Методическая статья

Структурно-ориентированное проектирование и разработка новых ингибиторов циклофилина А и производных ганодриола-F: подход в силико

DOI:

10.3791/67145

⸱

23 июня 2026 г.

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол структуроориентированного проектирования взаимодействия связывания белка и лиганда между санглифрином A и циклофилином A/Ганодриол-F, необходимым для открытия новых препаратов. Стабильность комплекса лиганд-рецепторов оценивалась с помощью молекулярно-динамического моделирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ось циклина Ds-CDK (циклофилин A (Cyp /Ганодриол F)) играет критическую роль в раке через различные процессы, такие как контроль пролиферации и ингибирование раковых клеток. Производные ганодриола F могут служить онкогенными мишенями для нескольких типов рака. Это исследование показало, что структуроориентированное проектирование и разработка новых ингибиторов Cyp A и производных ганодриола F могут использоваться для выбора рассчитанных позиций с целью повышения эффективности химических ингибиторов и их взаимодействия с выбранными рецепторами. Для этого подхода использовалось множество программных приложений для достижения оптимальных молекулярных взаимодействий. Всего с помощью программного обеспечения Chemsketch было создано 117 новых молекул лигандов ингибитора циклофилина. Конвертированные PDB-файлы новых лигандов ингибитора Cyp A были подготовлены для введения в рецептор фермента Санглифрин А. Взаимодействия стыковки лиганда и белка проводились с помощью программного обеспечения AutoDock 4.2.6 для выявления наилучших геометрических взаимодействий. Подтверждение стыковки проводилось с помощью программного обеспечения PyMOL 2.5. Наконец, водородные связи были обнаружены с помощью программ Chimera и Maestro. Выбранный комплекс, связанный с лиганд-рецептором, подвергся молекулярно-динамическому моделированию. Процесс моделирования MD продемонстрировал стабильность комплекса и показал, что выбранный лиганд может использоваться как ингибитор лекарств для раковых клеток. В результатах активные аминокислоты в участке связывания были идентифицированы: аргинин 55 в движении 1,53Å, аспарагин (Asn), глицин (Gly), треонин (Thr), лизин (Lys), изолейцин (Iso), гистидин (Hid), фенилаланин (Phe) и цистеин (Cys) с наибольшим количеством лигандов водородных связей — 45 гидроксимангиферонных. Он соединялся с 1nmk рецептором в координатах сетки X 38.86, Y — 10.987, Z — 40.734. Оценка комплекса 1nmk рецептор-лиганд в симуляции молекулярной динамики (MD) в силовом поле CHARMM 36 версии Громаса имеет оптимальные градусы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циклофилин А является сильным ингибитором человеческого Cyp A. Циклофилин — это надёжный ингибитор, который не нарушает иммунную систему, обладает лучшими фармакологическими свойствами и снижает торможение транспортеров. Плохой прогноз связывают с гиперэкспрессией циклофилинов — семейства белков с пептидил-пролилизомеразнойактивностью 1. Сообщалось, что циклофилины переэкспрессируются во многих видах рака, включая гепатоцеллюлярную карциному. При гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) циклофилины играют ключевую роль как для устойчивости к раку и для пролиферации лекарств2. Ингибирование получает важную информацию для выявления новых иммуносупрессоров на основе производных хиноксалина с помощью атомарного молекулярного стыковки и MD-симуляции для определения точного участка связывания DC838 с CypA 3.

Кроме того, исследования in vivo показали, что циклофилин DC838 предотвращает пролиферацию клеток селезёнки мышей, вызванное конканавалином. Несколько исследований сообщали о серии макроциклических ингибиторов циклофилина, синтезированных на основе санглифрина А (SFA), природноговещества 4. Начальная оптимизация соединений показала, что гидроксильная группа остатка тирозина m5, стереоцентры в C14 и C15, а также трипептид валин5м5тирозин5пиразиновой кислоты в ядре санглифрин являются существенными факторами, влияющими на потенциюсоединения 5. Единица C185C21 диена в SFA может быть заменена стироловой группой для создания мощных соединений с новым режимом связывания, при котором стироловая часть взаимодействует с аргинином (Arg)55 6 Cyp A посредством стекового взаимодействия. Неиммуносупрессивные ингибиторы циклофилина эффективны в лечении вируса гепатита C. ЦиклоспоринA 1, алиспоривир и большинство других циклоспоринов являются сильными ингибиторами MRP2, MDR1, OATP1B1 и других важных транспортёровлекарств 7,8.

С другой стороны, ганодериол F, очищенный из Ganoderma leucocontextum, замедляет прогрессирование клеткового цикла, ингибируя циклины CDK4/CDK6 9, а циклин-зависимые киназы (CDK) играют ключевую роль в контроле клеточного цикла млекопитающих. Циклин D-CDK4/CDK6 и циклин E-CDK2 являются ключевыми игроками в контроле прогрессирования клеточного цикла Ганодриолом F. Таким образом, ганодериол F может использоваться как потенциальный ингибитор CDK4/CDK6 в лечении рака молочнойжелезы 10,11. FA ингибирует фазу G1 клеточного цикла, что предотвращает рост макрофагов, зависящих от M-CSF, не влияя на жизнеспособность клетки12. Иммуносупрессор подавляет пролиферацию, деактивируя активность CDK2. В контексте рака роль циклина D-CDK4/6, наряду с другими циклинами и CDK, хорошо известна. Рак характеризуется нарушением дерегулирования пути циклин-CDK. В частности, когда клетка готова инициировать синтез ДНК, CDK4 опосредует проход через фазу G1 вместе с циклинами типа D. Этот процесс тесно связан с развитием и прогрессированием рака9.

Активный центр Cyp A характеризуется инвариантным каталитическим аргнином (Arg55) и высококонсервативной смесью гидрофобных, ароматических и полярных остатков, таких как Arg55, глутамин (Gln), глицин (Gly) и треонин (Thr)1,13,14. Активный участок семейства циклофилинов также состоит из аланина (Ala) и аспарагина (Asn)1. В то же время активный центр SFA состоит из аминокислот Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala, и Asn, которые образуют гидрофобный карман, охватывающий пиперазин-кислотную часть SFA. В отличие от нелигандированного Cyp A, связующий механизм между макроциклом и спин-велосипедом SFA заставляет Trp121 перестроить боковыецепи 16.

1nmk выбирается в качестве специфического PDB-кода Санглифрин А, как упоминалось в предыдущихисследованиях 17. SFA, иммуносупрессивное природное вещество, впервые было обнаружено в Streptomyces sp. A92-3081 5,18. SFA обладает высокой аффинностью к Cyp A и имеет уникальную структуру по сравнению с CsA, используя уникальный метод подавления иммунной системы. Сложная молекулярная структура SFA состоит из 22-членного макроцикла с девятиуглеродным тросом в позиции 23, заканчивающийся сильно замещённой спиро-бициклической группой. Исследования in vitro с фиброзными фибробластами лёгких человека и образцы пациентов с идиопатическим лёгочным фиброзом показали, что SFA увеличивает производство циклофилина B и подавляет секрецию коллагена типаI 19,20. Всего для выделения SFA (C16) было использовано 20 различных санглифринов. Её аффинность к циклофилинам примерно в 60 раз выше, чем у других членов группы SFA в эксперименте с безклеточным конкурентнымсвязыванием 15. Например, SFA значительно снижает количество биоактивного IL-12p70, основного источника IL-12, выделяемого дендритными клетками, тем самым ингибируя активность дендритных клеток. Это исследование предполагает, что SFA является мощным новым иммуносупрессивнымпрепаратом 1.

В этом протоколе новые структуры лигандов для Ganoderiol F/Cyp A генерировались с помощью in silico методов с программным обеспечением Chemsketch, а затем конвертировались в PDB-файлы с помощью совместимого программного обеспечения. Концепция связывания белков-лиганд является значимой проблемой в процессе открытия и разработкилекарств 21,22. Взаимодействие лиганд-рецепторов было докировано с помощью программного обеспечения AutoDock 4.2.6. Вычислительные стыковочные системы обычно генерируют несколько потенциальных конфигураций белков-лигандных комплексов. Один или несколько кандидатов с наименьшим энергетическим связыванием с 1nmk-рецептором могут быть выбраны для следующего этапа разработки препарата, чтобы обеспечить эффективность в силико-экспериментальных испытаниях. Программное обеспечение Chimera использовалось для определения оптимального лиганда, связывающего водород. Наконец, были проведены молекулярно-динамические (MD) симуляции комплекса лиганд-рецептор для измерения его стабильности. Этот метод описан в протоколе ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация лигандов и препаратов лигандов в программном обеспечении ChemSketch в силиции

ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение будет использоваться для отображения структуры лиганда/молекулы, то есть для молекулярного редактирования.

  1. Нарисуйте лиганд/структуру, как указано в процессе рисования, выполненном в программном обеспечении, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 1).
  2. Нажмите f9 , чтобы очистить конструкцию после того, как полностью нарисоваете конструкцию.
  3. Нажмите «Файл », затем «Сохранить как». (Перейти к папке, например, молекула 1 будет сохранена в папке 1 и так далее).
  4. Измените тип Save As на mdl molfiles, затем нажмите Save (не нужно указывать имя файла; используйте стандартное имя, предоставленное программой, например, noname).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В папке будет создан один файл, и каждый файл будет иметь формат mdl 2D-структурного лиганда.
  5. Повторите вышеуказанные шаги для всех молекул.

2. Преобразование формата файла (программное обеспечение Open Babel)

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение конвертирует форматы файлов. Здесь .mol-файл будет преобразован в формат .pdb, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 2).

  1. Слева, в формате ввода, выберите формат mol--mdl mol в выпадающем меню. Аналогично, справа, в выходном формате, выберите формат pdb — белковый банк данных.
  2. В формате ввода (слева) нажмите ... (кнопка просмотра).
  3. Перейдите к папке (например, папке 1), нажмите на только что нарисованный файл Chemsketch и откройте его.
  4. В формате вывода нажмите ....
  5. Откроется окно по умолчанию. Введите 1.pdb здесь, чтобы назвать файл. Для структуры 1 введите 1.pdb и нажмите Сохранить. Повторим этот шаг для молекулы/структуры 2, типизируя 2.pdb , и так далее.
  6. Наконец, из середины программного интерфейса нажмите Convert. Это преобразует координаты из формата mdl mol в формат PDB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь в папку будет добавлен ещё один файл. В каждом файле будет один pdb-файл с лигандом, который будет использоваться на следующих этапах.
  7. Кликните правой кнопкой мыши по недавно созданному файлу, выберите «Открыть с» и затем выберите «Блокнот».
  8. Повторите те же шаги для всех молекул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: AutoDock 4.2.6 появится на рабочем столе после установки инструментов MGL 1.5.7.
  9. Подготовьте входный файл 1nmk.pdb, как описано ниже.
  10. В файле 1nmk.pdb удалите все внешние лиганды, посетив сайт pdb.org и выбрав структуру 1nmk. Ищите лиганды под заголовком малой молекулы на структуре 1nmk, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 3).
  11. Найдите лиганд с названием SFM, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 4), и откройте файл 1nmk. Скачайте файл PDB 1nmk с сайта PDB. Найдите остаточный остаток завершения (TER), как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 5).
  12. Удалите остатки внешних лигандов (SFM) в структуре 1nmk, начиная с остатка после TER и заканчивая до остатка, указанного до конца. Сохраните модифицированный PDB-файл 1nmk на системе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PDB-файл 1nmk будет готов, а файл активного координатного сайта рецептора будет подготовлен в таблице 1.
  13. Откройте файл 1nmk и найдите Arg по аминокислоте номер 55.
  14. Найдите координаты x, y и z, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 6).

3. Подготовка параметров стыковки с помощью программного обеспечения AutoDock 4.2.6.

  1. Откройте программное обеспечение AutoDock 4.2.6 с рабочего стола.
  2. Выберите AutoDock 4.2.6 4.0 для подготовки рецептора 1nmk, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 7).
  3. Откройте меню «Файл », выберите «Читать молекулы», перейдите в папку, выберите 1nmk и нажмите «Открыть».
  4. Нажмите Редактировать, выберите Водород и нажмите Добавить. Выберите только Polar и нажмите OK. (Дополнительный файл 1, скриншот 8).
  5. Нажмите Редактировать, выберите Charges, а затем выберите Kollman Charges.
  6. Нажмите Редактировать, выберите Atoms, затем выберите Assign ad4 type (выберите любой из них).
  7. Откройте меню «Файл », выберите «Сохранить» и введите pdbqt. Окно откроется. Просмотрите папку 1, введите имя файла 1nmk.pdbqt и нажмите Сохранить.
  8. Выберите из Atom, а затем добавите , как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 9). Отметьте галочки сортировки узлов, сохраните координаты трансформации, запишите все записи и нажмите OK.
  9. Откройте Лиганд, выберите ввод, затем Открыть. Перейдите к папке 1, измените тип файла на все файлы, выберите 1.pdb и нажмите Открыть. Появится небольшое окно с информацией о выбранном лиганде, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 10).
  10. Откройте лиганд, затем торсионное дерево, а затем определите корень, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 11).
  11. Откройте Ligand, затем Output, а затем сохраняйте как pdbqt. Перейдите к папке 1, введите имя файла 1. pdbqt и нажмите Сохранить, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 12).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будут подготовлены все файлы pdbqt лиганда.
  12. Откройте сетку, выберите Макромолекулу, выберите 1nmk, а затем Молекулу. Появится предупреждение; нажмите OK, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 13). Перейдите в папку 1, введите имя файла 1nmk.pdbqt, нажмите Сохранить, и когда откроется окно замены, нажмите Да, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 14).
  13. Откройте сетку и выберите типы карт, выберите Лиганд, нажмите на 1 и выберите Лиганд, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 15).
  14. Подготовьте файл активных адресов GPF-рецепторов, как показано в Таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл GPF представляет активный координатный сайт рецептора (Таблица 1).
  15. Нажмите на Grid, затем перейдите в поле Grid, выберите Центр, выберите атом и введите поле Центральная сетка (Дополнительный файл 1, Скриншот 16).
    1. Выберите «Файл», затем «Закрыть», сохраняя текущие настройки.
    2. Выберите Grid, затем Output, и сохраните как GPF. Перейдите в папку 1 и введите имя файла 1nmk.gpf.
    3. Выберите Стыковка > макромолекулу > Установите жёсткое имя файла, перейдите к папке 1 и нажмите 1nmk.pdbqt, затем Открыть, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 17).
    4. Выберите стыковку, найдите 1 и выберите Лиганд (дополнительный файл 1, скриншот 18). Откроется окно с параметрами по умолчанию. Примите параметры по умолчанию, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 19).
    5. Затем выберите «Стыковка», перейдите в «Параметры поиска», выберите «Генетический алгоритм», который открывает окно с параметрами по умолчанию, и выберите «Принять», как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 20).
    6. Выберите Стыковка, затем Вывод, Ламарковская GA, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 21).
    7. Перейдите в папку 1, введите имя файла " 1nmk.dpf" и нажмите Сохранить, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 22).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте окно программного обеспечения AutoDock 4.2.6, откройте его снова и повторите процесс для следующей молекулы. Кроме того, 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf и 1nmk.dpf будут готовы к этапу стыковки.

4. Cygwin-I (процесс стыковки)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать файлы GLG и DLG , запустите алгоритм. Алгоритм (AutoGrid) работает в этом терминале Cygwin. В Cygwin перейдите к папке. Например, если папка 1 находится на диске C, она должна содержать одну папку с названием «project», за которой следует другая папка с названием «molecules», а затем все папки внутри неё. Следуйте этим шагам.

  1. Откройте терминал Cygwin .
  2. Введите cd c:/ и нажмите Enter. Затем введите CD Project и нажмите Enter.
  3. Введите cd molecules и нажмите Enter, затем cd 1 и Enter. Теперь папка 1 находится в терминале Cygwin.
  4. Введите ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & и нажмите Enter, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 23).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &", -l — минус маленькая l.
  5. Введите tail -f 1nmk.glg и нажмите Enter, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 4).
  6. Если AutoGrid успешно завершится, закройте это окно Cygwin, откройте новое окно Cygwin и повторите вышеописанный процесс для молекулы 2.
  7. Повторите этот шаг для всех молекул и запустите алгоритм (AutoDock 4.2.6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для AutoDock 4.2.6 повторите процесс навигации к папке, и при открытии папки введите и нажмите Enter для AutoDock 4.2.6.
  8. Введите ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & и нажмите Enter, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 24).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На приведённом выше шаге «-l» — это строчная буква «L» с отрицательным знаком.
  9. Тип хвоста -f 1nmk.dlg
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если AutoDock 4.2.6 завершится, закройте окно Cygwin и повторите процесс для молекулы 2.
  10. Следуйте процедуре Cygwin для всех молекул.
  11. После создания DLG-файлов для молекул перейдите в папку 1 и откройте DLG-файл в WordPad. Нажмите Ctrl + F, введите и нажмите Enter три раза, чтобы попасть в таблицу RMSD, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 25).
  12. Откройте окно Microsoft Excel или запишите страницу и создайте три столбца: No., Min. Binding Energy и Run.
  13. Записывайте данные согласно таблице RMSD в файле журнала. Энергия связывания находится в верхней части таблицы, как и в диапазоне, в котором она наблюдалась. Сделайте это для всех молекул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молекула с меньшей энергией связывания считается лучше остальных.
  14. Создайте ещё одну таблицу с деталями (серийный номер, минимальная энергия связывания и пробег) топ-20 молекул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура будет выполнена только для 20 молекул с верхними показателями.

5. Сигвин-ii

  1. Откройте терминал Cygwin, введите cd c:/ и нажмите Enter.
  2. Введите cd project и нажмите Enter, введите cd molecules и нажмите Enter.
  3. Введите cd (номер папки выбранной верхней молекулы) и нажмите Enter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Номер должен соответствовать папке в терминале Cygwin.
  4. Введите grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt и нажмите Enter. В отличие от AutoGrid и AutoDock, сообщение о успешном завершении не появляется и нажимает Enter, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 26).
  5. Нажмите Enter, и файл будет создан.
  6. Введите cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb и нажмите Enter. Файл будет создан, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 27).
  7. Закройте окно Cygwin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализировать взаимодействие лигандов и рецепторов после стыковки с помощью программного обеспечения PyMOL 2.5
    1. Откройте программу PyMOL 2.5, затем откройте файл и выберите рецептор.
    2. Откройте файл, затем выберите выбранную конфигурацию лиганда, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 28).
    3. В PyMOL 2.5 выберите Скрыть молекулу и Скрыть рецептор. В меню рецептора выберите «Показать поверхность», как показано на рисунке 1A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации водородной связи в рецепторном комплексе лиганд-1nmk будет использоваться программное обеспечение UCSF Chimera в 20 лигандах с наименьшей энергией связывания.

6. Программное обеспечение UCSF Chimera для визуализации водородных связей и анализа результатов

  1. Откройте UCSF Chimera, затем выберите File, затем Open, и переходите к диску c:/, затем Project, Molecules, выберите 1nmk.pdb и откройте его.
  2. Выберите диск, в котором расположены молекулы, затем откройте белок в программе UCSF.
  3. Выберите Residue, затем UNL Zoom.
  4. Выберите Зону, затем нажмите ОК, затем Действие, затем Метка, Остатки и Имя + Спецификатор.
  5. Выберите «Инструменты», затем «Анализ структуры », а затем «Найти H-связь», как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 29).
  6. Откройте окно по умолчанию и отметьте галочки на цветные H-связи, не соответствующие точным критериям, и найдите только H-связи с выбранными.
  7. Выберите Clear Selection для начала нового опроса, затем увеличите масштаб и найдите синие/оранжевые цветовые линии, которые обозначают H-связи, как показано на рисунке 3.
  8. Проверьте, сколько облигаций нужно подсчитать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение должно показывать взаимодействия водородных связей с Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, изолейцином 15623, Гистидином 5424, Фенилаланином (Phe)53, цистеином (Cys)52, Gly72, Asn71 и Hid70, а также указывать, находятся ли они в активном центре белка, как показано на рисунках 3A-D.
  9. Обратите внимание на количество H-связей и число молекул.
  10. Положите мышь на линию, показывающую H-связь, указывающую на взаимодействие с Arg55 и метионином, Gln, Gly и Thr.
  11. Нажмите клавишу Print Screen .
  12. Откройте приложение Paint , вставьте дополнительную фигуру и сохраните её в названной папке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы чётко показать H-связи и аминокислоты активного сайта, двумерная структура выбранных лигандов и рецепторов должна быть следующей:

7. Подготовка диаграммы взаимодействия лигандов для подтверждения стыковки и отображения водородной связи

  1. Открыть программное обеспечение AutoDock 4.2.6.
    1. Выберите «Анализ » и откройте «Макромолекулу», затем выберите 1nmk, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 30).
    2. Выберите Анализ и откройте Стыковку, затем Открыть, перейдите к файлу dlg.pdb и выберите его, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 31).
    3. Выберите Анализ и откройте Docking, затем выберите Write AutoDock Virtual Screening Ligand и сохранить его как PDB-файл, как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 32).
  2. Открыть программное обеспечение PyMOL 2.5, как показано в дополнительном файле 1 (Скриншот 33).
    1. Откройте сохранённый файл dlg.pdb, затем откройте файл 1nmk.pdb.
    2. Откройте файл, выберите «Экспорт молекулы», затем «Сохранить», как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 34).
    3. Откройте программу Maestro, откройте Файл, затем выберите Структуру импорта , как показано в Дополнительном файле 1 (Скриншот 35).
    4. Импортируйте диаграмму взаимодействия лигандов, сохраняйте двумерную структуру, как показано в дополнительном файле 2.

8. Симуляция MD

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы открыть GROMACS в Linux, следуйте следующим шагам

  1. Скачайте Ubuntu 20.04.6.
    1. Включите приложение Windows Features на ПК. Затем выберите подсистему Windows для Linux и нажмите OK.
    2. Следуйте им и нажмите Enter , чтобы установить GROMACS:
      1. Введите sudo apt-get update и нажмите Enter, затем sudo apt-get upgrade и Enter.
      2. Введите sudo apt-get install gcc и нажмите Enter, затем sudo apt-get install cmake и нажмите Enter.
      3. Введите sudo apt-get install built-essential и нажмите Enter, затем sudo apt-get install liDevfftw3-d и нажмите Enter.
      4. Введите sudo apt-get install GROMACS и нажмите Enter, затем Shift + Ctrl + T.
    3. Откройте папку на персональном компьютере и назовите её GROMACS, как показано в дополнительном файле 1 (скриншот 36).
    4. Откройте папку GROMACS и нажмите клавиши Shift + Ctrl + Правая , чтобы войти в Linux.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Симуляции использовали водную модель и версию GROMACS 4.0, многоядерную версию Win64, которая включала силовое поле CHARMM 36. Временной шаг был установлен на 2 fs, выбрано сгибающее расстояние от 1,0 до 1,2 нм.

9. Создание топологии лиганда с использованием модулей GROMACS pdb2gmx (Дополнительный файл 1, скриншот 37)

  1. Создайте файл lig.gro, извлечьте лиганд из структуры белка, введя grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb и нажав Enter, затем переименуйте «UNL» в «LIG» в файле.
  2. Откройте lig.pdb в PyMOL 2.5, удалите нежелательные атомы, нажав select на атомы и удалите атом. Нажмите «Сохранить », чтобы сохранить очищенную версию в формате lig_clean.pdb.
  3. Откройте очищенный файл в Avogadro , чтобы добавить водород с помощью инструмента сборки и сохранить его как lig.mol2. Отредактируйте верхнюю часть файла в текстовом редакторе, чтобы убедиться, что имя остатка установлено как LIG.
  4. Введите perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 и нажмите Enter.
  5. Сгенерируйте топологию лиганда с помощью CGenFF: загрузите lig_fix. mol2, обработайте входные данные и скачайте lig_fix.pdb. Активируйте среду Python и запустите Python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff и нажмите Enter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг генерирует четыре файла лигандов (lig.prm, lig.itp, lig.top и lig_ini.pdb).
  6. Сгенерируйте файл ligand.gro , введите gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro и нажмите Enter.
  7. Разделите белок, сохраняя только нелигандовые атомы в prot_clean.pdb и убедитесь, что атомы UNL размещены в верхней части объединённого комплекса.

10. Создание белковой топологии в модулях GROMACS pdb2gmx (Дополнительный файл 1, скриншот 38).

  1. Подготовьте белковую топологию, выберите gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter и нажмите Enter .
  2. Создайте комплекс белка и лиганда после добавления файла lig.gro в конец файла pro.gro . Затем введите gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic и нажмите Enter.
  3. Генерируйте сольват с помощью модели воды с определёнными точками зарядов для поддержания равновесия, введите gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top и нажмите Enter.
  4. Создайте ионные файлы, введите gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr и нажмите Enter. Введите gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral , нажмите Enter, затем выберите группу 15 для добавления ионов.
  5. Генерируйте минимизацию энергии em.gro.
  6. Введите gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr и нажмите Enter, а также gmx mdrun -v -deffnm em и нажмите Enter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворённая система будет минимизирована по энергии с помощью максимум 50 000 шагов с критерием сходимости силы 1 000,0 кДж/моль/нм.
  7. Создайте индексные файлы, введите gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, нажмите Enter.
  8. Введите gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 и нажмите Enter.
  9. Сгенерируйте файл index.ndx , введите gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx и нажмите Enter.
  10. Сгенерируйте NVT equilibration файл nvt.gro , введите gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr и нажмите Enter. Затем введите gmx mdrun -deffnm nvt и нажмите Enter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновесение системы проводилось при температуре 27,35 °C (300,5 K) для ансамбля количества атомов (N), объёма (V) и температуры (V) (NVT) системы в течение 100 ps.
  11. Обновите topol.top топологического файла, чтобы включить топологию и параметры лиганда для создания NPT.
  12. Генерируйте уравновесление ДНЯО.
  13. Создайте уравновесление NPT второй фазы, напишите gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr и нажмите Enter, введите gmx mdrun -deffnm npt и нажмите Enter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешенный NVT означает количество частиц, объём и температуру, а уравновешенный NPT — стабильность количества частиц, давления и температуры. Файлы NVT.mdp и NPT.mdp необходимы для получения результатов моделирования MD следующим образом.

11. Снятие фиксаторов положения и запуск симуляции молекулярной динамики производства для сбора данных

  1. Тип gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr и нажмите Enter. Затем введите gmx mdrun -deffnm md_0_10 и нажмите Enter.
  2. Подвергите систему MD-симуляции длительностью 1 нс для проверки устойчивости комплекса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отклонение по среднеквадратичному корню (RMSD) количественно определяет среднее структурное отклонение атомов по сравнению с эталонной структурой, а среднеквадратичное отклонение по флуктуациям (FMSD) измеряет усредненные по времени атомные флуктуации вокруг их средних позиций. Эти два значения необходимы для завершения запусков моделирования MD.
  3. Провести структурный анализ, включая RMSD, FMSD, водородные связи и свободную энергию.
  4. Нарисуйте графики анализа с помощью qtgrace_v026_win7 программного обеспечения и файла md_0_10.gro, чтобы показать траекторию с помощью VMD-программы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как упоминалось во введении, исследования in vivo и in vitro демонстрируют важность ингибиторов циклофилина в упрощении структуры санглиферина, тем самым снижая пролиферацию селезёнки мышей за счёт вмешательства в 5-й цикл клеток мышей. Кроме того, циклофилин A вместе с производными ганодриола F играет важную роль в сворачивании белка, иммунных ответах и клеточной сигнализации через активность PPIASE. Его апрегуляция при различных видах рака указ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из Streptomyces было извлечено новое иммуносупрессивное природное вещество под названием SFA или молекулярный рецептор 1nmk. Для определения энергии связывания построенных лигандов с белком-мишени использовался анализ молекулярного стыковки. Результаты показали, что из всех разработанных лигандов SFA отличается структурно от CsA и обладает значительным сродством к CypA 16. Cyp A, обладающий пептидил-пролил-цис-транс-изомеразной активностью, контролирует р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, X., et al. Inhibitors of cyclophilin A:Current and anticipated pharmaceutical agents for inflammatory diseases and cancers. Molecules. 29 (6), 1235(2024).
  2. Jin, S., Zhang, M., Qiao, X. Cyclophilin A:promising target in cancer therapy. Cancer Biol Ther. 25 (1), 2425127(2024).
  3. Nigro, P., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. Cyclophilin A:a key player for human disease. Cell Death Dis. 4 (10), e888(2013).
  4. Mahgoub, E. O., Kulkarni, S. Structural analyses of an epidermal growth factor receptor-specific single-chain fragment variable via an in silico approach. J Vis Exp. (201), e65894(2023).
  5. Steadman, V. A., et al. Discovery of potent cyclophilin inhibitors based on the structural simplification of sanglifehrin A. J Med Chem. 60 (3), 1000-1017 (2017).
  6. Wang, S., Dong, G., Sheng, C. Structural simplification:an efficient strategy in lead optimization. Acta Pharm Sin B. 9 (5), 880-901 (2019).
  7. AbuQamar, S. F., El-Tarabily, K. A., Sham, A. Co-expression networks in predicting transcriptional gene regulation. Methods Mol Biol. 2328, 1-11 (2021).
  8. Mahgoub, E. O., Bolad, A. K. Construction, expression and characterisation of a single chain variable fragment in the Escherichia coli periplasmic that recognise MCF-7 breast cancer cell line. J Cancer Res Ther. 10 (2), 265-273 (2014).
  9. Li, X., et al. Ganoderiol F purified from Ganoderma leucocontextum retards cell cycle progression by inhibiting CDK4/CDK6. Cell Cycle. 18 (21), 3030-3043 (2019).
  10. Han, Z., et al. Targeted gadofullerene for sensitive magnetic resonance imaging and risk-stratification of breast cancer. Nat Commun. 8 (1), 692(2017).
  11. Mahgoub, E. O., et al. Identification of colorectal adenocarcinoma key genes to be validated as potential prognosis biomarkers. Int J Stem Cell Res Ther. , (2025).
  12. Sánchez-Tilló, E., et al. Cyclophilin A is required for M-CSF-dependent macrophage proliferation. Eur J Immunol. 36 (9), 2515-2524 (2006).
  13. Schmetzer, O., Florcken, A. Sex differences in the drug therapy for oncologic diseases. Handb Exp Pharmacol. 214, 411-442 (2012).
  14. Ke, H., et al. Crystal structures of cyclophilin A complexed with cyclosporin A and N-methyl-4-[(E)-2-butenyl]-4,4-dimethylthreonine cyclosporin A. Structure. 2 (1), 33-44 (1994).
  15. Kallen, J., et al. Structure of human cyclophilin A in complex with the novel immunosuppressant sanglifehrin A at 1.6 Å resolution. J Biol Chem. 280 (23), 21965-21971 (2005).
  16. Sedrani, R., et al. Sanglifehrin−cyclophilin interaction:degradation work, synthetic macrocyclic analogues, X-ray crystal structure, and binding data. J Am Chem Soc. 125 (13), 3849-3859 (2003).
  17. Paulsen, J. L., et al. Evaluation of free energy calculations for the prioritization of macrocycle synthesis. J Chem Inf Model. 60 (7), 3489-3498 (2020).
  18. Shore, E. S. Selective inhibitors of cyclophilin D to treat pancreatitis. , University of Liverpool. United Kingdom. (2016).
  19. Flaxman, H. A., et al. Sanglifehrin A mitigates multi-organ fibrosis by targeting the collagen chaperone cyclophilin B. JCI Insight. , (2024).
  20. Flaxman, H. A. Structural and Mechanistic Studies of Molecular Glues and Their Targets [Doctoral dissertation]. , Harvard University Graduate School of Arts and Sciences. (2022).
  21. Mahgoub, E. O. Single chain fragment variables antibody binding to EGF receptor in the surface of MCF7 breast cancer cell line:application and production review. Open J Genet. 7 (2), 84-103 (2017).
  22. Mahgoub, E. O. The role of exosomes in cancer drug resistance, a review. J Clin Med Images Case Rep. 4 (1), 1632(2024).
  23. Lu, W., et al. DynamicBind:predicting ligand-specific protein-ligand complex structure with a deep equivariant generative model. Nat Commun. 15 (1), 1071(2024).
  24. Shinji, S., et al. Recent advances in the treatment of colorectal cancer:a review. J Nippon Med Sch. 89 (3), 246-254 (2022).
  25. Hyun, S., et al. One-bead-one-compound screening approach to the identification of cyclic peptoid inhibitors of cyclophilin D as neuroprotective agents from mitochondrial dysfunction. Chem Commun (Camb). 57 (19), 2388-2391 (2021).
  26. Hermosilla, P., et al. High quality illustrative effects for molecular rendering. Comput Graph. 54, 113-120 (2016).
  27. Comte, A., et al. Accelerating ligand discovery for insect odorant receptors. Int J Biol Sci. 21 (5), 2101(2025).
  28. Yang, X., et al. Molecular mechanism of allosteric modulation for the cannabinoid receptor CB1. Nat Chem Biol. 18 (8), 831-840 (2022).
  29. Fiorani, A. Electrospun polymeric scaffolds with enhanced biomimetic properties for tissue engineering applications. , (2014).
  30. Torres, P. H., et al. Key topics in molecular docking for drug design. Int J Mol Sci. 20 (18), 4574(2019).
  31. Huang, S. -Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mol Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  32. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  33. Bello, M., Martínez-Archundia, M., Correa-Basurto, J. Automated docking for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 8 (7), 821-834 (2013).
  34. Saikia, S., Bordoloi, M. Molecular docking:challenges, advances and its use in drug discovery perspective. Curr Drug Targets. 20 (5), 501-521 (2019).
  35. Chen, D., et al. Regulation of protein-ligand binding affinity by hydrogen bond pairing. Sci Adv. 2 (3), e1501240(2016).
  36. Ormeño, F., General, I. J. Convergence and equilibrium in molecular dynamics simulations. Commun Chem. 7 (1), 26(2024).
  37. Bikadi, Z., Hazai, E. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock. J Cheminform. 1, 15(2009).
  38. Mahgoub, E. O., et al. Role of functional genomics in identifying cancer drug resistance and overcoming cancer therapy relapse. Heliyon. 10 (1), e22095(2023).
  39. Mahgoub, E. O., Haik, Y., Qadri, S. Comparison study of exosomes molecules driven from (NCI1975) NSCLC cell culture supernatant isolation and characterization techniques. FASEB J. 33 (S1), 647.22(2019).
  40. Agu, P. C., et al. Molecular docking as a tool for the discovery of molecular targets of nutraceuticals in diseases management. Sci Rep. 13 (1), 13398(2023).
  41. Kotschy, J., et al. Microsecond timescale conformational dynamics of a small-molecule ligand within the active site of a protein. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (5), e202313947(2024).
  42. Roe, D. R., Brooks, B. R. A protocol for preparing explicitly solvated systems for stable molecular dynamics simulations. J Chem Phys. 153 (5), 054123(2020).
  43. Badar, M. S., et al. Molecular Dynamics Simulations: Concept, Methods, and Applications. Transdisciplinarity. , Springer. Cham. (2022).
  44. Garcia-Ortegon, M., et al. DOCKSTRING:easy molecular docking yields better benchmarks for ligand design. J Chem Inf Model. 62 (15), 3486-3502 (2022).
  45. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation:a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018 (1), 3502514(2018).
  46. Korlepara, D. B., et al. Plas-5k:dataset of protein-ligand affinities from molecular dynamics for machine learning applications. Sci Data. 9 (1), 548(2022).
  47. Ahamad, S., et al. Screening Malaria-box compounds to identify potential inhibitors against SARS-CoV-2 Mpro, using molecular docking and dynamics simulation studies. Eur J Pharmacol. 890, 173664(2021).
  48. Shukla, R., Tripathi, T. Molecular Dynamics Simulation of Protein and Protein-Ligand Complexes. Computer-Aided Drug Design. , Springer. Singapore, Singapore. (2020).
  49. Sharma, V., Panwar, A., Sharma, A. K. Molecular dynamic simulation study on chromones and flavonoids for the in silico designing of a potential ligand inhibiting mTOR pathway in breast cancer. Curr Pharmacol Rep. 6, 373-379 (2020).
  50. Patodia, S., Bagaria, A., Chopra, D. Molecular dynamics simulation of proteins:a brief overview. J Phys Chem Biophys. 4, 6(2014).
  51. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11, 320-328 (2019).
  52. Meng, X. -Y., et al. Molecular docking:a powerful approach for structure-based drug discovery. Curr Comput Aided Drug Des. 7 (2), 146-157 (2011).
  53. Hummel, M., Verestek, W., Schmauder, S. Molecular Dynamics Simulations-A Time and Length Scale Investigation. High Performance Computing in Science and Engineering'19. , Springer. Cham. (2021).
  54. Ocana, A., et al. Integrating artificial intelligence in drug discovery and early drug development:a transformative approach. Biomark Res. 13 (1), 45(2025).
  55. Mahgoub, E., et al. The therapeutic effects of tumor treating fields on cancer and noncancerous cells. Arab J Chem. 14 (10), 103386(2021).
  56. Islam, M. A., et al. Applications of molecular dynamics in nanomaterial design and characterization-a review. Chem Eng J Adv. 22, 100731(2025).
  57. Zelnik, I. D., et al. Computational design and molecular dynamics simulations suggest the mode of substrate binding in ceramide synthases. Nat Commun. 14, 2330(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AutoDock

Похожие статьи