Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комплексный конвейер для оценки эффективности эритропоэза человека in vitro и ex vivo

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 января 2025 г.

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

В этой статье

Краткое содержание

Моделирование эритропоэза дает ценную возможность понять биологическое значение участников этого процесса и оценить новые терапевтические подходы, которые могут облегчить дефекты дифференцировки. В данной статье мы описываем простой и надежный метод эффективной дифференцировки CD34+ гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток ex vivo.

Аннотация

Эритропоэз, удивительно динамичный и эффективный процесс, ответственный за выработку суточной нормы эритроцитов (примерно 280 ± 20 миллиардов клеток в день), имеет решающее значение для поддержания здоровья человека. Любой сбой в этом пути может иметь серьезные последствия, ведущие к проблемам со здоровьем. По данным Всемирной организации здравоохранения, примерно у 25% населения мира наблюдаются симптомы анемии. В этом протоколе описывается, как получить эритроидные клетки человека как in vitro, так и с использованием гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГСК) из таких источников, как пуповинная кровь (УСК) или кровь, взятая у здоровых доноров, и ex vivo с помощью ГСК, выделенных из костного мозга пациентов. Используя генетический подход, гены, представляющие интерес, могут модулироваться в ГСК, а их влияние на эритропоэз можно контролировать на различных стадиях процесса дифференцировки. Этот метод позволяет проводить скрининг соединений, возмущающих, усиливающих или восстанавливающих способность HSPC дифференцироваться в зрелые эритроидные клетки, и исследовать роль генов, представляющих интерес, в процессе дифференцировки эритроидов.

Введение

Каждый день в костном мозге вырабатывается около 280 миллиардов эритроцитов (эритроцитов), обеспечивающих транспортировку кислорода повсему организму. Эритропоэз — это тонко настроенный процесс дифференцировки, при котором из гемопоэтических стволовых клеток образуются зрелые, функциональные эритроциты. На этот процесс могут влиять многие заболевания, как приобретенные, так и врожденные, в том числе миелодиспластический синдром, апластическая анемия, талассемия и врожденная дизэритропоэтическая анемия2.

Клиническим проявлением нарушенного эритропоэза является анемия, которая является основной причиной заболеваемости во всем мире. Симптомы анемии варьируются от усталости, одышки и головокружения до опасных для жизни состояний, таких как сердечная недостаточность и остановка сердца3. Поскольку анемия поражает 1,8 миллиардачеловек во всем мире4, моделирование эритропоэза ex vivo для изучения этих состояний и лежащих в их основе механизмов остается глобальным приоритетом. Описанный здесь метод направлен на создание простой и надежной модели для изучения дифференцировки эритроидов как здоровых, так и больных. Эта модель позволяет анализировать роли конкретных генов в этом процессе и позволяет тестировать соединения, которые могут принести пользу пациентам с анемией. Исторически сложилось так, что моделирование неэффективного эритропоэза было сопряжено со многими проблемами, включая нехватку стволовых клеток в некоторых больных костном мозге и трудности с имитацией ниши костного мозга.

В предыдущих исследованиях использовались аналогичные или более сложные протоколы; например, Bondu et al. использовали коктейль цитокинов, включающий эритропоэтин (EPO), фактор стволовых клеток (SCF) и интерлейкин-6 (IL6) в течение 4 дней перед удалением IL6 из коктейля дифференцировки эритроидов, в отличие от Yip et al. только добавляли EPO в свой коктейль цитокинов после 7 дней жидкой культуры. Elvarsdóttir et al. разработали трехмерную (3D) культуральную модель для CD34+ клеток, чтобы способствовать наибольшему расширению и созреванию эритроидных клеток, включая генерацию эритробластических островов и энуклеированных эритроцитов, которые важны для изучения таких явлений, как кольцевые сидеропласты 5,6,7,8. В этом протоколе при расширении клеток используются только три цитокина (т.е. SCF, тромбопоэтин [TPO] и FMS-подобная тирозинкиназа 3 [FLT3]) и три цитокина, поддерживаемые на протяжении всего процесса дифференцировки (т.е. EPO, IGF1 и SCF). Одним из ключевых критериев, общих для этих различных исследований, является использование CD34+ клеток. Хотя происхождение этих клеток различно, они последовательно используются в этих различных протоколах. Источники могут варьироваться от неинвазивного сбора UCB до более инвазивных процедур для получения образцов костного мозга взрослого человека, которые могут быть собраны либо у мобилизованных пациентов с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF), либо с помощью пункций костного мозга. Как правило, модели жидких культур переносятся в течение 14 дней, в то время как 3D-модели могут поддерживать клетки в течение более длительных периодов времени. Эти протоколы необходимы для моделирования генетических заболеваний и нарушений эритропоэза. Генетические подходы, такие как нокдауны короткой шпильки РНК (шРНК), могут быть использованы для подавления интересующих генов и изучения их роли в эритропоэзе. Влияние сайленсинга генов можно затем отслеживать на различных стадиях дифференцировки, предоставляя ex vivo человеческую модель производства эритроцитов для изучения анемии как в здоровье, так и при болезни. Этот протокол включает в себя трансдукцию CD34+ клеток пуповинной крови с помощью шРНК, которая конститутивно экспрессирует репортерный ген, такой как усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), что позволяет сортировать образцы с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). Затем клетки инкубируют в дифференцировочных средах в течение 2 недель и контролируют с помощью анализа проточной цитометрии и иммунохимического окрашивания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования первичных образцов проводились в соответствии с институциональными рекомендациями (REC No 21/EE/0133; ID проекта IRAS: 283103).

1. Производство лентивирусов

Примечание: Лентивирусы должны быть произведены в лаборатории с уровнем биобезопасности L2 в стерильных условиях. Необходимо носить все необходимые СИЗ для этой лаборатории, включая двойные перчатки. Загрязненный материал обеззараживается вироцидным дезинфицирующим средством перед утилизацией в автоклавном контейнере. Здесь для иллюстрации процесса используется скрембл (контроль) shRNA, содержащий репортерный ген EGFP.

День 1

  1. Подогрейте желатин при температуре 37 °C на водяной бане до полного растворения. Разведите желатин в концентрации 0,1% в фосфатно-солевом буфере (PBS).
  2. Смажьте чашку диаметром 150 мм 2 мл 0,1% желатина. Используйте 2 посуды на вирус. Выдерживайте посуду в течение 30 минут при 37 °C.
  3. Засейте 5 миллионов HEK293T клеток в чашку, покрытую желатиновой оболочкой, в 20 мл 10% модифицированной среды Dulbecco's Modified Eagle′s Medium (DMEM) и поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C.

День 2

  1. Убедитесь, что слияние клеток достигло примерно 50%. Смените среду 22 мл 10% DMEM, не нарушая клеточный слой, за 2 ч до трансфекции.
  2. Приготовьте трансфекционную смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На одну чашку готовится одна смесь для трансфекции, так как больший объем может повлиять на образование осадка кальций-фосфата.
    1. Приготовьте реакционную смесь в центрифужной пробирке объемом 15 мл следующим образом: 32 мкг плазмида, 20 мкг плазмиды PAX (pCMVdR8.74), 9 мкг плазмида VSVG (pMD.G2) и доведите объем до 1125 мкл с помощью H2O.
    2. Добавьте 125 μL CaCl2 в реакцию и инкубируйте 5 минут при комнатной температуре (RT) на ролике.
    3. Приготовьте 1,25 мл 2x HEPES в отдельной центрифужной пробирке объемом 15 мл.
    4. Добавьте 2x HEPES по капле в реакционную смесь, осторожно вортексируя, затем поместите смесь на валик на 10 минут при RT.
  3. По капле нанесите реакцию на клетки по спирали и поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C после осторожного перемещения планшета крестообразным образом, чтобы гомогенизировать среду.

День 3

  1. Замените среду 16 мл 10% DMEM, не нарушая клеточный слой.

День 4

  1. Соберите надосадочную жидкость и храните ее при температуре 4 °C в течение ночи. Добавьте по 16 мл свежего DMEM в каждую пластину, не нарушая клеточный слой.

День 5

  1. Соберите надосадочную жидкость и бассейн с надосадочной жидкостью с 4 дня. Фильтр для удаления мусора с помощью фильтра 0,45 мкМ.
  2. Перенесите каждую 30 мл (день 4 + день 5) надосадочную жидкость в коническую пробирку для ультрацентрифугирования. Добавьте трубки в качающееся ведро, при необходимости с адаптерами для конического дна.
  3. Отбалансируйте пробирки лицом к лицу с точностью 0,02 g и ультрацентрифугу при 90 000 x g в течение 2 часов при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 200 мкл среды стволовых клеток в пробирку. Закройте пробирки парапленкой и выдержите пробирку в холодном помещении в течение 2-4 ч при перемешивании.
  5. Внесите по 20 мкл аликвоты каждого вируса и храните флаконы при температуре -80 °C. Оставьте по 2 мкл каждого вируса и добавьте 400 мкл DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это разбавление будет использоваться для титрования.

2. Титрование лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: С лентивирусами необходимо обращаться в лаборатории с уровнем биобезопасности L2 в стерильных условиях. Необходимо носить все необходимые СИЗ для этой лаборатории, включая двойные перчатки. Загрязненный материал обеззараживается вироцидным дезинфицирующим средством перед утилизацией в автоклавном контейнере.

  1. Семена HEK293T в 24-луночную тарелку. Добавьте 50 000 ячеек/лунку в 500 μл 10% DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 6 лунок для каждого вируса и оставьте одну лунку для нетрансдуцированных клеток.
  2. Выполните трансдукцию. Добавьте в разные лунки: 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 16 мкл, 32 мкл и 64 мкл разбавленного вируса из шага 1.13. Аккуратно гомогенизируйте.
  3. Смените среду через 24 часа, добавив 500 мкл 10% DMEM.
  4. На 4-й день после трансдукции подготовьте клетки к проточной цитометрии.
    1. Приготовьте буфер FACS с PBS, 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллин-стрептомицином (P/S), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и 1/2 000 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI).
    2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 500 мкл буфера FACS непосредственно с ЭДТА в каждую лунку.
    3. Отделите клетки с помощью пипетирования вверх и вниз.
  5. Отфильтруйте элементы через сетчатый фильтр 40 мкм и перенесите их в пробирки FACS.
  6. Определяют процентное содержание клеток EGFP с помощью проточной цитометрии.
  7. Настройте следующие ворота:
    1. Настройте зависимость DAPI от бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить мертвые ячейки.
    2. Настройте высоту SSC (SSC-H) в зависимости от области SSC (SSC-A), чтобы исключить агрегаты ячеек и выбрать отдельные ячейки.
    3. Установите область прямого рассеяния (FSC-A) в сравнении с SSC-A для затвора ячеек и удаления мусора в зависимости от размера.
    4. Настройте зеленый флуоресцентный белок (GFP) в сравнении с SSC-A для выбора клеток GFP+ .
  8. Титровать вирус.
    1. Рассчитайте концентрацию частиц (количество частиц/мл) для каждого условия:
    2. Клетки EGFP x Фактор разбавления вируса (200) x Количество засеянных клеток x1000) / объем вируса.
      Примечание: Например, клетки обрабатывали 64 мкл вируса, разведенного в дозе 1/200. После анализа проточной цитометрии 54% клеток были EGFP+. В этих условиях титр будет равен (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 частиц/мл.

3. Трансдуцирование CD34+ клеток, выделенных из пуповинной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть выполняется в стерильных условиях. Здесь CD34+ UCB-клетки (чистота >85%) трансдуцируются одной шРНК (контроль), содержащей репортер eGFP. Эксперимент проводится с использованием трех технических повторов. Пропорция должна быть скорректирована в соответствии с количеством образцов.

День 1

  1. Подготовьте следующие среды и буфер:
    1. Приготовьте среду для размораживания: FBS с добавлением 1% P/S и 10 мкг/мл ДНКазы
    2. Приготовьте буфер FACS: PBS с добавлением 1% P/S и 2% FBS (± 10 мкг/мл ДНКазы)
    3. Приготовьте среду для стимуляции (в среде стволовых клеток) с добавлением 150 нг/мл SCF, 150 нг/мл FLT-3, 10 нг/мл IL-6, 25 нг/мл G-CSF, 20 нг/мл TPO и 1% HEPES.
  2. Разморозьте 100 000 клеток CD34+ UCB, погрузив на 30 с водяную баню при температуре 37 °C. Добавьте по 1 мл среды для размораживания по капле в каждый флакон, а затем аккуратно восстановите суспендию, пипетируя вверх и вниз.
  3. Переложите клеточную суспензию по капле в общей сложности 5 мл размораживающей среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери клеток, отложите в сторону аликвоту 2 мл размораживающей среды, которая будет использоваться в конце для мытья наконечника и флакона.
  4. Центрифугировать в течение 8 мин при 320 x g при RT. Промыть клетки в 10 мл буфера FACS + ДНКазы.
  5. Центрифугировать в течение 8 мин при 320 x g при RT. Ресуспендировать клеточную гранулу в 2 мл среды для стимуляции (промывочный наконечник и пробирка со средой для стимуляции).
  6. Подсчитайте клетки, используя 5 μL клеточной суспензии и 5 μL трипанового синего.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к минимальному количеству 75 000 ячеек (25 000 клеток/состояние).
  7. Перелейте 2 мл клеточной суспензии в 24-луночный планшет и инкубируйте в течение ≥4-6 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе все ячейки (75 000-100 000) засеваются в одну лунку.
  8. Соберите клетки в пробирки FACS и долейте 1 мл среды для стволовых клеток. Центрифуга в течение 8 мин при 320 x g при RT.
  9. Разморозьте вирус и добавьте необходимый объем в среду для стимуляции при кратности инфекции (MOI) 30.
  10. Ресуспендируйте гранулированные клетки в вируссодержащей среде из расчета 100 000 клеток на 100 мкл вируса в 1 лунку 96-луночного планшета. Добавьте PBS в пустые лунки и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.

День 2

  1. Приготовьте расширяющую среду (в среде стволовых клеток) с добавлением 150 нг/мл SCF, 150 нг/мл FLT3-L и 20 нг/мл TPO.
  2. Добавьте полный объем клеточной суспензии из 96-луночной лунки планшета в пробирки FACS с 1 мл среды стволовых клеток. Промойте лунку и наконечник средой для стволовых клеток, в результате чего добавьте 2 мл среды стволовых клеток к клеточной суспензии в пробирке FACS.
  3. Центрифуга в течение 8 мин при 320 x g при RT.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 2 мл расширяющей среды. Добавьте клеточную суспензию в лунку на 24 лунки (промойте лунку и опрокиньте в процессе, чтобы получить в общей сложности 2 мл). Инкубируйте клетки в течение 4 дней при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сортировка клеток выполняется на 7-й день.

4. CD34+ EGFP+ Сортировка клеток и дифференцировка эритроидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть выполняется в стерильных условиях.

  1. Подготовьте следующие среды и буфер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среды с цитокинами должны быть приготовлены в свежем виде:
    1. Подготовьте буфер FACS, дополнив PBS 1% P/S и 2% FBS.
    2. Приготовьте расширительную среду (в среде стволовых клеток) с добавлением 150 нг/мл SCF, 150 нг/мл FLT3-L и 20 нг/мл TPO.
    3. Готовят среду для дифференцировки эритроцитов (в среде стволовых клеток) путем добавления 25 нг/мл SCF, 3 Ед/мл EPO и 50 нг/мл IGF1.
    4. Приготовьте 2x среды для дифференцировки эритроцитов (в среде стволовых клеток), добавив 50 нг/мл SCF, 6 ЕД/мл ЭПО и 100 нг/мл ИФР1.
  2. Добавьте полный объем клеток в отдельную пробирку FACS (промойте лунку и наконечник в процессе со средой для стволовых клеток). Центрифугируйте в течение 8 мин при 320 x g при RT. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 100 мкл буфера FACS.
  3. Добавьте 5 μL CD34 Ab/пробирку и инкубируйте в темноте при 4 °C в течение 20 минут.
  4. Ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS) и центрифугируйте в течение 8 мин при 320 x g при RT.
  5. Ресуспендируйте элементы в 200 мкл буфера FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS) и отфильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкМ перед сортировкой.
  6. Подготовьте бусины для контроля:
    1. Добавьте 0,5 мкл антитела CD34 (Ab) к 1 капле гранул в 100 мкл PBS и инкубируйте в темноте при 4 °C в течение 20 мин.
    2. Добавьте 1 мл PBS. Центрифугировать в течение 8 мин при 320 x g при RT. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 500 мкл PBS.
  7. Подготовьте лейкозные клеточные линии для контроля GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте любую доступную линию ячеек GFP+ в качестве контроля; Вместо него можно использовать бусины.
    1. Добавьте в трубку FACS элементы GFP (2 трубки FACS на 100 000 ячеек) и GFP+ (1 трубка FACS на 100 000 ячеек).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всего 3 трубки.
    2. Промойте ячейки в 1 мл буфера FACS. Центрифуга в течение 8 мин при 320 x g при RT.
    3. Ресуспендируйте 100 000 GFP-элементов в 500 мкл буфера FACS (неокрашенный), 100 000 GFP-элементов в 500 мкл буфера FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS) (окрашенный DAPI) и 100 000 элементов GFP+ в 500 мкл буфера FACS (элементы GFP+).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные трубки будут использоваться для настройки стробирования и компенсации на проточном цитометре. Если используемые элементы на 100% состоят из GFP, в трубку можно добавить GFP-элементы (50 000 GFP-элементов и 50 000 GFP+ элементов).
    4. Перед сортировкой профильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкм.
  8. Настройте следующие ворота:
    1. Настройте зависимость DAPI от бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить мертвые ячейки.
    2. Настройте параметр Высота SSC в зависимости от площади SSC (SSC-A), чтобы исключить агрегаты ячеек и выбрать отдельные ячейки.
    3. Настройте область прямого рассеяния (FSC-A) в сравнении с SSC-A для удаления мусора в зависимости от размера.
    4. Настройте GFP в сравнении с SSC-A, чтобы выбрать ячейки GFP+ .
    5. Настройте CD34 (PerCP-Cy5.5) и SSC-A для выбора клеток CD34+ .
  9. Переверните трубку FACS для сбора перед сбором клеток, чтобы покрыть стенки трубки FBS.
  10. Соберите клетки в среду стволовых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к 75 000-80 000 ячеек (25 000 ячеек x 3)
  11. Центрифугировать в течение 8 мин при 320 x g при ОТ и ресуспендировать клетки в 3 мл эритроидной дифференцировочной среды.
  12. Повторно суспензировать, а затем дозировать 1 мл на лунку в 3 лунки 24-луночного планшета. Заполните все внешние колодцы PBS.
  13. Выполняйте половинное истощение среды через день и заменяйте ее 2-кратной средой для дифференцировки эритроцитов.
    1. Чтобы освежить среду, убедитесь, что ячейки расположены в нижней части пластины. Аккуратно наклоните пластину и выньте 500 μл среды.
    2. Обновите, добавив 500 мкл с 2-кратной средой для дифференцировки цитокинов эритроидов.
    3. Перенесите клетки на 6-й день в 12-луночный планшет и добавьте 1 мл среды, чтобы получить окончательный объем 2 мл.

5. Анализ дифференцировки эритроидов методом проточной цитометрии два раза в неделю с 6 по 14 день

  1. Подготовьте следующие среды и буфер.
    1. Подготовка буфера FACS путем дополнения PBS 1% P/S и 2% FBS
    2. Готовят среду для дифференцировки эритроцитов (в среде стволовых клеток) путем добавления 25 нг/мл SCF, 3 Ед/мл EPO и 50 нг/мл IGF1.
  2. Соберите по 200 мкл клеток из каждой лунки 12-луночного планшета и замените их 250 мкл 2-кратной среды для дифференцировки эритроидов. Добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку.
  3. Центрифугируйте в течение 8 мин при 320 x g при RT. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 100 мкл буфера FACS.
  4. Добавьте 1 мкл CD71 Ab (1/100), 1 мкл CD34 Ab (1/100) и 1 мкл CD235a Ab (1/100) и инкубируйте в темноте при 4 °C в течение 20 минут.
  5. Ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS). Центрифуга в течение 8 мин при 320 x g при RT.
  6. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS).
  7. Подготовьте бусины для контроля:
    1. Добавьте 1 капельную компенсационную бусину в две пробирки в 100 мкл PBS, а затем добавьте 0,55 мкл одного антитела в каждую пробирку, чтобы получить контроль одного окрашивания (один для CD34, один для CD71 и один для CD235a).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 капли достаточно для обоих органов управления.
    2. Выдерживать в темноте при температуре 4 °C в течение 20 минут. Добавьте 1 мл PBS.
    3. Центрифугировать в течение 8 мин при 320 x g при RT. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 500 мкл PBS.
  8. Подготовьте лейкемическую клеточную линию для контроля.
    Примечание: Клетки K562 экспрессируют маркер CD71 и могут быть использованы в качестве положительного контроля для настройки FACS.
    1. Добавьте в трубку FACS элементы GFP (2 трубки FACS на 100 000 ячеек) и GFP+ (1 трубка FACS на 100 000 ячеек).
    2. Промойте ячейки в 1 мл буфера FACS. Центрифуга в течение 8 мин при 320 x g при RT.
    3. Ресуспендируйте 100 000 GFP-клеток в буфере FACS (неокрашенные), 100 000 GFP-клеток в буфере FACS с DAPI (разведение 1/2000 в буфере FACS) (окрашенные DAPI) и 100 000 GFP+ клеток в буфере FACS (GFP+ клетки).
  9. Настройте следующие ворота:
    1. Настройте зависимость DAPI от бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить мертвые ячейки.
    2. Настройте параметр Высота SSC в зависимости от площади SSC (SSC-A), чтобы исключить агрегаты ячеек и выбрать отдельные ячейки.
    3. Настройте область прямого рассеяния (FSC-A) в сравнении с SSC-A для удаления мусора в зависимости от размера.
    4. Настройте CD235a (APC-Cy7) против CD71 (PE).
    5. Настройте CD34 (PerCP-Cy5.5) против SSC-A.
  10. Запустите образец неокрашенных GFP-элементов и полностью окрашенных элементов, чтобы отрегулировать напряжение так, чтобы элементы сидели на правильном месте.
  11. Запустите бусины, ячейки GFP+ и ячейки, окрашенные DAPI. Компенсируйте и применяйте компенсацию к настройкам цитометра.
  12. Запустите образцы и запишите события.

6. Анализ дифференцировки эритроидов методом окрашивания по Гимзе

  1. Подготовьте 5 баночек для окрашивания:
    1. Приготовьте банку для окрашивания слайдами с бульоном эозин-метиленового синего 1:1 от May-Grünwald и PBS.
    2. Приготовьте банку для окрашивания предметными стеклами с 2,5 мл бульона Giemsa + 50 мл PBS.
    3. Подготовьте горку для окрашивания банки дистиллированной водой.
    4. Подготовьте банку для окрашивания горкой с PBS.
    5. Подготовьте горку для окрашивания банки холодным метанолом со льдом.
  2. Соберите 100 000 клеток для оптимального окрашивания, добавьте 1 мл PBS и центрифугируйте 300 x g в течение 5 минут.
  3. Выбросьте среду и повторно суспендируйте в 150 мкл PBS.
  4. Подготовьте предметные стекла, фильтровальную бумагу и конический адаптер в цитоцентрифугу и медленно опустите клеточный препарат в конический адаптер.
  5. Вращайте при 800 x g в течение 3 минут. Снимите предметные стекла и поместите их в банку с метанолом в лед на 15 минут.
  6. Погрузите предметные стекла в раствор May-Grünwald на 5 минут и периодически помешивайте, чтобы обеспечить правильное окрашивание.
  7. Затем погрузите предметные стекла в банку PBS до тех пор, пока не стечет пятно.
  8. Погрузите предметные стекла в раствор Giemsa на 20 минут и время от времени помешивайте, чтобы обеспечить правильное окрашивание.
  9. Осторожно погружайте горки в PBS до тех пор, пока не сойдет пятно.
  10. Оставьте слайды в PBS еще на 3 минуты.
  11. Быстро погрузите предметные стекла в дистиллированную воду и высушите на воздухе при RT.
  12. Добавьте каплю синтетической смолы на каждое пятно клеток и аккуратно добавьте сверху покровную крышку.
  13. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 1 часа при RT и заклейте покровное стекло лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CD34+ клетки из пуповинной крови или костного мозга сначала размораживают, стимулируют и трансдуцируют с помощью гфп-экспрессирующей шРНК (рис. 1А). Клетки CD34+GFP+ сортируются через 4 дня после трансдукции в соответствии со стратегией стробирования, показанной на рисунке 1B. Репрезентативные результаты показали созревание CD34+ клеток после трансдукции и сортировки FACS. Клетки анализируют (1) методом проточной цитом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе мы описали эффективный и надежный метод индуцирования эритроидной дифференцировки CD34+ гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), выделенных либо из костного мозга взрослого человека (КМ), либо из пуповинной крови (УКП). Этот конвейер включает в себя редактирование/модификацию первичных клеток для исследования функции любого гена, представляющего интерес, в процессе дифференцировки эритроидов. Этот метод был успешно использован для исследования функциональной зна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

К.., С.Б. и К.Р. были поддержаны программой HARP, благотворительной организацией Barts Charity (G-002167), фондом Кей Кендалл по борьбе с лейкемией (KKL1149) и Академией медицинских наук (SBF004\1099). Мы благодарим доктора Пантелицу Протопапу за получение материала для окрашивания и микроскопии MGG. Мы также отмечаем возможности проточной цитометрии и микроскопии Института рака им. Бартса Лондонского университета королевы Марии. Мы благодарим британскую благотворительную организацию Энтони Нолана за предоставление нам единиц пуповинной крови, использованных в этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2x HEPESMerck 51558
БусиныThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 антителоBD Biosciences347222
CD71 PE антителоBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
Монтажная среда DPX VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
ЖелатинMerckG1393
Раствор ГимзыAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Человеческий EPOPeproTech100-64
Человеческий Flt-3 лигандPeproTech300-19
Человек G-CSFPeproTech300-23
Человек IGF1PeproTech100-11
Человек IL-6PeproTech200-06
Человек SCFPeproTech300-07
Человек TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Клеточный анализаторBD BiosciencesNA
May-Grunwald Решение Generon26250-01
Pannoramic 250 Высокопроизводительный сканер 3DHISTECHNA
Пенициллин/СтрептомицинThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Stem Cell Medium Medium Medium StemCell Technologies9655

Ссылки

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эритроидная дифференцировкагемопоэтические стволовые клеткиэритропоэз ex vivoэритропоэз in vitroпроточная цитометрияантитела к CD34эритроидный рядсреда для эритроидной дифференцировкиокрашивание аннексином V
Комплексный конвейер для оценки эффективности эритропоэза человека in vitro и ex vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.