Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка и применение рапамицин-регулируемых тирозинфосфатаз

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

6 сентября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается разработка, создание и применение рапамицин-регулируемых фосфатаз. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках.

Аннотация

Тирозинфосфатазы являются важным семейством ферментов, которые регулируют важнейшие физиологические функции. Они часто нарушают регуляцию при заболеваниях человека, что делает их ключевыми объектами биологических исследований. Инструменты, которые позволяют регулировать активность фосфатазы, играют важную роль в препарировании их функции. Традиционные подходы, такие как сверхэкспрессия конститутивно активных или доминантных негативных мутантов или подавление с помощью миРНК, не имеют временного контроля. Ингибиторы фосфатазы часто имеют низкую специфичность, и они позволяют исследователям лишь определить, на какие процессы влияет ингибирование фосфатазы.

Мы разработали хемогенетический подход, систему Rapamycin-регулируемую (RapR), которая позволяет осуществлять аллостерическую регуляцию каталитического домена фосфатазы, что обеспечивает жесткий временной контроль активации фосфатазы. Система RapR состоит из домена iFKBP, вставленного в аллостерический сайт в фосфатазе. Внутренняя структурная динамика домена RapR нарушает каталитический домен, что приводит к инактивации фермента. Добавление рапамицина опосредует образование комплекса между iFKBP и коэкспрессируемым белком FRB, который стабилизирует iFKBP и восстанавливает активность каталитического домена фосфатазы.

Эта система обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках. Уникальные возможности этой системы позволяют идентифицировать переходные процессы и исследовать отдельные сигнальные пути после фосфатазы. В этом протоколе описываются рекомендации по разработке RapR-фосфатазы, ее биохимической характеристике и анализу ее влияния на нисходящую передачу сигналов и регуляцию клеточной морфодинамики. В нем также содержится подробное описание стратегии белковой инженерии, анализы in vitro , анализирующие активность фосфатазы, и эксперименты по визуализации живых клеток, выявляющие изменения в морфологии клеток.

Введение

Протеинтирозинфосфатазы представляют собой важнейшее семейство белков, участвующих во множестве клеточных сигнальных событий. Было показано, что они играют ключевую роль в регуляции пролиферации клеток, миграции и апоптоза 1,2,3. Следовательно, нарушение регуляции протеинтирозинфосфатаз приводит к различным изнурительным заболеваниям и расстройствам 4,5,6,7. Изучение физиологической функции тирозинфосфатаз и их роли в развитии этих патологий исторически затруднялось отсутствием инструментов, необходимых для изучения тонкостей передачи сигналов фосфатазы8.

Традиционно фосфатазы изучаются с помощью методов, которые не обладают желаемой специфичностью и/или не обеспечивают временного контроля их активности. Эти критические ограничения доступных инструментов затрудняют анализ специфической роли фосфатаз в сигнальных путях. Сверхэкспрессия конститутивно активных и доминантных негативных мутантов или подавление экспрессии фосфатазы обеспечивают специфичность, но не имеют временного контроля и часто могут запускать компенсаторные механизмы, которые маскируют истинную функцию фермента.

Фармакологические ингибиторы позволяют осуществлять временную регуляцию фосфатаз. Тем не менее, многие ингибиторы фосфатазы печально известны своей неспецифичностью из-за хорошо консервативного состава активного центра в тирозинфосфатазах9. Кроме того, из-за конструктивных ограничений ингибиторы, нацеленные на каталитический центр, демонстрируют плохую проницаемость клеточных мембран10. Еще одним ограничением ингибиторов является то, что они позволяют исследовать только эффектыинактивации фосфатазы. Таким образом, существует потребность в инструментах, которые позволяют осуществлять специфическую, регулируемую во времени активацию фосфатаз. Эти инструменты позволят исследователям идентифицировать прямые эффекты активации фосфатазы, отделяя их от множественных параллельных сигнальных каскадов, часто активируемых биологическими стимулами. Важно отметить, что жесткий временной контроль активности позволяет идентифицировать переходные события, индуцированные фосфатазой, и разделяет эффекты острой и длительной активности фосфатазы. Сочетание временной регуляции с мутационным анализом позволит детально проанализировать специфические роли отдельных доменов фосфатазы и исследовать ее нисходящую сигнализацию.

Чтобы решить проблему отсутствия желаемых возможностей в существующих инструментах, группа Каргинова разработала систему Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. В системе RapR используется сконструированный домен переключения, iFKBP, который обеспечивает аллостерическую регуляцию интересующего белка (POI). Встраивание домена iFKBP в положение, аллостерически связанное с каталитическим центром POI, делает его восприимчивым к регуляции рапамицином. В отсутствие рапамицина iFKBP разрушает каталитический центр из-за присущей ему высокой структурной динамики iFKBP и, таким образом, инактивирует POI. Добавление рапамицина индуцирует взаимодействие iFKBP с коэкспрессируемым белком FRB (рис. 1). Это приводит к стабилизации коммутационного домена, который, в свою очередь, восстанавливает структуру и функцию каталитического домена POI. Таким образом, инструмент позволяет осуществлять специфическую и регулируемую во времени активацию POI.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схема системы, регулируемой рапамицином RapR-Shp2. RapR обеспечивает аллостерическую активацию интересующего белка с добавлением рапамицина. Эта цифра была изменена из Fauser et al.12. Сокращения: iFKBP = вставляемый FKBP12; FRB = FKBP-рапамицин-связывающий домен; R = рапамицин; Shp2 = Src-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Инструмент RapR может быть применен к различным семействам белков. Он может быть использован для регуляции протеинкиназы, а также фосфатаз12,14. Этот протокол будет сосредоточен на применении инструмента RapR для контроля Shp2-фосфатазы. Shp2 является повсеместно экспрессируемой протеинтирозинфосфатазой, которая участвует в таких сигнальных процессах, как пролиферация, миграция, иммуномодуляция и дифференцировка 1,16,17,18. Нарушение регуляции Shp2 было связано с рядом солидных раковых опухолей, миелоидным лейкозом и нарушениями развития 5,7. Однако Shp2 стал жертвой тех же недостатков инструмента, что и описанные выше. Для борьбы с этими ограничениями был разработани охарактеризован RapR-Shp2, специфически и временно регулируемый конструкт Shp2.

До разработки RapR-Shp2 было известно, что Shp2 участвует в миграции клеток 19,20,21. Однако его конкретная роль в передаче сигналов в этом процессе была неизвестна. Также было неизвестно, на каком временном масштабе Shp2 регулирует миграцию клеток и какие конкретно морфодинамические изменения он вызывает в разные моменты своей активации. Кроме того, было неясно, будет ли острая и длительная активация Shp2 вызывать различные эффекты. С помощью RapR-Shp2 было обнаружено, что острая активация Shp2 индуцирует транзиторное распространение клеток, увеличение выпячиваний, поляризацию и миграцию клеток. Также были идентифицированы специфические пути ниже по течению от Shp2, которые регулируют отчетливые морфодинамические изменения12. Этот протокол предоставляет подробную информацию для разработки и определения характеристик RapR-Shp2, которые могут быть использованы для разработки и применения других фосфатаз RapR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дизайн RapR-фосфатаз

  1. Планирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя RapR-Shp2 в качестве примера, этот протокол подробно описывает важные шаги по созданию рапамицин-регулируемой тирозинфосфатазы. Описанный протокол оптимизирован для Shp2, и могут потребоваться дополнительные модификации для адаптации к специфическим свойствам отдельных фосфатаз.
    1. Чтобы гарантировать, что каталитическая активность Shp2 контролируется исключительно рапамицином, а не эндогенными механизмами, вводят мутацию в фосфатазу, чтобы удерживать ее в конститутивно активной конформации. В случае Shp2 введите мутацию D61A.
      Примечание: Если активирующая мутация не вводится для конкретной ПТФазы, то ее вариант RapR будет функционировать как And-зависимая система, регулируемая эндогенными сигналами и рапамицином.
    2. Идентификация сайтов вставки iFKBP в каталитическом домене фосфатазы с использованием кристаллической структуры для управления выбором, как описано ранее13. Если структура недоступна, выполните выравнивание аминокислотной последовательности с каталитическим доменом Shp2-фосфатазы для идентификации мест вставки (рисунок 2A). Убедитесь, что место введения расположено в гибкой петле, которая структурно связана с каталитическим карманом, но расположена вдали от кармана, чтобы предотвратить стерическое препятствие связыванию субстрата iFKBP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация о вставке обсуждается в Обсуждении.
    3. Рассмотрите тип линкерной последовательности, которая будет использоваться между вставленным доменом iFKBP и представляющей интерес фосфатазой. Выбор оптимальной последовательности компоновщиков чрезвычайно важен для успеха инструмента RapR и обсуждается далее в разделе Обсуждение (рисунок 2B).

figure-protocol-1
Рисунок 2: Схема соображений при разработке RapR-фосфатазы. (A) Выравнивание Shp2 (фиолетовый), PTP1B (зеленый) и PTP-PEST (розовый) с выделенными консервативными местами введения. (B) Представление вставки компоновщика между Shp2 и iFKBP. (C) Фосфатазный домен Shp2 бежевого цвета с местами введения, обозначенными синим цветом. Эта цифра была изменена из Fauser et al.12. Сокращения: Shp2 = Src гомология-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза; iFKBP = встраиваемый FKBP12; ПТФ = протеинтирозинфосфатаза; RapR = Рапамицин-регулируемый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Создание RapR-фосфатазы

  1. Введение iFKBP в представляющую интерес фосфатазу с использованием модифицированного сайт-направленного мутагенеза
    1. Сгенерируйте «мегапраймер» с кодировкой iFKBP с помощью ПЦР.
      1. Разработка праймеров для синтеза «мегапраймера», которые содержат 20-25 нуклеотидов, отжигающихся до 5' или 3' конца iFKPB, линкерную последовательность, которая соединяет iFKPB с интересующей фосфатазой, и 28-32 нуклеотидов, соответствующих сайту вставки (рис. 3). Подтвердите, что полученный продукт содержит iFKPB, фланкированный фрагментами отжига до и после места введения в исследуемую фосфатазу.
      2. Синтезируйте iFKBP, содержащий «мегапраймер», с помощью ПЦР (10 мкл 5-кратного полимеразного буфера, 1 мкл 50 нг/мкл матричной ДНК, содержащей iFKBP, 2 мкл 10 мМ dNTP, 0,5 мкл 100 мкМ запаса каждого «мегапраймера» праймера [прямой и обратный], 35 мкл воды, 1 мкл ДНК-полимеразы). Разделите эту реакцию ПЦР на 2 отдельные реакции объемом 25 мкл перед проведением ПЦР. Цикл ПЦР проводят в соответствии с рекомендациями производителя ДНК-полимеразы или следующим стандартным циклом ПЦР: (i) 98 °C в течение 2 мин, (ii) 98 °C в течение 30 с, (iii) 55-70 °C в течение 30 с, (iv) 72 °C в течение 30 с, (v) повторяют шаги ii-iv 25x, (vi) 72 °C в течение 2 мин.
      3. Очистите «мегапраймер» с помощью электрофореза в агарозном геле. Загрузите содержимое ПЦР с предыдущего этапа в 1% агарозный гель и нанесите 120 В примерно на 30 минут. Найдите в геле «мегапраймер» длиной 400 нуклеотидов, удалите фрагмент и очистите его с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
    2. Модифицированный сайт-направленный мутагенез
      1. Готовят модифицированную реакцию сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды, содержащей в качестве матрицы ген исследуемой фосфатазы (5 мкл 5-кратного полимеразного буфера, 2 мкл 50 нг/мкл матрицы, 2 мкл 10 мМ dNTP, 10 мкл экстрагированного «мегапраймера», 2,5 мкл воды, 2,5 мкл ДМСО, 1 л ДНК-полимеразы).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ДМСО в реакционную смесь снижает температуру отжига22.
      2. Запустите следующий цикл ПЦР: начальная стадия денатурации при 98 °C в течение 3 мин, затем 18 циклов последовательных этапов инкубации при 98 °C в течение 30 с, 65 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 20 с, 55 °C в течение 20 с, 50 °C в течение 20 с, 72 °C в течение 18 мин. Запустите цикл на ночь (время цикла 7 часов). После завершения цикла храните ПЦР-реакцию при температуре 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
      3. После завершения цикла добавьте 1 мкл фермента DpnI и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: DpnI будет переваривать остаточный шаблон, увеличивая выход вновь синтезированного продукта.
      4. Преобразуйте переваренный продукт в DH5α компетентных клетках, следуя инструкциям производителя. Планшет для трансформации на агаровых планшетах LB с соответствующим антибиотиком для выбора (карбенициллин для конструкции pcDNA RapR-Shp2). Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. После того, как колонии вырастут, храните пластины LB при температуре 4 °C до 1 месяца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
  2. Выделение желаемой конструкции ДНК, содержащей RapR-фосфатазу
    1. Проведение ПЦР-скрининга колоний бактерий23. Поскольку не все колонии, выращенные на LB-планшете, будут содержать желаемую плазмиду, обязательно проведите скрининг перед выделением плазмидной ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте праймеры для экрана, который будет отжигаться на шаблоне и в гене iFKBP. Ситет может быть выполнен с использованием мастермикса Taq-полимеразы (см. Таблицу материалов).
    2. После выявления положительных колоний введите одну положительную колонию в 3 мл бульона LB, включая соответствующий антибиотик, инкубируйте и встряхните при температуре 37 °C в течение ночи.
    3. Извлеките плазмидную ДНК из жидкой культуры, следуя инструкциям производителя к набору для экстракции плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов)
      Примечание: Рекомендуется секвенировать вновь созданную конструкцию RapR PTPase, прежде чем приступать к оценке in vitro .

figure-protocol-2
Рисунок 3: Схема дизайна праймера и модифицированная стратегия клонирования сайт-направленного мутагенеза. Этап 1 заключается в синтезе iFKBP, содержащего «мегапраймер» с «липкими концами», с отжигом в место введения представляющей интерес фосфатазы, а этап 2 заключается во введении «мегапраймера» в представляющую интерес фосфатазу. Эта цифра была изменена по Karginov et al.13. Сокращение: iFKBP = вставляемый FKBP12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Оценка RapR-PTPазы с помощью анализа активности in vitro

Примечание: Этот протокол используется для оценки регуляции активности сконструированной RapR-PTPase. Ниже описан анализ иммунопреципитированного Shp2 с использованием фосфорилированного N-концевого фрагмента паксиллина в качестве субстрата. Может потребоваться выбор другого субстрата для конкретной ПТФазы, представляющей интерес.

  1. День 1
    1. Планшет 800 000 HEK293T клеток/лунку в 6-луночном тканевом планшете в среде DMEM с добавлением добавки L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ) и 10% FBS по объему. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 на ночь.
  2. День 2
    1. После того, как клетки слились на ~60–80%, трансфектируйте их в соответствии с протоколом производителя предпочтительной трансфекции (см. Таблицу материалов).
      1. Пример протокола трансфекции: Добавьте 1 г плазмидной ДНК (pcDNA-mCherry-FRB и pcDNA-flag-RapR-Shp2, каждый) к 200 мкл бессывороточного DMEM и 6 мкл реагента для трансфекции и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте 100 мкл трансфекционной смеси на лунку клеток. В качестве контроля включайте образцы, трансфицированные конститутивно активными и доминантными негативными конструкциями Shp2. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 .
  3. День 3
    1. Приготовление белка-G сефарозы
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте нарезанные кончики пипеток перед работой с сефарозой. Срезанные кончики следует использовать на каждом этапе работы с сефарозой. Сефарозу необходимо тщательно ресуспендировать на каждом этапе перед пипетированием.
      1. Ресуспендируйте и возьмите соответствующее количество сефарозы Protein-G в пробирку объемом 1,5 мл. Для каждой лунки в 6-луночном планшете используйте 10 μL Protein-G Sepharose. Для полного 6-луночного планшета используйте 60 мкл сефарозы.
      2. Промойте сефарозу 1 мл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов). Микроцентрифугу в течение 1 мин при 2 000 × г и осторожно удалите буфер для лизиса. Повторите 2 раза.
      3. Ресуспендируйте сефарозу в 380 мкл буфера для лизиса. Добавьте БСА до конечной концентрации 1 мг/мл и антитело (0,5 мкл для каждого образца IP, антитело против флага [см. Таблицу материалов]). Инвертировать на ротаторе при 4 °C в течение 1,5 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество антител должно быть определено экспериментально для каждого используемого антитела.
    2. Подготовьте клетки к иммунопреципитации.
      1. Добавьте соответствующее количество рапамицина (1 мМ стоковый раствор в этаноле) до конечной концентрации 1 мкМ или добавьте такой же объем этанола (отрицательный контроль) в образцы. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% CO2 .
      2. Положите 6-луночный планшет с клетками на лед и аккуратно промойте клетки 3 мл холодного PBS. Отсадите PBS и добавьте 300 мкл буфера для лизиса (с 1 мкМ рапамицином для активированного образца фосфатазы или эквивалентным объемом этанола в отрицательном контрольном образце) и соскребите с помощью клеточного скребка. Перенесите образцы в пробирки объемом 1,5 мл и поместите в микроцентрифугу на 10 минут при температуре 1 000 × г при 4 °C.
      3. Перенесите 20 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку объемом 1,5 мл, чтобы проверить уровень экспрессии. Добавьте 20 мкл 2x Laemmli буфера с 5% β-меркаптоэтанолом в каждую пробирку для проверки сцеживания и инкубации при 95–100 °C в течение 5 минут. Используйте оставшуюся надосадочную жидкость для иммунопреципитации на шаге 3.3.3.3.
    3. Иммунопреципитация RapR-Shp2
      1. Промойте Protein-G сефарозу с шага 3.3.1.3. с 1 мл буфера для лизиса. Микроцентрифугу в течение 1 мин при 2 000 × г при 4 °C каждый раз и тщательно отсасывайте буфер для лизиса. Повторите этот шаг 2 раза.
      2. Используя срезанные наконечники, ресуспендируйте сефарозу в буфере для лизиса (50 мкл на образец, поэтому для 6-луночного планшета ресуспендируйте в 300 мкл буфера для лизиса). Пипетку 50 мкл взвешенной смеси сефарозы в отдельную новую пробирку объемом 1,5 мл для каждого образца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В буферном растворе для лизиса будет ресуспендирована сефароза, оставшаяся из-за объема сефарозы.
      3. Добавьте оставшийся надосадочный слой из подготовленных клеток с шага 3.3.2.3 в каждую пробирку Сефарозы. Вращайте при температуре 4 °C в течение 1,5–2 часов.
    4. Анализ активности фосфатазы
      Субстрат Shp2 следует получать путем фосфорилирования очищенного N-концевого фрагмента паксиллина с использованием конститутивно активной Src-киназы в соответствии с ранее описанным протоколом киназной реакции12.
      1. Ближе к концу шага 3.3.3.3 приготовьте раствор фосфо-паксиллина. В каждый образец добавьте раствор фосфо-паксиллина (конечная концентрация 3 мкг/мл) в 40 мкл общего количества имидазола буфера (см. Таблицу материалов). Добавляйте рапамицин до конечной концентрации 1 мкМ к аликвоте раствора фосфо-паксиллина для активированных образцов RapR-Shp2 и эквивалентный объем этанола к раствору для неактивированных образцов.
      2. Установите нагревательный шейкер на 32 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для других фосфатаз может потребоваться другая температура для оптимальной активности.
      3. Промойте Сефарозу образцами с шага 3.3.3.3 2 раза с 0,5 мл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов). Промойте образцы 2 раза 0,5 мл буфера для промывки. Каждый буфер должен содержать либо рапамицин в концентрации 1 мкМ для активированных образцов, либо эквивалентный объем этанола для неактивированных образцов. Удалите как можно больше буфера после окончательной стирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как только этот шаг будет достигнут, может быть полезно использовать пипетку для медленного и осторожного удаления последнего количества буфера, чтобы убедиться, что сефароза не аспирирована. Любой оставшийся буфер будет влиять на концентрацию фосфо-паксиллина и приводить к неточным показаниям.
      4. Добавьте 40 мкл приготовленной фосфо-паксиллиновой буферной смеси имидазола в каждый образец, с рапамицином или без него (в зависимости от образца). Очень осторожно перемешайте и сразу же поместите в нагревательный шейкер и выдерживайте в течение 40 минут при температуре 32 °C. Установите нагревательный шейкер минимум на 1 000 об/мин, чтобы образец полностью перемешивался в течение всего периода инкубации.
      5. Остановите реакцию, добавив 40 мкл 2x Laemmli Buffer в каждый образец. Инкубируйте образцы при температуре 95–100 °C в течение 5 минут. Охладите образцы.
      6. Загрузите 15 мкл каждого образца (включая образцы лизата из шага 3.3.2.3.) в гель SDS-полиакриламида с градиентом 4–15% и запустите стандартный протокол вестерн-блоттинга с использованием мембран PVDF.
      7. Блоттинг с использованием антитела anti-Flag для обнаружения конструкции RapR-Shp2, анти-mCherry для обнаружения mCherry-FRB и анти-pY118 или анти-pY31 паксиллина для обнаружения фосфорилирования паксиллина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Получившиеся вестерн-блоттинги должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 4.

4. Анализ активности RapR-Shp2 в живых клетках

Примечание: Этот протокол используется для определения способности RapR-Shp2 дефосфорилировать эндогенные субстраты и индуцировать нисходящую передачу сигналов. Другие RapR-PTPases потребуют анализа их специфических субстратов и путей.

  1. День 1
    1. Планшет 198 000 A431 клеток/лунка в 6-луночном тканевом планшете в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ). Поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 на ночь.
  2. День 2
    1. Заражайте клетки аденовирусными конструкциями, экспрессирующими RapR-Shp2 и FRB, добавляя аденовирус непосредственно в среду, уже находящуюся в чашке. Оставьте аденовирус на клетках в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 на ночь. Используйте клетки, инфицированные FRB, только в качестве отрицательного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество аденовируса необходимо определять в каждом конкретном случае в зависимости от титра.
  3. День 3
    1. Голодание клеток A431 путем инкубации в DMEM с 0,5% FBS в течение 4 ч перед экспериментом.
    2. Добавляйте рапамицин в конечную концентрацию 1 мкМ или такой же объем этанола (отрицательный контроль) в клетки в течение 2–4 ч.
      Примечание: Инкубация может отличаться для других фосфатаз.
    3. Положите 6-луночный планшет с клетками на лед и аккуратно промойте клетки 3 мл холодного PBS. Отсадите PBS, добавьте 300 мкл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов) и энергично соскребите клеточным скребком. Перенесите образцы в пробирки объемом 1,5 мл и микроцентрифугу на 5 мин при температуре 2 000 × г при 4 °C.
    4. Переложите по 250 мкл каждого образца в новую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 250 мкл 2x Laemmli буфера с 5% β-меркаптоэтанолом и инкубируйте при 95–100 °C в течение 5 минут.
    5. Загрузите 25 мкл каждого образца на гель SDS-PAGE с градиентом 4–15% и запустите стандартный протокол вестерн-блоттинга с использованием мембран PVDF.
    6. Оцените опосредованное RapR-Shp2 дефосфорилирование EGFR и PLCγ с использованием антител против pY992 EGFR и против pY783 PLCγ. Оцените последующую активацию MAP-киназы Erk1/2 путем оценки ее фосфорилирования на остатках pT202/pY204.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получившиеся вестерн-блоты должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 5.

5. Анализ морфодинамических изменений, индуцированных активацией RapR-Shp2 в клетках HeLa с использованием визуализации живых клеток

Примечание: Этот протокол используется для определения влияния активации RapR-Shp2 на образование клеточных выпячиваний, распространение и миграцию клеток.

  1. День 1
    1. Поместите 700 000 клеток HeLa в чашку для клеточных культур диаметром 35 мм и поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 . Дайте клеткам прилипнуть к посуде (~2–3 ч).
    2. Трансфектируйте клетки в соответствии с протоколом производителя предпочтительного реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов).
      1. Пример протокола трансфекции: Добавьте 0,5 мкг ДНК (плазмиды pcDNA-mCherry-FRB и pcDNA-Venus-RapR-Shp2, каждая) к 100 мкл бессывороточного DMEM и 6 мкл реагента для трансфекции. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте трансфекционную смесь в клетки и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 . Используйте клетки, трансфицированные pcDNA-mCherry-FRB, только в качестве отрицательного контроля.
    3. Покрытие круглого стеклянного покровного стекла #1.5 25 мм с фибронектином (5 мг/л) путем инкубации в течение 1 ч при 37 °C.
  2. День 2
    1. Промойте стекло с покрытием PBS.
    2. За 4 ч до визуализации трансфицированные клетки HeLa нанесите на покровное стекло с покрытием в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ) для достижения 30% конфлюенции.
    3. Через два часа после нанесения покрытия аккуратно переключите среду в тарелке на предварительно подогретую среду без сыворотки Leibovitz L-15 на 2 часа.
    4. Окрашивайте клетки CellMask Deep Red кремом для плазматической мембраны в соответствии с протоколом производителя.
    5. Поместите покровное стекло в чистую камеру камеры для визуализации (см. Таблицу материалов). Добавьте 1 мл предварительно подогретого фильтрующего материала L-15 и залейте 1 мл предварительно подогретого минерального масла, чтобы предотвратить испарение. Поддерживайте температуру в камере при температуре 37 °C до получения изображения.
    6. Визуализируйте ячейки при температуре 37 °C с помощью нагреваемого предметного столика.
      1. Выберите подходящие каналы для визуализации конструкции RapR и CellMask для эпифлуоресцентной визуализации. Чтобы следовать этому протоколу, используйте указанный объектив 40x (см. Таблицу материалов) и следующие наборы фильтров: фильтры возбуждения 514/10 и фильтры излучения 540/21 для визуализации Venus-RapR-Shp2, фильтры возбуждения 561/10 и фильтры излучения 595/40 для визуализации mCherry-FRB, а также фильтры возбуждения 640/20 и 655LP для визуализации CellMask Deep Red. Используйте многополосное полихроичное зеркало для всех флуоресцентных каналов (см. таблицу материалов).
      2. Делайте снимки каждые 2 минуты в течение 4–4,5 часов.
        Примечание: Более быстрые морфодинамические изменения потребуют более частой регистрации.
      3. Через 1 час визуализации добавьте рапамицин до конечной концентрации 1 мкМ для стимуляции RapR-Shp2.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается создание масок клеток на основе . Файлы стека TIF, собранные в ходе экспериментов с визуализацией в реальном времени. Затем будет описано, как создать макрос в ImageJ для анализа масок, в результате чего будет создана электронная таблица с площадью ячейки, которая затем будет проанализирована на предмет изменений с течением времени. Наконец, протрузивная и ретрактивная активность клеток будут проанализированы с помощью Metamorph.

  1. Сгенерируйте двоичную маску изображений CellMask с помощью функции MovThresh из программного пакетаCellGeo 24.
  2. Скопируйте папку MovThresh в папку анализа изображений.
  3. Скопируйте изображения канала CellMask или другого мембранного маркера в папку MovThresh.
    1. Если несколько ячеек были изображены в одном месте, обрезайте изображения для создания файлов, содержащих только одну ячейку, прежде чем создавать маску в MatLab.
  4. Убедитесь, что в MatLab правильно указана папка MovThresh.
  5. Запустите MovThresh.
  6. Импортируйте стопки изображений по одной.
  7. Выберите «Сглаженная кривая», а затем запустите команду «Повторное пороговое значение».
  8. Сохраните как номер Mask_Image в новой папке с меткой «Маски».
  9. После того, как все стеки изображений будут преобразованы в маски, откройте их в программном обеспечении ImageJ25.
    1. Анализ площади клеток в ImageJ
      1. Откройте все стеки изображений Mask в ImageJ.
      2. Отрегулируйте параметр «Измерение » в соответствии с областью.
      3. Нажмите «Плагины» | Макросы | Запись.
      4. Нажмите «Обработать» | Двоичный | Сделайте двоичным.
        1. Выберите вариант по умолчанию .
          ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте ничего лишнего во время записи макроса. Если включены дополнительные шаги, рекомендуется начать заново с шага 6.9.1.3.
      5. Нажмите «Анализировать» | Анализируйте частицы.
        1. Снимите все флажки, кроме «Сводка».
      6. Завершите запись и нажмите кнопку Создать макрос.
      7. Нажмите «Выполнить » для каждого стека изображений после его выбора и сохраните таблицу результатов для каждого стека изображений. Вариант по умолчанию будет сохранен как файл csv.
      8. Сохраните макрос и повторно используйте его для будущих анализов (необязательно).
    2. Обработка данных об области в таблице
      1. Для каждой анализируемой клетки усредните площадь клетки по изображениям, полученным до активации рапамицином.
      2. Разделите все значения площади на среднюю площадь клетки, предшествующей добавлению рапамицина.
      3. Вычислите среднее значение для каждой временной точки для всех визуализируемых ячеек и определите 90% доверительные интервалы. Построение графика данных.
    3. Анализ протрузии клеток
      1. Скопируйте папку ProActive в папку анализа изображений.
      2. Скопируйте стопки изображений в маске из MovThresh в только что созданную папку ProActive.
      3. Откройте MatLab и установите каталог в папку ProActive.
      4. Запустите ProActive.
      5. Импортируйте файлы стека изображений замаскированных ячеек в графический интерфейс ProActive.
      6. Определите тип деятельности. Анализ выступающей активности позволит получить данные о присоединенной площади ; анализ втягивающей активности позволит получить данные о потерянных площадях ; и общая активность будут генерировать общие данные об изменении площади (как потерянные, так и приобретенные).
      7. Установите область для определения нормализации.
      8. Сгладьте кривую либо с использованием предложенных пороговых значений, либо с использованием среднего значения для повторного порога каждой временной точки. При этом пороговые значения усредняются по определенному окну, сводя к минимуму несоответствия в пороговых значениях между временными точками.
      9. Нажмите «Файл» | Сохранить как | Результаты (.mat)
        1. При обработке всех трех типов действий области назовите обрабатываемые файлы данных следующим образом: ProResultData #, RetResultData # или ResultData #.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте пробел перед числом и пронумеруйте данные, начиная с 1.
      10. Повторите шаг 6.9.3.6. для всех импортированных стеков изображений в масках.
      11. После обработки всех ячеек закройте графический интерфейс ProActive.
      12. Откройте DataToFileTotalArea в редакторе Matlab для обработки файлов "ResultData" общей активности.
      13. Измените количество ячеек в соответствии с количеством созданных файлов результатов. Если на шагах 6.9.3.5–6.9.3.10 было обработано 7 ячеек, убедитесь, что первые три строки скрипта выглядят следующим образом:
        filename='Данные результата ';
        ячейки = 1:7;
        lag=1;
      14. Нажмите Run и повторите это для DataToFileProtArea и DataToFileRetArea для обработки выступающих и отзываемых данных соответственно. В результате анализа будут созданы три текстовых файла "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" и "AllCellsRet.txt"
      15. Откройте файлы .txt в таблице и нормализуйте, как описано в разделе 6.9.2. Вычислите среднее значение для каждой временной точки для всех визуализируемых ячеек и определите 90% доверительных интервалов. Построение графика данных.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующие графики из вышеуказанных шагов должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 4 представлены результаты, которые можно ожидать от анализа активности фосфатазы на основе паксиллина. В этом эксперименте конститутивно активная и доминантная отрицательная активность Shp2-фосфатазы сравнивалась с активной и неактивной активностью RapR-Shp2 с использованием фосфо-паксиллина в качестве считывания. Конструкции Shp2 подвергали иммунопреципитации и анализу активности, описанному в протоколе. Показания фосфо-паксиллина для конститутивно активного Shp2 и активного RapR...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны этапы разработки, определения характеристик и применения хемогенетически контролируемых фосфатаз. Инструмент RapR-Shp2 основан на регулируемом рапамицином переключателе, вставленном в каталитический домен Shp2. Сильной стороной этого средства является специфичность и жесткий временной контроль активности фосфатазы. Инструмент применим к другим фосфатазам и в сочетании с ранее описанной технологией RapR-TAP позволяет реконструировать отдельные нисходящие ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы выражают признательность доктору Джордан Фаузер за ее вклад в разработку RapR-Shp2 и связанных с ним протоколов. Работа была поддержана премией 5R35GM145318 от NIGMS, премией R33CA258012 от NCI и премией P01HL151327 от NHLBI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#1.5 Стеклянные покровные стекла 25 мм круглыеWarner Instruments64-0715
1.5 мл ПробиркиСША Scientificcc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 г Tris-HCL, 131.5 мл глицерина, 52.5 мл 20% SDS, 0.5 г бромофенолового синего, конечный pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 КлеткиATCCCRL-1555
АгарсозаGoldBiotechA-201
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µ m стерильно-фильтрованный
Brig 35,30 б/в %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoН/Д Н/ДОпубликовано в 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red краситель плазматической мембраныinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a компетентный клеткиNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
Лестница ДНКGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI ФерментNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-дитиотреитол, Реагенты Cleland's
EGTAAcros409910250
Фибронектин из плазмы крупного рогатого скотаSigmaF1141
FuGENE(R) 6 Реагент для трансфекцииPromegaE2692Реагент для трансфекции
Набор для экстракции геляThermo ScientificK0692Набор для экстракции геля
Гель с зеленым окрашиванием нуклеиновых кислотGoldBioG-740-500
Гелевый краситель фиолетового цвета 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 мл
HEK 293T КлеткиATCCCRL-11268
HeLa CellsATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ Программное обеспечение для обработкиН/Д/Д
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Имидазол буфер25 мМ Имидазол pH 7,2, 2,5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 5 мМ DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB АгарФишерBP1425-2
лизисный буфер20 мМ Hepes-KOH, pH 7,8, 50 мМ KCl, 1 мМ EGTA, 1% NP40
Обновление MATLABMathWorksN/AR 2022b использовалось для запуска функций CellGeo
Metamorph Программное обеспечение для автоматизации микроскопии и анализа изображенийН/ДН/Д
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Минеральное маслоSigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX Сборные гели 12 лунокBio-Rad4561085
Молекулярная биология Класс ВодаCorning46-000-CV
Многополосный полихроичный зеркальныйхроматический технология89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x объективOlympusN/A
PBS без Ca и MgCorning21-031-CV
ПЦР-пробиркиlabForce1149Z650,2 мл 8-полосковые пробирки и колпачки, жесткая полоска индивидуально прикрепленные купольные колпачки
phusion plus ДНК-полимеразаThermo ScientificF630S
праймерыIDT
белок-g сефарозамиллипоры16-266
Мембраны PVDFBioRad1620219иммуноблоттинг PVDF/фильтровальная бумага сэндвичи
рапамицинФишераAAJ62473MF
0,25% трипсина, 2,21 мМ ЭДТА, 1x [-] натрийCorning25-053-CI
трис-ацетат-ЭДТА (TAE) 50xFischerBP1332-1для электрофореза
Промывочный буфер20 мМ Hepes-KOH, pH 7,8, 50 мМ KCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1% NP40
β-меркаптоэтанолFisher ChemicalO3446I-100
AntiАнтитела
Anti-EGFR АнтителаКлеточная сигнализация2232
Anti-Erk 1/2 антителаКлеточная сигнализация9102
Anti-Flag антителоMillipore-SigmaF3165
Anti-GAPDH АнтителоinvitrogenAM4300
Anti-GFP антителоClontech632380
Anti-mCherry антителоinvitrogenM11217
Антитело против паксиллинаThermo FischerBDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 антитело CellSignaling2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 АнтителоКлеточная сигнализация9101
Антифосфо-паксиллин Y31 АнтителоMillipore-Sigma05-1143
Антифосфо-ПЛК&гамма; Y783 Клеточнаясигнализация14008
Анти-ПЛК&гамма; Клеточная передача5690
Promega E2692 Н антител сигналов антител

Ссылки

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Регуляция рапамициномхемогенетические инструментыактивация фосфатазыаллостерическая регуляцияфосфатаза SHIP-2клетки HEK-293Tанализ иммунопреципитациивестерн-блоттингморфодинамика клеток
Разработка и применение рапамицин-регулируемых тирозинфосфатаз
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.