Разработка и применение рапамицин-регулируемых тирозинфосфатаз

Summary

В этом протоколе описывается разработка, создание и применение рапамицин-регулируемых фосфатаз. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках.

Abstract

Тирозинфосфатазы являются важным семейством ферментов, которые регулируют важнейшие физиологические функции. Они часто нарушают регуляцию при заболеваниях человека, что делает их ключевыми объектами биологических исследований. Инструменты, которые позволяют регулировать активность фосфатазы, играют важную роль в препарировании их функции. Традиционные подходы, такие как сверхэкспрессия конститутивно активных или доминантных негативных мутантов или подавление с помощью миРНК, не имеют временного контроля. Ингибиторы фосфатазы часто имеют низкую специфичность, и они позволяют исследователям лишь определить, на какие процессы влияет ингибирование фосфатазы.

Мы разработали хемогенетический подход, систему Rapamycin-регулируемую (RapR), которая позволяет осуществлять аллостерическую регуляцию каталитического домена фосфатазы, что обеспечивает жесткий временной контроль активации фосфатазы. Система RapR состоит из домена iFKBP, вставленного в аллостерический сайт в фосфатазе. Внутренняя структурная динамика домена RapR нарушает каталитический домен, что приводит к инактивации фермента. Добавление рапамицина опосредует образование комплекса между iFKBP и коэкспрессируемым белком FRB, который стабилизирует iFKBP и восстанавливает активность каталитического домена фосфатазы.

Эта система обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках. Уникальные возможности этой системы позволяют идентифицировать переходные процессы и исследовать отдельные сигнальные пути после фосфатазы. В этом протоколе описываются рекомендации по разработке RapR-фосфатазы, ее биохимической характеристике и анализу ее влияния на нисходящую передачу сигналов и регуляцию клеточной морфодинамики. В нем также содержится подробное описание стратегии белковой инженерии, анализы in vitro , анализирующие активность фосфатазы, и эксперименты по визуализации живых клеток, выявляющие изменения в морфологии клеток.

Introduction

Протеинтирозинфосфатазы представляют собой важнейшее семейство белков, участвующих во множестве клеточных сигнальных событий. Было показано, что они играют ключевую роль в регуляции пролиферации клеток, миграции и апоптоза ^1,2,3. Следовательно, нарушение регуляции протеинтирозинфосфатаз приводит к различным изнурительным заболеваниям и расстройствам 4,5,6,7. Изучение физиологической функции тирозинфосфатаз и их роли в развитии этих патологий исторически затруднялось отсутствием инструментов, необходимых для изучения тонкостей передачи сигналов фосфатазы⁸.

Традиционно фосфатазы изучаются с помощью методов, которые не обладают желаемой специфичностью и/или не обеспечивают временного контроля их активности. Эти критические ограничения доступных инструментов затрудняют анализ специфической роли фосфатаз в сигнальных путях. Сверхэкспрессия конститутивно активных и доминантных негативных мутантов или подавление экспрессии фосфатазы обеспечивают специфичность, но не имеют временного контроля и часто могут запускать компенсаторные механизмы, которые маскируют истинную функцию фермента.

Фармакологические ингибиторы позволяют осуществлять временную регуляцию фосфатаз. Тем не менее, многие ингибиторы фосфатазы печально известны своей неспецифичностью из-за хорошо консервативного состава активного центра в тирозинфосфатазах⁹. Кроме того, из-за конструктивных ограничений ингибиторы, нацеленные на каталитический центр, демонстрируют плохую проницаемость клеточных мембран¹⁰. Еще одним ограничением ингибиторов является то, что они позволяют исследовать только эффекты^{инактивации} фосфатазы. Таким образом, существует потребность в инструментах, которые позволяют осуществлять специфическую, регулируемую во времени активацию фосфатаз. Эти инструменты позволят исследователям идентифицировать прямые эффекты активации фосфатазы, отделяя их от множественных параллельных сигнальных каскадов, часто активируемых биологическими стимулами. Важно отметить, что жесткий временной контроль активности позволяет идентифицировать переходные события, индуцированные фосфатазой, и разделяет эффекты острой и длительной активности фосфатазы. Сочетание временной регуляции с мутационным анализом позволит детально проанализировать специфические роли отдельных доменов фосфатазы и исследовать ее нисходящую сигнализацию^.

Чтобы решить проблему отсутствия желаемых возможностей в существующих инструментах, группа Каргинова разработала систему Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. В системе RapR используется сконструированный домен переключения, iFKBP, который обеспечивает аллостерическую регуляцию интересующего белка (POI). Встраивание домена iFKBP в положение, аллостерически связанное с каталитическим центром POI, делает его восприимчивым к регуляции рапамицином. В отсутствие рапамицина iFKBP разрушает каталитический центр из-за присущей ему высокой структурной динамики iFKBP и, таким образом, инактивирует POI. Добавление рапамицина индуцирует взаимодействие iFKBP с коэкспрессируемым белком FRB (рис. 1). Это приводит к стабилизации коммутационного домена, который, в свою очередь, восстанавливает структуру и функцию каталитического домена POI. Таким образом, инструмент позволяет осуществлять специфическую и регулируемую во времени активацию POI.

Рисунок 1: Схема системы, регулируемой рапамицином RapR-Shp2. RapR обеспечивает аллостерическую активацию интересующего белка с добавлением рапамицина. Эта цифра была изменена из Fauser et ^al.12. Сокращения: iFKBP = вставляемый FKBP12; FRB = FKBP-рапамицин-связывающий домен; R = рапамицин; Shp2 = Src-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Инструмент RapR может быть применен к различным семействам белков. Он может быть использован для регуляции протеинкиназы, а также фосфатаз^12,14. Этот протокол будет сосредоточен на применении инструмента RapR для контроля Shp2-фосфатазы. Shp2 является повсеместно экспрессируемой протеинтирозинфосфатазой, которая участвует в таких сигнальных процессах, как пролиферация, миграция, иммуномодуляция и дифференцировка 1,16,17,18. Нарушение регуляции Shp2 было связано с рядом солидных раковых опухолей, миелоидным лейкозом и нарушениями развития ^5,7. Однако Shp2 стал жертвой тех же недостатков инструмента, что и описанные выше. Для борьбы с этими ограничениями был разработан^{и охарактеризован} RapR-Shp2, специфически и временно регулируемый конструкт Shp2.

До разработки RapR-Shp2 было известно, что Shp2 участвует в миграции клеток 19,20,21. Однако его конкретная роль в передаче сигналов в этом процессе была неизвестна. Также было неизвестно, на каком временном масштабе Shp2 регулирует миграцию клеток и какие конкретно морфодинамические изменения он вызывает в разные моменты своей активации. Кроме того, было неясно, будет ли острая и длительная активация Shp2 вызывать различные эффекты. С помощью RapR-Shp2 было обнаружено, что острая активация Shp2 индуцирует транзиторное распространение клеток, увеличение выпячиваний, поляризацию и миграцию клеток. Также были идентифицированы специфические пути ниже по течению от Shp2, которые регулируют отчетливые морфодинамические изменения¹². Этот протокол предоставляет подробную информацию для разработки и определения характеристик RapR-Shp2, которые могут быть использованы для разработки и применения других фосфатаз RapR.

Protocol

1. Дизайн RapR-фосфатаз

1. Планирование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя RapR-Shp2 в качестве примера, этот протокол подробно описывает важные шаги по созданию рапамицин-регулируемой тирозинфосфатазы. Описанный протокол оптимизирован для Shp2, и могут потребоваться дополнительные модификации для адаптации к специфическим свойствам отдельных фосфатаз.
   1. Чтобы гарантировать, что каталитическая активность Shp2 контролируется исключительно рапамицином, а не эндогенными механизмами, вводят мутацию в фосфатазу, чтобы удерживать ее в конститутивно активной конформации. В случае Shp2 введите мутацию D61A.
      Примечание: Если активирующая мутация не вводится для конкретной ПТФазы, то ее вариант RapR будет функционировать как And-зависимая система, регулируемая эндогенными сигналами и рапамицином.
   2. Идентификация сайтов вставки iFKBP в каталитическом домене фосфатазы с использованием кристаллической структуры для управления выбором, как описано ранее¹³. Если структура недоступна, выполните выравнивание аминокислотной последовательности с каталитическим доменом Shp2-фосфатазы для идентификации мест вставки (рисунок 2A). Убедитесь, что место введения расположено в гибкой петле, которая структурно связана с каталитическим карманом, но расположена вдали от кармана, чтобы предотвратить стерическое препятствие связыванию субстрата iFKBP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация о вставке обсуждается в Обсуждении.
   3. Рассмотрите тип линкерной последовательности, которая будет использоваться между вставленным доменом iFKBP и представляющей интерес фосфатазой. Выбор оптимальной последовательности компоновщиков чрезвычайно важен для успеха инструмента RapR и обсуждается далее в разделе Обсуждение (рисунок 2B).

Рисунок 2: Схема соображений при разработке RapR-фосфатазы. (A) Выравнивание Shp2 (фиолетовый), PTP1B (зеленый) и PTP-PEST (розовый) с выделенными консервативными местами введения. (B) Представление вставки компоновщика между Shp2 и iFKBP. (C) Фосфатазный домен Shp2 бежевого цвета с местами введения, обозначенными синим цветом. Эта цифра была изменена из Fauser et ^al.12. Сокращения: Shp2 = Src гомология-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза; iFKBP = встраиваемый FKBP12; ПТФ = протеинтирозинфосфатаза; RapR = Рапамицин-регулируемый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Создание RapR-фосфатазы

1. Введение iFKBP в представляющую интерес фосфатазу с использованием модифицированного сайт-направленного мутагенеза
   1. Сгенерируйте «мегапраймер» с кодировкой iFKBP с помощью ПЦР.
      1. Разработка праймеров для синтеза «мегапраймера», которые содержат 20-25 нуклеотидов, отжигающихся до 5' или 3' конца iFKPB, линкерную последовательность, которая соединяет iFKPB с интересующей фосфатазой, и 28-32 нуклеотидов, соответствующих сайту вставки (рис. 3). Подтвердите, что полученный продукт содержит iFKPB, фланкированный фрагментами отжига до и после места введения в исследуемую фосфатазу.
      2. Синтезируйте iFKBP, содержащий «мегапраймер», с помощью ПЦР (10 мкл 5-кратного полимеразного буфера, 1 мкл 50 нг/мкл матричной ДНК, содержащей iFKBP, 2 мкл 10 мМ dNTP, 0,5 мкл 100 мкМ запаса каждого «мегапраймера» праймера [прямой и обратный], 35 мкл воды, 1 мкл ДНК-полимеразы). Разделите эту реакцию ПЦР на 2 отдельные реакции объемом 25 мкл перед проведением ПЦР. Цикл ПЦР проводят в соответствии с рекомендациями производителя ДНК-полимеразы или следующим стандартным циклом ПЦР: (i) 98 °C в течение 2 мин, (ii) 98 °C в течение 30 с, (iii) 55-70 °C в течение 30 с, (iv) 72 °C в течение 30 с, (v) повторяют шаги ii-iv 25x, (vi) 72 °C в течение 2 мин.
      3. Очистите «мегапраймер» с помощью электрофореза в агарозном геле. Загрузите содержимое ПЦР с предыдущего этапа в 1% агарозный гель и нанесите 120 В примерно на 30 минут. Найдите в геле «мегапраймер» длиной 400 нуклеотидов, удалите фрагмент и очистите его с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
   2. Модифицированный сайт-направленный мутагенез
      1. Готовят модифицированную реакцию сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды, содержащей в качестве матрицы ген исследуемой фосфатазы (5 мкл 5-кратного полимеразного буфера, 2 мкл 50 нг/мкл матрицы, 2 мкл 10 мМ dNTP, 10 мкл экстрагированного «мегапраймера», 2,5 мкл воды, 2,5 мкл ДМСО, 1 л ДНК-полимеразы).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ДМСО в реакционную смесь снижает температуру отжига²².
      2. Запустите следующий цикл ПЦР: начальная стадия денатурации при 98 °C в течение 3 мин, затем 18 циклов последовательных этапов инкубации при 98 °C в течение 30 с, 65 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 20 с, 55 °C в течение 20 с, 50 °C в течение 20 с, 72 °C в течение 18 мин. Запустите цикл на ночь (время цикла 7 часов). После завершения цикла храните ПЦР-реакцию при температуре 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
      3. После завершения цикла добавьте 1 мкл фермента DpnI и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
         ПРИМЕЧАНИЕ: DpnI будет переваривать остаточный шаблон, увеличивая выход вновь синтезированного продукта.
      4. Преобразуйте переваренный продукт в DH5α компетентных клетках, следуя инструкциям производителя. Планшет для трансформации на агаровых планшетах LB с соответствующим антибиотиком для выбора (карбенициллин для конструкции pcDNA RapR-Shp2). Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. После того, как колонии вырастут, храните пластины LB при температуре 4 °C до 1 месяца.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
2. Выделение желаемой конструкции ДНК, содержащей RapR-фосфатазу
   1. Проведение ПЦР-скрининга колоний бактерий²³. Поскольку не все колонии, выращенные на LB-планшете, будут содержать желаемую плазмиду, обязательно проведите скрининг перед выделением плазмидной ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте праймеры для экрана, который будет отжигаться на шаблоне и в гене iFKBP. Ситет может быть выполнен с использованием мастермикса Taq-полимеразы (см. Таблицу материалов).
   2. После выявления положительных колоний введите одну положительную колонию в 3 мл бульона LB, включая соответствующий антибиотик, инкубируйте и встряхните при температуре 37 °C в течение ночи.
   3. Извлеките плазмидную ДНК из жидкой культуры, следуя инструкциям производителя к набору для экстракции плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов)
      Примечание: Рекомендуется секвенировать вновь созданную конструкцию RapR PTPase, прежде чем приступать к оценке in vitro .

Рисунок 3: Схема дизайна праймера и модифицированная стратегия клонирования сайт-направленного мутагенеза. Этап 1 заключается в синтезе iFKBP, содержащего «мегапраймер» с «липкими концами», с отжигом в место введения представляющей интерес фосфатазы, а этап 2 заключается во введении «мегапраймера» в представляющую интерес фосфатазу. Эта цифра была изменена по Karginov et ^al.13. Сокращение: iFKBP = вставляемый FKBP12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Оценка RapR-PTPазы с помощью анализа активности in vitro

Примечание: Этот протокол используется для оценки регуляции активности сконструированной RapR-PTPase. Ниже описан анализ иммунопреципитированного Shp2 с использованием фосфорилированного N-концевого фрагмента паксиллина в качестве субстрата. Может потребоваться выбор другого субстрата для конкретной ПТФазы, представляющей интерес.

1. День 1
   1. Планшет 800 000 HEK293T клеток/лунку в 6-луночном тканевом планшете в среде DMEM с добавлением добавки L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ) и 10% FBS по объему. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на ночь.
2. День 2
   1. После того, как клетки слились на ~60–80%, трансфектируйте их в соответствии с протоколом производителя предпочтительной трансфекции (см. Таблицу материалов).
      1. Пример протокола трансфекции: Добавьте 1 г плазмидной ДНК (pcDNA-mCherry-FRB и pcDNA-flag-RapR-Shp2, каждый) к 200 мкл бессывороточного DMEM и 6 мкл реагента для трансфекции и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте 100 мкл трансфекционной смеси на лунку клеток. В качестве контроля включайте образцы, трансфицированные конститутивно активными и доминантными негативными конструкциями Shp2. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 .
3. День 3
   1. Приготовление белка-G сефарозы
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте нарезанные кончики пипеток перед работой с сефарозой. Срезанные кончики следует использовать на каждом этапе работы с сефарозой. Сефарозу необходимо тщательно ресуспендировать на каждом этапе перед пипетированием.
      1. Ресуспендируйте и возьмите соответствующее количество сефарозы Protein-G в пробирку объемом 1,5 мл. Для каждой лунки в 6-луночном планшете используйте 10 μL Protein-G Sepharose. Для полного 6-луночного планшета используйте 60 мкл сефарозы.
      2. Промойте сефарозу 1 мл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов). Микроцентрифугу в течение 1 мин при 2 000 × г и осторожно удалите буфер для лизиса. Повторите 2 раза.
      3. Ресуспендируйте сефарозу в 380 мкл буфера для лизиса. Добавьте БСА до конечной концентрации 1 мг/мл и антитело (0,5 мкл для каждого образца IP, антитело против флага [см. Таблицу материалов]). Инвертировать на ротаторе при 4 °C в течение 1,5 ч.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество антител должно быть определено экспериментально для каждого используемого антитела.
   2. Подготовьте клетки к иммунопреципитации.
      1. Добавьте соответствующее количество рапамицина (1 мМ стоковый раствор в этаноле) до конечной концентрации 1 мкМ или добавьте такой же объем этанола (отрицательный контроль) в образцы. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% CO₂ .
      2. Положите 6-луночный планшет с клетками на лед и аккуратно промойте клетки 3 мл холодного PBS. Отсадите PBS и добавьте 300 мкл буфера для лизиса (с 1 мкМ рапамицином для активированного образца фосфатазы или эквивалентным объемом этанола в отрицательном контрольном образце) и соскребите с помощью клеточного скребка. Перенесите образцы в пробирки объемом 1,5 мл и поместите в микроцентрифугу на 10 минут при температуре 1 000 × г при 4 °C.
      3. Перенесите 20 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку объемом 1,5 мл, чтобы проверить уровень экспрессии. Добавьте 20 мкл 2x Laemmli буфера с 5% β-меркаптоэтанолом в каждую пробирку для проверки сцеживания и инкубации при 95–100 °C в течение 5 минут. Используйте оставшуюся надосадочную жидкость для иммунопреципитации на шаге 3.3.3.3.
   3. Иммунопреципитация RapR-Shp2
      1. Промойте Protein-G сефарозу с шага 3.3.1.3. с 1 мл буфера для лизиса. Микроцентрифугу в течение 1 мин при 2 000 × г при 4 °C каждый раз и тщательно отсасывайте буфер для лизиса. Повторите этот шаг 2 раза.
      2. Используя срезанные наконечники, ресуспендируйте сефарозу в буфере для лизиса (50 мкл на образец, поэтому для 6-луночного планшета ресуспендируйте в 300 мкл буфера для лизиса). Пипетку 50 мкл взвешенной смеси сефарозы в отдельную новую пробирку объемом 1,5 мл для каждого образца.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В буферном растворе для лизиса будет ресуспендирована сефароза, оставшаяся из-за объема сефарозы.
      3. Добавьте оставшийся надосадочный слой из подготовленных клеток с шага 3.3.2.3 в каждую пробирку Сефарозы. Вращайте при температуре 4 °C в течение 1,5–2 часов.
   4. Анализ активности фосфатазы
      Субстрат Shp2 следует получать путем фосфорилирования очищенного N-концевого фрагмента паксиллина с использованием конститутивно активной Src-киназы в соответствии с ранее описанным протоколом киназной реакции¹².
      1. Ближе к концу шага 3.3.3.3 приготовьте раствор фосфо-паксиллина. В каждый образец добавьте раствор фосфо-паксиллина (конечная концентрация 3 мкг/мл) в 40 мкл общего количества имидазола буфера (см. Таблицу материалов). Добавляйте рапамицин до конечной концентрации 1 мкМ к аликвоте раствора фосфо-паксиллина для активированных образцов RapR-Shp2 и эквивалентный объем этанола к раствору для неактивированных образцов.
      2. Установите нагревательный шейкер на 32 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для других фосфатаз может потребоваться другая температура для оптимальной активности.
      3. Промойте Сефарозу образцами с шага 3.3.3.3 2 раза с 0,5 мл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов). Промойте образцы 2 раза 0,5 мл буфера для промывки. Каждый буфер должен содержать либо рапамицин в концентрации 1 мкМ для активированных образцов, либо эквивалентный объем этанола для неактивированных образцов. Удалите как можно больше буфера после окончательной стирки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Как только этот шаг будет достигнут, может быть полезно использовать пипетку для медленного и осторожного удаления последнего количества буфера, чтобы убедиться, что сефароза не аспирирована. Любой оставшийся буфер будет влиять на концентрацию фосфо-паксиллина и приводить к неточным показаниям.
      4. Добавьте 40 мкл приготовленной фосфо-паксиллиновой буферной смеси имидазола в каждый образец, с рапамицином или без него (в зависимости от образца). Очень осторожно перемешайте и сразу же поместите в нагревательный шейкер и выдерживайте в течение 40 минут при температуре 32 °C. Установите нагревательный шейкер минимум на 1 000 об/мин, чтобы образец полностью перемешивался в течение всего периода инкубации.
      5. Остановите реакцию, добавив 40 мкл 2x Laemmli Buffer в каждый образец. Инкубируйте образцы при температуре 95–100 °C в течение 5 минут. Охладите образцы.
      6. Загрузите 15 мкл каждого образца (включая образцы лизата из шага 3.3.2.3.) в гель SDS-полиакриламида с градиентом 4–15% и запустите стандартный протокол вестерн-блоттинга с использованием мембран PVDF.
      7. Блоттинг с использованием антитела anti-Flag для обнаружения конструкции RapR-Shp2, анти-mCherry для обнаружения mCherry-FRB и анти-pY118 или анти-pY31 паксиллина для обнаружения фосфорилирования паксиллина.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Получившиеся вестерн-блоттинги должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 4.

4. Анализ активности RapR-Shp2 в живых клетках

Примечание: Этот протокол используется для определения способности RapR-Shp2 дефосфорилировать эндогенные субстраты и индуцировать нисходящую передачу сигналов. Другие RapR-PTPases потребуют анализа их специфических субстратов и путей.

1. День 1
   1. Планшет 198 000 A431 клеток/лунка в 6-луночном тканевом планшете в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ). Поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на ночь.
2. День 2
   1. Заражайте клетки аденовирусными конструкциями, экспрессирующими RapR-Shp2 и FRB, добавляя аденовирус непосредственно в среду, уже находящуюся в чашке. Оставьте аденовирус на клетках в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 на ночь. Используйте клетки, инфицированные FRB, только в качестве отрицательного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество аденовируса необходимо определять в каждом конкретном случае в зависимости от титра.
3. День 3
   1. Голодание клеток A431 путем инкубации в DMEM с 0,5% FBS в течение 4 ч перед экспериментом.
   2. Добавляйте рапамицин в конечную концентрацию 1 мкМ или такой же объем этанола (отрицательный контроль) в клетки в течение 2–4 ч.
      Примечание: Инкубация может отличаться для других фосфатаз.
   3. Положите 6-луночный планшет с клетками на лед и аккуратно промойте клетки 3 мл холодного PBS. Отсадите PBS, добавьте 300 мкл буфера для лизиса (см. Таблицу материалов) и энергично соскребите клеточным скребком. Перенесите образцы в пробирки объемом 1,5 мл и микроцентрифугу на 5 мин при температуре 2 000 × г при 4 °C.
   4. Переложите по 250 мкл каждого образца в новую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 250 мкл 2x Laemmli буфера с 5% β-меркаптоэтанолом и инкубируйте при 95–100 °C в течение 5 минут.
   5. Загрузите 25 мкл каждого образца на гель SDS-PAGE с градиентом 4–15% и запустите стандартный протокол вестерн-блоттинга с использованием мембран PVDF.
   6. Оцените опосредованное RapR-Shp2 дефосфорилирование EGFR и PLCγ с использованием антител против pY992 EGFR и против pY783 PLCγ. Оцените последующую активацию MAP-киназы Erk1/2 путем оценки ее фосфорилирования на остатках pT202/pY204.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получившиеся вестерн-блоты должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 5.

5. Анализ морфодинамических изменений, индуцированных активацией RapR-Shp2 в клетках HeLa с использованием визуализации живых клеток

Примечание: Этот протокол используется для определения влияния активации RapR-Shp2 на образование клеточных выпячиваний, распространение и миграцию клеток.

1. День 1
   1. Поместите 700 000 клеток HeLa в чашку для клеточных культур диаметром 35 мм и поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 . Дайте клеткам прилипнуть к посуде (~2–3 ч).
   2. Трансфектируйте клетки в соответствии с протоколом производителя предпочтительного реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов).
      1. Пример протокола трансфекции: Добавьте 0,5 мкг ДНК (плазмиды pcDNA-mCherry-FRB и pcDNA-Venus-RapR-Shp2, каждая) к 100 мкл бессывороточного DMEM и 6 мкл реагента для трансфекции. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте трансфекционную смесь в клетки и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 . Используйте клетки, трансфицированные pcDNA-mCherry-FRB, только в качестве отрицательного контроля.
   3. Покрытие круглого стеклянного покровного стекла #1.5 25 мм с фибронектином (5 мг/л) путем инкубации в течение 1 ч при 37 °C.
2. День 2
   1. Промойте стекло с покрытием PBS.
   2. За 4 ч до визуализации трансфицированные клетки HeLa нанесите на покровное стекло с покрытием в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ) для достижения 30% конфлюенции.
   3. Через два часа после нанесения покрытия аккуратно переключите среду в тарелке на предварительно подогретую среду без сыворотки Leibovitz L-15 на 2 часа.
   4. Окрашивайте клетки CellMask Deep Red кремом для плазматической мембраны в соответствии с протоколом производителя.
   5. Поместите покровное стекло в чистую камеру камеры для визуализации (см. Таблицу материалов). Добавьте 1 мл предварительно подогретого фильтрующего материала L-15 и залейте 1 мл предварительно подогретого минерального масла, чтобы предотвратить испарение. Поддерживайте температуру в камере при температуре 37 °C до получения изображения.
   6. Визуализируйте ячейки при температуре 37 °C с помощью нагреваемого предметного столика.
      1. Выберите подходящие каналы для визуализации конструкции RapR и CellMask для эпифлуоресцентной визуализации. Чтобы следовать этому протоколу, используйте указанный объектив 40x (см. Таблицу материалов) и следующие наборы фильтров: фильтры возбуждения 514/10 и фильтры излучения 540/21 для визуализации Venus-RapR-Shp2, фильтры возбуждения 561/10 и фильтры излучения 595/40 для визуализации mCherry-FRB, а также фильтры возбуждения 640/20 и 655LP для визуализации CellMask Deep Red. Используйте многополосное полихроичное зеркало для всех флуоресцентных каналов (см. таблицу материалов).
      2. Делайте снимки каждые 2 минуты в течение 4–4,5 часов.
         Примечание: Более быстрые морфодинамические изменения потребуют более частой регистрации.
      3. Через 1 час визуализации добавьте рапамицин до конечной концентрации 1 мкМ для стимуляции RapR-Shp2.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается создание масок клеток на основе . Файлы стека TIF, собранные в ходе экспериментов с визуализацией в реальном времени. Затем будет описано, как создать макрос в ImageJ для анализа масок, в результате чего будет создана электронная таблица с площадью ячейки, которая затем будет проанализирована на предмет изменений с течением времени. Наконец, протрузивная и ретрактивная активность клеток будут проанализированы с помощью Metamorph.

1. Сгенерируйте двоичную маску изображений CellMask с помощью функции MovThresh из программного пакета^{CellGeo 24}.
2. Скопируйте папку MovThresh в папку анализа изображений.
3. Скопируйте изображения канала CellMask или другого мембранного маркера в папку MovThresh.
   1. Если несколько ячеек были изображены в одном месте, обрезайте изображения для создания файлов, содержащих только одну ячейку, прежде чем создавать маску в MatLab.
4. Убедитесь, что в MatLab правильно указана папка MovThresh.
5. Запустите MovThresh.
6. Импортируйте стопки изображений по одной.
7. Выберите «Сглаженная кривая», а затем запустите команду «Повторное пороговое значение».
8. Сохраните как номер Mask_Image в новой папке с меткой «Маски».
9. После того, как все стеки изображений будут преобразованы в маски, откройте их в программном обеспечении ImageJ²⁵.
   1. Анализ площади клеток в ImageJ
      1. Откройте все стеки изображений Mask в ImageJ.
      2. Отрегулируйте параметр «Измерение » в соответствии с областью.
      3. Нажмите «Плагины» | Макросы | Запись.
      4. Нажмите «Обработать» | Двоичный | Сделайте двоичным.
         1. Выберите вариант по умолчанию .
            ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте ничего лишнего во время записи макроса. Если включены дополнительные шаги, рекомендуется начать заново с шага 6.9.1.3.
      5. Нажмите «Анализировать» | Анализируйте частицы.
         1. Снимите все флажки, кроме «Сводка».
      6. Завершите запись и нажмите кнопку Создать макрос.
      7. Нажмите «Выполнить » для каждого стека изображений после его выбора и сохраните таблицу результатов для каждого стека изображений. Вариант по умолчанию будет сохранен как файл csv.
      8. Сохраните макрос и повторно используйте его для будущих анализов (необязательно).
   2. Обработка данных об области в таблице
      1. Для каждой анализируемой клетки усредните площадь клетки по изображениям, полученным до активации рапамицином.
      2. Разделите все значения площади на среднюю площадь клетки, предшествующей добавлению рапамицина.
      3. Вычислите среднее значение для каждой временной точки для всех визуализируемых ячеек и определите 90% доверительные интервалы. Построение графика данных.
   3. Анализ протрузии клеток
      1. Скопируйте папку ProActive в папку анализа изображений.
      2. Скопируйте стопки изображений в маске из MovThresh в только что созданную папку ProActive.
      3. Откройте MatLab и установите каталог в папку ProActive.
      4. Запустите ProActive.
      5. Импортируйте файлы стека изображений замаскированных ячеек в графический интерфейс ProActive.
      6. Определите тип деятельности. Анализ выступающей активности позволит получить данные о присоединенной площади ; анализ втягивающей активности позволит получить данные о потерянных площадях ; и общая активность будут генерировать общие данные об изменении площади (как потерянные, так и приобретенные).
      7. Установите область для определения нормализации.
      8. Сгладьте кривую либо с использованием предложенных пороговых значений, либо с использованием среднего значения для повторного порога каждой временной точки. При этом пороговые значения усредняются по определенному окну, сводя к минимуму несоответствия в пороговых значениях между временными точками.
      9. Нажмите «Файл» | Сохранить как | Результаты (.mat)
         1. При обработке всех трех типов действий области назовите обрабатываемые файлы данных следующим образом: ProResultData #, RetResultData # или ResultData #.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте пробел перед числом и пронумеруйте данные, начиная с 1.
      10. Повторите шаг 6.9.3.6. для всех импортированных стеков изображений в масках.
      11. После обработки всех ячеек закройте графический интерфейс ProActive.
      12. Откройте DataToFileTotalArea в редакторе Matlab для обработки файлов "ResultData" общей активности.
      13. Измените количество ячеек в соответствии с количеством созданных файлов результатов. Если на шагах 6.9.3.5–6.9.3.10 было обработано 7 ячеек, убедитесь, что первые три строки скрипта выглядят следующим образом:
          filename='Данные результата ';
          ячейки = 1:7;
          lag=1;
      14. Нажмите Run и повторите это для DataToFileProtArea и DataToFileRetArea для обработки выступающих и отзываемых данных соответственно. В результате анализа будут созданы три текстовых файла "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" и "AllCellsRet.txt"
      15. Откройте файлы .txt в таблице и нормализуйте, как описано в разделе 6.9.2. Вычислите среднее значение для каждой временной точки для всех визуализируемых ячеек и определите 90% доверительных интервалов. Построение графика данных.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующие графики из вышеуказанных шагов должны выглядеть примерно так, как показано на рисунке 6.

Results

На рисунке 4 представлены результаты, которые можно ожидать от анализа активности фосфатазы на основе паксиллина. В этом эксперименте конститутивно активная и доминантная отрицательная активность Shp2-фосфатазы сравнивалась с активной и неактивной активностью RapR-Shp2 с использованием фосфо-паксиллина в качестве считывания. Конструкции Shp2 подвергали иммунопреципитации и анализу активности, описанному в протоколе. Показания фосфо-паксиллина для конститутивно активного Shp2 и активного RapR-Shp2 были сходными, что указывает на то, что активный RapR-Shp2 не подвергался негативному влиянию введения домена RapR и сохранял полную активность после активации. Доминантный отрицательный Shp2 и неактивный RapR-Shp2 также были сходны, что указывает на то, что конструкция RapR-Shp2 не проявляет активности в неактивном состоянии. Это указывает на успешную разработку RapR-фосфатазы. Фосфосубстрат, используемый для этого анализа, может отличаться в зависимости от интересующей фосфатазы.

На рисунке 5, как и на рисунке 4, сравниваются конститутивно активный, доминантный отрицательный, активный и неактивный RapR-Shp2. Этот эксперимент проводился без иммунопреципитации конструкций. Вместо этого он был разработан для характеристики нисходящих сигнальных эффектов конструкции RapR-Shp2 в клетках. Здесь конструкции Shp2 экспрессировались в HEK293T клетках. Показано, что нижележащий эффектор ERK1/2 увеличивает фосфорилирование в ответ на активацию RapR-Shp2, как и в конститутивно активном образце. Неактивный RapR-Shp2 не вызывал этого изменения. Это указывает на то, что нисходящая передача сигналов Shp2 сохраняется с включением RapR-домена. Аналогичным образом, известные фосфосубстраты EGFR и PLCγ дефосфорилировались в ответ на активацию RapR-Shp2 в клетках A431.

Наконец, на рисунке 6 представлены результаты активации RapR-Shp2 на морфодинамику клеток HeLa. Как только RapR-Shp2 был активирован, клетки показали увеличение протрузивной активности, а также площади клеток. Это указывает на то, что активация RapR-Shp2 достаточна для индуцирования морфодинамических изменений в клетках HeLa и может позволить исследователям исследовать специфические нисходящие сигнальные пути, ответственные за этот эффект.

Рисунок 4: Результаты анализа активности на основе паксиллина: Конститутивно активные, доминантные отрицательные и RapR-Shp2 были иммунопреципитированы и подверглись анализу активности с использованием описанного протокола. Уровни pY31 paxillin как в CA, так и в RapR-Shp2 были схожими, что указывает на то, что конструкция RapR-Shp2 имела аналогичную активность по сравнению с CA Shp2 после активации. Неактивированный образец RapR-Shp2 не проявлял активности, как и образец DN, что указывает на то, что он не был «дырявым». Эта цифра была изменена из Fauser et ^al.12. Сокращения: RapR = Rapamycin-regulated; Shp2 = гомология Src-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза; DN = доминантное отрицательное; CA = конститутивно активный; FRB = FKBP-рапамицин-связывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Результаты анализа лизата цельных клеток: Конститутивно активные, доминантные отрицательные и RapR-Shp2 экспрессировались в HEK293T клетках, и протокол лизата цельных клеток был завершен. В неактивном состоянии RapR-Shp2 не активировал ERK1/2 путем фосфорилирования, подобно образцу DN Shp2. Это указывает на то, что RapR-Shp2 не проявляет активности, когда неактивен. После активации уровень фосфорилирования ERK1/2 был аналогичен таковому в образце CA Shp2, что указывает на успешную активацию и последующую передачу сигналов Shp2. Аналогичным образом, клетки A431, экспрессирующие RapR-Shp2, показали снижение фосфорилирования как EGFR, так и PLCγ, которые являются известными субстратами Shp2. Эта цифра была изменена из Fauser et ^al.12. Сокращения: RapR = Rapamycin-regulated; Shp2 = гомология Src-2 домен-содержащая протеинтирозинфосфатаза; DN = доминантное отрицательное; CA = конститутивно активный; ERK = киназа, регулируемая внеклеточным сигналом; GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; EGFR = рецептор эпидермального фактора роста; PLCγ = фосфолипаза С гамма; FRB = FKBP-рапамицин-связывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Анализ площади и активности клеток на основе визуализации в реальном времени: клетки HeLa были трансфицированы RapR-Shp2 и подвергнуты описанному протоколу визуализации в реальном времени. Данные анализировались в соответствии с протоколом анализа данных. После активации (обозначено вертикальной серой линией) клетки HeLa показали увеличение как клеточной протрузионной активности, так и клеточной площади. В отрицательных образцах, которые экспрессировали только FRB, эта активность отсутствовала. Это указывает на то, что активация RapR-Shp2 вызывает быстрые морфодинамические изменения в клетках HeLa и стимулирует распространение и выпячивание клеток. Эта цифра была изменена из Fauser et ^al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

В этом протоколе подробно описаны этапы разработки, определения характеристик и применения хемогенетически контролируемых фосфатаз. Инструмент RapR-Shp2 основан на регулируемом рапамицином переключателе, вставленном в каталитический домен Shp2. Сильной стороной этого средства является специфичность и жесткий временной контроль активности фосфатазы. Инструмент применим к другим фосфатазам и в сочетании с ранее описанной технологией RapR-TAP позволяет реконструировать отдельные нисходящие сигнальные пути²⁶. Уникальные возможности подхода RapR позволили исследователям идентифицировать переходные процессы, индуцированные активацией Shp2, и проанализировать конкретные нисходящие сигнальные пути, регулирующие отдельные морфодинамические процессы.

Несколько критических факторов влияют на конструкцию фосфатазы RapR. Хорошо разрешенная кристаллическая структура каталитического домена исследуемой фосфатазы очень полезна при выборе места инсерции iFKBP. Тем не менее, из-за высокого структурного сходства между тирозинфосфатазами, выравнивание аминокислотных последовательностей каталитических доменов может предоставить достаточную информацию для идентификации сайта введения, как показано на примере выравнивания Shp2 с PTP1B и PTPPest (рис. 2). Для RapR-Shp2 в качестве наиболее оптимального места вставки был выбран Val406, расположенный в центре, соединенном с критической каталитической петлей WPD через β-цепь. Один и тот же сайт введения может привести к успешной регуляции других ПТФаз, как это было продемонстрировано для PTP1B и PTP-PEST¹² (рисунок 2A).

Если представляющая интерес фосфатаза является мультидоменным белком, структурная информация об организации доменов поможет предотвратить вмешательство в другие функции ПТФазы. Еще одним фактором, влияющим на разработку оптимальной RapR-ПТФазы, является то, сколько аминокислот должно быть заменено вставленной iFKBP. Более крупные и гибкие петли вставки в PTPase могут потребовать дополнительного укорочения для обеспечения жесткой регуляции каталитической активности iFKBP. Аналогичным образом, длина и состав линкеров, соединяющих iFKBP с PTPase, будут влиять на эффективность регулирования. Короткие линкеры, состоящие из одного остатка Gly, обеспечат более жесткую регуляцию, но могут снизить максимальную активность фермента, если они вносят стойкое структурное искажение, даже когда iFKBP связывается с рапамицином и FRB. Компоновщики средней длины Gly-Ser-Gly обеспечивают большую гибкость, но могут быть недостаточно жесткими для некоторых PTPases. Длинные линкеры, состоящие из Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly, помогут предотвратить образование непреднамеренных вторичных структур, которые могут повлиять на регуляцию ПТФазы. RapR-Shp2 был протестирован со всеми тремя типами линкеров; наиболее оптимальным был признан линкер Gly-Ser-Gli.

Важнейшим аспектом, определяющим успешную разработку инструментов RapR, является установление надежного анализа фосфатазы и наличие соответствующего контроля. Сравнение активности RapR-фосфатазы с активностью доминантно-негативных и конститутивно активных версий POI позволяет оценить негерметичность RapR-конструкции и степень активации. Кроме того, отсутствие дефосфорилирования конститутивно активной фосфатазой или сниженное фосфорилирование доминантным негативным мутантом будет указывать на ненадлежащие условия реакции.

Для анализа фосфатазы условия реакции потребуют оптимизации для каждой ПТФазы. Регулировка температуры, времени реакции и буферных условий будет зависеть от интересующей PTPase. Энергичное перемешивание образцов имеет решающее значение для обеспечения достаточного перемешивания связанной с сефарозой ПТФазы и ее субстрата. Наконец, если описанный анализ фосфатазы не является оптимальным для конкретной ПТФазы, представляющей интерес, то в качестве альтернативного анализа²⁷ можно использовать фосфатазную реакцию с использованием-нитрофенилфосфата в качестве субстрата.

В экспериментах по визуализации живых клеток при подготовке образца следует учитывать несколько критериев. В описанном протоколе используется среда L-15 на основе буфера HEPES, который не чувствителен к концентрации_CO2 . Если желательно использование среды на основе бикарбоната, то следует дополнить HEPES для поддержания pH образца или использовать камеру для визуализации окружающей среды, дополняющую CO₂ . Протокол рекомендует наносить слой минерального масла поверх образца, чтобы предотвратить испарение и упростить добавление рапамицина. Можно использовать и другие установки с использованием камеры визуализации окружающей среды или закрытой камеры, но добавление рапамицина может быть более сложным. При добавлении рапамицина в клетки во время визуализации следите за тем, чтобы стадия не смещалась и клетки не были нарушены. Любые дополнительные движения образца в процессе визуализации будут препятствовать сбору данных. Интенсивность освещения и время экспозиции должны быть низкими для снижения фототоксичности, особенно при длительной визуализации. Адекватная эффективность трансфекции клеток также имеет решающее значение. Соотношение FRB и ДНК RapR-Shp2 в соотношении 1:1 обеспечивает адекватную экспрессию, но для новых конструкций это соотношение потребует корректировки. Чтобы обеспечить эффективную активацию, FRB должен экспрессироваться на более высоком уровне, чем фосфатаза RapR.

Ограничением инструментов на основе RapR является невозможность быстрой деактивации. Смена среды удаляет внеклеточный рапамицин, но деактивация конструкций RapR может занять несколько часов из-за очень плотного связывания рапамицина с конструкцией RapR. Быстрая инактивация может быть достигнута путем добавления активного ингибитора центра ПТФазы. Тем не менее, потенциальные побочные эффекты ингибитора могут затруднить интерпретацию результатов. Кроме того, даже в сочетании с ингибитором ПТФазы подход RapR не может быть использован для экспериментов по циклической активации/инактивации. Еще одним ограничением системы RapR является отсутствие пространственного контроля. Конструкции RapR глобально экспрессируются и, следовательно, активируются повсюду в клетке. Одним из потенциальных решений является применение рапамицина в клетке, который может высвобождаться под действием близкого ультрафиолетового света локально в клетке^28,29. Кроме того, инструмент RapR может быть модифицирован для достижения активации представляющей интерес фосфатазы в определенном белковом комплексе или в определенном субклеточном месте. Путем присоединения партнера по связыванию или субклеточной метки к FRB, RapR-PTPase будет нацелена на определенный белок или место в клетке. Наконец, рапамицин является хорошо охарактеризованным иммуносупрессором за счет ингибирования mTOR и может влиять на клеточную сигнализацию, потенциально нарушая передачу сигналов интересующей ПТФазы. Чтобы преодолеть эту проблему, неиммуносупрессивные аналоги рапамицина (iRap и AP21967) представляют собой хорошую альтернативу. Было показано, что оба соединения регулируют конструкции RapR¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Стеклянные покровные стекла 25 мм круглые	Warner Instruments	64-0715
1.5 мл Пробирки	США Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 г Tris-HCL, 131.5 мл глицерина, 52.5 мл 20% SDS, 0.5 г бромофенолового синего, конечный pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Клетки	ATCC	CRL-1555
Агарсоза	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µ m стерильно-фильтрованный
Brig 35,30 б/в %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	Н	/Д Н/Д	Опубликовано в 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red краситель плазматической мембраны	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a компетентный клетки	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
Лестница ДНК	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Фермент	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-дитиотреитол, Реагенты Cleland's
EGTA	Acros	409910250
Фибронектин из плазмы крупного рогатого скота	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Реагент для трансфекции	Promega	E2692	Реагент для трансфекции
Набор для экстракции геля	Thermo Scientific	K0692	Набор для экстракции геля
Гель с зеленым окрашиванием нуклеиновых кислот	GoldBio	G-740-500
Гелевый краситель фиолетового цвета 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 мл
HEK 293T Клетки	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Программное обеспечение для обработки	Н/Д	/Д
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Имидазол буфер			25 мМ Имидазол pH 7,2, 2,5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 5 мМ DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Агар	Фишер	BP1425-2
лизисный буфер			20 мМ Hepes-KOH, pH 7,8, 50 мМ KCl, 1 мМ EGTA, 1% NP40
Обновление MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b использовалось для запуска функций CellGeo
Metamorph Программное обеспечение для автоматизации микроскопии и анализа изображений	Н/Д	Н/Д
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Минеральное масло	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Сборные гели 12 лунок	Bio-Rad	4561085
Молекулярная биология Класс Вода	Corning	46-000-CV
Многополосный полихроичный зеркальный	хроматический технология	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x объектив	Olympus	N/A
PBS без Ca и Mg	Corning	21-031-CV
ПЦР-пробирки	labForce	1149Z65	0,2 мл 8-полосковые пробирки и колпачки, жесткая полоска индивидуально прикрепленные купольные колпачки
phusion plus ДНК-полимераза	Thermo Scientific	F630S
праймеры	IDT
белок-g сефароза	миллипоры	16-266
Мембраны PVDF	BioRad	1620219	иммуноблоттинг PVDF/фильтровальная бумага сэндвичи
рапамицин	Фишера	AAJ62473MF
0,25% трипсина, 2,21 мМ ЭДТА, 1x [-] натрий	Corning	25-053-CI
трис-ацетат-ЭДТА (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	для электрофореза
Промывочный буфер			20 мМ Hepes-KOH, pH 7,8, 50 мМ KCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1% NP40
β-меркаптоэтанол	Fisher Chemical	O3446I-100
AntiАнтитела
Anti-EGFR Антитела	Клеточная сигнализация	2232
Anti-Erk 1/2 антитела	Клеточная сигнализация	9102
Anti-Flag антитело	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Антитело	invitrogen	AM4300
Anti-GFP антитело	Clontech	632380
Anti-mCherry антитело	invitrogen	M11217
Антитело против паксиллина	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 антитело Cell	Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Антитело	Клеточная сигнализация	9101
Антифосфо-паксиллин Y31 Антитело	Millipore-Sigma	05-1143
Антифосфо-ПЛК&гамма; Y783 Клеточная	сигнализация	14008
Анти-ПЛК&гамма;	Клеточная передача	5690