Использование анализа теплового сдвига для зондирования связывания субстрата с селенопротеином O

Краткое содержание

В данной работе мы представляем анализ теплового сдвига, высокопроизводительный флуоресцентный метод, используемый для исследования связывания малых молекул с белками, представляющими интерес.

Аннотация

Определение биологической важности белков с неизвестными функциями представляет собой значительное препятствие в понимании клеточных процессов. Несмотря на то, что биоинформатические и структурные прогнозы внесли свой вклад в изучение неизвестных белков, экспериментальные проверки in vitro часто затрудняются оптимальными условиями и кофакторами, необходимыми для биохимической активности. Связывание кофактора не только необходимо для активности некоторых ферментов, но также может повысить термическую стабильность белка. Одно из практических применений этого явления заключается в использовании изменения термической стабильности, измеряемой изменениями температуры плавления белка, для зондирования связывания лигандов.

Анализ теплового сдвига (TSA) может быть использован для анализа связывания различных лигандов с интересующим белком или для поиска стабилизирующего условия для проведения таких экспериментов, как рентгеновская кристаллография. Здесь мы опишем протокол ТСА с использованием псевдокиназы, селенопротеина О (SelO), для простого и высокопроизводительного метода тестирования связывания металлов и нуклеотидов. В отличие от канонических киназ, SelO связывается с АТФ в инвертированной ориентации, чтобы катализировать перенос АМФ к гидроксильным боковым цепям белков в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование белка. Используя сдвиг в температурах плавления, мы получаем важнейшее представление о молекулярных взаимодействиях, лежащих в основе функции SelO.

Введение

Большая часть протеома человека остается плохо охарактеризованной. «Эффект уличного фонаря», описанный Данхэмом и Кустатшером и др., относится к явлению, при котором широко исследованные белки получают больше внимания, оставляя малоизученные белки незамеченными ^1,2. Факторы, способствующие этому эффекту, включают биологическую важность и актуальность определенных белков для заболевания. Более того, предварительные исследования, которые предлагают фундаментальные знания, а также наличие инструментов для функционального анализа, еще больше стимулируют исследования хорошо изученных белков ^1,2. Такие проекты, как Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium и Enzyme Function Initiative, направлены на характеристику малоизученных белков с использованием структурной и функциональной протеомики ^2,3,4. Дополнительным подходом к идентификации молекулярных функций недостаточно изученных белков является изучение взаимодействий этих белков с малыми молекулами для получения ценной информации о регуляции и специфичности субстрата.

Связывание малых молекул может повысить термическую стабильность белка⁵. Это явление, известное как индуцированная лигандом конформационная стабилизация, часто приводит к увеличению температуры плавления белка, что дает измеримое указание на связывание лиганда⁶. Термическая стабильность белка может быть измерена с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), также известной как термофтор, или анализа теплового сдвига (TSA)7,8,9,10. При АСП образец белка подвергают повышению температуры в присутствии экологически чувствительного красителя⁶. По мере того, как белок разворачивается и денатурируется, краситель связывается с обнаженными гидрофобными областями белка и излучает флуоресценцию. Внешние флуоресцентные красители, или экологически чувствительные красители, не имеют собственной флуоресценции и вместо этого флуоресцируют при взаимодействии со своей целевой молекулой ^9,11,12. Наиболее часто используемый краситель, SYPRO Orange, обладает рядом преимуществ, таких как повышенная стабильность и минимальная фоновая флуоресценция ^8,9,12. Примечательно, что SYPRO Orange совместим с системами полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР), учитывая его длины волн возбуждения и излучения около 470 нм и 570 нм соответственно. Эта уникальная функция позволяет проводить высокопроизводительные, точные и чувствительные измерения, совместимые с системами обнаружения флуоресценции, обычно используемыми в системах ОТ-ПЦР⁸.

TSA является универсальным инструментом для исследования взаимодействия белков с потенциальными кофакторами или лекарственными препаратами, а также для определения стабилизирующих условий для кристаллографии. Некоторые из его преимуществ по сравнению с другими методами грохочения заключаются в относительной простоте настройки и высокой производительности при использовании 96- или 384-луночных планшетов 13,14,15. Разработка этого метода стала преобразующим для исследований по открытию лекарств, обеспечивая удобство и позволяя изучать различные добавки, такие как ионы, лиганды и лекарства ^6,16. Более того, адаптивность TSA побудила ученых расширить его применение, облегчая измерение аффинностей связывания наряду со скрининговыми анализами^17,18. TSA является эффективным инструментом в исследованиях структурной биологии для выявления условий, способствующих стабилизации белка, представляющего интерес для кристаллизации¹⁹. Таким образом, его гибкость и относительная легкость сделали TSA краеугольным камнем в определении характеристик белков. Здесь мы будем использовать TSA для анализа связывания металлов и нуклеотидов с малоизученной псевдокиназой, селенопротеином О (SelO), в качестве примера.

Киназы являются одним из наиболее целевых семейств белков в Drug Discovery²⁰. Предполагается, что примерно 10% киназ человека являются неактивными и называются псевдокиназами, поскольку в них отсутствуют ключевые каталитические остатки, необходимые для катализа^21,22. Селенопротеин О (SelO) является эволюционно консервативной псевдокиназой, в которой отсутствует консервативный аспартат, присутствующий в каталитическом мотиве HRD²³. У эукариот SelO локализуется в митохондриях и защищает клетки от окислительного стресса^24,25. Структурный и биохимический анализы показывают, что SelO переносит аденозинмонофосфат (АМФ) из АТФ в белковые субстраты в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование²⁵. Недавние исследования показывают, что ферменты, катализирующие АМПиляцию, могут связываться с альтернативными нуклеотидами, такими как UTP in vitro^26,27. В частности, исследования показали, что гомолог SelO из Salmonella typhimurium катализирует белковое UMPylation, или перенос UMP, марганец-зависимым образом²⁸. Учитывая эти интригующие наблюдения, мы протестировали связывание SelO с АТФ и УТФ в присутствии магния и марганца, что служит репрезентативным примером применения TSA. Следующий протокол может быть легко адаптирован для оптимизации и изучения взаимодействий других белков и добавок, представляющих интерес.

Протокол

1. Экспериментальная установка

1. Используйте термоамплификатор, который может обнаруживать флуоресценцию, например, инструмент ОТ-ПЦР, для выполнения описанного протокола. При использовании SYPRO Orange, как описано в этом протоколе, используйте режим сканирования, который позволяет возбуждать около 470 нм и обнаруживать излучение около 570 нм. Запрограммируйте термоамплификатор на удержание образца при температуре 20 °C в течение 2 мин с последующим повышением температуры на 0,5 °C/1 мин до 95 °C; измерять интенсивность флуоресценции каждые 1 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнить необязательный шаг в конце цикла, чтобы вернуть блок образца к температуре 20 °C (Рисунок 1).
2. Каждая реакция содержит четыре компонента: буфер, представляющий интерес, добавку и внешний флуоресцентный краситель. Спланируйте эксперимент таким образом, чтобы включить в него такие элементы управления, как отсутствие белка, отсутствие красителя, белок без добавок и только добавки, чтобы определить любую фоновую флуоресценцию, которая может повлиять на интерпретацию результатов. Если это возможно, включите положительный контроль, такой как добавка, которая, как известно, связывает и стабилизирует интересующий белок.
3. Для анализа используйте очищенный белок. Чтобы следовать этому примеру, используйте E. coli SelO, экспрессированную и очищенную, как описано ранее^25,29. Вкратце, экспрессируйте His-сумо, помеченный SelO (E. coli SelO ppSumo) в клетках Rosetta DE3 и очищайте его с помощью сродства Ni²⁺-NTA. Расщепите бирку His-сумо с помощью протеазы Ulp и дополнительно очистите SelO с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
4. Флуоресценция SYPRO Orange будет зависеть от его взаимодействия с интересующим белком. Поскольку эти взаимодействия будут варьироваться от белка к белку, оптимизируйте концентрацию белка и красителя для получения максимального сигнала от сигнала к шуму флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: SYPRO Orange не совместим с некоторыми белками и добавками, такими как моющие средства^11,30. Дополнительные внешние красители, перечисленные в ^{пункте 12}, могут быть проверены по мере необходимости.

2. Определение оптимальной концентрации красителя (рисунок 2А)

1. Приготовьте 20 мкл разведений 50x, 40x, 30x, 20x и 10x SYPRO Orange из исходного раствора, который содержится в 5000-кратном содержании ДМСО.
2. Диспонируйте 8 мкл белка 6,25 μM, разведенного в буфере TSA, в шесть отдельных лунок 384-луночного ПЦР-планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем примере мы использовали следующий буфер TSA для выполнения разведений: 10 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT. Выборки могут быть запущены в трех экземплярах для повышения надежности результатов.
3. Добавьте по 1 мкл буфера TSA в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем буфера будет заменен добавлением малых молекул после оптимизации концентрации красителя и белка.
4. Добавьте по 1 мкл каждого серийного разбавления раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку. Добавьте 1 мкл буфера без красителя в конечную лунку для контроля отсутствия красителя.
5. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
6. Кратковременно опустите планшет при 1000 × г в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
7. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

3. Определение оптимальной концентрации белка (рисунок 2В)

1. Приготовьте 20 мкл последовательных разведений 25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ, 3,125 мкМ и 1,56 мкМ белка с использованием буфера TSA (10 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT).
2. Диспенсируйте 8 мкл последовательных разведений белка в пять отдельных лунок 384-луночного планшета.
3. Дозируйте буфер только на^6-й уровень, а также без контроля белка.
4. Добавьте по 1 мкл буфера TSA в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем буфера будет заменен добавлением малых молекул после оптимизации концентрации красителя и белка.
5. Добавьте по 1 мкл каждого 50-кратного раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку.
6. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
7. Кратковременно уменьшите температуру планшета при 1000 × g в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
8. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

4. Постановка эксперимента TSA (Рисунок 3A)

ПРИМЕЧАНИЕ: После оптимизации концентрации белка и оранжевого красителя SYPRO, анализ может быть выполнен с добавлением желаемых малых молекул для анализа связывания.

1. Определите количество условий, учитывая репликации и адекватные элементы управления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы проверим связывание SelO с восемью условиями в трех экземплярах. Включая контрольную группу (без добавки, без белка и без красителя), мы имеем 11 реакций x 3 (трипликативные) = 33 всего реакции.
2. Основываясь на оптимальной концентрации белка и красителя, наблюдаемой для SelO, убедитесь, что каждая реакция содержит 8 мкл белка 6,25 мкм, 1 л добавки и 1 мкл 50x оранжевого красителя SYPRO, что в сумме составляет 10 мкл реакционного объема. Таким образом, конечная используемая концентрация составляет 5 мкМ белка и 5x оранжевый краситель SYPRO.
3. Приготовьте 288 мкл раствора белка 6,25 мкМ с использованием буфера TSA. На этот объем рабочего раствора белка приходится 36 реакций (33 реакции с дополнительными 10% на вариации пипетирования).
4. Диспонируйте 8 мкл белка 6,25 мкМ в отдельные лунки 384-луночного планшета. Выдавайте буфер только для контроля отсутствия белка.
5. Добавьте 1 мкл малых молекул в 10-кратной концентрации, чтобы получить окончательный 1-кратный концентрацию. Чтобы следовать этому примеру, добавьте 1 мкл 20 мМ MgCl2_{для достижения} конечной концентрации 2 мМ. Дозируйте буфер только для контроля без добавок.
6. Добавьте по 1 мкл каждого 50-кратного раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку.
7. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
8. Кратковременно уменьшите температуру планшета при 1000 × g в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
9. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

5. Анализ данных

1. Экспорт данных с аппарата ОТ-ПЦР для единиц относительной флуоресценции (RFU) по отношению к температуре (°C).
2. Используйте выбранное программное обеспечение для извлечения и построения графиков точек данных с точностью до самой высокой интенсивности, измеренной для каждой кривой плавления. Важно подтвердить, что контрольные группы без белка и красителя демонстрируют низкую фоновую флуоресценцию без температурно-зависимого увеличения флуоресценции (рис. 3A, B и дополнительная таблица S1). Выполняйте анализ данных с помощью свободно доступного программного обеспечения, такого как MoltenProt³¹ или DSFWorld³².
3. Определите температуру плавления с помощью сигмоидальной подгонки Больцмана. Температура плавления (T_m) определяется как температура, при которой наблюдается 50% денатурации или половина максимальной интенсивности (Рисунок 3C).
4. Тепловой сдвиг на кривой плавления может указывать на стабилизирующие или дестабилизирующие добавки. Для расчета изменения температуры плавления (T_m) используется формула: T_m= T_{m добавка -} T_m буфер. Положительное значение описывает стабилизирующее состояние или взаимодействующую добавку; отрицательное значение описывает дестабилизирующее состояние (рисунок 3D).

Результаты

Эукариотический SelO состоит из N-концевой митохондриальной последовательности, киназоподобного домена и высококонсервативного селеноцистеина на С-конце белка²³. Этот митохондриально-резидентный фермент кодирует домен псевдокиназы, который сохраняется от бактерий к человеку²³. Структурный анализ гомолога SelO из Pseudomonas syringae выявил аминокислотные изменения в активном центре, которые способствуют связыванию АТФ в инвертированной ориентации по сравнению с каноническими киназами²⁵. Соответственно, SelO катализирует АМПилирование, а не фосфорилирование нескольких белков, участвующих в антиоксидантной сигнализации, для защиты клеток от окислительного повреждения и гибели клеток^. В дополнение к АМПиляции, было показано, что некоторые прокариотические и эукариотические АМПилазы катализируют UMPylation^27,28.

Мы использовали очищенный рекомбинантный E . coli SelO в TSA для изучения связывания нуклеотидов АТФ и UTP с SelO в присутствии двухвалентных катионов. Подобно каноническим киназам, SelO содержит мотив DFG, в котором аспартат связывает ион металла с координирующим нуклеотидом в активном центре. Во-первых, мы оптимизировали концентрацию белка и красителя для надежных флуоресцентных измерений в TSA, определив, что от 5 мкМ до 10 мкМ E. coli SelO является оптимальным при использовании 5x SYPRO Orange (рис. 2). Кроме того, мы показали, что безбелковые белки, как и контрольные группы без красителей, имели низкий флуоресцентный сигнал, который не реагировал на повышение температуры. Мы обнаружили повышение термической стабильности E. coli SelO примерно на +4 °C и +12 °C в присутствии ATP-Mg²⁺ и ATP-Mn²⁺ соответственно (рис. 3). Тем не менее, мы не наблюдали сдвига в термической стабильности при инкубации с UTP, что указывает на то, что E. coli SelO может не проявлять обнаруживаемого связывания с UTP.

Рисунок 1: Настройка термоамплификатора. Пример программы термоамплификатора, используемой для повышения температуры образца на +0,5 °C/мин при измерении флуоресценции SYPRO Orange с помощью канала FRET. Рекомендация также включает инкубацию при температуре окружающей среды в начале и в конце протокола. Аббревиатура: FRET = резонансная передача энергии Фёрстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Оптимизация концентраций белка и красителя. (A) Репрезентативные результаты оптимизации концентрации оранжевого красителя SYPRO с использованием 5 мкМ Escherichia coli SelO. (B) Репрезентативные результаты оптимизации концентрации E. coli SelO с использованием 5-кратного оранжевого красителя SYPRO. Кривая термической денатурации отображает относительные единицы флуоресценции (ось y) по отношению к температуре (ось x). Результаты представляют собой среднее значение ± SD из тройных скважин (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3:Кривые термической денатурации и ΔT_m анализ SelO в присутствии нуклеотидов и двухвалентных катионов. (A) Исходные данные кривых термической денатурации образцов (5 мкМ Escherichia coli SelO в присутствии 200 мкМ катионов АТФ или УТФ и 2 мМ двухвалентных катионов, 5x SYPRO Orange), экспортированных с помощью аппарата ОТ-ПЦР и построенных графиков. SelO ATP-Mg представляет образцы с SelO, ATP и MgCl₂, SelO ATP-Mn представляет образцы с SelO, ATP и MnCl₂, SelO UTP-Mg представляет образцы с SelO, UTP и MgCl₂, SelO UTP-Mn представляет образцы с SelO, UTP и MnCl₂. Обратите внимание, что контрольные группы без красителей и белков демонстрируют низкую флуоресценцию. Результаты представляют собой среднее значение ± SD из тройных скважин (n = 3). (B) Кривые термической денатурации, построенные с максимальной интенсивностью и соответствующие сигмоидальному уравнению Больцмана. Несмотря на то, что ЮТП не влияла на термическую денатурацию SelO, мы наблюдали заметный сдвиг в термической денатурации в присутствии АТФ (фиолетовые кривые). Результаты представляют собой среднее значение ± SD из тройных скважин (n = 3). (C) Гистограмма, отображающая значения T_m, полученные из сигмоидальной аппроксимации Больцмана данных, представленных на рисунке 3B. Результаты представляют собой среднее значение ± SD из тройных скважин (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Гистограмма, отображающая изменение температуры плавления ΔT_m (добавка T_{m -} буфер T_m). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица S1: Примеры данных для TSA SelO в присутствии металлов и нуклеотидов. Электронная таблица исходных данных, экспортированных с аппарата ОТ-ПЦР, и данных, обработанных для удаления значений после максимальной интенсивности РФИ, как описано в шагах протокола 5.1 и 5.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Анализ теплового сдвига (TSA) служит эффективным методом скрининга белок-лигандных взаимодействий, в том числе с кофакторами и ингибиторами. В этом протоколе мы использовали TSA для измерения связывания псевдокиназы SelO с нуклеотидами и двухвалентными катионами. Наши результаты показывают, что SelO проявляет повышенную термическую стабильность в присутствии АТФ и Mg²⁺/Mn²⁺. Это наблюдение согласуется с предыдущими сообщениями, указывающими на то, что гомологи SelO из E. coli, S. cerevisiae и H. sapiens катализируют перенос АМФ из АТФ в гидроксильную боковую цепь белковых субстратов^25,29. Несмотря на то, что TSA дает ценную информацию о связывании нуклеотидов, она может не идентифицировать субстрат in vivo. Другие молекулы, а не только субстрат, также могут влиять на термическую стабильность белка. Чтобы точно идентифицировать субстрат, необходимо учитывать такие факторы, как концентрация клеток и аффинность связывания. Тем не менее, TSA является отличным инструментом для скрининга большого количества условий, таких как связывание малых молекул, с использованием термостабилизации в качестве считывания.

Полезность TSA выходит за рамки его применения при анализе связывания малых молекул с активными или регуляторными центрами белков. TSA внесла значительный вклад в биофизическую характеристику белков, обеспечив стабилизирующие условия, которые делают белок более подходящим для экспериментов по кристаллографии. Примечательно, что TSA имеет ряд преимуществ, в том числе простую настройку и высокую пропускную способность с использованием общедоступных лабораторных материалов, таких как планшеты для ПЦР и машины для ОТ-ПЦР. Эти преимущества позволяют тестировать многочисленные условия, которые могут быть невыполнимыми или простыми при использовании других методов. В многочисленных исследованиях АСК использовался для измерения термической стабильности рекомбинантных белков с библиотекой соединений для определения оптимальных условий кристаллизации белка^19,33.

Включение соответствующих средств контроля необходимо для того, чтобы избежать неправильной интерпретации кривых плавления, при этом автофлуоресценция от пластин или добавок является распространенной проблемой. TSA может не подходить для соединений, которые проявляют автофлуоресценцию или гасят флуоресценцию оранжевого SYPRO. Потенциальным решением является скрининг альтернативных красителей, описанных в ^{пункте 12}. Изложенный здесь протокол TSA может быть легко адаптирован для других белков и добавок, представляющих интерес. Добавки не ограничиваются только водорастворимыми соединениями, как показано в нашем протоколе с нуклеотидами и двухвалентными катионами. Вместо этого добавки могут охватывать широкий спектр состояний, таких как переменный pH, лиганды или препараты, растворяемые в ДМСО⁸. Кроме того, преинкубация лиганда с белком может обеспечить более воспроизводимые результаты за счет уменьшения интерференции и артефактов от красителя. Добавки, такие как липиды и моющие средства, могут привести к высокой флуоресценции из-за их взаимодействия с SYPRO Orange. Пример кривой денатурации показан на рисунке 3А , который показывает низкую фоновую флуоресценцию в сочетании со значительным увеличением флуоресценции при термической денатурации белка. Оптимальная концентрация красителя и белка обеспечит максимальное соотношение сигнал/шум при сохранении постоянного флуоресцентного сигнала между репликами.

TSA предлагает преимущество простоты благодаря минимальному количеству компонентов, что сокращает количество переменных для оптимизации. Важнейшие шаги включают определение оптимальных концентраций как красителя, так и белка. Важно отметить, что для ТСА требуется очищенный, «хорошо ведущийся» белок. Белок и добавка должны быть стабильными в буфере при концентрациях, используемых в TSA. Белки или состояния, склонные к агрегации или олигомеризации, могут приводить к ошибочным показаниям флуоресценции. Агрегированные или развернутые белки могут проявлять высокую флуоресценцию первоначально с небольшим увеличением при денатурации. Олигомеризация белков также может привести к множественным переходным состояниям, что усложняет анализ¹⁰. Концентрация белка может быть точно настроена для предотвращения агрегации.

TSA совместим с широким спектром буферов и солей, что позволяет оптимизировать стабилизирующие условия для белка и добавки¹¹. Объемы растворов белка и добавок могут быть скорректированы для преодоления ограничений концентраций белка и добавок. Например, более низкие концентрации добавки, такие как 5x, могут быть использованы вместо 10x раствора, используемого в репрезентативных результатах. Примечательно, что относительное количество белка и добавки, необходимых для проведения анализа, является низким, поскольку 384-луночные ПЦР-планшеты могут вмещать объемы до 10 мкл общего образца.

Учитывая сильные стороны TSA, он идеально подходит для исследования малоизученных белков, таких как псевдокиназы. Псевдоферменты представляют собой каталитически неактивные белки, которые структурно гомологичны активным ферментам³⁴. Недавние структурные и биохимические исследования показали, что некоторые псевдоферменты являются активными ферментами, в то время как большинство из них имеют некаталитические функции^35,36. Несмотря на то, что псевдоферменты каталитически неактивны, они участвуют в различных заболеваниях и играют важную роль, включая скаффолдинг и аллостерическую^{модуляцию.} Однако механизм действия и функциональное значение многих псевдоферментов неизвестны. Активность некоторых псевдоферментов регулируется связыванием лигандов, что приводит к повышению термической стабильности, что связано с конформационными изменениями белка¹⁴. Мы предполагаем, что TSA является ценным инструментом для изучения связывания лигандов с псевдоферментами для определения оптимального лиганда по функциональной активности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аденозин 5′-трифосфат динатриевая соль	гидрат Sigma Aldrich	A2383-10G	используется для получения репрезентативных результатов, но не требуется для выполнения TSA
Avanti J-15R с микропланшетом в сборе носителя	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Система для ПЦР в реальном времени	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-луночные ПЦР-планшеты, тонкостенные, с юбкой, прозрачные/белые	Bio-Rad	HSP3805
хлорид магния	Sigma Aldrich	M8266-100G	используется для получения репрезентативных результатов, но не требуется для выполнения TSA
тетрагидрат хлорида марганца (II)	Sigma Aldrich	M3634-500G	используется для получения репрезентативных результатов, но не требуется для выполнения TSA
Microseal 'B' PCR Plate Герметизирующая пленка, адгез, оптический	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-трифосфат тринатрия соль	гидрат Sigma Aldrich	U6625-100MG	используется для получения репрезентативных результатов, но не требуется для выполнения TSA