Методическая статья

Подготовка сверхчувствительной библиотеки кДНК для секвенирования микроРНК нового поколения из малых внеклеточных везикул

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) содержат специфичные для клетки микроРНК, которые регулируют клетки-реципиенты, идентификация которых может пролить свет на их функцию и роль в качестве биомаркеров. Наш оптимизированный протокол подготовки библиотеки кДНК содержит уникальные штрихкоды, которые обеспечивают мультиплексирование образцов и улучшенную обработку EV с низким входом при использовании двойных индексных штрихкодов с парным концом для совместимости с секвенсорами Illumina.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние исследования показывают, что небольшие внеклеточные везикулы (sEVs), которые содержатся во всех биожидкостях, играют важнейшую роль в межклеточной коммуникации, передавая белки, ДНК и РНК. МикроРНК (микроРНК), упакованные в sEV, стали важнейшими доставляемыми регуляторами в клетках-реципиентах. Поскольку sEVs, секретируемые нормальными и больными клетками, несут различный груз микроРНК, недавние исследования профилирования sEV-miRNA показывают, что они могут помочь идентифицировать новые циркулирующие биомаркеры. Тем не менее, специфичные для клеток/болезней sEV, циркулирующие в различных биожидкостях, после выделения обеспечивают низкие количества микроРНК, которые, как правило, трудно количественно оценить с помощью традиционных спектрометрических методологий. Секвенирование малых некодирующих РНК нового поколения (NGS), которое позволяет проводить амплификацию клонированных последовательностей микроРНК, дает ценную возможность оценить грузы микроРНК sEV. К сожалению, коммерческие процедуры подготовки библиотек кДНК часто требуют ввода РНК, значительно превышающего неизмеримые количества, доступные из изолированных sEV.

Таким образом, учитывая надежность и возможности мультиплексирования нашей существующей процедуры подготовки библиотеки кДНК (т.е. изначально оптимизированной для анализа низкозатратной, сильно деградированной, фиксированной формалин-запеченной парафином (FFPE) РНК), мы попытались оценить ее применимость для анализа микроРНК sEV. Важно отметить, что, принимая во внимание недавние технические усовершенствования кластеризации чипов секвенирования, мы стремились адаптировать наш подход к штрихкодированию транскриптов в рамках процесса подготовки библиотеки кДНК с парным концом, совместимым с двойным индексом, чтобы расширить наши возможности секвенирования и мультиплексирования. Используя РНК, выделенную из 8,4 × 109 sEVs в 16 репликациях, и по уменьшению количества sEVs с 1010 sEV до 2,5 × 107 sEVs, мы оценили воспроизводимость и чувствительность этой методологии. Данные показывают, что 16 3'-аденилированных штрихкодов ДНК позволяют легко воспроизводить и чувствительно обнаруживать профили sEV-miRNA среди повторов с использованием всего 3,15 пг мелких некодирующих РНК или 1,35 пг микроРНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малые внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные (~30-200 нм в диаметре) частицы клеточного происхождения, покрытые фосфолипидной бислойной мембраной, которая наследуется от их клетки происхождения и надежно защищает их молекулярный груз 1,2. Общепризнано, что практически все клетки продуцируют и выделяют sEVs в межклеточный компартмент, который, в свою очередь, может быть обнаружен в большинстве биожидкостей (т.е. крови, моче, слюне и т.д.)2,3,4. Недавние исследования показали, что стабильно инкапсулированные молекулярные грузы (т.е. ДНК, РНК, белки, липиды и т.д.) 5,6,7 sEVs, находясь в контакте или доставляясь к клеткам-реципиентам, опосредуют межклеточную коммуникацию8. Текущие исследовательские усилия были сосредоточены на улучшении выделения специфичных для клеток sEV из различных биожидкостей для точной идентификации и мониторинга этих молекулярных грузов 9,10. Учитывая, что sEV содержат небольшие некодирующие РНК и, в частности, микроРНК (микроРНК), которые сохраняют свою регуляторную функцию при клеточной доставке, многие исследования были сосредоточены на оценке полезности микроРНК в качестве биомаркеров, которые могут выявить состояние клеток их происхождения 11,12,13.

МикроРНК (микроРНК) представляют собой большой класс (~2000 известных у человека) малых некодирующих РНК с размерами от 19 до 25 нуклеотидов (nt), которые связываются с несовершенными комплементарными сайтами в 3'-нетранслируемых областях своих мишеней мРНК и направляют их деградацию и/или посттранскрипционную репрессию14,15. Было описано, что с функциональной точки зрения микроРНК контролируют многие биологические процессы, а дерегуляция их экспрессии связана с изменениями в молекулярных, биохимических и физиологических процессах, которые способствуют возникновению и развитию заболеваний, включая рак 16,17,18. Важно отметить, что исследования показали, что больные клетки, особенно раковые, не только дифференциально экспрессируют микроРНК по сравнению с нормальными клетками18, но и что их упаковка в sEV также отличается19,20.

В то время как несколько исследований сосредоточены на установлении молекулярных процессов и путей, которые управляют упаковкой sEV в нормальных и больных клетках 19,21,22, исследования биомаркеров в настоящее время сосредоточены на идентификации различимых малых некодирующих сигнатур РНК и/или микроРНК, которые упаковываются и секретируются конкретными больными/раковыми клетками через sEV. Таким образом, целенаправленная изоляция больных клеткоспецифичных sEV из различных биожидкостей человека и оценка их мультиомных молекулярных грузов могут позволить разработать диагностические и прогностические анализы для неинвазивного выявления различных заболеваний и раковых опухолей человека 23,24,25,26. Несмотря на то, что sEV-miРНК являются наиболее изученными некодирующими транскриптами, другие малые виды некодирующих РНК (т.е. изоформы микроРНК (isomiR), пивиРНК, фрагменты транспортной РНК (tRFs), рРНК, орфанные некодирующие РНК (онкРНК)...) также оцениваются на предмет их потенциальной полезности в качестве циркулирующих биомаркеров sEV, с особым акцентом на обнаружение различных видов рака 27,28,29,30,31,32.

Предпочтительно, анализ секвенирования нового поколения (NGS) малых некодирующих транскриптов РНК (включая микроРНК) после их штрихкодирования и подготовки библиотеки кДНК идеально подходит для исследования известных и/или неизвестных малых некодирующих видов РНК, содержащихся в циркулирующих sEV, которые могут быть связаны с заболеваниями27. Действительно, sEV NGS с малой РНК обеспечивает высокопроизводительный подход к обнаружению специфичных для клетки малых некодирующих РНК-транскриптов, которые в противном случае остались бы неизвестными при глобальной оценке с помощью технологий, специфичных для мишеней (т. е. мультиплексной ПЦР, микрочипов, специализированных панелей и т. д.) 32,33,34. Учитывая, что ранее мы оптимизировали протокол подготовки ультрачувствительной, высоковоспроизводимой библиотеки кДНК, который мы разработали для анализа сильно деградированных и низкоконцентрированных фиксированных формалин-парафином (FFPE) РНК 35,36, мы стремились адаптировать его для анализа малых некодирующих РНК и микроРНК, инкапсулированных в sEVs 37,38,39,40.

С прекращением выпуска прибора Illumina HiSeq2500, который предоставил нам годы высококачественного анализа одноконцевой двухиндексной микроРНК грузов sEV37,40, мы стремились изучить воспроизводимость и чувствительность нашего протокола при адаптации к обновленным инструментам секвенирования с использованием теперь уже парной двухиндексной химии. С намерением сохранить возможности мультиплексирования исходного протокола, мы сохранили существующие 16 штрих-кодов для получения транскриптов кДНК с малой РНК перед их интеграцией в парную химию с двойным индексом. Используя только пару штрихкодов i5 и i7, мы позволяем создать надежную лабораторную библиотеку кДНК, в которой одновременная обработка и анализ до 16 отдельных образцов улучшают аналитическую воспроизводимость низковходной РНК sEV. Таким образом, мы представляем биохимические процессы, обновленные штрих-коды, праймеры ПЦР и маркеров размера, а также этапы выделения, необходимые для создания высоковоспроизводимых библиотек кДНК с использованием сверхмалых количеств микроРНК, выделенных из sEV плазмы человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Все реагенты и олигонуклеотиды готовятся следующим образом:

ПРИМЕЧАНИЕ: Все нуклеотиды, используемые в этом протоколе, подробно описаны на рисунке 1 и в дополнительном файле 1 в концентрациях, которые используются для реализации этого протокола. Последовательности праймеров см. в Дополнительном файле 2 .

  1. Приготовьте стоковый раствор калибратора коктейля, который будет использоваться при каждой отдельной лигировании в качестве контроля различных ферментативных реакций:
    1. Ресуспендируйте олигонуклеотид-носитель (0,5 мкМ) (Дополнительный файл 1) водой, не содержащей РНКазы.
    2. Объедините 10 калибраторов (по 10 мкл каждый, Дополнительный файл 1) в одну пробирку объемом 1,5 мл, чтобы получить массу 100 мкМ, разбавьте ее с помощью олигонуклеотида-носителя до раствора 0,0052 нМ и храните при -20 °C.
  2. Ресуспендируйте каждый из 17 уникальных (16 экспериментальных и 1 тестовый адаптер со штрих-кодом) аденилированные 3'-адаптеры (рис. 1A) водой, не содержащей нуклеаз, в концентрации 50 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый адаптер квотируется в отдельные пробирки, содержащие 2,5 μL для хранения при -80 °C в течение 2 лет, чтобы предотвратить циклы замораживания-размораживания большего количества материала.
  3. Ресуспендируйте различные экспериментальные РНК-олигонуклеотиды, включая носитель экстракции РНК (Дополнительный файл 1), носитель 3'-лигирования РНК (Дополнительный файл 1), тест на лигирование РНК (Дополнительный файл 1) и 3'-лигирование (Дополнительный файл 1; адаптер 19 nt-3' и адаптер 24 nt-3') и 5' лигирование (Дополнительный файл 1; 5'адаптер-19 nt-3'адаптер и 5'адаптер-24 nt-3'адаптер) до маркеров размера ДНК 250 нг/μл.
  4. Разбавьте очищенный от ВЭЖХ 5'-адаптер до 100 мкМ водой, не содержащей нуклеаз (рис. 1A).
  5. Ресуспендируйте ОТ и первые ПЦР 5' и 3' праймеры ОТ/ПЦР до 100 мкМ водой, не содержащей нуклеаз (рис. 1B).
  6. Ресуспендируйте вторые олигонуклеотиды ПЦР 5' и 3' ПЦР i7 и i5 до 100 мкМ водой, не содержащей нуклеаз (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвотируйте каждый праймер ДНК в течение 10 экспериментов и храните при температуре -80 °C.
  7. Приготовьте полиакриламид denAturing (PAA) гель для загрузки, смешайте и аликвот 1 мл в пробирки и храните при температуре -80 °C.
    1. Приготовьте раствор 0,5 М Na2Н2 ЭДТА, добавив 18,6 г Na2Н2 ЭДТА в 50 мл воды, не содержащей нуклеаз. Медленно добавляйте гранулы NaOH в приготовленный раствор Na2H2 EDTA до достижения pH 8,0. Увеличьте объем до 100 мл с помощью ddH2O, чтобы получить исходный раствор 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Взвесьте 15 мг бромофенола синего в пробирку объемом 15 мл, ресуспендируйте порошок в 600 мкл воды, не содержащей нуклеаз, добавьте 14,25 мл деионизированного формамида. Наконец, добавьте 150 мкл 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Разлейте окончательный раствор ПАА в пробирки объемом 1 мл и храните при температуре -80 °C.
    3. Приготовьте 5x агарозный гель для загрузки красителя.
      1. Взвесьте и растворите 1,86 г Na2H2-EDTA в 50 мл воды, не содержащей РНКазы, и отрегулируйте pH до 8,0, добавив гранулы NaOH. Добавьте воду, не содержащую РНКазы, в 100 мл, чтобы получить 50 мМ раствор Na2H2 EDTA.
      2. К 5 мл 50 мМ Na2H2 EDTA добавьте 20 мг бромофенола синего, 20 мг ксилола цианола FF и 2 г Ficoll типа-400. Смешайте пробирку, содержащую три красителя, и добавьте еще 5 мл 50 мМ Na2H2 EDTA. Аликвоте отдельные пробирки объемом 1 мл 5x агарозного геля загружают красителем и хранят при -80°C.

2. Подготовка образцов EV РНК

  1. После выделения sEV оцените их морфологию с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM; Рисунок 2), концентрация с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA; Рисунок 3) и распределение поверхностных белков с использованием наноизображений сверхвысокого разрешения (Рисунок 4) или эквивалентной технологии количественного определения sEV.
  2. Аликвотируйте эквивалентное количество sEVs в разных пробирках, добавьте РНКазу-А (12,5 мкг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
  3. Инициируйте экстракцию малых некодирующих РНК, включая микроРНК, из sEV с помощью набора для экстракции малых РНК и инициируйте выделение фаз РНК.
  4. Отделите нижнюю водную фазу буфера для лизиса РНК, добавьте ее в новую пробирку, а затем добавьте 4 нг олигонуклеотида носителя РНК (Дополнительный файл 1) в каждый образец РНК перед проведением выделения колонки в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Скоростной вакуум для каждого отдельного образца РНК до 9,5 μл, чтобы инициировать протокол подготовки библиотеки кДНК.

3. Настройка лигирования 3' адаптера со штрих-кодом с 16 образцами РНК и 1 тестовым образцом

  1. Идентифицируйте 16 отдельных образцов sEV-РНК, поместите их в 9,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в силиконизированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и поместите их на лед не менее чем за 10 минут до начала экспериментов.
  2. Перед экспериментом приготовьте 10-кратный буфер РНК-лигазы (без АТФ).
    1. В силиконизированной пробирке объемом 1,5 мл соедините 343 мкл безнуклеазной воды двойной дистилляции (ddH2O), 500 мкл 1 М Трис pH 7,5, 100 мкл 1 М MgCl2, 50 мкл 20 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 7 мкл 14 М 2-меркаптоэтанола.
    2. Перемешайте раствор, перевернув пробирку, центрифугируйте в течение 2 с при 2000 × г при комнатной температуре (RT) на настольной центрифуге, а затем положите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, описывающие «центрифугу в течение 2 с», выполняются с помощью микроцентрифуги в режиме RT со скоростью не выше 2000 × g.
  3. Разморозьте коктейль калибратора 0,0052 нМ, поместив трубку на лед на 10 минут.
  4. Приготовьте мастер-смесь для лигирования для 18 реакций в силиконизированной пробирке объемом 1,5 мл, смешав 40 мкл 10-кратного буфера РНК-лигазы, 10 мкл калибраторного коктейля 0,0052 нМ и 40 мкл безнуклеазного ddH2O.
  5. Поверните и поверните пробирку объемом 1,5 мл и положите ее на лед.
  6. Добавьте 4,5 мкл мастер-смеси лигирования к каждому из 16 индивидуально аликвотированных образцов sEV РНК, и в реакцию тестового лигирования, содержащую 100 нг тестового олигонуклеотида для лигирования РНК (Дополнительный файл 1), предварительно аликвотируемого и в объеме 9,5 мкл. Перемешивайте и вращайте трубки, прежде чем положить их обратно на лед.
  7. Перенесите 16 образцов и испытайте реакцию в нагревательный блок в течение 1 минуты при температуре 90 °C и перенесите обратно на лед.
  8. По отдельности нанесите 4 мкл 50% PEG на каждую пробирку, перемешайте и поверните пробирки, прежде чем положить их обратно на лед.
  9. Разморозьте по 2,5 мкл аликвот из каждого из 17 3' адаптеров со штрих-кодом (16 экспериментальных (от #1 до #16) и тестовых адаптеров (#17)) и положите на лед для размораживания.
  10. Перенесите по 1 мкл каждого из 17 адаптеров в соответствующие 16 образцов, содержащих sEV-РНК, и один тестовый образец с Ligation Master Mix (т. е. 4,5 мкл) и 50% ПЭГ (т. е. 4 мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы и реакции смешиваются путем перелистывания пробирок и вращения их, а не пипетирования растворов вверх и вниз, чтобы предотвратить потерю материала.
  11. Приготовьте разбавленный фермент лигирования T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q, добавив 10 мкл фермента с 10 мкл безнуклеазного ddH2O в новую силиконизированную пробирку объемом 1,5 мл.
  12. Перенесите по 1 мкл разбавленного фермента лигирования T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q в каждую из 17 пробирок (16 экспериментальных и 1 тестовый образец РНК). Не пипетируйте вверх и вниз, меняйте наконечники между каждой пробиркой, держите пробирки на льду, перемешивайте, центрифугируйте и кладите пробирки на лед.
  13. Наложите перевязки на свежий лед в держатель трубки в ведре со льдом в холодильной камере на ночь до 18 часов.

4. PAGE выделение 3'-адаптерных лигированных малых РНК

  1. Поместите 17 пробирок на нагревательный блок при температуре 90 °C на 1 минуту, чтобы деактивировать Т4 РНК Лигаза 2, и поместите на лед на 2 минуты для остывания.
  2. Смешайте 1 мкл GlycoBlue и 26 мкл 5 М безнуклеазного NaCl в свежую пробирку и перелейте по 1,2 мкл этого раствора осаждения в каждую из 17 пробирок.
  3. Добавьте по 63 мкл 100% этанола в каждую из 17 пробирок, закройте, переверните и поворачивайте вниз в течение 2 секунд, прежде чем снова положить на лед.
  4. Объедините содержимое 16 пробирок sEV РНК в одну силиконизированную пробирку объемом 1,5 мл, сохраняя при этом отдельную пробирку для лигирования тестируемой РНК.
  5. Переверните пробирку, содержащую объединенные образцы, 3 раза перемешайте, кратковременно центрифугируйте в течение 2 с и поставьте на лед на 60 минут для осаждения.
  6. Приготовьте большой (16 x 20 см2) гель с содержанием 15% полиакриламида (PAGE) следующим образом:
    1. Силиконизируйте (т.е. с помощью раствора на основе силикона) и отлите короткие и длинные стеклянные пластины вместе с распорками 0,1 см.
    2. Приготовьте 15% гелевую смесь, смешав 9 мл системного разбавителя, 18 мл системного концентрата, 3 мл системного буфера, 240 мкл APS (9%) и 12 мкл TEMED в конической пробирке объемом 50 мл.
    3. Быстро перенесите раствор между стеклянными пластинами с помощью пипетки объемом 30 мл. Прежде чем гель полимеризуется, добавьте 14-луночный гребень (толщиной 0,1 см) и установите гель в вертикальном положении на 30 минут при RT.
  7. Извлеките пробирку с объединенными образцами РНК изо льда и центрифугируйте ее при 16 000 × г в течение 60 минут при 4 °C.
  8. Тем временем завершите установку 15% PAGE, аккуратно сняв гребень, очистив лунки с безнуклеазным H2O с помощью пульверизатора над раковиной, прежде чем высушить и установить 15% PAGE на гелевом аппарате, где верхний и нижний резервуары заполнены 0,5x раствором Tris-Borate EDTA (TBE), перед 30-минутным предварительным запуском при 450 В.
  9. Извлеките пробирку из центрифуги (шаг 4.6) и тщательно высушите гранулу РНК с помощью пипетки Пастера с наконечником объемом 10 мкл без фильтра на конце, подключенным к вакуумной системе, не повреждая гранулу.
  10. Ресуспендируйте гранулу РНК, содержащую осажденные 16 лигирования РНК, в 20 мкл безнуклеазного ddH2O и добавьте 20 мкл раствора для загрузки гелем PAA. Перемешайте пробирку, поставьте на центрифугу в течение 2 с и положите на лед.
  11. Замените 0,5x TBE гелевого аппарата на свежий 0,5x TBE.
  12. Установите пробирку с лестницей размера РНК 20.о., две пробирки с каждым из двух 3'-лигирующих маркеров короткого размера ДНК (Дополнительный файл 1) и одну пробирку, содержащую олигонуклеотид для теста на лигирование РНК (т.е. лигированный с помощью адаптера с штрих-кодом #17).
  13. В каждую из пробирок (т.е. лестницу, 3'-лигирование коротких олигопластов ДНК и тест на лигирование РНК) добавьте 20 μл раствора для загрузки гелем PAA.
  14. Установите пробирку с образцами 16 лигированных РНК и 1 пробирку с лигированием РНК при температуре 90 °C на 1 минуту и снова положите на лед.
  15. Замените 0,5x буфер TBE из нижнего и верхнего резервуаров (т.е. добавьте буфер ниже уровня лунки, чтобы не было перекрестного загрязнения между лунками во время загрузки) и загрузите лестницу на концах геля, тестовое лигирование РНК, два коротких маркера размера ДНК с обеих сторон лунки, содержащие 16 объединенных 3'-лигирования РНК со штрих-кодом (см. Рисунок 5).
  16. Запустите 15% гель PAGE со всеми образцами в течение 90 минут при напряжении 450 В (~35 мА) в охлажденных условиях (т.е. с вентиляторами, обдувающими стеклянные пластины).
  17. Снимите 15% PAGE со стекла и слегка распылите на него раствор SYBR Gold (10 μл SYBR Gold в 25 мл 0,5x TBE) и оставьте под наклоном в течение 5 минут в темноте.
  18. Поместите гель на трансиллюминатор синего света (рис. 5) и совместите оба адаптера 19 nt-3' и оба маркера размера адаптера 24 nt-3' с короткими олигонуклеотидами ДНК с помощью линейки и вырежьте область геля, содержащую лигированные конструкции микроРНК (на рисунке 6 показано 3'-лигирование и результирующая конструкция). Отдельно вырежьте верхнюю полосу тестового лигирования РНК, которая также будет использоваться для тестового 5'-лигирования на следующий день.
  19. Поместите два отдельных отрезка геля (т.е. для 16 образцов РНК и для тестового лигирования) в разные пробирки для прерывания геля объемом 0,5 мл, установленные в силиконизированные пробирки объемом 1,5 мл, центрифугируйте при 16 000 × г в течение 3 минут в режиме ЛТ, а затем повторно суспендируйте два фрагментированных кусочка геля 300 мкл 400 мМ раствора NaCl, закройте пробирки. и заклеить их парапленкой.
  20. Установите трубки на шейкер с перемешиванием при 1 100 об/мин при 4 °C, на ночь (16-17 часов).

5. Лигирование 5' адаптера

  1. Перенесите два отдельных фрагментированных геля и их растворы (16 x 3' образцов со штрих-кодом (штрих-коды #1 - #16) и 3' тестовой РНК со штрих-кодом (штрих-код #17)) на две отдельные 5 мкм фильтрующие пробирки, каждая из которых упакована в силиконизированные пробирки объемом 1,5 мл, запечатайте их парапленкой и центрифугируйте в течение 5 мин при концентрации 2300 × г при RT.
  2. Добавьте 950 мкл 100% этанола в каждый отфильтрованный раствор, закройте пробирки, переверните для смешивания, отжмите в течение 2 с, запечатайте пробирки парапленкой и положите их на лед на 1 ч.
  3. Приготовьте 50% водный бульон ДМСО, смешав 1 мл воды без нуклеазы с 1 мл ДМСО, оберните пробирку алюминиевой фольгой и храните при РТ в темноте.
  4. Приготовьте 15% гель PAGE и предварительно запустите его, следуя шагам, описанным в разделе 4.6.
  5. Центрифугируйте пробирки, содержащие 3'-лигированные образцы 16 РНК, и исследуемое лигирование РНК при 16 000 × г в течение 60 мин при 4°С для осаждения лигированных РНК.
  6. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь гранул РНК, и высушите пылесосом.
  7. Ресуспендируйте 3'-лигированную таблетку из 16 образцов РНК и исследуйте каждую РНК в 8 мкл безнуклеазного ddH2Oбез пипетирования вверх и вниз. Слегка поверните пробирки для смешивания, центрифугируйте в течение 2 с (2 000 × г) при RT и поставьте пробирки на лед.
  8. Приготовьте 10-кратный буфер РНК-лигазы (с АТФ), смешав 500 мкл 1 М Триса (pH 7,5), 100 мкл 1 М MgCl2, 50 мкл 20 мг/мл ацетилированного БСА, 200 мкл 10 мМ АТФ, 7 мкл 2-меркаптоэтанола 14 М и 143 мкл воды, не содержащей РНКазы, в пробирке объемом 1,5 мкл.
  9. Добавьте 2 мкл 10-кратного буфера РНК-лигазы (т.е. с АТФ), 1 мкл 100 мкМ 5'-адаптера и 4 мкл 50% водного ДМСО в каждую пробирку. Перемешайте, вращайте в течение 2 секунд при RT, затем установите пробирку при температуре 90 °C на 1 минуту, чтобы денатурировать РНК, и поместите ее обратно на лед.
  10. Добавьте 3 мкл 50% ДМСО, перемешайте, открутите до гранул, добавьте 3 мкл РНК-лигазы T4 в каждую пробирку, переверните пробирки, центрифугируйте в течение 2 с при RT и установите пробирки на шейкер при температуре 37 °C на 75 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте пипетку вверх и вниз.
  11. Подготовьте лестницу для ДНК 20 нт и две отдельные пробирки, содержащие олигонуклеотиды ДНК с размером 5'-лигирования, длинные ДНК (Дополнительный файл 1; адаптер 5'-19 nt-3' и адаптер 5'-адаптер-24 nt-3'), и добавьте по 20 мкл ПАА в каждую из пробирок.
  12. После завершения 5'-переходного лигирования добавьте по 20 мкл PAA к каждому из двух лигаторов (т.е. 16 образцов РНК и тестовой РНК), перемешайте путем перелистывания, уменьшите вращение и установите при температуре 90 °C на 1 минуту, после чего поместите пробирки обратно на лед.
  13. Опорожните верхний и нижний резервуары гелевым аппаратом и добавьте свежий 0,5х раствор КЭ ниже уровня лунок верхнего резервуара.
  14. Загрузите лестницу на конец геля, образец тестовой РНК с 5'-лигированием, два олигонуклеотида длинной ДНК по маркеру размера (т.е. адаптер 5'-19 nt-3' адаптер и адаптер 5'-адаптер-адаптер 24 nt-3') в лунки, окружающие лунку, куда будут загружены образцы 5'-лигированной 16 РНК (на рисунке 6 показано 5'-лигирование и результирующая конструкция). Запустите гель в течение 90 минут при напряжении 450 вольт.
  15. После завершения прогона удалите гель из аппарата и стекла и распылите на него раствор SYBR Gold (т.е. 10 μл SYBR Gold в 25 мл 0,5x TBE) и оставьте в темноте на 5 минут.
  16. Используя 5'-адаптер-19 nt-3'адаптер и оба маркера размера 5'-адаптер-24 nt-3' в качестве олигонуклеотидов длинных ДНК, непосредственно иссекайте участок геля, содержащий 5'-лигированные образцы 16 РНК (рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование тестовой РНК оценивается на геле, чтобы продемонстрировать, что лигирование 5'-адаптера позволяет сдвиг по размеру эквивалентен маркерам размера. Исследуемое лигирование РНК не иссекается из геля; только лигированные 16 комбинированных образцов РНК.
  17. Перенесите вырезанный кусочек геля, содержащий 16 лигированных образцов РНК, в пробирку с гелем-прерывателем объемом 0,5 мл, уберите в пробирку объемом 1,5 мл, вращайте при 16 000 × г в течение 3 мин при ОТ, а затем добавьте 300 мкл 300 мкл 300 мМ NaCl и 1 мкл 100 мкМ 3' праймера ОТ/ПЦР (рис. 1B) к измельченным кусочкам геля в пробирке.
  18. Запечатайте пробирку парапленкой и установите на шейкер с перемешиванием со скоростью 1 100 об/мин при 4 °C, на ночь (17-18 часов) в холодном помещении.

6. Обратная транскрипция 5' и 3'-лигированных 5' и 3'-лигированных малых некодирующих РНК и микроРНК

  1. Нанесите пипетку из пробирки, содержащей измельченный гель, на пробирку с фильтром длиной 5 мкм, вставленную в пробирку объемом 1,5 мл без силиконизированной РНКазы, и кратковременно отжмите, чтобы раствор прошел через фильтр.
  2. Добавьте в этот отфильтрованный раствор 950 μл 100% этанола, переверните пробирку для перемешивания, вращайте в течение 2 секунд и поставьте на лед на 60 минут.
  3. Осаждение гранулы РНК путем центрифугирования пробирки при 16 000 × г при 4 °C в течение 1 ч.
  4. Извлеките пробирку, осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь гранулы, и высушите гранулу в вакууме перед тем, как снова суспендировать ее в 5,6 мкл безнуклеазного H2O.
  5. Настройте реакцию RT, добавив в пробирку 3 мкл 5x первого цепочечного буфера, 4,2 мкл 10x dNTP (каждый с концентрацией 2 мМ) и 1,5 мкл дитиотреитола (DTT). Щелкните, чтобы перемешать, и вращайте в течение 2 секунд.
  6. Настройте реакцию при температуре 90 °C ровно на 30 с, а затем перенесите пробирку в блок при температуре 50 °C на 2 минуты.
  7. Запустите реакцию ОТ, добавив в раствор 0,75 мкл фермента обратной транскриптазы, перемешайте и установите при температуре 50 °C на 35 минут.
  8. Перенесите пробирку при температуре 95 °C на 1 минуту, чтобы денатурировать фермент и цепи кДНК/РНК, затем добавьте 95 μL не содержащего РНКазы H2O, перемешайте пробирку и положите ее на лед на 2 минуты. Эта пробирка содержит кДНК, полученную из 16 образцов РНК, каждый из которых имеет отдельный штрих-код в 3'.

7. Проведите тестовую ПЦР и масштабную амплификацию

  1. Приготовьте свежий 10-кратный ПЦР-буфер, смешав 304 мкл безнуклеазного H2O, 125 мкл 2 M KCl, 50 мкл 1 M Tris pH 8,0, 10 мкл 1 M MgCl2, 5 мкл 1% Triton X-100 и 6 мкл 1 М 2-меркаптоэтанола в пробирку, которую можно хранить на льду.
  2. Соберите пилотную/тестовую ПЦР-реакцию для кДНК, полученную на стадии 6.8 (выше), путем объединения 67 мкл H2O без нуклеазы с 10 мкл 10x PCR буфера, 10 мкл 10x dNTP, 0,5 мкл 100 μM 5' ПЦР-праймера, 0,5 мкл 100 μM 3' ПЦР-праймера, 10 мкл стоковой библиотеки кДНК, и 2 мкл 50-кратной Taq-полимеразы в свежую ПЦР-пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением амплификации ПЦР настройте прибор, установив два различных файла следующим образом: Для файла #1: 94 °C в течение 45 с, 50 °C в течение 85 с, 72 °C в течение 60 с в течение 12 циклов и 4 °C; и для Файла#2: 94 °C в течение 45 с, 50 °C в течение 85 с, 72 °C в течение 60 с в течение 2 циклов, и 4 °C.
  3. Для пилотной/тестовой ПЦР-реакции поместите ПЦР-пробирку, содержащую 100 μл ПЦР-реакции, в амплификатор и запустите File#1.
  4. Как только Файл #1 будет готов, откройте пробирку для ПЦР и перенесите 12 μL реакции в микроцентрифугу объемом 1,5 мл, содержащую 3 μL 5-кратного гелеобразного красителя. Закройте тюбик, и напишите на крышке «12 циклов».
  5. Возьмите ПЦР-пробирку, установите ее в термоамплификатор и запустите File#2.
  6. Как только Файл #2 будет готов, перенесите 12 μL ПЦР-реакции в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 3 μL 5x гелеобразного красителя, и напишите «14 циклов» на ее крышке.
  7. Повторите амплификацию ПЦР еще четыре раза подряд (т.е. по два цикла ПЦР каждый), одновременно перенося 12 мкл продукта ПЦР в конце каждой амплификации, и, в свою очередь, получите четыре разные пробирки, помеченные 16, 18, 20 и 22 циклами.
  8. Загрузите лестницу размера 20 нт и каждый из амплифицированных ПЦР продуктов на 2,5% агарозу и запустите гель в 0,5x TBE в течение 30 минут при 120 В.
  9. Определите оптимальный цикл амплификации ПЦР (рис. 8A) на основе соотношения и наличия димеров праймеров (нижняя полоса) и амплифицированной кДНК (верхняя полоса).
    Учитывая, что общее поступление РНК в 16 образцах может быть ниже 1 нг, ожидается, что праймерные димеры будут генерировать продукт быстрее и в больших количествах, чем очищенная кДНК. Таким образом, адекватный цикл ПЦР обычно выбирается между 18 и 22 циклами. На рисунке 8А адекватный цикл ПЦР для этой библиотеки равен 20. На рисунке 8B подробно описан размер конструкции ПЦР.
  10. После определения адекватного цикла амплификации ПЦР установите отрицательный результат ПЦР (без кДНК) и четыре положительные ПЦР-реакции по 100 мкл (т.е. каждая из которых содержит 12 мкл кДНК).
    1. Чтобы упростить приготовление ПЦР-реакций, в пробирке объемом 1,5 мл можно создать мастер-смесь для ПЦР (т.е. для 4,5 реакций) путем объединения 292,5 мкл нуклеазного праймера H2O, 45 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 45 мкл 10-кратного dNTP, 3,25 мкл 3'-праймера RT/PCR (рис. 1B) и 2,25 мкл 5'-праймера для ПЦР (рис. 1B). Переверните эту трубку, перемешайте и вращайте, чтобы собрать на дне трубки.
    2. Перелейте по 86 мкл мастер-смеси для ПЦР в каждую из четырех ПЦР-пробирок объемом 0,5 мл.
    3. Добавьте 12 мкл библиотеки кДНК (хранящейся на льду), затем 2 мкл 50-кратной титановой Taq-полимеразы в каждую из 4 пробирок ПЦР и перемешайте пипетированием вверх и вниз.
    4. Приготовьте реакционную пробирку для ПЦР без шаблона, добавив 77 мкл безнуклеазного H2O, 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, 10 мкл 10-кратного dNTP, 0,5 μл 5'-праймера для ПЦР, 0,5 мкл 3'-праймера для ПЦР и 2 мкл 50-кратной Taq-полимеразы в отдельную ПЦР-пробирку и пипетируйте вверх и вниз для смешивания.
    5. Установите пробирки ПЦР в термоамплификатор с использованием цикла ПЦР, указанного в шаге 7.9, и установите новую программу на амплификаторе по мере необходимости.
  11. Приготовьте 2,5% агарозный гель с 0,5x TBE и бромидом этидия и перелейте 12 μL из каждой ПЦР-пробирки в отдельные пробирки, содержащие 3 μL 5-кратного гелеобразного красителя.
  12. Приготовьте лестницу 20 мкл, соединив 3 мкл лестницы с 9 мкл безнуклеазного H2O и 3 мкл гелеобразующего красителя.
  13. Загрузите гель, запустите его в течение 30 минут при напряжении 120 В и убедитесь, что амплификация ПЦР одинакова между четырьмя различными реакциями и что контроль без шаблона пуст (Рисунок 8C).
  14. Соедините четыре ПЦР-реакции между двумя силиконизированными микроцентрифужными пробирками объемом 1,5 мл (т.е. двумя пробирками, каждая из которых содержит 90 мкл продукта) и добавьте 18 мкл 5 М NaCl и 800 мкл 100% этанола в каждую из двух пробирок.
    1. Переверните пробирки для перемешивания и храните их при температуре -20 °C для осаждения в течение ночи.

8. Очистка амплифицированной ПЦР библиотеки

  1. Центрифугируйте две пробирки, содержащие смешанные положительные ПЦР-реакции, при 16 000 × г в течение 60 мин при 4 °C.
  2. Через 60 минут удалите надосадочную жидкость, высушите гранулы ДНК в вакууме и повторно суспендируйте их в 19,5 мкл 1x буфера, а затем добавьте 0,5 мкл фермента PmeI.
  3. Установите дайджесты PmeI при температуре 37 °C в течение 2 ч, чтобы удалить любые маркеры размера ДНК, которые содержались в соседних лунках (т.е. 19 nt-3' адаптер, 24 nt-3') или переносчики РНК (т.е. носитель экстракции РНК, носитель РНК после 3' лигирования) (т.е. см. сайты PmeI, включенные в РНК и праймеры ДНК в Дополнительном файле 1)
  4. Запустите два дайджеста в трех разных лунках 2,5% агарозного геля, используя 0,5x TBE, чтобы избежать накопления избытка димеров праймера в одной лунке и создания мазка.
    1. Добавьте по 3 мкл 5-кратного гелеобразного красителя в каждый из дайджесов, объедините два дигеста, а затем загрузите 16,5 мкл в три отдельные соседние лунки.
    2. Загрузите лестницу размером 20 нт ДНК в концевые лунки геля и запустите гель в течение 90 минут при напряжении 150 В (Рисунок 8D).
  5. Чтобы очистить библиотеки ДНК, вырежьте верхние полосы ПЦР из трех соседних дорожек геля и перенесите их в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
  6. Очистите амплифицированную ПЦР библиотеку с помощью набора для экстракции геля, следуя инструкциям производителя, и количественно оцените очищенный продукт ДНК с помощью флуориметра, следуя инструкциям производителя.

9. Окончательная амплификация ПЦР для добавления штрих-кодов, совместимых с секвенсором

  1. Приготовьте свежую 10-кратную буферную смесь для ПЦР, как описано в шаге 7.1.
  2. Настройте ПЦР-реакции, включив в каждую из трех пробирок один отрицательный контроль (без ампликонов) и три ПЦР-реакции с использованием 0,75 нг продукта ПЦР, очищенного в результате первой ПЦР-амплификации, следующим образом:
    1. Организуйте три отдельные ПЦР-реакции, смешав 75 мкл ddH2O, 10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 10 мкл 10-кратного dNTP, 1 мкл 5'-2-го праймера ПЦР (т.е. праймера i503 (рис. 1B)), 1 мкл 3' праймера PCR2-го праймера (т.е. праймера i702 (рис. 1B)), 1 мкл продукта ПЦР (т.е. 0,75 нг из очищенного гелем1-го продукта ПЦР) и 2 мкл титановой так-полимеразы.
    2. Установить отрицательный контроль ПЦР (т.е. без матрицы ДНК) путем смешивания 76 мкл ddH2O, 10 мкл 10x ПЦР-буфера, 10 мкл 10x dNTP, 1 мкл 5'2-го праймера ПЦР (т.е. праймера i503 (рис. 1B)), 1 мкл 3' праймера ПЦР2-го (т.е. праймера i702 (рис. 1B)), и 2 мкл Taq-полимеразы.
    3. Настройте четыре ПЦР-реакции (т.е. один отрицательный контроль, три положительных) на амплификаторе, запрограммированном следующим образом: 72 °C в течение 3 мин, 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с в течение 9 циклов, а затем 72 °C в течение 5 мин и окончательное удержание при 10 °C.
  3. После завершения циклов ПЦР возьмите 10 мкл реакционной смеси и добавьте 3 мкл загрузочного красителя и оцените продукты на 2,5% агарозном геле, как показано на рисунке 9A, вместе с лестницей 20 nt.
  4. После валидации размера ПЦР-продукта (т.е. верхней полосы ПЦР, работающей со скоростью 164.н., как показано на Рисунке 9B и Рисунке 6 для размера и подробностей по окончательной конструкции) и распределения полосы, объедините ПЦР-продукты в двух пробирках, добавив к каждой 135 μL ПЦР-продукта (т.е. 90 μЛ + 45 μЛ), 13,5 μL 5 M NaCl, и 650 мкл 100% этанола и выпадать в осадок при температуре -20 °C в течение ночи.
  5. На следующий день опустите две ПЦР-пробирки при 16 000 × г в течение 60 минут при 4 °C.
  6. Высушите каждую гранулу, повторно суспендируйте 19,5 мкл 1x буфера PmeI и добавьте 0,5 мкл PmeI в течение 2 ч при 37 °C на вибростенде для дальнейшего удаления любых маркеров размера, которые содержались в соседних лунках (т.е. 19 nt-3' адаптер, 24 nt-3'адаптер) или носителей РНК (т.е. носителя экстракции РНК, носителя РНК после лигирования 3') загрязнителей.
  7. Спесенные продукты поместить в три лунки с 2,5% агарозным гелем и разделить при 150 В в течение 90 минут.
  8. Вырежьте верхнюю полосу, которая составляет 164.о. (Рисунок 9C), и очистите продукт ДНК с помощью набора для выделения ДНК и количественно оцените с помощью флуориметра.
  9. Запустите конечный продукт ПЦР на чипе ДНК, чтобы проверить размер, концентрацию и чистоту библиотеки перед разведениями и анализом с помощью секвенатора.
  10. Передача файла данных FASTQ в конвейер RNAworld для подстройки адаптера, демультиплексирования, выравнивания по геному человека перед анализом микроРНК, как описано ранее41. В качестве альтернативы, используя сценарий, представленный в дополнительном файле 3, демультиплексируйте чтения из файла FASTQ и выполните дальнейшую обработку с использованием выбранного нами аналитического конвейера с малой РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как подробно описано в приведенном выше протоколе, мы описываем одновременную обработку до 16 отдельных образцов РНК малых внеклеточных везикул (sEV) (т.е. для анализа малых некодирующих РНК и микроРНК), которые анализируются вместе в одной библиотеке после прохождения 3'-штрихкодирования. SEV, которые были отобраны для нашего анализа, были выделены с помощью ультрацентрифугирования, как описано ранее37,40, из 45 мл плазмы, собранной у женщин с диагнозом тройной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали протокол подготовки библиотеки кДНК для воспроизводимого и чувствительного секвенирования нового поколения (NGS) некодирующих РНК, включая микроРНК (микроРНК), эффективно выделенных из малых внеклеточных везикул (sEVs). Учитывая, что ограниченное количество малых некодирующих РНК и микроРНК может быть восстановлено из глобально или селективно выделенных sEV, мы стремились оптимизировать нашу процедуру подготовки библиотеки кДНК, которая обеспечивает воспроизводимый и чувст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О.Л. является безработным основателем EValuate Diagnostics, Inc с небольшим процентом акций компании. У других авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию доктора Томаса Ташля за их поддержку и за предоставление доступа к оригинальной технологии, разработанной в их лаборатории, а также за предоставление нам доступа к конвейеру RNAworld.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1% Тритон Х-100InvitrogenHFH10
10 мМ АТФ AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 М меркаптоэтанолSigmaO3445I-100 
Лестница 20 nt Jena BioscienceM-232S
20 мг/мл бычья сыворотка альбуминсигмаB8894-5ML 
50x Титановые таки Лаборатории Clontech 
Персульфат аммонияFisher Scientific 7727-54-0
Трансиллюминатор синего света - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Вертикальная система гель-электрофореза со стеклянными пластинами и гребнямиGIBCOV16
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD9170-5VL
Eppendorf микроцентрифуга 5424RСША научная4054-4537Q
Eppendorf ТермомиксерСША научная4053-8223Q
Фильтрующая трубка с 5-мм фильтрIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Силиконизированные микроцентрифужные пробирки с низким удержанием 1,5 млFisher Scientific02-681-320
Гелевая пробирка 0,5 млIST Engineering Inc.3388-100
Аппарат для гелевого электрофореза 7 см x 10 см - Мини-саб Cell GT с гелевыми капами и гребнямиBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 секвенсорIllumina20047256
Jersey-Cote (решение на основе кремния)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge двухроторная персональная центрифугаСША научная2641-0016
Модель V16 полиакриламидный гель электрофорез, очки, гребни и спейсерыCiore Life Science21070010
олигонуклеотидыIDTОпределен при заказе
Owl EasyCast B2 мини система электрофореза - с гелевыми лотками и расческамиThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen28704
Кубитный флуориметрThermoFisher ScientificQ33238
Фермент рестрикции PmeI и 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Обратная транскриптаза - Superscript IIIThermoFisher12574026
РНКаза без воды AmbionAM9932
Встряхиватель - Термомиксер EppendorfEppendorf5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III Инвитроген18080-044
СИБР ГолдЛайф Технологии S11494
Титановая Taq-полимеразаTakara639208
T4 РНК-лигаза 1 NEBM0204S
T4 РНК-лигаза 2 усеченная K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Темоциклер с подогреваемой крышкойApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel System концентрат, разбавитель и буферNational DiagnosticsEC-833
639208Комплект для обратной транскрипции

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи