Бергмейеровское количественное определение уровня глюкозы в микробиологических образцах

Summary

Количественная оценка глюкозы по Бергмейеру — это спектрофотометрический ферментативный метод, в основном используемый для клинических испытаний, которые точно и чувствительно измеряют количество глюкозы. В данной работе мы представляем протокол использования данного метода для микробиологических образцов.

Abstract

Концентрация глюкозы является ключевым показателем клеточного метаболизма и может указывать на общую скорость метаболизма, отклонение в метаболизме глюкозы и, в некоторых случаях, на то, как клетки связывают метаболизм глюкозы с энергетическим метаболизмом. Кроме того, внутриклеточный и внеклеточный уровень глюкозы свидетельствует о клеточном метаболическом статусе. Ферментативные методы, такие как количественная оценка глюкозы по Бергмейеру, являются более точными и чувствительными, чем другие методы, такие как динитрозалициловая кислота или флуоресцентные методы, которые обычно используются в микробиологии. Несмотря на то, что количественное определение глюкозы по Бергмейеру используется в основном в клинической области, оно также может быть применено к любой клетке, но не было подробно описано для бактерий, грибков, дрожжей или других микроорганизмов.

В данной работе мы представляем методологию количественного определения глюкозы из образцов бактерий и дрожжей с использованием ферментативного метода количественного определения глюкозы по методу Бергмейера. В процедуре участвовали ферменты глюкозооксидаза, пероксидаза и о-дианисидина дигидрохлорид, инкубированные при 37 °C в течение 20 мин с последующим добавлением серной кислоты. Затем поглощающая способность измеряется на длине волны 545 нм. Важно подчеркнуть, что, хотя этот метод сопряжен с трудностями при измерении высоких концентраций глюкозы (выше 60 г/л), можно измерить концентрации ниже 50 г/л с помощью коэффициентов разбавления. Этот ферментативный подход ценен для исследований и анализа в микробиологии и других научных областях. Точность и чувствительность метода делают его полезным для обнаружения даже низких концентраций глюкозы в микробиологических образцах.

Introduction

Глюкоза служит основным источником энергии и углерода для многих микроорганизмов, включая бактерии, дрожжи и грибки. Эти микроорганизмы поглощают глюкозу через транспортеры, расположенные на внеклеточной мембране, где она претерпевает ряд биохимических реакций в метаболическом пути гликолиза и превращается в пируват¹. Существуют различные методы количественного определения редуцирующих сахаров, таких как глюкоза. Например, можно использовать реактив^{Бенедикта 2}, использование 3,5-динитрозалициловой кислоты (ДНС)^3,4, метод антрона⁵ или методы фенол-серной кислоты⁶. Тем не менее, эти методы обнаруживают любой редуцирующий сахар, присутствующий в образце, такой как фруктоза и мальтоза, которые могут вносить свой вклад в сигнал и затруднять точное количественное определение конкретного сахара.

Кроме того, они требуют строгого контроля температуры и работы с опасными веществами, что может усложнить процесс и повлиять на точность. Эти методы также могут подвергаться воздействию других соединений, присутствующих в образце, что затрудняет точное количественное определение уровня глюкозы. С другой стороны, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) предлагает более точную альтернативу, позволяющую различать глюкозу и другие редуцирующие сахара, хотя и с более высокими эксплуатационными расходами. Эти контрастные методы подчеркивают постоянную потребность в разработке точных и экономически эффективных методов количественного определения уровня глюкозы⁷.

В методе глюкозооксидаза-пероксидаза-серная кислота (GOX-H₂SO₄) используются два фермента: глюкозооксидаза (GOD) и пероксидаза (POD). GOD — это фермент оксидоредуктазы, который очень селективен в отношении окисления β-D-глюкозы⁸. Этот комплекс действует как катализатор во время реакции, которая происходит, когда глюкоза находится в присутствии кислорода, образуя глюконовую кислоту и перекись водорода (H₂O₂). H₂O₂ обнаруживается с помощью хромогенного акцептора кислорода, о-дианисидина, который при взаимодействии с POD вызывает его окисление и высвобождение H₂O₂, препятствуя превращению глюконовой кислоты обратно в глюкозу (см. рис. 1). Полученный цвет стабилизируют добавлением серной кислоты (_Н2SO₄), которая также останавливает ферментативную реакцию, избегая таким образом возможных помех, которые могли бы возникнуть при продолжении реакции⁹.

Рисунок 1: Обзор метода количественного определения глюкозы с использованием фермента глюкозооксидазы, который реагирует с глюкозой с образованием перекиси водорода (H₂O₂) и глюконовой кислоты. В последующем фермент пероксидаза вступает в реакцию_{с Н2}О₂ в присутствии О-дианисидина дигидрохлорида. На заключительном этапе добавляется серная кислота (H₂SO₄), чтобы остановить ферментативную реакцию, в результате чего розовый цвет измеряется при 529 нм. Сокращения: POD = пероксидаза; GOD = глюкозооксидаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Ферментативный метод GOX-H₂SO₄ – это методика, широко используемая для измерения концентрации глюкозы в биологических образцах, большинство из которых представляют клинический интерес. Тем не менее, в немногих исследованиях изучался метод, позволяющий количественно оценить количество глюкозы в питательной среде для оценки ее потребления. Таким образом, в настоящем протоколе представлена методика количественного определения глюкозы с помощью ферментативной реакции глюкозооксидазы, пероксидазы, о-дианисидина дигидрохлорида и_Н2SO₄ в образцах микробиологических жидкостей, которая возникает как модификация работы, выполненной Бергмейером⁹ путем использования 50% (v/v) H₂SO₄ и более низких количеств реагентов.

Protocol

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте 100 мл 0,1 М фосфатного буфера. Взвесьте 1,28 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 0,1304 г дикалийфосфата (K₂HPO₄) и добавьте их в стеклянный стакан. Теперь добавьте 70 мл деионизированной воды (H₂Odi) и отрегулируйте pH до 5,5 с помощью 1 М соляной кислоты (HCl) или гидроксида калия (KOH). Перелейте раствор в мерную колбу и отрегулируйте итоговый объем до 100 мл. Затем перелейте раствор в янтарную емкость и храните раствор при температуре 4-8 °C до 3 месяцев.
   ВНИМАНИЕ: Надевайте нитриловые перчатки на протяжении всего процесса подготовки, чтобы предотвратить контакт с кожей и потенциальное загрязнение, так как о-дианисидина дигидрохлорид потенциально канцерогенен.
2. Приготовьте 1% w/v раствор o-дианисидина дигидрохлорида. Взвесьте 0,01 г о-дианисидина дигидрохлорида и поместите его в центрифужную пробирку объемом 2,0 мл. С помощью микропипетки объемом 1000 мл добавьте 1,0 мл H₂Odi для растворения соединения, затем медленно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Защитите раствор от света, обернув контейнер алюминиевой фольгой, и храните его при температуре -20 °C для сохранения устойчивости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения поддержки трубки во время измерения на аналитических весах в качестве дополнительной опоры можно использовать стакан объемом 10 мл. Это помогает стабилизировать трубку, обеспечивая точность измерений и сводя к минимуму риск смещения или наклона, которые могут повлиять на результаты, полученные на весах.
3. В объемную колбу объемом 100 мл добавьте 10 мл фосфатного буферного раствора, а затем 1 мл 1% v/v раствора о-дианисидина дигидрохлорида. Затем отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью фосфатного буфера, чтобы получить конечную концентрацию 0,01% смеси о-дианисидина и буфера. Перелейте раствор в янтарную колбу и оберните ее алюминиевой фольгой, чтобы защитить от света. Хранить раствор при температуре 4-8 °C до 3-4 месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждение необходимо для предотвращения разложения, которое может нарушить достоверность экспериментальных измерений. Чтобы избежать деградации о-дианисидиново-буферной смеси, небольшую порцию 13 мл (достаточно для 12 образцов) можно поместить в пластиковую пробирку объемом 14 мл на льду до использования.
4. Приготовьте 50% раствор H₂SO₄ . Поместите мерную колбу объемом 100 мл с 30 мл H₂Odi в ледяную баню и дайте ей остыть в течение 10 минут. Затем медленно влейте 51 мл H₂SO₄ (98% v/v) вниз по стенкам колбы, осторожно встряхивая для гомогенизации раствора. Подождите, пока смесь остынет, так как реакция является экзотермической (выделяет тепло). Отрегулируйте итоговый объем до 100 мл с помощью H₂Odi и переложите раствор в стеклянную янтарную колбу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вытяжной шкаф и соблюдайте все протоколы безопасности, обязательно надевайте соответствующие средства защиты. Приготовьте 50 мл 40% раствора карбоната кальция, чтобы нейтрализовать любые возможные разливы, которые могут произойти.
5. Приготовьте 50 мМ раствора ацетата натрия, растворив 0,04 г ацетата натрия в 5 мл H₂Odi в стакане. Отрегулируйте pH до 5,1 с помощью ледяной уксусной кислоты. Наконец, отрегулируйте объем до 10 мл с помощью H₂Odi.

2. Приготовление ферментов

1. В стерильной микропробирке объемом 2,0 мл смассировать 0,01 г глюкозооксидазы и смешать с 1 мл 50 мМ ацетата натрия, pH 5,0, до получения конечной концентрации 10 мг/мл. Накройте тубу алюминиевой фольгой и храните при температуре -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить до 2 месяцев при температуре -20 °C.
2. Рассчитайте объем раствора фермента V₂ , необходимый для достижения желаемой активности фермента в каждой пластиковой кювете (общим объемом 1,5 мл) с помощью уравнения (1): V₁C₁ = V₂C₂, где V₁ составляет 1 500 μл, C₁ — 28,5 ед активности фермента, а C₂ (концентрация ферментного раствора) — 12 970 ед/мл (10 мг фермента [129 000 ед/г] в 1 мл из H₂Odi).
   V₂ = (1 500 мкл × 28,5 ед)/12 970 Ед = 3,29 мкл (1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более точного пипетирования значение можно округлить до 3,3 мкл.
3. В новую микропробирку объемом 2 мл внесите 0,0031 г фермента пероксидазы и добавьте 1 мл фосфатного буфера, pH 5,5, чтобы достичь конечной концентрации 3,1 мг/мл. Накройте микропробирку алюминиевой фольгой и храните при температуре -20 °C.
4. Рассчитайте объем раствора пероксидазы, необходимый для достижения желаемой активности фермента на одну кювету, с помощью уравнения (1). Начните с общего объема кюветы 1 500 мкл и целевой активности фермента 1,25 ЕД. Затем определите необходимый объем ферментного раствора, учитывая его концентрацию 1551 ЕД.
   V₂ = (1 500 мкл × 1,25 U)/1 551 U = 1,208 мкл
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более точного пипетирования значение округляли до 1,20 мкл.

3. Стандарт глюкозы

1. Приготовьте стандартную D-глюкозу в концентрации 1 г/л, добавив 0,01 г D-глюкозы к 10 мл H₂Odi в мерной колбе. Чтобы разбавить концентрацию до 0,5 г/л, возьмите 500 мкл исходного раствора и смешайте его с 500 мкл H₂Odi, чтобы получить конечный объем 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс разбавления необходим для создания точных стандартных решений.

4. Подготовка стандартной кривой

1. С помощью новой микротрубки объемом 2 мл добавьте буфер и объемы глюкозы, указанные в таблице 1.
2. Установите сухую термованну на 37 °C. Как только температура стабилизируется, добавьте 3,3 мкл глюкозооксидазы во все пробирки, а затем добавьте 1,2 мкл пероксидазы в каждую пробирку. Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C в течение 20 минут.
3. После инкубации немедленно добавьте 750 мкл 50% H₂SO₄ (v/v) в каждую микротрубку и дайте смеси остыть на ледяной бане в течение 2 минут. В результате конечный объем составляет 1 500 μл. Наконец, переложите раствор на пластиковую кювету и измерьте поглощение на длине волны 529 нм.

Таблица 1: Калибровочная кривая глюкозы для метода GOX-H₂SO₄ . Сокращения: БОГ = глюкозооксидаза; POD = пероксидаза; H₂SO₄ = серная кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

5. Тестирование микробиологических образцов

1. Получите образец путем выращивания бактерий или дрожжей в жидкой питательной среде при определенных условиях, включая температуру, скорость перемешивания и время инкубации. Как только культура достигнет желаемой оптической плотности (OD) или концентрации клеток, соберите культуру для дальнейшей обработки.
   Примечание: Pseudomonas reptilivora культивировали при постоянной скорости перемешивания 300 об/мин и 28 °C, в то время как Debaryomyces hansenii культивировали со скоростью перемешивания 200 об/мин при 30 °C в орбитальном шейкере. В конкретном случае D. hansenii пищевое рапсовое масло также использовалось в качестве индуктора для производства липазы.
2. Очистите рабочую зону 70% спиртовым раствором или подходящим чистящим средством в соответствии с протоколами биобезопасности. Зажгите горелку, чтобы обеспечить асептику.
3. Перенесите 100 мкл питательной среды в микропробирку объемом 1,5 мл или 2 мл с помощью стерильных наконечников.
4. Центрифугируйте образцы при 7 500 × г в течение 7 мин при 4 °C или при 10 000 × г в течение 7 мин без контроля температуры. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, которая содержит глюкозу в растворе, и выбросьте гранулу.
5. Используйте 0,5 мкл надосадочной жидкости для концентрации глюкозы в диапазоне от 1 до 20 г/л, затем смешайте с 749,5 мкл о-дианисидинового буфера, 3,3 мкл GOD, а затем 1,2 мкл POD. Инкубируйте микропробирки в течение 20 минут при 37 °C, как описано в шаге 4.2, и немедленно добавьте 750 μL 50% H₂SO₄ и дайте остыть на ледяной бане в течение 2 минут.
   1. При концентрациях выше 20 г/л выполните разведение 1:1 стерильным H₂Odi, прежде чем продолжить.
   2. Если образцы надосадочной жидкости были ранее заморожены при температуре -80 °C или -20 °C, перед использованием их разморозьте при комнатной температуре и вихревом состоянии в течение 30 с. Если необходимо разбавление, используйте стерильный Н₂Оди.
   3. Для образцов с концентрацией глюкозы выше 30 г/л проводят разведение в соотношении 1:1 стерильным H₂Odi, в результате чего коэффициент разбавления равен 2.
6. Рассчитайте общую концентрацию глюкозы в каждом образце с помощью уравнения (2) в программе для работы с электронными таблицами.
   (2)
   Где:
   x = концентрация глюкозы (г/л) δ = конечный объем реакции (0,0015 л)
   y = поглощающая способность, M.S. = количество использованного образца*
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения b и m взяты из уравнения, которое моделирует линию тренда калибровочной кривой для метода (y = mx + b). *Значение M.S. должно быть основано на количестве пробы, использованной для получения соотношения при соответствующем разведении (т.е., если вы берете 0,5 μL надосадочной жидкости, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); если используется коэффициент разбавления (ДФ), полученное поглощение умножается на ДФ.
   Например, если получено поглощение 0,5 и использовано DF 2, то результат будет 1,0. Следовательно, y = 1,0, и это значение должно быть внесено в уравнение (2), как описано ранее.

6. Аналитическая валидация

1. Рассчитайте параметры аналитической валидации метода GOX-H₂SO₄ в соответствии с тем, что установлено Национальным метрологическим центром и Мексиканским органом по аккредитации¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Рассчитайте точность в процентах от коэффициента вариации или % CV = (S/x) × 100, где x — среднее значение группы выборки, а S — стандартное отклонение с допустимым значением ≤10%.
   2. Определите линейность, подогнав стандартную кривую к линейной модели R² выше 0,995.
   3. Рассчитайте предел количественной оценки (LOQ) с помощью уравнения: LOQ = yB + 10sB, где yB представляет концентрацию аналита, которая производит сигнал, эквивалентный целевому сигналу, а 10sB обозначает 10-кратное стандартное отклонение бланка
   4. Рассчитайте систематическую погрешность с помощью этого уравнения: Наклон = x - m, где x = среднее значение экспериментальной концентрации, а m - теоретическая концентрация.
   5. Определение точности как степени согласованности между вещественным значением и теоретическим значением.
      Recovery % = (CR/CV) × 100
      Где CR — среднее значение экспериментальной концентрации, а CV — коэффициент вариации теоретической концентрации.

7. Вмешательство других редуцирующих сахаров

1. Оцените по отдельности четыре редуцирующих сахара: глюкозу, фруктозу, галактозу и ксилозу из исходного раствора 0,5 г/л. Кроме того, используйте трегалозу в качестве отрицательного контроля. Следуйте протоколу для всех образцов и измерьте поглощение при 545 и 529 нм.

Results

Спектрофотометрический анализ GOX-H₂SO₄ показал однократное максимальное поглощение на длине волны 529 нм (λmax) (рис. 2A), а дополнительные значения поглощения наблюдались на длине волны 545 нм. Анализируя значения поглощения при различных концентрациях глюкозы, мы получили линейность (R²) 0,9977 для λ529 нм и R² 0,9967 для λ545 нм (рис. 2B). Линейность в заданном диапазоне относится к способности предоставлять результаты, прямо пропор...

Discussion

Количественное определение глюкозы в питательных средах имеет важное значение для понимания роста микроорганизмов и метаболической активности, поскольку глюкоза служит основным источником энергии для многих микроорганизмов. В этом исследовании мы использовали метод GOX-H₂SO₄ для точного измерения уровня глюкозы в питательных средах с целью оптимизации микробных процессов в бактериальной или дрожжевой ферментации. Наши выводы согласуются с выводами Yuen and McNeill

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 мл микропробирки	Eppendorf	-	-
2,0 мл микропробирки	Eppendorf	-
-CaCO3	Meyer	471-34-1	Карбонат кальция
D-глюкоза	Meyer	50-99-7	D-глюкоза
Драйбат	ФишерНаучный	11-718-4	серийный 911NO251. Блок ШхГхВ мм/дюйм: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Глюкозооксидаза	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Порошок фермента
H2O	-	-	Деионизированная вода
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Серная кислота
HCl	Meyer	7647-01-0	Гидрохлоридроновая кислота
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Дикалийфосфат
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Монокалийфосфат
KOH		Meyer 1310-58-3	Гидроксид калия
Lambda 35	PerkinElmer-Spectrophotometer
Microtube
дигидрохлорид	Sigma Aldrich	D3252	Хромогенная
пероксидаза	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Ферментный порошок
pH-метр	Hanna	1131	Hanna 1170
Ацетат натрия	Meyer	127-09-3	Meyer
Шпатели для взвешивания	-	--