикл по 2 минуты при 72 °C.
    3. Очистить продукты ПЦР с помощью 18 мкл парамагнитных шариков (объём 0,8x) в 20 мкл буфера с низким содержанием ЭДТА.
    4. Измеряйте концентрацию библиотеки и распределение размеров фрагментов с помощью систем высокого разрешения электрофореза.
    5. Объединяйте равное количество отдельных библиотек, включая входные, H3K4me3 ChIP, BrdU IP и eSPAN сэмплы, и выполняйте параллельное парное секвенирование с платформой секвенирования Illumina.

3. Анализ данных eSPAN для дрожжевых клеток (1 день)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс анализа данных применяется только к данным по дрожжам; анализ данных eSPAN для ES клеток можно проследить, как изложено в недавней публикации23.

  1. Извлекать необработанные файлы последовательностей, обрезать последовательности адаптеров инструментами Trim Galore и удалять чтения менее 10 bp, чтобы уменьшить размер выходного файла и избежать сбоев программ выравнивания. Убедитесь, что файлы находятся в форматах file1_1.fq, file1_2.fq для парных чтений:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --длина 10 - парный
  2. Генерируйте индексные файлы бабочки для эталонного генома:
    Bowtie2-build genome.fa
  3. Сопоставьте чтения с соответствующим референсным геномом (геном Saccharomyces (sacCer3) для дрожжей) с помощью Bowtie 2:
    Галстук-бабочка 2 -x геном -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --локальный --без ласточкиного хвоста --без диссонанта --максины 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. Удалите многокарточные чтения с помощью SAMtools и дублирующие чтения с помощью инструментов Sambamba:
    samtools view -BHS - Q 40 input.BAM -o output.BAM
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
  5. Используйте deeptools, чтобы сгенерировать крупные файлы покрытия чтения по нитям Watson и Crick отдельно для каждого сэмпла из чистых bam-файлов:
    bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
    bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand вперёд -bs 1 - extendReads
  6. Вычислите среднее смещение при каждой позиции нуклеосомы25 для каждого образца на основе формулы: log2 считывания вперёд (цепь Уотсона)/обратная (цепь Крика) после эталонного положения нуклеосом былиразделены 25. Скрипты R для этих вычислений доступны на https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Для стандартного расчёта используйте следующие команды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг применяется только к данным по дрожжам; расчёт смещения для ES ячеек можно проследить, как изложено в недавней публикации23.
    Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. При необходимости скорректируйте смещение нити на смещение BrdU:
    Rscript normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --цель target_list --контроль control_list
    ПРИМЕЧАНИЕ: «matrix_files» — это список файлов, сгенерированных cal_bias. Письмо R, разделённое запятыми. например, 'file1', 'file2', 'file3'. «classes_list» — это список примеров классов, соответствующих каждому файлу, разделённому запятыми (например, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). «condition_list» — это список примерных условий, соответствующих каждому файлу и разделённых запятыми. Каждый файл будет парен по классу и условиям для корректировки смещения. «target_list» — это список предметов, взятых из classes_list. Он определит классы, которые будут служить данными для корректировки органами управления (например, 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). «control_list» — это список предметов, взятых из списка предметов. Он определит классы, которые будут действовать как данные, которые будут корректироваться контроллерами. Убедитесь, что длина списка совпадает с длиной target_list (например, 'brdu')
  8. После расчёта и корректировки сгруппируйте выборки и создайте визуализации данных.
    Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g группа 1, группа 2 --интервал=T
    -s требует списка смещённых файлов, сгенерированных вышеуказанными скриптами
    -o — выходной файл
    -g определяет экспериментальные группы для вычисления, то есть биологические реплики для отображения среднего смещения.
    --интервал T или F, для отображения стандартных ошибок на графиках внутри экспериментальных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о происхождении репликации была определена данными BrdU IP. Информация о положении одной нуклеосомы была получена из ранее опубликованной статьи25. Для анализа данных ES клеток мыши информация о происхождении была получена из набораOK-seq 26, и средний расчёт смещения должен следовать протоколу, изложенному в предыдущейработе 23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eSPAN может использоваться для получения специфической для цепочки информации о целевом белке, такой как гистоны и модификации гистонов. В этом репрезентативном результате процессы сбора образцов и eSPAN проводились по схеме, изложенной на рисунке 2, с использованием системы дрожжей с почками. Обработка и сбор образцов следуют состоянию ранней S-фазы, обработанной гидроксимочевиной, согласно этому протоколу. Были использованы два штамма дрожжей — WT (дикий тип) и мутант mcm2-3A. Суб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение белков, связанных с ведущими и отстающими репликационными цепями, важно для понимания механизмов репликации хроматина и связанного с ним процесса, которые напрямую связаны с исследованиями рака у человека и механизмами лекарственной устойчивости. Для изучения репликации ДНК и связанных с ней процессов, таких как зарождающийся хроматиновый захват 29, 30, 31, использовались несколько методов, таких как 2D-гель, иммунопреципитация нативного хроматина (nChIP), iPOND и зарождающийся захватхромати...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) и Фондом стартапов Hormel (C.Y.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 M EDTA, pH 8,0Термо Фишер Сайентифик15575020
1,5 мл низкосвязывающих трубок ДНК Эппендорф22431021
10x амплигазный буферLucigenA1905B
10x PBS Корнинг21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 дюйма. Игла BD PrecisionGlidBD Biosciences305198
ACCEL-NGS 1S ПЛЮС НАБОР БИБЛИОТЕКИ ДНКИнтегрированные ДНК-технологии10009817набор для подготовки библиотеки ДНК с низким уровнем входа;
Agilent 2100 биоанализатор AgilentБиоанализ 2100 года
Agilent DNA 1000 kit Agilent5607-1504
Ampligase LucigenA0110KОбращайтесь с параформальдегидом осторожно, он является воспламеняющимся и опасным.
AMPure XPБекманA63881
Реагент AMPure XP SPRIБекман КоултерA63882
Анти-BrdU антитела BD Biosciences555627
Анти-H3K4me3 антитела  Abcamab8580
Автоматизированный счётчик ячеек, модель TC10BioRad145-0001
Bacitracin Sigma11702
Bacto peptone Термо Фишер Сайентифик211830
Бензамидин гидрохлорид SigmaB2417Горючие твердые вещества
BrdU SigmaB5002Обращайтесь с BrdU осторожно, так как это потенциальный мутаген и тератоген.
BSANew England BiolabsB9000S
CaCl2SigmaC4901
Инкубатор клеточной культуры Thermo Fisher Scientific  Модель Forma серии II с водяной рубашкой CO2 инкубатор3140
Клеточная культурная среда  
Клеточная линия ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– Размер сухой сетки 400
Хлороформ  Sigma366919
Магнитные шарики, покрытые Concanavalin A (ConA), nbsp;Полинауки86057-10
ДигитонинМиллипор300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli  tRNA Sigma10109541001
Этанол Термо Фишер СайентификBP2818100Обращайтесь с этанолом осторожно, он горючий.
глюкозаSigmaG7021
Glycerol SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
Изопропанол Термо Фишер СайентификBP26324Обращайтесь с изопропонолом осторожно, он воспламеняющийся
KAPA HiFi HotStart Ready MixРош7958889001
KClSigmaP9541
KOHSigma221473Обращайтесь с KOH осторожно, он коррозийный
Вакуум на низкой скорости
Магнитная стойка МиллипорLSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal CyclerЭппендорф5331
MgCl2SigmaM8266
Микрококковая нуклеаза  (MNase)УортингтонLS004798
Набор для очистки ПЦР MinElute;Цягэн28006
Мини-бисерМини BeadBeater 24 Disruptor607
Мини-центрифуга Эппендорф5424R
MnCl2Sigma244589
Многоплатформенный шейкерФишербранд02-217-765
Мультиплатформенный шейкер-инкубаторБенчмаркINCU-SHAKER 10L
Мультитермальный тепловой блок  ЭппендорфТермомиксер C
N-[Трис(гидроксиметил)метил]-3-аминопропансульфоновая кислота  (СТУК)SigmaT5130200– Размер сухой сетки 400
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045Обращайтесь с NaOH осторожно, он агрессивен
NEBNext HiFi 2 и раза; PCR мастер-миксNew England BiolabsM0541
NP-40 Игепал CA-630Thermo ScientificJ61055. AP
ПараформальдидSigma158127Обращайтесь с параформальдегидом осторожно, он является воспламеняющимся и опасным.
фермент pA-Tn5 Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Фенол-хлороформ-изоамиловый спирт Инвитроген15593049
Pipette P1000, P200, P20 и P2Эппендорф2231300004
PMSFSigma10837091001
Таблетка с ингибитором протеазыSigmaS8830
Коктейль с ингибиторами протеазы таблетка SigmaS8830
Белок G-сефарозных бусинок  GE Healthcare17-0618-02
Раствор для осаждения белковЦягэн848023
Раствор для осаждения белковЦягэн848023Обращайтесь с KOH осторожно, он коррозийный
Раствор для осаждения белков Цягэн848023
Протеиназа K Sigma311584401
QIAquick ПЦР-очистка, набор и bbsp;Цягэн28106
RNase ASigma10109169001
SDS SigmaL3771
Спектрофотометр Термо Сайентифик.2000/2000c
Спермидин SigmaS2626
T4 DNA PolNew England Biolabs,  M0203
Настольная центрифуга Бекман КоултерAllegra X-5
Tris Sigma11814273001
Triton X-100 SigmaT8787
экстракт дрожжей Термо Фишер Сайентифик212730

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Stillman, B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).
  2. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).
  3. Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. Eukaryotic DNA replication fork. Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).
  4. Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication. Science. 317 (5834), 127-130 (2007).
  5. Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. Division of labor at the eukaryotic replication fork. Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).
  6. Daigaku, Y., et al. A global profile of replicative polymerase usage. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).
  7. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  8. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).
  9. Reijns, M. aM., et al. Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).
  10. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).
  11. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  12. Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication. Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).
  13. Yu, C., et al. Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall. Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).
  14. Gan, H., et al. The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands. Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).
  15. Yu, C., et al. A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).
  16. Petryk, N., et al. Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).
  17. Li, Z., et al. DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).
  18. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  19. Kaya-Okur, H. S., et al. Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).
  20. Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains. Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  21. Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).
  22. Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast. Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).
  23. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells. Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).
  24. Rosebrock, A. P. Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  25. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).
  26. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 10208(2016).
  27. Foltman, M., et al. Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication. Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).
  28. Jia, J., Yu, C. The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance. Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).
  29. Alabert, C., et al. Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components. Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).
  30. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  31. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).
  32. Ramachandran, S., Henikoff, S. Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing. Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).
  33. Petryk, N., et al. Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq. Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).
  34. Zhong, J., et al. Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application. BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).
  35. Li, Z., et al. Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements. Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).
  36. Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance. Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).
  37. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BrdUMNase

Похожие статьи