Методическая статья

Поясничная интратекальная инъекция векторов генной терапии для таргетирования центральной нервной системы у мышей и крыс

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67138

⸱

16 мая 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Поясничная интратекальная инъекция представляет собой трансляционно релевантный путь введения генной терапии в центральную нервную систему. Этот всеобъемлющий стандартизированный протокол для интратекальных инъекций поясничного отдела новорожденных, молодых и взрослых мышей и крыс призван помочь исследователям использовать эту технику для доклинических исследований генной терапии.

Аннотация

Одним из методов воздействия на центральную нервную систему для лечения неврологических заболеваний является использование поясничного интратекального пути введения. Этот подход обходит гематоэнцефалический барьер для прямого доступа к спинномозговой жидкости и преимущественно нацелен на клетки центральной нервной системы. Многочисленные опубликованные доклинические исследования с использованием поясничного интратекального пути инъекции способствовали развитию клинических испытаний генной терапии; Однако описанные протоколы изменчивы и рассредоточены по нескольким ресурсам. Здесь представлен полный набор протоколов интратекальных инъекций поясничного отдела новорожденным, ювенильным и взрослым мышам и крысам для доклинических исследований генной терапии. При правильной подготовке эту технику инъекций можно выполнить быстро и надежно. В дополнение к подробному описанию протокола инъекции на каждой стадии развития, обсуждаются связанные с этим параметры, такие как объем инъекции, которые могут повлиять на результаты исследования. Чтобы продемонстрировать применение поясничных интратекальных инъекций для воздействия на центральную нервную систему, представлена экспрессия аденоассоциированного вируса серотипа 9 в головном мозге, спинном мозге и периферических тканях после успешной или неудачной инъекции.

Введение

Проблема в лечении неврологических заболеваний, которые требуют глобальной доставки через центральную нервную систему (ЦНС), но в остальном являются хорошими кандидатами для генной терапии, в значительной степени объясняется неэффективным нацеливанием на ЦНС и соответствующие типы клеток1. В настоящее время проводится значительный объем исследований по оптимизации глобального нацеливания на клетки и ткани ЦНС путем разработки средств доставки 1,2. Тем не менее, достаточно широкая доставка векторов все еще может быть достигнута с помощью современной технологии генной терапии векторов с использованием определенных комбинаций вирусных векторов и путей введения 3,4. В настоящее время золотым стандартом для получения широкой доставки ЦНС в результате однократного лечения является использование аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9) вместе с прямой инъекцией в спинномозговую жидкость (ликвор).

Существует три типичных пути введения для прямых инъекций спинномозговой жидкости: поясничный интратекальный (IT), внутримозговой (ICV) и интрацистернальный (ICM)5. Каждый из этих путей введения приводит к различным паттернам биораспределения в ЦНС и периферических тканях, но все они имеют преимущество в обходе гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для достижения клеток ЦНС, которые способствуют патологии неврологических заболеваний и фенотипам6. Инъекция ИТ в поясничный отдел позвоночника является стандартом для клинического использования при доставке лекарств людям, поскольку клиническая процедура является рутинной и простой, с меньшей инвазивностью по сравнению с инъекциями ICV и ICM.

Инъекции ИТ в поясничном отделе позвоночника являются признанной методикой, которая широко используется в области анестезии и обезболивания, первая статья была опубликована в 1885 году. Первый протокол инъекций ИТ в поясничном отделе позвоночника у взрослых мышей был опубликован в 1980году8, и с тех пор он был широко принят и пересмотрен9. В эти протоколы были внесены небольшие коррективы или усовершенствования 10,11,12, включая метод сохранения продукта 13. Протоколы инъекций ИТ в поясничном отделе позвоночника взрослым крысам также были впервые опубликованы в 1976 году, с катетеризацией при хроническом введении14 и прямой инъекцией при однократном лечении15. Совсем недавно группы опубликовали протоколы инъекций ИТ в поясничный отдел у неонатальных или молодых мышей и крыс 16,17.

Широкое внедрение и валидация этого метода обхода ГЭБ и клеток-мишеней в ЦНС привели к многочисленным успешным доклиническим и клиническим исследованиям генной терапии для лечения неврологических заболеваний. Положительные данные об эффективности и безопасности у мышей, крыс и приматов, моделирующих неврологические заболевания, вызвали волнение и интерес к потенциальной клинической пользе для этих заболеваний 18,19,20,21,22,23. Некоторые из этих исследований в настоящее время проходят клинические испытания (например, идентификаторы clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 и NCT05518188)3,6. В этой статье описан простой протокол инъекций поясничного отдела IT мышам и крысам разного возраста, без удаления спинномозговой жидкости, который может быть использован для проектов трансляционной генной терапии. Этот протокол похож на уже имеющиеся протоколы, которые широко распространены; Тем не менее, имеет смысл процитировать эти соответствующие протоколы в одном месте для легкого доступа и ознакомления, вместе с сопутствующими видеовизуальными материалами. Этот протокол объясняет инъекцию неонатальным мышам и крысам в постнатальный день (P) 0-1 и молодым мышам и крысам P21, с репрезентативными результатами успешной и неудачной инъекции ИТ в поясничный отдел позвоночника в P1 у мышей. В ходе обсуждения рассматриваются распространенные ошибки и конкретные детали, требующие пристального внимания при выполнении этой процедуры, а также рекомендации о том, как практиковать эти инъекции до начала доклинического исследования.

Протокол

Описанные здесь процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Юго-западном медицинском центре Техасского университета. Самцы и самки мышей дикого типа C57BL6/J в возрасте P1-P28 использовались для протоколов с участием мышей. Самцы и самки крыс дикого типа Sprague-Dawley в возрасте P1-P56 использовались для протоколов с участием крыс. За исключением операции по выживанию, описанной в разделе 3, все остальные процедуры вызывают лишь кратковременный дискомфорт и не требуют использования анестетиков или анальгетиков. Люди должны следить за лабораторными животными на предмет большего, чем кратковременный дискомфорт, и обращаться за рекомендациями к своему персоналу IACUC и ветеринарному персоналу о необходимости использования анестетиков и анальгетиков. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Поясничная IT-инъекция мышам >P21

  1. Подготовка
    1. Приготовьте растворы для инъекций, включая вектор для генной терапии в желаемой концентрации (концентрациях) и контрольный раствор (обычно буфер для рецептуры, используемый при производстве векторов). Инъекционные растворы должны быть стерильными и оставаться стерильными на протяжении всей процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны оставаться на льду в течение всей процедуры.
    2. Соберите и продезинфицируйте все материалы, включая шприц и иглу, пипетку и раствор для инъекций. Следуйте организационным рекомендациям по использованию шкафов биобезопасности и воздействию инъекционных средств. Описанные здесь процедуры проводились в шкафу биобезопасности класса 2.
    3. С помощью микролитровой пипетки отмерьте нужный объем инъекционного раствора и переложите его на стерильную парафиновую пленку. Обычно используется объем инъекции 5 μл, который рассматривается как целевой объем для взрослых мышей >P21 (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости объем можно увеличить; Тем не менее, за животными следует тщательно следить на предмет побочных реакций на большие объемы инъекций. Смотрите раздел «Обсуждение» для получения подробной информации об объеме инъекций и побочных реакциях. Раствор также можно переносить непосредственно с наконечника пипетки на шприц или использовать калиброванные газонепроницаемые микролитровые шприцы для непосредственного измерения объема раствора для инъекций.
    4. Наберите раствор в микролитровый шприц с помощью иглы 30 г 0,5 дюйма, стараясь не набрать пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибр и длина иглы могут повлиять на проникновение в кожу. При рассмотрении размера используемого шприца объем инъекции не должен быть менее 10% от емкости шприца. При объемах, превышающих 50% емкости шприца, убедитесь, что поршень можно легко нажать указательным пальцем. Если поршень не может быть легко нажат, используйте шприц большей емкости.
  2. Сдерживающий
    1. Доминирующей рукой держите находящуюся в сознании (необезболивающую) мышь за хвост на бумажном полотенце. Бумажное полотенце поможет сдержать, успокоить, а мышь не укусит. Мышь должна находиться в нейтральном положении лежа так, чтобы боковая сторона тела была обращена к вам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости обучать или приучать мышей к этому ограничителю до процедуры. Мыши могут испытывать трудности из-за сдержанности, но не должны вызывать специфическую болевую реакцию. Если наблюдается более чем кратковременная реакция на боль, может потребоваться введение анальгетиков; Обратитесь за ветеринарной помощью.
    2. Недоминирующей рукой сложите часть бумажного полотенца на голову и верхнюю часть тела мыши и крепко возьмитесь за тазовый пояс между недоминирующим большим и указательным пальцами. Следите за тем, чтобы ладонь была сложена, упираясь в голову мыши. Подвздошный гребень мыши должен быть пальпируемым и располагаться в центре дистальной фаланги каждого пальца (рис. 1A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживающие средства от рук или бумажного полотенца не должны ухудшать дыхание.
    3. Аккуратно вращайте основание хвоста, чтобы обеспечить правильное выравнивание позвоночника. Таз мыши должен быть квадратным, таким, чтобы позвоночные отростки поясничного отдела позвоночника располагались перпендикулярно рабочей поверхности.
    4. Промокните тыльную поясничную область мыши с помощью 70% спиртовой салфетки.
    5. Разделите волосы на расстоянии ~2-6 мм краниально к гребню подвздошной кости, чтобы помочь визуализировать место инъекции.
    6. Нащупайте межпозвоночное пространство L4-L5 или L5-L6, ~2-6 мм краниально от гребня подвздошной кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное расстояние зависит от размера и возраста мыши.
  3. Инъекция
    1. Доминирующей рукой удерживайте центр микролитрового шприца и расположите его перпендикулярно позвоночнику мыши в межпозвоночном пространстве L4-L5 или L5-L6. Убедитесь, что поршень шприца можно нажать указательным пальцем без чрезмерного движения руки. Скосом иглы обращенной к голове мыши прокалывают кожу над межпозвоночным пространством.
    2. Когда на кончике иглы прощупываются края кости вокруг межпозвонкового пространства, уменьшите угол наклона шприца до 30-45 градусов (рисунок 1А).
    3. Игла должна проскальзывать в межпозвоночное пространство, вызывая резкий щелчок хвостом, и должна быть плотно зажата между позвонками.
    4. Стараясь не сместить шприц, нажимайте на поршень равномерно, чтобы раствор подавался в течение 10 секунд.
    5. Удерживайте шприц на месте в течение 15-30 секунд после полного нажатия на поршень, чтобы обеспечить рассеивание раствора и предотвратить обратный поток.
    6. Плавно и медленно извлекайте шприц из мыши под тем же углом входа 30-45 градусов. Когда игла будет извлечена, поверните шприц, чтобы предотвратить обратный поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не продвигать иглу при вращении шприца, так как это может привести к физическому повреждению спинного мозга.
    7. Освободите мышь от ограничителя и верните ее в домашнюю клетку.
    8. Наблюдайте за мышью после инъекции на предмет аномальной способности передвижения, двигательных нарушений, нарушений дыхания и координации. Смотрите обсуждение для получения дополнительной информации о побочных реакциях.
    9. Очищайте оборудование, следуя рекомендациям производителя. Для многократных инъекций рекомендуются разные шприцы для каждого вектора генной терапии и контрольного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Съемные иглы можно чистить, стерилизовать и использовать повторно несколько раз; Однако тупые иглы использовать не стоит, так как они могут навредить животному и увеличить вероятность пропущенных уколов. Тупая игла не проколет кожу легко, и от нее следует отказаться соответствующим образом. Если количество шприцев ограничено, рекомендуется завершить все инъекции носителя до того, как перейти к вектору генной терапии, и ввести наименьшую дозу генной терапии перед введением более высоких доз.
    10. Следуйте рекомендациям учреждения по стерилизации оборудования между животными.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема расположения пальцев и шприца для интратекальной инъекции в поясничном отделе позвоночника у мышей и крыс. (A) Вид сбоку мыши >P21, показывающий размещение иглы и изменение угла наклона шприца во время инъекции в поясничный отдел IT. Пунктирный красный овал указывает на расположение пальца над подвздошным гребнем мыши. Увеличенный вид позвоночника показывает интратекальное пространство (синий) с приблизительным расположением иглы (зеленая стрелка) и спинной мозг (розовый). Дорсальный вид (B) мыши >P21, (C) мыши D) крысы >P21, с опорными точками для размещения иглы (зеленый круг), тазового пояса (пунктирный желтый овал) и размещения пальцев (пунктирный красный овал). Место разреза и ретракторы также изображены на рисунке (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Поясничная IT-инъекция мышам и крысам

  1. Подготовка
    1. Выполните шаг 1.1. Единственным исключением является объем впрыска на шаге 1.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые объемы инъекций для неонатальных мышей (P0-P1) не должны превышать 3 μл, для молодых мышей (P5-P7) не должны превышать 5 μл, а для молодых мышей (P10) не должны превышать 10 μл. Рекомендуемые объемы инъекций для неонатальных крыс (P0-P1) не должны превышать 5 μл, для молодых крыс (P5-P7) не должны превышать 10 μл, а для молодых крыс (P10) не должны превышать 30 μл (Таблица 1).
  2. Сдерживающий
    1. Используя доминирующую руку, держите мышь/крысу за хвост на бумажном полотенце. Мышь/крыса должна находиться в нейтральном положении лежа так, чтобы боковая сторона тела была обращена к вам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши/крысы могут испытывать трудности из-за ограничения, но не должны вызывать специфическую болевую реакцию. Если наблюдается более чем кратковременная реакция на боль, может потребоваться введение анальгетиков; Обратитесь за ветеринарной помощью.
    2. Мягко, но крепко возьмитесь за тазовый пояс между недоминантным большим и указательным пальцами. Гребень подвздошной кости должен быть пальпируемым и располагаться в центре дистальной фаланги каждого пальца (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом возрасте нет опасений быть укушенным, поэтому наматывать мышь/крысу бумажным полотенцем не требуется. У крыс P5-10 может потребоваться использовать бумажное полотенце, чтобы держать более крупных крысят неподвижными.
    3. Аккуратно вращайте основание хвоста, чтобы обеспечить правильное выравнивание позвоночника. Таз мыши/крысы должен быть квадратным, чтобы позвоночные отростки поясничного отдела позвоночника располагались перпендикулярно рабочей поверхности.
    4. Промокните спинную поясничную область мыши/крысы 70% спиртовой салфеткой.
    5. Сделайте пробор между волосами, если применимо, на ~1-3 мм краниально к гребню подвздошной кости, чтобы помочь визуализировать место инъекции. Визуализация целевой области легче у молодых мышей/крыс. У безволосых новорожденных в межпозвоночном пространстве может быть видна вмятина.
    6. Нащупайте или визуализируйте межпозвоночное пространство L4-L5 или L5-L6, ~1-3 мм краниально от гребня подвздошной кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное расстояние варьируется в зависимости от размера и возраста мыши/крысы.
  3. Инъекция
    1. Используя доминирующую руку, удерживайте центр микролитрового шприца и расположите его под углом 30-45 градусов к позвоночнику мыши/крысы. Скосом иглы к голове мыши/крысы проколите кожу примерно на 1-3 мм от межпозвоночного пространства. Из-за наклонной ориентации шприца точка введения на коже находится немного каудально по отношению к межпозвоночному пространству.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние может меняться в зависимости от возраста и размера мыши/крысы.
    2. Остальные шаги идентичны шагам 1.3.3-1.3.10 мышей >P21.

3. Поясничная IT-инъекция крысам >P21

ПРИМЕЧАНИЕ: В литературе описано множество процедур внутривенных инъекций, начиная от техник без анестезии и заканчивая более обширными хирургическими подходами14,15. Описывается процедура прямого введения с использованием малоинвазивной методики с использованием легкой анестезии и небольшого разреза кожи. Использование анестезии, такой как изофлуран, может помочь с сдержанностью, расслабить мускулатуру и предотвратить движение во время инъекции. Небольшой разрез на коже над местом инъекции повышает точность инъекции, позволяя визуализировать межпозвоночное пространство и устраняя необходимость прокола через толстую кожу. Из-за разреза требуется применение анестетиков и анальгетиков. С практикой стало возможным выполнять инъекции ИТ в поясничный отдел у крыс старше P21 без анестезии или разреза по усмотрению пользователя и в ожидании институциональных требований15. Следуйте рекомендациям и рекомендациям учреждения в отношении анестезии, соответствующих анальгетиков и хирургии выживания лабораторных животных.

  1. Подготовка
    1. Выполните шаг 1.1. Единственными исключениями являются объем инъекции на шаге 1.1.3 и размер иглы на шаге 1.1.4. Объемы инъекций для крыс могут сильно варьироваться в зависимости от возраста и размера тела. Смотрите раздел «Обсуждение» для получения дополнительной информации об объеме инъекций в разном возрасте (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослым крысам рекомендуется использовать иглу размером 27 г x 1 дюйм, так как иглы меньшего калибра могут гнуться, а более короткие иглы могут недостаточно проникать во внутрибольничное пространство. При желании можно использовать более длинную (1,25-1,5 дюйма) иглу.
    2. Обезболите крысу с использованием предпочтительного и одобренного анестетика (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
      Примечание: Для описанных здесь процедур крысам подвергали анестезии с использованием газа изофлурана и смеси лидокаина в соотношении 1:1: бупивакаин использовался в качестве местного анестетика. Температура тела должна поддерживаться с помощью утвержденного внешнего источника тепла на протяжении всей процедуры и восстановления.
    3. Следуйте стандартной асептической подготовке места хирургического вмешательства для каждого животного. Кратко побрейте дорсальную поясничную область и подготовьте кожу хирургическим скрабом, бетадином и 70% изопропиловым спиртом.
  2. Хирургическое вмешательство
    1. Поместите крысу в нейтральное положение лежа так, чтобы боковая сторона тела была обращена к вам.
    2. Пальпируйте тазовый пояс, определив гребень подвздошной кости и пояснично-крестцовое соединение. У крыс >P21 позвоночные отростки могут быть легко идентифицированы.
    3. С помощью скальпеля сделайте надрез на 1 см над межпозвоночным пространством L4-L5 или L5-L6. Разрез должен затрагивать только кожу и нижележащую фасцию, оставляя мышцу нетронутой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать ретракторы, чтобы удерживать кожу открытой во время оставшейся части процедуры.
    4. Мягко, но крепко возьмитесь за тазовый пояс между недоминантным большим и указательным пальцами. Гребень подвздошной кости должен быть пальпируемым и располагаться в центре дистальной фаланги каждого пальца (Рисунок 1D). Используйте москитные щипцы для зондирования вдоль средней линии спины, чтобы найти межпозвоночное пространство.
  3. Инъекция
    1. Используя доминирующую руку, удерживайте центр микролитрового шприца и расположите его перпендикулярно позвоночному пространству крысы в межпозвоночном пространстве L4-L5 или L5-L6. Следите за тем, чтобы поршень шприца можно было надавить указательным пальцем без чрезмерного движения руки. Скосом иглы обращенной к голове крысы проколите иглой мышцу над межпозвоночным пространством.
    2. Введите иглу в межпозвоночное пространство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла может оказывать небольшое сопротивление при прохождении между позвоночными отростками, и для прохождения через этот зазор может потребоваться небольшая регулировка угла наклона шприца. Однако она должна оставаться примерно под углом 90 градусов, перпендикулярно позвоночнику. Будет ощущаться хлопок, когда игла войдет во внутрибольничное пространство. В зависимости от параметров анестетика взмах хвостом или ногой может быть или не быть заметным. Игла должна быть плотно зажата между позвонками.
    3. Соблюдая осторожность, чтобы не сдвинуть шприц с места, нажмите на поршень, чтобы подать раствор в течение 30 секунд.
      Примечание: В отличие от инъекций мышам, при использовании этого метода может оказаться невозможным уменьшить угол шприца у крыс >P21. Большие объемы следует впрыскивать медленнее, чтобы предотвратить чрезмерное нарастание давления.
    4. Удерживайте шприц на месте в течение 30-60 с после полного нажатия на поршень, чтобы обеспечить рассеивание раствора и предотвратить обратный поток.
    5. Плавно извлеките шприц из крысы. Когда игла будет извлечена, поверните шприц, чтобы предотвратить обратный поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не продвигать иглу при вращении шприца, так как это может привести к физическому повреждению спинного мозга.
    6. Закройте разрез кожи с помощью утвержденного метода, например, шовного материала или зажимов для раны. У крыс, используемых в этом протоколе, кожа была закрыта непрерывным внутрикожным или простым прерывистым методом с использованием шва 5-0 PDS II.
    7. Восстановите крысу после обезболивания.
    8. Следуйте шагам 1.3.9-1.3.10 и всем рекомендациям по послеоперационному уходу.

Результаты

Несмотря на то, что многие факторы могут влиять на трансдукцию вектора генной терапии, гистологическое окрашивание тканей остается наиболее точным методом определения успешности интратекальных инъекций поясничного отдела позвоночника (IT). Широкое и равномерное распределение вектора генной терапии в центральной нервной системе (ЦНС) после инъекции свидетельствует об успешной процедуре. На рисунке 2C представлена успешная инъекция самокомплементарной AAV9-опосредованной генной терапии, стимулирующей слабую повсеместную экспрессию трансгена под промотором JeT в дозе 1,3 × 1011 vg/мышь у неонатальных мышей (P1) через 4 месяца после инъекции. Анализ РНК с использованием зонда, нацеленного на трансген, доставляемый генной терапией, выявляет широкое распространение в поясничном отделе спинного мозга, шейном отделе спинного мозга и головном мозге. В раздел включены разделы печени и сердца, чтобы подчеркнуть, что даже при прямом введении спинномозговой жидкости (СМЖ) вектор генной терапии все еще может быть распределен по периферическим тканям.

figure-results-1
Рисунок 2: Окрашенные 5-микронные участки ткани ЦНС и периферической ткани мыши через 4 месяца после инъекции в P1. Красное окрашивание указывает на экспрессию трансгена с помощью РНК-скопа, а синее контрокрашивание ядер осуществляется с помощью гематоксилина. (А) Инъекция с буфером для контрольной состава. (B) Неудачная внутрипаренхиматозная инъекция вектором AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Успешная инъекция ИТ-инъекции в поясничный отдел позвоночника с помощью вектора AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). Вектор генной терапии, используемый в (B) и (C), вводили в трансляционно значимой дозе 1,3E11 vg/мышь. Масштабная линейка: верхняя панель (5 мм); нижняя панель (1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Концентрированная экспрессия в поясничном отделе спинного мозга в сочетании с отсутствием экспрессии в головном мозге, как показано на рисунке 2B, может указывать на интрапаренхиматозную инъекцию спинного мозга и должна рассматриваться как неудачная инъекция. Это происходит, когда игла вводится слишком глубоко в позвоночный столб, мимо интратекального пространства и в спинной мозг. Кроме того, очень низкая экспрессия или ее отсутствие в спинном и головном мозге (не показано) также следует рассматривать как неудачную нецелевую инъекцию, предполагая, что вектор и доза используются там, где ожидается широкое распределение ЦНС. Это может быть связано с тем, что игла вводится недостаточно далеко или не расположена латерально к средней линии.

Паттерны экспрессии, наблюдаемые при успешных инъекциях, могут различаться в зависимости от следующих восьми факторов: (1) возраст на момент инъекции, (2) ранее существовавший иммунитет, (3) скорость инфузии, (4) вектор генной терапии, (5) доза генной терапии, (6) белки клеточной поверхности, (7) тропизм и (8) если применимо, подходящий выбор промотора длястимулирования экспрессии трансгена.. В то время как паттерны экспрессии могут различаться, широкое, равномерное, широко распространенное распределение будет универсальным до тех пор, пока доза достаточно высока с эффективным вектором, таким как AAV9.

Основными ограничениями использования гистологического анализа для подтверждения успешности инъекции ИТ в поясничном отделе являются длительное время ожидания — ожидание до конца исследования, после проведения вскрытия и сбора тканей — и обширные ресурсы, необходимые для обработки тканей всех мышей в крупном исследовании генной терапии. К сожалению, наш опыт показывает, что немедленные и прямые признаки положительной или отрицательной инъекции могут быть ненадежными; Тем не менее, рефлекс щелчка хвостом при входе иглы в интратекальное пространство является хорошим индикатором успешного позиционирования в режиме реального времени и, вероятно, указывает на успешную инъекцию. Не путайте подергивание, когда игла прокалывает кожу у мыши/крысы без анестезии с реакцией хвоста на попадание иглы во внутрибольничное пространство. Использование фармакологических средств, таких как NMDA, вещество Р и лидокаин, как во время обучения, так и в смеси с экспериментальным раствором для инъекций, как сообщается, обеспечивает более непосредственное указание на успех инъекции 9,11,24. Если речь идет об этих препаратах, важно оценить их совместимость с вектором генной терапии.

Обсуждение

Инъекция поясничного отдела IT – это быстрая и малоинвазивная процедура, которая надежно доставляет вектор генной терапии в спинномозговую жидкость для лечения заболеваний ЦНС 5,6. Процедура имеет трансляционное значение, и в описанном здесь протоколе подробно описано, как выполнять этот путь введения у мышей и крыс всех возрастов, от новорожденных до взрослых. Важно определить этот протокол для мышей и крыс всех возрастов, а также предоставить вспомогательные видеоматериалы, чтобы помочь исследователям во внедрении этого метода для введения генной терапии. Опыт нашей лаборатории показывает, что этот протокол может быть последовательно реализован для нескольких пользователей и исследований с течением времени 18,25,26,27,28,29,30.

Существуют важные различия при выполнении инъекции поясничного отдела IT у молодых мышей/крыс по сравнению со старыми мышами/крысами, в первую очередь в угле, под которым игла вводится в позвоночник, и рекомендуемом объеме, который вводится. Зарегистрированные объемы инъекций ИТ в поясничный отдел значительно варьируются в разных исследованиях и у разных видов31. Учет объема инъекции важен для того, чтобы избежать длительного повышения внутричерепного давления (ВЧД), которое может нарушить поток ликвора и мозговой крови, вызвать дискомфорт и привести к хроническим неврологическим осложнениям, включая гидроцефалию, ишемию, клеточное повреждение и смерть32,33. ВЧД определяется объемом ликвора, мозговой крови и ткани ЦНС, которые не могут быть напрямую связаны с массой тела. При нормальном функционировании ВЧД автоматически регулируется многими факторами, включая объем ликвора, объем мозговой крови, дыхание, положение тела, скорость производства ликвора и скорость оттока ликвора в кровь33,34. Таким образом, объемы инъекций ИТ должны определяться на основе свойств спинномозговой жидкости (Таблица 1), а не массы тела 25,27,28,30. Жирным шрифтом выделены рекомендуемые объемы для введения в каждом возрасте у каждого вида.

Объем ИТ-инъекцийЗначения спинномозговой жидкости для взрослых
P0-1 (μл)Р5-7 (мкл)P10 (μл)>P21 (μл)Общий объем (μл)Производительность (μл/мин)Оборот (ч)Внутричерепное давление (мм рт.ст.)
Мышей355-105-2030-4025,300,32-0,3525,301,7-225,305,0 +/- 0,528
Крыс55-1010-3010-200 (20-75)150251,7-2,8252-2.66258,6 +/- 1,7,27

Таблица 1: Сводные данные об объемах инъекций ИТ в поясничный отдел позвоночника мышам и крысам в разном возрасте. Рекомендуется использовать жирные значения, которые были доставлены в целости и сохранности. Максимально возможные объемы формально не оценивались. Дополнительная информация об известных параметрах спинномозговой жидкости - общем объеме, скорости производства, обороте и внутричерепном давлении - у мышей и крыс включена для справки.

В этой области не хватает знаний о верхнем пороге для разовых объемов болюсных ИТ-инъекций. У взрослых людей, крыс и мышей, у которых известен объем СМЖ, увеличение общего объема СМЖ на 30%, по-видимому, не вызывает хронических травм или заболеваний 31,33,35,36. Отсутствие известных объемов спинномозговой жидкости у ювенильных или неонатальных мышей делает невозможной подобную экстраполяцию. Некоторые группы начинают изучать объем и продукцию спинномозговой жидкости у молодых животных37. До тех пор, пока не будут проведены дополнительные исследования в этих областях, объем инъекций будет по-прежнему зависеть от значений, сообщаемых исследователями.

У мышей и крыс, особенно при лечении в более молодом возрасте или при больших объемах инъекций, может наблюдаться напряжение мышц, разгибание конечностей, учащенное дыхание или временный паралич задних конечностей, который должен пройти сам по себе в течение нескольких минут. В крайних случаях острое повышение ВЧД может вызвать сердечно-сосудистые и дыхательные аномалии, которые могут быть смертельно опасными32,33. Если какие-либо постпроцедурные аномалии сохраняются через 24 ч, мышей/крыс следует удалить из исследования и гуманно усыпить. Стойкий паралич задних конечностей может возникнуть, если игла введена слишком далеко, воздействуя на спинной мозг. Это может быть связано с распространенной ошибкой при выполнении инъекции поясничного отдела IT: движение шприца после взмаха хвостом при нажатии на поршень. Следует избегать движений шприцем и иглой. Если с помощью первого прокола невозможно определить правильное положение, можно предпринять вторую попытку в том же месте. Если вторая попытка также не увенчалась успехом, попробуйте изменить положение иглы, чтобы нацелиться на следующее межпозвоночное пространство. Обратите внимание, что множественные уколы иглой могут привести к утечке последующей успешной инъекции.

Чтобы стать опытным в инъекциях ИТ для поясничного отдела, может потребоваться время. Чтобы практиковать инъекции в качестве терминальной процедуры, следуйте приведенному выше протоколу с использованием одобренного раствора красителя, такого как синий Эванса или зеленый краситель Маккормика с концентрацией 0,2 микрона (рис. 3), или с помощью фармакологических средств, рассмотренных в разделе «Репрезентативные результаты». Использование красителя рекомендуется для устранения неполадок и освоения инъекции, потому что в течение 1 минуты легко определить, была ли инъекция успешной или неудачной. Практика с красителем предназначена только для процедур, не связанных с выживанием, так как у животных может развиться реакция на краситель при непосредственном введении в ЦНС. Эта реакция может произойти в течение минуты после успешной инъекции и характеризуется быстрым зудом и извивающимися движениями. Животные должны быть немедленно усыплены, как только будет замечена такая реакция, чтобы свести к минимуму дискомфорт. После успешной практики инъекции красителя краситель останется локализованным в позвоночнике (без красителя в близлежащих периферических тканях) и будет двигаться вверх по позвоночному столбу к мозжечку, головному мозгу и обонятельным луковицам. В P1 кожа достаточно прозрачна, чтобы можно было увидеть, как краситель движется вниз по позвоночному столбу в хвосте. Если краситель не достигает мозга в течение нескольких минут, инъекция не удается.

figure-discussion-1
Рисунок 3: Зеленый краситель Маккормика в мозге после успешной практики инъекций в поясничный отдел IT. Все мозги получены от мышей P21, которым ввели краситель в объеме 5 мкл, и показаны в вентральном виде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Для получения дополнительной информации о соответствующих параметрах, связанных с дизайном доклинических испытаний, таких как титр вируса и дозы, см. ранее опубликованные обзоры 3,6,31.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить центральное предприятие по производству вирусного вектора AAV Юго-западного университета Техаса за производство вектора AAV9 и Юхуи Ху, научного сотрудника лаборатории Грея, за обработку и окрашивание ткани, представленной на рисунке 2.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтр 0,2 мкмЭлектронная микроскопия Sciences67005Используется для фильтрации раствора красителя
от 0,5 до 10 &; L ПипеткаEppendorfTI13690026Используется для измерения раствора для инъекций
1,5 мл МикропробиркаEppendorf22364111Используется для хранения растворов для инъекций
10 & микро; L ШприцHamilton7635-01Объем впрыска не должен быть менее 10% от емкости шприца
от 10 до 100 мкм; L ПипеткаEppendorfTI13690029Используется для измерения раствора для инъекций
10&микро; l Наконечники для пипетокСША Scientific Inc11203810Используются для измерения раствора для инъекций
100 и микро; L ШприцHamilton7638-01Только для крыс >21. Объем инъекции должен быть не менее 10% от емкости шприца
100&мкм; L Наконечники для пипетокСША Scientific Inc11231840Используются для измерения раствора для инъекций
25 и микро; L ШприцHamilton7636-01Идеально подходит для 5-10 & микро; L инъекции. Объем инъекции не должен быть менее 10% от емкости шприца
27 калибра Игла(ы)Hamilton7803-01Только для крыс >21. 27 калибр, Малая игла Hub RN, 1 дюйм, тип острия 4 при 12&�;, 6/PK
30 Игла(ы)Hamilton7803-1730 калибр, Малая игла Hub RN, 0,5 дюйма, тип точки 4 при 12&�С, 6/PK
50 & микро; L ШприцHamilton7637-01Только для крыс >21. Объем инъекции должен быть не менее 10% от емкости шприца
70% этанолPharmco111000140Используется для дезинфекции рабочего места и оборудования
70% Прокладки для подготовки изопропилового спиртаPDIB60307Используется для приготовления места инъекции
АнальгетикТолько для крыс >21.
Анестетик (изофлуран)Пирамал для интенсивной терапии66794001725Только для крыс >21.
BetadinePurdue Products6906606Только для крыс >21. Используется для подготовки кожи
Контрольный растворРаствор для инъекций
Раствор красителя (зеленый)McCormickДля практики, не только для выживания
ПерчаткиKimberly-Clark19-149-863BСИЗ
Ведро для льда со льдомFisher Scientific03-395-150Поддерживать вирусный векторный раствор на льду 
Щипцы от комаров (изогнутые или прямые)Fine Science Tools13009-12Только для крыс >21. Используется для пальпации межпозвоночного пространства.
ИглодержателиFine Science Tools12002-12Только для крыс >21. Используется для сшивания кожи с помощью шовной нити
Бумажное полотенцеBerkshire18-998-123Используется для сдерживания взрослых мышей во время инъекции
ParafilmStatLabPM996Используется для набора раствора в шприц
РетракторыStoelting52124PТолько для крыс >21. Используется для удержания открытого разреза кожи
Лезвие скальпеляFine Science Tools10015-00Только для крыс >21. Используется для разреза
Ручка лезвия скальпеляИнструменты для тонкой науки10003-12Только для крыс >21. Используется для разреза
Стерильный шприцFisher Scientific14-955-459Используется для фильтрации раствора красителя
Хирургический скраб (подготовка кожи)Medline Industries Inc.MDS098720Только для крыс >21. Используется для подготовки кожи
Шовный материал или зажимы для ранStoelting50483Только для крыс >21. Используется для закрытия кожи.
Раствор для чистки шприца / иглыHamilton18311Можно использовать альтернативный чистящий раствор
Щипцы для большого пальцаFine Science Tools11019-12Только для крыс >21. Используется при хирургическом доступе и закрытии
раствора для инъекцийVector Solution
Injection

Ссылки

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects. Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  3. Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders. Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).
  4. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).
  5. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
  6. Chen, X., et al. Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration. Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).
  7. Corning, J. L. Spinal anesthesia and local medication of the cord. NY Med. J. , 483-485 (1885).
  8. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: A new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  9. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  10. Choi, S. E., et al. High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery. J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).
  11. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. 144, e58565(2019).
  12. Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice. J Vis Exp. 85, e51229(2014).
  13. Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31(2010).
  14. Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).
  15. Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).
  16. Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. 205, e66463(2024).
  17. Lu, X., Jiang, Y. H. Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery. J Vis Exp. 205, e65761(2024).
  18. Chen, X., et al. Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies. J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).
  19. Deschenes, N. M., et al. Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis. Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).
  20. Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice. Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).
  21. Kagiava, A., et al. Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).
  22. Wong, H., et al. CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice. JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).
  23. Laoharawee, K., et al. Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer. Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).
  24. Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice. Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).
  25. Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).
  26. Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies. Brain Res. 1739, 146832(2020).
  27. Chen, X., et al. AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease. J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).
  28. Karumuthil-Melethil, S., et al. Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant. J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).
  29. Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).
  30. Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice. Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).
  31. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application. Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).
  32. Allen, C. H., Ward, J. D. An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure. Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).
  33. Belov, V., et al. Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications. Front Neurosci. 15, 604197(2021).
  34. Moazen, M., et al. Intracranial pressure changes during mouse development. J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).
  35. Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection. N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).
  36. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).
  37. Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation. Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

спинномозговая жидкостьгематоэнцефалический барьердоставка генов с помощью AAVдоклинические мышиные моделитаргетная доставка в спинной мозгмодели неврологических заболеванийтехника инъекции
Поясничная интратекальная инъекция векторов генной терапии для таргетирования центральной нервной системы у мышей и крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.