Method Article

Системная очистка и биофизическая характеристика миозина-7а человека на основе системы MultiBac

DOI:

10.3791/67135

⸱

August 23rd, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описаны процедуры рекомбинантного производства голофермента миозина-7а человека с использованием системы MultiBac Baculovirus и изучения его подвижности с использованием специально разработанного in vitro анализа скольжения нитей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миозин-7а — моторный белок на основе актина, жизненно важный для слуховых и зрительных процессов. Мутации в миозине-7а приводят к синдрому Ушера 1 типа, наиболее распространенной и тяжелой форме слепоглухоты у людей. Выдвигается гипотеза, что миозин-7а образует трансмембранный комплекс адгезии с другими белками Ушера, необходимый для структурно-функциональной целостности фоторецепторных и волосковых клеток улитки. Тем не менее, из-за трудностей с получением чистого, интактного белка, точные функциональные механизмы человеческого миозина-7a остаются неясными, а структурные и биомеханические исследования ограничены. Недавние исследования показали, что миозин-7а млекопитающих представляет собой мультимерный моторный комплекс, состоящий из тяжелой цепи и трех типов легких цепей: регуляторной легкой цепи (RLC), кальмодулина и кальмодулиноподобного белка 4 (CALML4). В отличие от кальмодулина, CALML4 не связывается с ионами кальция. Как кальций-чувствительные, так и нечувствительные кальмодулины имеют решающее значение для миозина-7а млекопитающих для правильной тонкой настройки его механических свойств. В данной статье мы подробно описываем метод получения рекомбинантного голофермента миозина-7а человека с использованием системы экспрессии белка Baculovirus MultiBac. В результате получается миллиграммовое количество полноразмерного белка высокой чистоты, что позволяет его биохимическую и биофизическую характеристику. Кроме того, мы представляем протокол оценки его механических и подвижных свойств с использованием специализированных анализов подвижности in vitro и флуоресцентной микроскопии. Наличие интактного белка миозина-7а человека, наряду с описанным здесь подробным протоколом функциональной характеристики, открывает путь к дальнейшим исследованиям молекулярных аспектов миозина-7а в зрении и слухе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миозины являются молекулярными моторными белками, которые взаимодействуют с актином для управления многочисленными клеточными процессами 1,2,3,4. Человек обладает 12 классами и 39 генами миозина5, которые участвуют в широком спектре физиологических функций, таких как сокращение мышц6и сенсорныепроцессы7. Каждая молекула миозина представляет собой мультимерный комплекс, состоящий из тяжелой цепи и легких цепей. Тяжелая цепь делится на области головы, шеи и хвоста. Головка содержит актин- и нуклеотид-связывающие сайты, которые отвечают за гидролиз АТФ и генерируют силу на актиновых филаментах2. Горловина образована несколькими α-спиральными мотивами IQ, в которых связан определенный набор световых цепей. Вместе они функционируют как рычаг для усиления конформационных изменений двигателя в большие движения 8,9,10. Хвост содержит классово-специфичные поддомены и играет регуляторную роль в настройке моторной активности миозина и опосредовании взаимодействий с партнерами по связыванию клеток 2,11.

Человеческий миозин-7а, входящий в состав миозинов 7-го класса, необходим для слуховых и зрительных процессов12,13. IQ-мотивы человеческого миозина-7а связаны с уникальной комбинацией легких цепей, включая регуляторную легкую цепь (RLC), кальмодулин и кальмодулин-подобный белок 4 (CALML4)14,15,16. Помимо стабилизации плеча рычага, эти легкие цепи регулируют механические свойства миозина-7а в ответ на передачу сигналов кальция, особенность, которая, по-видимому, является уникальной для изоформы14 млекопитающих.

Дефекты в гене, кодирующем тяжелую цепь миозина-7а (MYO7A/USH1B), ответственны за синдром Ушера 1 типа, наиболее тяжелую форму комбинированной потери зрения и слуха у человека17. Кроме того, ген легкой цепи CALML4 входит в число генов-кандидатов, которые были картированы как содержащие причинный аллель для USH1H, еще одного варианта синдрома Ашера1 типа 15,18. В сетчатке миозин-7а экспрессируется в пигментном эпителии сетчатки и клетках фоторецепторов13. Он участвует в локализации меланосомов в пигментном эпителии сетчатки (РПЭ)19 и фагоцитозе дисков наружного сегмента фоторецепторов клетками РПЭ20. Во внутреннем ухе миозин-7а в первую очередь обнаруживается в стереоцилиях, где он играет решающую роль в формировании пучков волос и в стимулировании процесса механоэлектрической трансдукции 12,21,22.

В то время как важность миозина-7а в сенсорных клетках хорошо известна, его функциональные механизмы на молекулярном уровне остаются плохо изученными. Этот пробел в знаниях отчасти связан с проблемами очистки интактного белка, особенно изоформы млекопитающих. В последнее время был достигнут значительный прогресс в использовании системы MultiBac для рекомбинантной экспрессии полного голофермента миозина-7ачеловека14. Этот прогресс позволил структурно и биофизически охарактеризовать этот моторный белок, что привело к открытию нескольких уникальных свойств человеческого миозина-7а, которые специально адаптированы для слуховыхфункций млекопитающих.

Система MultiBac представляет собой усовершенствованную платформу для клеток бакуловируса/насекомых, специально разработанную для экспрессии эукариотических мультимерных комплексов24,25. Ключевой особенностью этой системы является ее способность содержать несколько кассет экспрессии генов, каждая из которых кодирует субъединицу комплекса, в пределах одного бакуловируса MultiBac. Сборка кассет экспрессии мультигенов облегчается с помощью так называемого модуля размножения: сайта хомингирующей эндонуклеазы (HE) и соответствующего спроектированного сайта BstXI, фланкирующего множественные сайты клонирования (MCS). Этот модуль позволяет выполнять итеративную сборку одной экспрессионной кассеты путем рестрикции/лигирования, используя тот факт, что сайты рестрикции HE и BstXI удаляются при их лигировании. В этой работе тяжелая цепь человеческого миозина-7а, RLC, кальмодулин и CALML4 клонируются в модуль размножения в векторе pACEBac1 (рисунок 1A), которые затем собираются в кассету с мультигенной экспрессией с помощью итерационного процесса (рисунок 1B). Мультигенная кассета миозина-7а интегрируется в бакуловирусный геном (бакмид) путем транспозиции элемента mini-Tn7 из вектора pACEBac1 в сайт-мишень mini-attTn7 в геноме (рис. 1C). В соответствии с процедурами очистки бакмидов, продукции бакуловируса и амплификации (Рисунок 1D, E) получен рекомбинантный бакуловирус миозин-7a MultiBac, который может быть использован для крупномасштабного производства белка (Рисунок 1F). Кроме того, световые цепи миозина-7а могут быть получены отдельно в E. coli и очищены с помощью расщепляемой метки His6-SUMO 26,27,28. Очищенные легкие цепи полезны для изучения динамики связывания и регуляции миозина-7а.

Очищенный белок миозин-7а может быть подвергнут структурным, биохимическим и биофизическим исследованиям, чтобы получить представление о структурно-функциональной регуляции этого моторного белка. Кроме того, его взаимодействие с актиновой сетью и другими связывающими белками29 может быть изучено с использованием различных подходов к восстановлению in vitro. Результаты этих анализов будут информировать о биофизических свойствах этого миозина, что приведет к механистическому пониманию того, как миозин-7a управляет изменениями в цитоскелете и, в конечном счете, формирует уникальную морфологию и функцию сенсорных клеток. В этой статье мы подробно описываем рабочий процесс анализа скольжения актиновых филаментов, который был специально адаптирован для миозина-7а млекопитающих. Анализ скольжения актиновых филаментов представляет собой надежный анализ подвижности in vitro, который количественно изучает движение флуоресцентных актиновых филаментов, приводимых в движение большим числом моторов миозина, иммобилизованных на покровной поверхности 30,31,32. К преимуществам этого анализа можно отнести простоту настройки, минимальные требования к оборудованию (широкопольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный цифровой камерой) и высокую воспроизводимость. Кроме того, поскольку движение актиновых филаментов управляется кластером иммобилизованных моторов миозина, этот анализ особенно полезен для изучения подвижности мономерных миозинов, таких как миозин-7a14,33. Протоколы включают в себя несколько модификаций, от экспериментальных процедур до анализа изображений, специально адаптированных к уникальным подвижным свойствам миозина-7а млекопитающих. Благодаря наличию интактного белка миозина-7а и описанному здесь протоколу функциональной характеристики, эта статья закладывает основу для дальнейшего исследования молекулярной роли миозина-7а как в физиологических, так и в патологических процессах.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Здесь мы описываем протокол синтеза интактного голофермента миозина-7а человека и характеристики его подвижности in vitro. Этот протокол разделен на три раздела: во-первых, экспрессия человеческого миозина-7a с использованием системы экспрессии белка бакуловируса MultiBac; Во-вторых, раздельная очистка световых цепей миозина-7а с помощью системы E.coli His6-SUMO; и, наконец, изучение подвижности человеческого миозина-7а с помощью анализа скольжения актин-филамент.

1. Получение комплекса миозин-7а на основе системы MultiBac

  1. Создание мультигенной кассеты бакуловируса для экспрессии комплекса миозин-7а человека (16 дней)
    Примечание: Требуется один цикл клонирования (4 дня) для вставки кДНК субъединиц миозина-7a в векторы pACEBac1 и три цикла клонирования для завершения поэтапного лигирования всех модулей размножения, необходимых для экспрессии комплекса миозин-7а, в результате чего в общей сложности 16 дней.
    1. Клонируйте кДНК, кодирующие тяжелую цепь (HC) миозин-7a, кальмодулин, CALML4 и RLC , в векторы pACEBac1 с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколами производителя (см. Таблицу материалов; Рисунок 1А). Метка FLAG вставляется на С-конце миозина-7a HC для облегчения очистки.
      Примечание: Миозин-7а млекопитающих образуется в виде двух изоформ сплайсинга, отличающихся только сегментом из 11 аминокислот на N-конце23. Это короткое N-концевое расширение играет решающую роль в регуляции АТФазной активности миозина-7a14. Было показано, что добавление N-контактной метки может нарушить нормальную регуляцию этим N-контактным расширением и значительно снизить ферментативную активность и подвижностьмотора14. Таким образом, используется С-концевая метка FLAG, чтобы избежать нарушения естественной регуляции белка.
    2. Сконструируйте мультигенную кассету экспрессии для голофермента миозин-7а с использованием умножения хоуминга эндонуклеазы/BstXI, как описано ниже (рис. 1B).
      Примечание: Самонаводящаяся эндонуклеаза I-CeuI образует связующие концы, совместимые с концами, генерируемыми расщеплением BstXI. При лигировании создается сайт рестрикции гибрида хоуминг эндонуклеазы/BstXI, который не может быть разрезан ни одним из ферментов. Ту же процедуру можно повторить для интеграции большего количества модулей умножения. Если на вставочной или векторной конструкциях присутствуют несколько сайтов рестрикции для I-CeuI и BstXI, эти дополнительные сайты должны быть устранены с помощью сайт-направленного мутагенеза, чтобы гарантировать уникальность сайтов разреза I-CeuI и BstXI.
    3. Подготовка вставки: Расщепите конструкцию вкладыша (например, pACEBac-M7a HC) с помощью самонаводящейся эндонуклеазы I-CeuI (см. Таблицу материалов), а затем очистите линеаризованную плазмиду с помощью набора для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов). Далее линеаризованную плазмиду расщепляют с помощью BstXI (см. Таблицу материалов), отделяют фрагмент, содержащий кассету с экспрессией генов, с помощью гель-электрофореза и очищают с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: I-CeuI и BstXI требуют различных условий буферизации, в соответствии с протоколами производителя, для достижения 100% активности. Кроме того, для полного среза с помощью I-CeuI требуется минимум 3 часа, в то время как для BstXI требуется всего 15 минут инкубации. Таким образом, пищеварение должно выполняться последовательно.
    4. Подготовка векторов: Линеаризация векторной конструкции (например, pACEBac-CaM) с помощью расщепления BstXI. Щелочная фосфатаза входит в состав векторного препарата для предотвращения лигирования векторной плазмиды к самой себе (см. Таблицу материалов). Получите продукт пищеварения с помощью электрофореза и очистите его с помощью набора для экстракции гелем.
    5. Лигирование: Лигирование вставки, обработанной I-CeuI/BstXI, и вектора, обработанного BstXI, ДНК-лигазой T4 (см. Таблицу материалов). Проводите реакции лигирования при комнатной температуре (20 °C -25 °C) в течение 10 мин с соотношением 1:1 по массе вставной ДНК к векторной ДНК, поддерживая общую массу близкой к 100 нг в каждой реакции лигирования.
    6. Трансформация и анализ плазмид: Трансформируйте смеси лигирования в клетки DH5α (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителя и проведите скрининг положительных колоний на устойчивость к гентамицину. Очистите плазмиды с помощью коммерческого набора (см. Таблицу материалов) и проверьте правильные клоны (например, плазмиды, содержащие как M7a HC, так и CaM) на основе конкретных моделей рестрикционного расщепления и секвенирования ДНК вставок.
    7. Интеграция нескольких кассет экспрессии генов: Повторите шаги с 1.1.2 по 1.1.6 для интеграции дополнительных генных кассет, экспрессирующих другие субъединицы миозина-7а.
  2. Производство и очистка рекомбинантной ДНК бакмидов (4 дня; Рисунок 1С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 - Бактериальная трансформация и рост трансформированных колоний. Дни 2-3 - Выращивание колоний и отбор на успешное превращение. День 3 - Отбор и посев положительных колоний, начало ночной инокуляции. День 4 - Очищение ДНК бакмидов.
    1. Трансформируйте компетентные клетки DH10Bac (см. Таблицу материалов) с 1 нг секвенированной плазмиды pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Планшет 20-200 мкл клеток на агаровой пластине, содержащей 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл галогенированного индолил-β-галактозида и 40 мкг/мл IPTG (см. Таблицу материалов) и инкубируют планшет при 37°C в течение 48 ч, чтобы обеспечить развитие темно-синего цвета у отрицательных клонов.
      Галогенированный индолил-β-галактозид окрашивает колонии, которые продолжают экспрессировать LacZ (что указывает на неудачную транспозицию), что позволяет отобрать белые колонии, где транспозиция была успешной.
    3. Тщательно выберите изолированную белую колонию и выращивайте клетки в течение ночи в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина и 10 мкг/мл тетрациклина при 37 °C в орбитальном шейкере при 225 об/мин.
    4. Центрифугируйте культуру при давлении 2,465 х г в течение 10 минут, чтобы гранулировать кишечную палочку. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл буфера P1 из набора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что здесь используются буферы из набора Miniprep, протокол очистки продукта bacmid отличается от протокола, поставляемого в комплекте.
    5. Добавьте 300 μL буфера P2 из набора. Перемешайте, перевернув трубки несколько раз, а затем выдерживайте при комнатной температуре в течение 3 минут.
    6. Добавьте 300 мкл буфера N3 из набора и перемешайте путем инверсии, чтобы остановить реакцию лизиса. Центрифугируйте при 17 885 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    7. Переложите надосадочную жидкость в чистую стерильную пробирку и повторите центрифугирование еще 10 минут.
    8. Перенесите 800 мкл надосадочной жидкости в другую стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл (см. Таблицу материалов) и добавьте 600 мкл холодного изопропанола (см. Таблицу материалов), перемешивая путем строгой инверсии. Затем центрифугируйте при 17 885 x g в течение 20 мин при 4 °C.
    9. Выбросьте надосадочную жидкость и найдите маленькую белую гранулу. Промойте гранулу 800 μL холодного 70% этанола (см. Таблицу материалов) и центрифугируйте при 17 885 x g в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно добавляйте этанол вдоль стенки трубки, чтобы не потревожить гранулы.
    10. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите промывку этанолом один раз. Высушите пеллеты на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут. При необходимости тщательно отсасывайте лишнюю жидкость.
    11. Растворите гранулу в 20 μл EB-буфера из набора. Убедитесь, что гранула полностью растворилась, щелкнув пробиркой или осторожно перемешав с помощью пипетирования. Определите концентрацию с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
    12. При необходимости отрегулируйте объем буфера, чтобы концентрация бакмида составляла примерно 1 г/л. Храните ДНК бакмида при температуре 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к производству вируса P0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный бакмид может храниться при температуре 4 °C и сохраняет эффективность в течение нескольких месяцев. Мы видели успешные трансфекции препаратами bacmid возрастом до 1 года. В качестве альтернативы бакмид может быть аликвотирован и храниться при температуре -20 °C. Следует избегать многократных циклов замораживания/размораживания, так как они снижают эффективность трансфекции.
  3. Трансфектировать клетки насекомых Sf9 бакмидом для получения рекомбинантного бакуловируса (6 дней; Рисунок 1D)
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 - Трансфекция клеток с ДНК бакмидов. Дни 2-6 - Наблюдайте за ростом и экспрессией клеток. День 6 - Сбор вируса P0.
    1. Добавьте клетки Sf9 в питательных средах (см. Таблицу материалов) в 6-луночный планшет в концентрации 0,33 x 106 клеток/мл по 3 мл на лунку. Дайте пластине постоять при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы элементы могли прикрепиться к нижней части пластины.
    2. Для каждой лунки приготовьте трансфекционную смесь, соединив 10 мкл катионного липидного реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов) с 250 мкл улучшенной среды минимального содержания (MEM) (см. Таблицу материалов) в стерильной микроцентрифужной пробирке. Перемешать методом инверсии и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    3. Добавьте 1 мкг (в расчете на концентрацию, определенную на шаге 1.2.12) неразбавленного миозина-7а бакмида в трансфекционную смесь. Перемешать методом инверсии и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    4. Равномерно распределите всю ДНК-липидную смесь по каплям в лунки. Оставьте одну лунку для нетрансфицированных клеток в качестве отрицательного контроля.
    5. Запечатайте 6-луночный планшет пленкой (см. Таблицу материалов) и выдерживайте при температуре 27 °C в течение 6 дней. Наблюдайте за ростом и отстраненностью на протяжении всего этого времени. Если на конструкции присутствует флуоресцентная метка, проверьте ее на развитие флуоресценции (рис. 2).
    6. Когда у трансфицированных клеток появятся признаки инфекции на поздней стадии, перенесите среду, содержащую вирус, из инфицированных лунок в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 805 x g в течение 10 минут.
    7. Перенесите надосадочную жидкость в чистую коническую пробирку объемом 15 мл, оберните ее алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C. Этот продукт теперь является вирусом P0 и, по нашему опыту, может эффективно храниться и использоваться до четырех месяцев.
  4. Амплификация запаса бакуловируса (3-5 дней; Рисунок 1E)
    1. Приготовьте 100 мл (или желаемый объем) клеток Sf9 в концентрации 2 x 106 клеток/мл в питательных средах для клеточных культур Sf9 в колбе Эрленмейера объемом 250 мл (см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте соотношение 1:100 (v/v) вирусного запаса P0 к культуре клеточной суспензии Sf9 и инкубируйте при 27 °C в орбитальном шейкере при 135 об/мин.
    3. Контролируйте рост каждые 24 часа до тех пор, пока клетки не достигнут ~90% гибели клеток. Оказавшись на этом расстоянии, центрифугируйте клеточную суспензию при 500 х г в течение 10 мин и соберите надосадочную жидкость, содержащую вирус Р1.
    4. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной фильтрации 0,22 мкм (см. Таблицу материалов). Храните отфильтрованный продукт в темноте и храните при температуре 4 °C. Этот продукт теперь является вирусом P1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса снижается при длительном хранении при температуре 4 °C. Рассмотрите возможность создания свежего вирусного фонда, если он хранился более 4 месяцев, или титруйте вирусный запас перед использованием в выражении34.
  5. Экспрессия белка (60 -72 ч между началом экспрессии и сбором клеточной гранулы; Рисунок 1E)
    1. Получить логарифмическое выращивание клеток Sf9 в концентрации 2 х 106 клеток/мл и добавить вирус Р1 в соотношении 12 мл вируса к 300 мл клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход белка составляет примерно 1 мг/л. Рекомендуется использовать минимум 1,5 л клеточной суспензии для экспрессии этого белка.
    2. Культивируйте клетки при 27 °C в орбитальном вибростенде со скоростью 135 об/мин в течение примерно 60 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие образцы могут быть собраны в разные моменты времени и проанализированы с помощью гелей SDS для оценки уровня экспрессии белка. Кроме того, если белки слиты с флуоресцентными метками, уровни экспрессии могут быть оценены с помощью флуоресцентной микроскопии. Забор клеток должен быть осуществлен не позднее наступления клеточной гибели.
    3. Центрифугируйте клеточную суспензию при 3,735 x g в течение 5 мин при 4 °C для гранулирования клеток. Пеллеты можно хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования или консервировать для длительного хранения. Обычно мы используем клеточные гранулы в течение нескольких недель, но активный белок восстанавливается через несколько месяцев после замораживания.
  6. Очистка белка (2 дня; Рисунок 1F)
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 - Экстракция и очистка белка с помощью FLAG-аффинной хроматографии. День 2 - Аликвота и замораживание образцов после ночного диализа. Описанный ниже протокол предназначен для очистки миозина-7а из клеточных гранул объемом 1,5 л.
    1. Приготовьте мастер-буфер, содержащий 10 мМ MOPS (pH 7,2), 500 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мкг/мл лейпептина и 100 мкг/мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Отфильтруйте его с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и храните буфер при температуре 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: PMSF нестабилен в водных растворах. Приготовьте стоковый раствор PMSF в виде 1 М в 100% этаноле и храните его при температуре -20 °C до 6 месяцев.
    2. Приготовьте 75 мл экстракционного буфера, дополнив его 3 таблетками ингибитора протеазы, не содержащими ЭДТА, 2 мМ АТФ и 0,1 мМ дитиотреитола (ДТТ; см. Таблицу материалов).
    3. Добавьте 75 мл экстракционного буфера в гранулу, пока она еще заморожена. Оставьте гранулу в буфере для экстракции на льду, пока она не оттает. Используйте серологическую пипетку, чтобы разбить гранулу, чтобы ускорить процесс размораживания.
    4. С помощью наконечника диаметром 1/2 дюйма (13 мм) произведите ультразвуковую обработку на льду в течение 10 минут с амплитудой 50%, 5 с включено, 5 с выключено.
    5. Центрифугируйте общий лизат при 33 746 x g в течение 30 мин при 4 °C. Во время центрифугирования приготовьте 1,5 мл смолы FLAG, промыв 3 мл 50% суспензии смолы Anti-FLAG affinity (см. Таблицу материалов) с 40 мл PBS. Гранулируйте смолу центрифугированием при 800 x g в течение 2 мин при 4 °C. Осторожно удалите PBS, не потревожив смолу.
    6. Добавьте надосадочную жидкость из центрифугирования лизата в промытую смолу и инкубируйте при непрерывном вращении при 4 °С в течение 1 ч.
    7. Гранулируйте смолу центрифугированием при 800 x g в течение 2 минут при 4°C. Не нарушая смолу, удалите надосадочную жидкость.
    8. Ресуспендируйте смолу в 40 мл основного буфера и центрифугируйте при 800 x g в течение 2 минут при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив смолу. Повторите стирку 1 раз.
    9. Переложите промытую смолу на две полипропиленовые спиновые колонны (см. Таблицу материалов). Промойте каждую колонку 1 раз 2 мл Master Buffer. Снимите главный буфер, центрифугируя колонку при давлении 1 400 x g в течение 2 минут при 4 °C. Смола будет упакована на дно.
    10. Приготовьте элюирующий буфер, добавив 100 мкг/мл пептида FLAG-пептида (см. Таблицу материалов) в мастер-буфер.
    11. Добавьте 300 мкл элюирующего буфера в упакованную смолу в каждой колонке и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования, чтобы убедиться, что смола полностью гидратирована элюирующим буфером. Дайте смоле инкубироваться с буфером для элюирования на льду в течение 10 минут.
    12. Центрифугируйте колонны при давлении 1 400 x g в течение 2 мин при 4 °C. Переведите проточный поток в чистую микроцентрифужную пробирку и держите ее на льду. Это первая дробь.
    13. Повторите шаги 1.6.11-1.6.12 таким образом, чтобы из каждого столбца было собрано по 4 дроби.
    14. Проводят гель-электрофорез35 SDS-PAGE с фракциями элюирования для определения их относительных концентраций. Пока гель течет, приготовьте диализный буфер, содержащий 500 мМ NaCl, 10 мМ MOPS, 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ EGTA и 1 мМ DTT.
    15. Соедините самые концентрированные фракции. Перенесите образец в диализную кассету 10K MWCO (см. Таблицу материалов) и проводите диализ в течение ночи при температуре 4 °C. Используйте диализный буфер объемом 1 л примерно на 500 мкл белка. Выполните не менее трех замен диализного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод спин-колонки и центрифугирования элюирования позволяет элюировать белки в высоких концентрациях (0,5-1 мг/мл). Дальнейшие шаги по концентрации обычно не требуются. Однако, если требуются более концентрированные белки, загрузите образцы в концентрационные пробирки мощностью 100 000 MWCO (см. Таблицу материалов) и центрифугируйте при 1400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем белкового раствора.
    16. На следующий день аккуратно выгрузите образец из диализной кассеты. Аликвота 15 мкл на ПЦР-пробирку и опустите пробирки в емкость с жидким азотом для мгновенной заморозки. Замороженные белки можно хранить при температуре -80 °C для использования в будущем (рис. 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход миозина-7а при использовании этого метода обычно составляет от 0,5 до 1 мг/л.

2. Очистка легких цепей RLC и CALML4 с помощью системы E. coli His6-SUMO (7 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: Дни 1-4 - Клонирование и очистка плазмид. День 5 - Бактериальная трансформация. Дни 6-7 - Очищение, аликвотирование и замораживание конечных белков.

  1. Клонируйте кДНК, кодирующие RLC и CALML4, в вектор pET-SUMO, который содержит последовательность His6 до SUMO для облегчения очистки. При необходимости домен His6-SUMO может быть отделен от гибридного белка с помощью протеазы26,36 SENP2.
  2. Для каждого белка легкой цепи трансформируйте компетентные клетки BL21 E. coli (см. Таблицу материалов) с плазмидой и начните выращивание жидкой культуры объемом 5 мл на ночь с трансформированными клетками.
  3. На следующий день инокулируйте 5 мл ночной культуры в 1 л бульона Лурия-Бертани (LB), содержащего 50 мкг/мл канамицина. Дайте культуре расти при 37 °C с непрерывным встряхиванием при 270 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность (O.D.) не достигнет 0,6 - 1,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение внешнего диаметра удваивается примерно каждые 20 минут, как только оно достигает 0,2. Регулярно контролируйте операционный отлив.
  4. Инициируйте экспрессию белка путем добавления в культуру 250 мкМ изопропил b-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Инкубировать в течение 3-5 часов при 37 °C или 16 °C в течение ночи с непрерывным встряхиванием при 270 об/мин.
  5. Гранулируют кишечную палочку путем центрифугирования клеточной суспензии при 4347 х г в течение 15 мин при 4 °С. Выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Приготовьте ресуспензионный буфер, содержащий 50 мМ Tris-HCl, 1 М NaCl, 5 мМ имидазола и 10% глицерина, pH 7,4 (см. Таблицу материалов). Держите на льду.
  7. Повторно суспендируйте гранулу в 15-25 мл буфера для ресуспензии и переложите суспензию в чистую мензурку, доведя общий объем до 35 мл. Добавьте ДНКазу и РНКазу в суспензию в соотношении 1:1000 (v/v) для получения конечной концентрации 1 мкг/мл и 2 мкг/мл соответственно. Добавьте в суспензию одну таблетку ингибитора протеазы, не содержащую ЭДТА, 4 мМ 2-меркаптоэтанола и 1% Triton X (см. Таблицу материалов). Держать на льду 20 минут.
  8. Ультразвуковой обработкой гранулированной суспензии в ледяной воде с 1 с включением и 1 с выключением в общей сложности 1 мин при 100% амплитуде. Оставьте гомогенизированный лизат при температуре 4 °C при непрерывном вращении в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление Triton X помогает в лизисе клеток при подготовке к ультразвуковой обработке.
  9. Центрифугируйте лизаты при давлении 26 900 x g в течение 45 мин при 4 °C. Пока это происходит, начните подготовку кобальтовой смолы (см. Таблицу материалов). Используйте 500 μл кобальтовой смолы на 1 л культуры E. coli . Промойте смолу 2 раза сверхчистой водой и один раз с помощью буфера для суспензии, центрифугируя при 4 347 x g в течение 2 минут при 4 °C.
  10. После центрифугирования лизата смешайте надосадочную жидкость с промытой смолой и осторожно раскалывайте при температуре 4 °C в течение 30 минут.
  11. Центрифугируйте суспензию лизат-смолы при 4347 x g в течение 2 мин при 4°С. Смола будет упакована на дно тубы. Не нарушая смолу, удалите надосадочную жидкость.
  12. Промойте смолу ресуспензионным буфером центрифугированием при 4,347 x g в течение 2 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость. Повторяйте стирки до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной.
  13. Приготовьте элюирующий буфер, содержащий 50 мМ Tris HCl, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, 10% глицерина, 4 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,25 мкМ протеазы SENP2 (см. Таблицу материалов). Держите его на льду.
  14. Ресуспендируйте смолу в 1 мл буфера для ресуспендирования и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4 °C при непрерывном вращении.
  15. На следующий день центрифугируйте при давлении 4,347 x g в течение 2 минут, чтобы гранулировать смолу. Соберите надосадочную жидкость, которая содержит расщепленный белок легкой цепи и протеазу.
  16. Добавьте в смолу 1 мл элюирующего буфера. Повторите центрифугирование и соберите надосадочную жидкость.
  17. Удалите протеазу с помощью быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC). Вкратце, подготовьте колонку исключения размера (см. Таблицу материалов) с буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 5 мМ DTT (pH 7,4). Концентрируйте надосадочную жидкость до 500 мкл с помощью концентрационной трубки мощностью 10 000 MWCO. Загрузите концентрированный образец в колонку, подключенную к автоматизированной хроматографической системе с помощью шприца, протекайте через буфер, содержащий 50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 5 мМ DTT (pH 7,4). Контролируйте собранные фракции с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Соберите белковые фракции с молекулярной массой, соответствующей легким цепям.
    Примечание: Протеаза также может быть удалена с помощью аффинной хроматографии, если в протеазу встроена очищающая метка (например, метка GST).
  18. Запустите гель SDS-PAGE с фракциями элюирования, чтобы определить чистоту и относительные концентрации белков легкой цепи в каждой фракции. Желаемые фракции — это фракции, содержащие концентрированные белки легкой цепи без видимых полос протеазы. Соедините нужные белковые фракции и сконцентрируйте их с помощью концентрационной трубки35 мощностью 10 000 MWCO.
  19. Мгновенно заморозьте аликвоты белка в жидком азоте и немедленно перенесите при температуре -80 °C для длительного хранения (рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход RLC и CALML4 при использовании системы E. coli His6-SUMO составляет около 1-2 мг/л.

3. Скользящий анализ миозин-7а актиновой филаментной нити (3 ч)

Методы, используемые в этом разделе, аналогичны описанным для других миозинов31 , с основными изменениями, заключающимися в инкубации и применении миозина в буфере с высокой ионной силой и длительном интервале, необходимом для достижения точного измерения смещений от кадра к кадру.

  1. Получить 20 мкМ филаментозный актин (F-актин) путем полимеризации глобулярного актина (G-актина) в полимеризационном буфере (50 мМ KCl, 25 мМ MOPS, 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT (pH 7,0)) при 4 °C в течение ночи. Пометьте F-актин, добавив 1,2-кратный избыток молярного избытка родамина-фаллоидина (см. Таблицу материалов). Накрыть алюминиевой фольгой и выдерживать на льду не менее 2 ч.
    Примечание: G-актин может быть приобретен у коммерческих продавцов (см. Таблицу материалов) или очищен из порошка ацетона из кроличьих мышц31,37. Меченый F-актин может храниться при температуре 4 °C до 2 месяцев в этой концентрации.
  2. Подготовьте проточную камеру, как описано ранее31. Кратко поместите две полоски двустороннего скотча на расстоянии 2-3 мм друг от друга на очищенное и обработанное нитроцеллюлозой предметное стекло микроскопа (см. Таблицу материалов). Положите нитроцеллюлозный колпак нитроцеллюлозной стороной вниз на полоски, создав проточную камеру с приблизительным объемом 10 мкл (рис. 4).
  3. Проведение анализа на скольжение актинового филамента
    1. В проточную камеру добавьте один объем камеры 0,2 мг/мл очищенного белка человеческого миозина-7a в 500 мМ NaCl Motility Buffer (500 мМ NaCl, 20 мМ MOPS, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EGTA (pH 7,4)). Дайте понервироваться в течение 5 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно добавлять миозин-7a в буфер с высоким содержанием солей, так как это снимает аутоингибированное состояние и позволяет миозину-7а прилипать к поверхности в активированной конформации.
    2. Промойте проточную камеру с трехкамерным объемом 1 мг/мл BSA (см. Таблицу материалов) в 150 мМ NaCl Motility Buffer (150 мМ NaCl, 20 мМ MOPS, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EGTA, 1 мМ DTT (pH 7,4)), протягивая жидкость с помощью чистой салфетки на выходе для поглощения излишков жидкости. Выдерживать в течение 1 минуты после3-й стирки.
    3. Пропустите через проточную камеру 10 нМ F-актина, меченного родамином фаллоидином, в буфере подвижности NaCl 150 мМ. Контролируйте связывание актиновых филаментов с поверхностью под флуоресцентным микроскопом со 100-кратным объективом. Плотность актиновых филаментов должна быть оптимальной (рис. 5A), обеспечивая достаточное количество филаментов в поле зрения для отслеживания, но при этом достаточно разреженной, чтобы предотвратить перекрытие нескольких филаментов, что усложняет отслеживание.
    4. Промойте проточную камеру трехкамерными объемами 150 мМ NaCl Motility Buffer для удаления несвязанных актиновых филаментов и избытка родамина-фаллоидина.
    5. Инициируйте подвижность путем добавления одного объема камеры конечного буфера (200 мМ NaCl, 20 мМ MOPS, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EGTA, 50 мМ DTT, 2 мМ АТФ, 2,5 мг/мл глюкозы, 100 мкг/мл глюкозооксидазы, 2 мкМ RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. Запишите изображения на флуоресцентный микроскоп с использованием возбуждения 561 нм для визуализации актина, меченного родамином фаллоидином. Найдите область на предметном стекле с желаемой плотностью актина (рис. 5A) и делайте снимки каждые 30 с в течение 30 минут.
      Примечание: Скорость миозина-7а млекопитающих составляет примерно 5 нм/с. При настройке частоты кадров при регистрации важно убедиться, что смещения нитей накала между кадрами достаточно велики (более одного пикселя) для обеспечения точного отслеживания. Субпиксельные перемещения между кадрами могут привести к завышению скорости. Частота кадров 30 с позволяет актиновым нитям перемещаться между кадрами на расстояние около 150 нм, что соответствует более чем двум пикселям на микроскопе. Тем не менее, следует следить за тем, чтобы на используемом микроскопе можно было наблюдать значительное смещение. При наличии многопозиционной записи можно использовать для одновременного сбора нескольких полей зрения для анализа.
  4. Анализ движения актиновых филаментов с помощью программы FAST (установленной на компьютере Mac)38.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь программа FAST является лишь одним из многих вариантов количественной оценки движения нити накала. Мы выбрали FAST, потому что он автоматизирован, быстр и не требует платного программного обеспечения. Другие варианты включают алгоритмы на основе MATLAB, такие как FIESTA, методы на основе ImageJ/FIJI, такие как MTrack2 и Manual Tracking, и методы на основе Python, такие как Philament39.
    1. Скачайте и установите программу FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3 совместимую версию с дополнительным модулем для. nd2 конвертации файлов. NB: Оригинальную версию python2 можно найти на github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. Запустите программу FAST, как описано впункте 38 , используя значение допуска 33, чтобы сохранить только плавно движущиеся нити.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображения дрейфуют из-за механических проблем со сценой или из-за одновременного сбора нескольких серий, фильмы следует сначала стабилизировать. Для этого мы рекомендуем плагин FIJI Image Stabilizer, доступный для скачивания по следующему адресу - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Используйте программу FAST для анализа вновь созданных .tif изображений, предварительно установив значения -xmax и -ymax. Они задают параметры для диаграммы рассеяния, выводимой программой, и представляют наибольшую длину нити накала (в нм) и максимальную скорость нити накала (в нм/с). В этом примере мы использовали 20 000 нм для -xmax и 20 нм/с для -ymax, чтобы обеспечить захват всех данных (рис. 5D).
    4. Используйте -px для установки размера пикселя полученного изображения, который в данном случае будет равен 65 нм, и -minv для установки минимальной скорости (в нм/с), необходимой для включения в анализ. Для низкой скорости миозина-7а в этом примере используйте 0,1 нм/с.
    5. Используйте -maxd для установки максимально допустимого расстояния между кадрами для связывания нитей накаливания. Это установлено для того, чтобы избежать связывания отдельных нитей накаливания между кадрами, и в этом примере мы используем стандартное значение 2000 нм.
    6. Используйте -pt для установки допуска на колебания скоростей нити накала и включайте только нити с плавным движением. В этом примере используется пороговое значение допуска в 33 %. Это означает, что нити накаливания со стандартным отклонением скорости, превышающим 33% от среднего значения скорости, будут исключены из дальнейшего анализа.
    7. Наконец, используйте -d для указания папки, содержащей .tif стеки для анализа. Вся командная строка с заданными параметрами и значениями будет следующей: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [имя папки, содержащей фильмы].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа FAST выведет диаграммы рассеяния (Рисунок 5D) с соответствующими исходными данными, которые могут быть извлечены для анализа и визуализации в других программах (Рисунок 5C). Он также выведет график траекторий отслеживаемых нитей (рисунок 5B), который следует использовать для проверки того, что отслеживание работает должным образом. Примеры графиков и других возможных визуализаций данных приведены ниже.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очищенный комплекс миозин-7а и белки легкой цепи могут быть оценены с помощью гель-электрофореза SDS-PAGE, как показано на рисунке 3. Полоса выше отметки 200 кДа соответствует тяжелой цепи миозина-7а (255 кДа). Три полосы, мигрирующие между отметками 22 и 14 кДа сверху вниз, — это RLC (20 кДа), кальмодулин и CALML4 соответственно. В то время как кальмодулин и CALML4 имеют одинаковую молекулярную массу около 17 кДа, эти два белка могут быть разделены с помощью 16% геля трис-глицина.

На видео 1 и рисунке 5 показан характерный анализ скольжения актиновой филаментации с миозином-7а млекопитающих. Непосредственным признаком, выявленным в результате этого анализа, является медленная подвижность миозина-7а. Видео воспроизводится со скоростью, в 500 раз превышающей норму, чтобы лучше визуализировать движение актиновых филаментов, приводимых в движение этим миозином. Этот анализ может быть модифицирован для дальнейшего изучения того, как внешние факторы, такие как температура, ионная сила и вязкость раствора, влияют на активность миозина-7а. Кроме того, миозин-7а-связывающие белки могут быть введены в проточную ячейку для изучения их влияния на взаимодействие и подвижность актомиозинов.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс производства голофермента миозин-7а на основе системы MultiBac. (A) Вставьте кДНК, кодирующие тяжелую цепь миозина-7a, RLC, CALML4 и кальмодулин, в сайты множественного клонирования (MCS) вектора pACEBac1. (B) Сконструировать мультигенную экспрессирующую кассету для кодирования комплекса миозин-7a путем итеративного лигирования векторов pACEBac1, которые содержат кДНК тяжелой цепи миозина-7a, RLC, CALML4 и кальмодулин. (C) Интегрировать мультигенную кассету миозина-7a в геном бакуловируса путем транспозиции элемента mini-Tn7 из вектора pACEBac1 в сайт-мишень mini-attTn7 в геноме. (D) Получение бакуловирусов, экспрессирующих комплекс миозин-7а, путем трансфекции клеток Sf9 рекомбинантным бакмидом, содержащим мультигенную кассету миозина-7а. (E) Бакуловирус может быть амплифицирован путем инокуляции вируса P0 в культуру клеточной суспензии Sf9 и сбора надосадочной жидкости. Полученный продукт, вирус P1, может быть использован для крупномасштабной экспрессии белка. (F) Рабочий процесс колоночной очистки комплекса миозин-7а с помощью FLAG-affinity. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные флуоресцентные изображения клеток Sf9, трансфицированных бакмидом, экспрессирующим миозин-7a с С-концевой меткой GFP. Изображения показывают нормальное развитие бакуловирусной инфекции: клетки начинают экспрессировать миозин-7a примерно на 4-й день после трансфекции, причем почти все клетки заражаются в течение одной недели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: SDS-гели очищенного комплекса миозин-7а и белков легкой цепи. (A) Очищенный полноразмерный голофермент человеческого миозина-7а с использованием системы MultiBac. Обозначены тяжелая цепь (HC) и легкая цепь. (B) Очищенные RLC и CALML4 с использованием системы His6-SUMO. Кальмодулин (CaM) приобретается (см. Таблицу материалов) и очищается из мозга крупного рогатого скота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Рабочий процесс сборки проточной камеры и анализа скольжения актина. Обработанный нитроцеллюлозой покровный стекло прикрепляется к предметному стеклу микроскопа с помощью двух кусков двустороннего скотча. При этом создается проточная камера объемом около 10 мкл. Белки добавляются последовательно в камеру, в то время как излишки растворов отводятся через канал с помощью папиросной бумаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты анализа планирующего актинового филамента и анализа трекинга. (A) Пример кадра из таймлапс-записи, показывающий движение актинового филамента, приводимое в движение моторами миозина-7а с декорированной поверхностью. (B) Вывод изображения слежения за нитью накала из программы FAST для того же поля зрения, как показано на рисунке (A). (C) Репрезентативная гистограмма скорости скольжения актина, генерируемой миозином-7a млекопитающих: 4,2 ± 1,4 нм/с (среднее значение ± стандартное отклонение; количество дорожек = 550). (D) Пример автоматически сгенерированного вывода из программы FAST, показывающий рассчитанную длину и скорости нити накала. %STUCK показывает процент нитей, которые считаются застрявшими на основе предоставленного пользователем минимального порога скорости. MVEL представляет собой среднюю скорость всех неприлипших нитей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Видео 1: Анализ скольжения актиновых филаментов с использованием миозина-7а. Очищенный полноразмерный человеческий миозин-7а прикрепляется к поверхности. Этот видеоролик был получен с частотой 1 кадр каждые 30 с экспозицией 200 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен подробный протокол производства рекомбинантного человеческого белка миозин-7а из клеток насекомых. Несмотря на то, что система Sf9/бакуловирус была использована для получения различных миозинов 40,41,42,43, только недавно миозин-7а млекопитающих был успешно очищен с использованием бакуловирусной системы MultiBac 14. Установлено, что миозин-7a млекопитающих связан с тремя типами легких цепей, все из которых необходимы для структурной и функциональнойцелостности белка. Это контрастирует с его беспозвоночным гомологом и большинством других миозинов, которые обычно связываются только с одной или двумя легкими цепямитипа 44,45. Это означает, что для синтеза человеческого голофермента миозина-7а в каждой Sf9-клетке должны одновременно экспрессироваться как минимум четыре различных гена. В этом случае система MultiBac имеет значительные преимущества по сравнению с коинфекцией с множественными бакуловирусами, поскольку она обеспечивает воспроизводимое соотношение субъединиц комплекса миозин-7а в каждой инфицированной клетке. На самом деле, Беляев и др. статистически продемонстрировали это: по мере увеличения числа типов вирусов вероятность получения клетками равного соотношения вирусов резко снижается —46. Например, при двух типах вирусов только 12,78% клеток достигают равного соотношения, в то время как при использовании четырех типов вирусов этот процент снижается до 0,29%, при условии, что каждый тип вируса распределяется между клетками независимо. Эта изменчивость может быть проблематичной, когда субъединичные белки должны собираться в постоянном соотношении для получения максимального выхода комплекса. Несмотря на то, что основное внимание в данной статье уделяется миозину-7а млекопитающих, становится все более очевидным, что система MultiBac предлагает более оптимизированный подход к получению мультимерных комплексов, чем метод коинфекции, особенно для белков с большим количеством субъединиц и с низким выходом.

Несколько факторов имеют решающее значение для достижения высокопродуктивного производства белка миозин-7а с использованием этого метода. Во-первых, крайне важно определить оптимальное время для сбора клеток Sf9 . Это позволяет максимально производить белок, сводя к минимуму вредные последствия лизиса клеток и гибели, вызванной вирусом. Продукция белковых комплексов на основе MultiBac часто демонстрирует замедленный пик экспрессии по сравнению с моноцистронными бакуловирусными системами или при экспрессии более мелких белков. Мы обнаружили, что лучшее время для забора клеток, инфицированных вирусом миозина-7a MultiBac, составляет от 60 до 65 часов после заражения. Настоятельно рекомендуется непрерывный мониторинг уровня экспрессии белка на протяжении всего процесса. Это может быть достигнуто с помощью флуоресцентной микроскопии, если флуоресцентная белковая метка слита, или с помощью анализа SDS-PAGE в противном случае. Кроме того, важно одновременно контролировать жизнеспособность клеток, чтобы определить оптимальные сроки для достижения наивысшего выхода белка с минимальной гибелью клеток.

Миозин-7а представляет собой большой мономерный миозин, чувствительный к деградации белка14. Чтобы предотвратить деградацию в процессе очистки, важно убедиться, что все буферы предварительно охлаждены, а все процедуры проводятся при температуре 4 °C. Кроме того, решающее значение имеет сведение к минимуму воздействия миозина-7а на протеазы. Помимо использования коктейлей ингибиторов протеазы, мы рекомендуем ограничить инкубацию клеточного лизата смолой FLAG-смолой до 1 часа. Не было показано, что увеличение этой продолжительности приводит к значительному улучшению связывания смолы или увеличению общего выхода белка и может представлять более высокий риск деградации белка.

Отличительной особенностью миозина-7а млекопитающих, по сравнению с изоформами низших видов44, является сочетание уникальных компонентов легких цепей. Эти легкие цепи играют важную регуляторную роль в функции миозина-7а. Например, кальмодулин динамически взаимодействует с тяжелой миозин-тяжелой цепьюCa2+-зависимымобразом47, модулируя ее подвижность и механический выход, механизм, который, по-видимому, специфически адаптирован к слуховым волосковым клеткам млекопитающих14. В то время как точное сродство связывания кальмодулина с отдельными мотивами IQ еще предстоит определить в контексте всей молекулы, мы заметили, что некоторое количество кальмодулина постепенно диссоциирует по мере того, как избыток легких цепей в клеточном лизате удаляется во время очистки. Это может изменить механические свойства миозина-7а. Чтобы смягчить эту проблему, мы используем спиновые колонки в сочетании с щадящим центрифугированием на этапе элюирования. Это позволяет элюировать белки в небольшом объеме и в высокой концентрации, что может устранить необходимость в этапах концентрации. Такая практика сокращает общий процесс очистки белка и сводит к минимуму риск диссоциации легкой цепи. В анализах на скольжение актина мы включаем избыток белков легкой цепи в конечный буфер, чтобы гарантировать, что нативные легкие цепи остаются связанными с тяжелой цепью миозина-7а.

Потребность в избыточных легких цепях представляет собой одно из нескольких различий между анализом скольжения актина с миозином-7а и другими хорошо изученными миозинами, такими как миозин-2. Анализы на миозин-2 обычно проводятся с низкой ионной силой (например, 50 мМ). По мере того, как ионная сила увеличивается до физиологической (150 мМ), актиновые филаменты имеют тенденцию к отделению, и подвижность замедляется. В случае миозина-7а подвижность останавливается при низкой ионной силе, а скольжение наблюдается только при длине больше или равной 150 мМ. Из-за аутоингибирования полноразмерного миозина-7а его наносят на покровное стекло в растворе с высокой ионной силой способом, подобно тому, как растворяются миозиновые нити перед нанесением, чтобы позволить белкам связываться в ориентации и конформации, которые обеспечивают последующее скольжение.

Низкая скорость, наблюдаемая в анализах на скольжение актина с миозином-7а, создает некоторые проблемы при сборе и анализе данных о подвижности. Действительно, транслокация происходит на несколько порядков медленнее по сравнению с миозином скелетных мышц, который использовался, когда этот анализ былпервоначально разработан. Такая низкая скорость может привести к трудностям в точном измерении и переоценке скорости, которая масштабируется с частотой кадров48. Точность локализации любого метода слежения конечна, и даже статичный объект имеет кажущееся смещение положения между последовательными изображениями. По мере увеличения частоты дискретизации это приводит к искусственно завышенному значению скорости. Этот эффект справедлив для любого типа анализа подвижности, но относительный эффект очень мал для анализов, в которых происходит большое перемещение в несколько пикселей между кадрами. Снимая точки данных через очень большие интервалы (каждые 60 с, 90 с и т. д.), можно убедиться в точности измеренной скорости, поскольку частота дискретизации не должна влиять на значение. Поскольку интервал регистрации миозина-7a очень велик, задержка может быть использована для записи с нескольких позиций во время одного и того же захвата. Это позволяет записывать несколько видеороликов одновременно. Недостатком этого метода является то, что механические недоработки со сценой приведут к дополнительному сносу из-за переключения положений. Это можно объяснить с помощью стабилизации изображения, как описано выше.

В оригинальной версии программного обеспечения FAST на языке Python2 (github.com/turalaksel/FASTrack) каждая точка выходных данных представляет собой скорость нити накала в окне N-кадров (по умолчанию 5 кадров). Модифицированная версия программного обеспечения Python3 (github.com/NeilBillington/FASTrack3) включает в себя дополнительный выход, в котором точки данных отображаются на основе нити за нитью. Графики по умолчанию, созданные программным обеспечением, основаны на наборе данных типа N window. Оба типа выходных данных одинаково действительны, и хотя исходный вывод будет давать гораздо больше точек данных для каждого фильма, мы обычно используем данные на основе нитей накала, поскольку они более непосредственно сопоставимы с существующими методами количественной оценки скольжения нити накала и дают более интуитивную информацию о количестве нитей с определенными скоростями в конкретном фильме. Обратите внимание, что даже в этом анализе по типу нити накала количество точек данных не будет точно соответствовать истинному количеству нитей накаливания, поскольку отслеживание прекращается, когда нити пересекаются, а новые следы обнаруживаются по мере их появления после пересечения.

Ограничения методов, описанных в данной статье, заключаются в том, что белок млекопитающих экспрессируется в клетках насекомых. Хотя многие такие белки, в том числе и этот, были успешно экспрессированы таким образом, существуют и другие системы экспрессии, которые могут более точно имитировать нативную среду белка. Системы экспрессии у млекопитающих могут вносить важные посттрансляционные модификации в белок, которые отсутствуют в системе насекомых. То же самое в еще большей степени верно и для экспрессии в бактериальной системе, используемой здесь для производства световых цепей миозина. Тем не менее, мы считаем, что относительная простота и высокая доходность в этих случаях перевешивают потенциальные ограничения. Анализ подвижности in vitro , который используется для характеристики белка, ограничен в том, сколько информации он может дать о белке. Например, многие аспекты регуляции миозина маскируются или обходятся анализом и, таким образом, не могут быть исследованы с помощью этого метода. Существуют многие другие типы анализов, такие как одномолекулярная подвижность, оптическая ловушка, а также биохимические и биофизические методы, для исследования свойств миозина in vitro, но в качестве метода измерения активности миозина выбран метод скольжения нити, потому что он требует меньше белка, чем многие биохимические анализы, прост в выполнении и где может быть продемонстрирована успешная подвижность. говорит нам о том, что белок является как биохимически, так и механически активным.

Описанный здесь рабочий процесс представляет собой ряд методов получения высококачественного белка миозин-7а и определения его механических свойств. Несмотря на то, что эти методы специально разработаны для этого класса миозинов, процедуры экспрессии и очистки в более общем плане полезны в качестве руководства по получению этого типа лабильного белка, состоящего из нескольких различных полипептидов и имеющего тенденцию к диссоциации и деградации. Кроме того, методы характеризации полезны для всех типов моторных белков, и, в частности, соображения по сбору данных и параметрам анализа должны быть полезны для всех, кто измеряет скорость транслокации низкоскоростных молекулярных моторов.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр микроскопии и Центр визуальных функций и морфологии Университета Западной Вирджинии за обсуждение и помощь в анализе изображений. Эта работа поддерживается фондами стартапов от Медицинской школы Университета Западной Вирджинии до R.L. Эта работа также поддерживается Центром передового опыта в области биомедицинских исследований (Vs-CoBRE) (P20GM144230) Национального института общих медицинских наук (NIGMS) и Сетью передового опыта в области биомедицинских исследований NIGMS Западной Вирджинии (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,7 мл микроцентрифужные пробиркиVWR87003-294
1X FLAG пептидGenScriptN/AПользовательский пептидный синтез
22x22 мм No 1,5 покровные стеклаVWR48366-227
250 мл конические центрифужные пробиркиNunc376814
250 мл вентилируемый шейкер ErlenmyerКолба IntelixBioDBJ-SF250VP
2-меркаптоэтанолVWRM131
75x25x1 мм предметные стекла микроскопа VistavisionVWR16004-42
Белок актина (>99% чистоты)ЦитоскелетAKL99
Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрующий блокMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Центробежный фильтрующий блокMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Одноразовая хроматографическая колонкаBio-Rad732-6008
BL21 Компетентная кишечная палочкаNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
Бычья сыворотка АльбуминМиллипор Sigma5470
BstXI ФерментНовая Англия BiolabsR0113S
КальмодулинМиллипор Sigma208694
каталазыMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-дитиотреитолMillipore SigmaDO632
DL-дитиотреитолMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Офисный склад с двусторонней лентой909955
EGTA, молекулярная биология классаMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, молекулярная биология классMillipore Sigma324626-25GM
ЭтанолThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Трансфекционный реагентGibcoA38915
FAST программаhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand  Модель 505 Звуковой дисмембранFisher ScientificFB505110
Раствор реагента гентамицинаGibco15710-06410 мг/мл в дистиллированной воде
ГлюкозаМиллипоры SigmaG5767
ГлюкозооксидазаМиллипоры SigmaG2133
ГлицеринИнвитроген15514-011
HisPur Кобальтовая смолаThermo Fisher89966
ЭнзимНовая Англия BiolabsR0699S
изображенияhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ИмидазолМиллипоры Sigmai2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
изопропанолFisher ScientificA451SK
КанамицинFisher ScientificAAJ67354AD
большие отверстия Наконечники для пипетокFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB агар, готовый порошокThermo FisherJ75851-A1
Ингибитор лейпептина протеазыThermo Fisher78435
Хлорид магнияThermo FisherJ61014.=E1M
Хлорид магнияThermo FisherJ61014.=E1M
Максимальная эффективность DH10Bac Компетентные клеткиGibco10361012
микроцентрифужные пробирки, 1,7 млVWR87003-294
Микроцентрифужные пробирки, 1,7 млVWR87003-294
Микроцентрифужные пробирки, 1,7 млVWR87003-294
МикроскопNikonМодель: Eclipse Ti с системой H-TIRF с объективом
МикроскопКамера ORCA-Fusion BT
Микроскоп Лазерный блокAndor iXon Ultra
Miller' s LB Broth Corning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-альфа Компетентная E.coli (высокая эффективность)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitroцеллюлозaLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Восстановленная сыворотка MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ПарапленкаMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink РНКаза А (20 мг/мл)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Набор для экстракции геля (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
протеазойPMID:17591783Очищено в лаборатории
Sf9 элементыThermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Сыворотка без средств массовой информации CompleteGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Диализные кассеты, 10K MWCO, 3 млThermo FisherA52971
Многопористость хлорида натрияSigmaS7653
Многопористость хлорида натрияSigmaS7653
Stericup Быстросъемная вакуумная одноразовая система фильтрацииMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Увеличение 10/300 GLCytiva29148721
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202S
T4 ДНК-лигаза буфер - 10X с 10mM АТФNew England BiolabsB0202A
тетрациклина гидрохлоридMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XАмериканский биоаналитический9002-93-1
15519028 Плагин стабилизатора 100X TIRF SENP2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972(2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90(2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196(2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132(2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243(2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833(2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216(2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761(2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118(2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864(2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2(2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180(2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147(2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216(2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563(2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin 7a PurificationMultiBac SystemBiophysical CharacterizationHuman Myosin 7aActin Based MotorUsher SyndromeProtein ExpressionIn Vitro MotilityFluorescence MicroscopyMotor Protein Complex

Related Articles