Методическая статья

Мышиная модель механотрансдукционного гипертрофического рубцевания, подобного человеческому

DOI:

10.3791/67156

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол объясняет, как создать гипертрофированную модель рубцевания мышей, которая увеличивает передачу сигналов механотрансдукции для моделирования рубцов, подобных человеческим. Этот метод включает в себя увеличение механического напряжения в заживающем разрезе у мыши и использование специализированного устройства для создания воспроизводимой, избыточной рубцовой ткани для детального гистологического и биоинформатического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипертрофическое рубцевание (ВТСП) – это аномальный процесс заживления раны, который приводит к чрезмерному образованию рубцовой ткани. За последнее десятилетие мы продемонстрировали, что механотрансдукция — преобразование механических стимулов в клеточные реакции — приводит к чрезмерному заживлению фиброзных рубцов. Мышиная модель для оценки гипертрофического рубцевания, подобного человеческому, будет важным инструментом для изучения различных терапевтических средств и их способности уменьшать рубцевание и улучшать заживление. В частности, наша лаборатория разработала модель раны мыши, которая увеличивает механическую нагрузку для развития человека. В этом протоколе используются биомеханические нагрузочные устройства, изготовленные из модифицированных небных расширителей диаметром 13 мм, руки которых расположены по обе стороны разреза и постепенно разводятся друг от друга, чтобы обеспечить непрерывное напряжение на раневом ложе во время заживления. За почти два десятилетия использования эта модель была значительно усовершенствована для повышения эффективности и воспроизводимости. Используя мышиную модель HTS, можно индуцировать значительные дермальные фиброзные рубцы, которые гистологически сопоставимы с гипертрофическими рубцами человека. Эта мышиная модель обеспечивает среду для разработки биологических препаратов, участвующих в лечении ВТСП и состояний, связанных с механотрансдукцией, таких как реакция на инородное тело.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заживление ран, процесс, с помощью которого организм пытается восстановить поврежденные ткани и восстановить кожный барьер, может привести к атипичному заживлению, если процессы гемостаза, воспаления, пролиферации и ремоделирования являются нерегулярными. Гипертрофическое рубцевание (ВТСП) является примером нерегулярного заживления раны, характеризующегося чрезмерным отложением внеклеточного матрикса и соединительной ткани в месте повреждения, что приводит к образованию увеличенной площади рубцовой ткани 1,2,3. Области тела, которые подвергаются повторной механической стимуляции растяжения, такие как вокруг суставов или на лице, более склонны к развитию ВТС и фиброза 4,5,6,7,8,9,10. Мы и другие показали, что механическое растяжение через раневое ложе способствует образованию ВТСП за счет активации механотрансдукционных путей — преобразования механических стимулов в клеточные реакции 9,11.

ВТШ не только связана со сложными биологическими процессами, но и несет значительные социальные, медицинские и экономические проблемы для пострадавших людей. Пострадавшие люди могут бороться с самооценкой и депрессией, особенно когда шрамы находятся на видимых участках, таких как лицо и руки 1,9,10,12. В научных обзорных статьях указывается, что распространенность ВТСП колеблется от 32% до 72% в Соединенных Штатах10,13. Серьезность этих эстетических проблем, особенно в случаях серьезных ожоговых травм в области лица, подчеркивается растущим числом случаев полной трансплантации лица дляулучшения внешности. Эти рубцы также могут вызывать функциональные нарушения, ограничивая движения 6,14, и часто требуется хирургическое вмешательство для иссечения рубцов и восстановления подвижности10. Стоимость лечения HTS может быть существенной, включая расходы на хирургию, лечение, физиотерапию или даже долгосрочный уход 1,10. Только в Соединенных Штатах ежегодные затраты на лечение ВТСП превышают 4 миллиардадолларов10.

Учитывая распространенность ВТСП и крайние меры, принимаемые для устранения ее осложнений, традиционные методы лечения (например, хирургическое иссечение, инъекции кортикостероидов и лазерная терапия) остаются весьма вариабельными 1,2,15,16,17. Хотя эти методы лечения могут принести облегчение в некоторых случаях, они могут быть недостаточными из-за сложного характера патологии рубцов. Такие факторы, как генетические различия между людьми и неполное понимание механизмов, управляющих ВТС, приводят к тому, что терапевтические стратегии остаются клинически неудовлетворительными 18,19,20. Будущее ВТСП-терапии, по-видимому, заключается в новых инновационных подходах, нацеленных на клеточные механистические факторы ВТСП, таких как механотрансдукция11,21, которая, как мы широко продемонстрировали, способствует чрезмерному заживлению фиброзных рубцов 5,6,7,8,11,21,22,23,24.25. В частности, ранее мы разработали мышиную модель, которая увеличивает механическую нагрузку на рану для развития человекаподобного HTS9. Тем не менее, после почти двух десятилетий использования, модель была значительно усовершенствована для повышения эффективности и воспроизводимости. Этот протокол позволит исследователям наилучшим образом использовать обновленную и оптимизированную мышиную модель HTS для изучения клеточных популяций и движущих сил, вызывающих чрезмерное рубцевание. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить исследователям протокол, предназначенный для создания гипертрофических рубцов у мышей, подобных человеческим.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для всех экспериментов было получено одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Аризоны (контрольный номер: 2021-0828). В этом протоколе используются 15-недельные самцы мышей C57BL/6J, хотя он может быть применен к другим возрастам и штаммам 9,26.

1. Создание биомеханического загрузочного устройства HTS

Примечание: Модификация небных экспандеров в устройство HTS может произойти в любой момент до начала эксперимента.

  1. Возьмите немодифицированный небный экспандер и предъявите в makerspace ядро или производственное ядро со спецификациями в соответствии с рисунками 1A, B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пространство для творчества или ядро производства недоступны, перейдите к следующим шагам.
  2. Используйте инструмент для гибки проволоки Mini Universal Bender (MUB) для изменения небного расширителя в соответствии со спецификациями, приведенными на рисунке 1A, B.
  3. Поместите устройство на поверхность, как показано на рисунке 1A1.
  4. Согните руки на 90° вверх для верхних предплечий и на 90° вниз для нижних предплечий, когда устройство лежит ровно с MUB, как показано на рисунке 1A2. На рисунке 1А3 показан внешний вид устройства при горизонтальном положении на поверхности, где руки теперь идеально параллельны корпусу устройства.
  5. Согните каждую руку обратно на 90° вдоль оси пунктирной линии, как показано на рисунке 1А4. Смотрите Рисунок 1A5 для устройства после гибки.

2. Эпиляция и первичный разрез на 0 день после операции (POD 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер). Подготовьте стерилизованные швы 5-0 к использованию и имейте под рукой хирургический маркер.

  1. Очистите рабочее пространство спреем с 70% этанолом.
  2. Положите грелку, установленную при температуре 35 °C, на стол для подготовки к операции. Наклейте на грелку впитывающую прокладку скотчем. Положите еще одну впитывающую подушечку поверх предыдущей (для сбора сбритых волос). Примотайте конус (или конусы) для анестезии к абсорбирующей прокладке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: [Необязательно] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.
  3. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии с 1-3% изофлураном и 2 л/мин потоком кислорода, пока мыши не начнут спокойно дышать (2-3 минуты).
  4. Вставьте нос каждой мыши в отверстие носового конуса, чтобы можно было вдохнуть анестезию, состоящую из 1-3% изофлурана с 2 л/мин кислорода. Подтвердить адекватную анестезию можно отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Нанесите на глаза мыши офтальмологическую смазывающую мазь.
  5. Используйте электрическую бритву, чтобы сбрить волосы на тыльной стороне в этой области, как показано на рисунке 1C.
  6. Нанесите депиляторную пасту пальцем в перчатке или ватным тампоном на кожу, покрывая выбритый участок. Через 45 с сотрите пасту марлей, а затем спиртовым тампоном. Протрите спинную поверхность другим спиртовым тампоном, чтобы удалить пасту для депиляции, оставив после себя безволосый участок (Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать умеренное количество пасты, быстро удалить пасту и протереть мышь после удаления пасты, чтобы предотвратить ожоги кожи депиляторной пастой. Кожа мышей тонкая, что делает ее восприимчивой к быстрым химическим ожогам, которые могут иметь пагубные последствия как для здоровья мышей, так и для качества экспериментов.
  7. Прикрепите ушную бирку к мышке для идентификации.
  8. После удаления шерсти поместите мышь обратно в клетку, чтобы предотвратить чрезмерное воздействие изофлурана. Следите за мышью.
  9. Снимите верхнюю абсорбирующую прокладку, покрытую волосами, чтобы получить чистую предоперационную рабочую поверхность.
  10. Обустройте отдельную зону хирургической работы. Положите на операционный стол грелку, установленную при температуре 35 °C. Наклейте на грелку впитывающую прокладку скотчем. Примотайте конус (или конусы) для анестезии к абсорбирующей прокладке.
  11. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии с потоком кислорода 2-4% изофлурана и 2 л/мин до тех пор, пока мышь не начнет спокойно дышать (2-3 минуты).
  12. Выньте мышь из индукционной камеры и поместите ее на рабочую поверхность. Вставьте нос каждой мыши в отверстие носового конуса, чтобы можно было вдохнуть анестезию, состоящую из 1-3% изофлурана с 2 л/мин кислорода. Подтвердить адекватную анестезию можно отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Нанесите на глаза мыши офтальмологическую смазывающую мазь.
  13. Введите 0,05 мг/кг бупренорфина с пролонгированным высвобождением в плечо подкожно с помощью иглы 21 G для лечения послеоперационной боли.
  14. Продезинфицируйте спинную поверхность мыши тремя чередующимися раундами скраба на основе йода/хлоргексидина и спиртового тампона. С помощью хирургического маркера и линейки отметьте линию 2 см на тыльной средней линии, где будет сделан разрез на всю толщину, как показано на рисунке 1D.
  15. Используйте скальпель или ножницы для препарирования (хирургическое предпочтие), чтобы сделать разрез по средней линии тыльной линии на всю толщину через отмеченную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не разрезать подлежащие ткани (например, мышцы), как показано на рисунке 1D.
  16. Используя 5-0 швов по простой прерывистой схеме, закройте разрез, разрезав рану пополам, как показано на рисунке 1D. Используйте не менее 5 равномерно расположенных швов.
  17. Разрежьте марлю Telfa на кусок размером 3 см х 1 см. Поместите его в центр поролоновой клеевой повязки и наложите клейкую повязку на тыльную сторону мыши таким образом, чтобы марля закрывала разрез, как показано на рисунке 1D. Наложите разрезанную пополам повязку на живот и оберните по окружности, пока она не встретится со спинной повязкой.
  18. После того, как перевязка будет завершена, поместите мышь в отдельную стерильную клетку и наблюдайте за ней до тех пор, пока она полностью не восстановится от анестетика.
  19. Повторите процедуру со всеми мышами, независимо от экспериментальной группы. Дайте разрезу зажить в течение следующих 4 дней, прежде чем перейти к следующему этапу.

3. Размещение биомеханического загрузочного устройства HTS (POD 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией очистите и автоклавируйте устройства HTS и несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный привод, степлер для кожи, скобки для кожи). Подготовьте стерилизованные 5-0 швов к применению. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.

  1. Подготовьте область операции, как описано в шагах 2.1 и 2.2.
  2. Обезболите мышь и обеспечьте обезболивание, выполнив шаги 2.11-2.13.
  3. С помощью щипцов или игольчатого повязки отделите повязку от брюшной полости мыши, проводя инструментом из стороны в сторону против вентральной стороны. Оставив средство между оберткой и кожей, чтобы снять повязку с кожи, с помощью ножниц срезайте повязку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не порезать кожу мыши, не сорвать повязку и не нарушить заживающий разрез.
  4. Очистите спинку спиртовым тампоном. Осмотрите разрез на предмет расхождения раны или признаков инфекции.
  5. Убедитесь, что устройство HTS не удлиняется/расширяется и находится в максимально уменьшенной форме, как показано на рисунке 1B. Слегка смажьте дужки прибора медицинским клеем.
  6. Одной рукой сделайте кожу на тыльной стороне мыши слегка натянутой в поперечном направлении. Другой рукой поместите устройство HTS на тыльную сторону мыши таким образом, чтобы разрез был равноудален от каждого плеча устройства HTS, тем самым центрируя устройство над разрезом. Убедитесь, что кожа между дужками устройства HTS равномерно натянута. Удерживайте устройство на месте, пока клей не высохнет (~30 с), как показано на рисунке 2A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать равномерно натянутую кожу, чтобы обеспечить равное натяжение разреза с помощью устройства. Оставляйте швы нетронутыми во время этого процесса, потому что в процессе установки устройства добавляется механическое напряжение на кожу, что может вновь открыть заживающий разрез. Швы остаются на месте до первого дня растяжения, чтобы рана оставалась закрытой.
  7. Наложите четыре шва вокруг каждой руки и через кожу, как показано на рисунке 2B. Во время наложения швов следите за тем, чтобы игла выходила из кожи по направлению к разрезу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введение иглы со стороны разреза устройства иногда может привести к разрыву разреза из-за силы, необходимой для прокола кожи.
  8. Теперь поместите три скобки вокруг рук и через кожу, закрепив устройство HTS на коже, как показано на рисунке 2B.
  9. Забинтуйте мышь, выполнив шаги 2.17 и 2.18.
  10. Повторите процедуру со всеми мышами, независимо от экспериментальной группы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши получают один и тот же препарат; Тем не менее, они случайным образом распределяются в каждой экспериментальной группе (например, контрольной, стретч-группе), чтобы обеспечить несмещенное распределение мышей в экспериментальном дизайне. В частности, как контрольные, так и стретч-мыши будут иметь устройство, прикрепленное к их тыльной стороне. Устройства контрольных мышей останутся нетронутыми, в то время как мыши-растяжители пройдут следующие этапы.

4. Начальное растяжение биомеханического загрузочного устройства HTS (POD 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер) перед операцией. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.

  1. Случайным образом назначьте каждую мышь с помощью ушной бирки к нужной группе. Для контрольных мышей просто снимите швы на разрезе и поменяйте повязки ран (шаги 1-6, а затем 8-9). При желании снимите прибор в момент растяжения и сделайте фото измерительным инструментом для масштабирования, чтобы отследить размер рубца.
  2. Подготовьте операционное поле, обезболите мышь, и снимите повязку, выполнив шаги 3.1-3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сорвать повязку и не потревожить заживающий разрез. Если плечо аппарата HTS оторвалось от кожи, слегка приклейте его обратно на место и наложите скоб или шов в зависимости от размера отслоения.
  3. Снимите швы с раны с помощью диссекционных ножниц или другого метода по выбору.
  4. Вставьте ключ устройства HTS в устройство и поворачивайте, чтобы развернуть устройство, пока кожа не станет натянутой, но не будет подвергаться риску разрыва кожи, как показано на рисунке 2C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это первоначальное отвлечение может занять около 4-8 полных оборотов ключа, так как кожа может быть рыхлой между рычагами устройства.
  5. Забинтуйте мышь, выполнив шаги 2.17 и 2.18.

5. Последующее растяжение биомеханического загрузочного устройства ВТСП (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер) перед операцией. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.

  1. Для контрольных мышей достаточно просто поменять повязки на раны (шаги 1-5, а затем шаги 13-14). При желании снимите прибор в момент растяжения и сделайте фото рубца измерительным инструментом для масштабирования, чтобы отследить размер рубца.
  2. Подготовьте операционную область, обезболите мышь и снимите повязку, выполнив шаги 3.1-3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если рука устройства HTS оторвалась от кожи, приклейте ее на место и добавьте скоб или шов в зависимости от размера отслоения.
  3. Вставьте ключ устройства HTS в устройство и поверните, чтобы развернуть устройство, пока кожа не станет натянутой, но не будет подвергаться риску разрыва кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять примерно 4 оборота или ~2 мм полного отвлечения. Если устройство достигло максимального выдвижения и не может быть вытянуто дальше, выполните шаги 5.4-5.7 для снятия и повторного подключения нового устройства. В противном случае забинтуйте мышь, выполнив шаги 2.17 и 2.18.
  4. Если устройство достигло максимального растяжения, извлеките устройство из тыльной стороны мыши, удалив скобы с помощью средства для снятия скоб или ножниц, открыв зубцы скоб. Затем снимите швы и аккуратно снимите устройство.
  5. Очистите устройство скальпелем, спиртовыми тампонами и бумажными полотенцами. Замочите устройство в 70% этаноле на ~20 минут, чтобы облегчить очистку. Затем с помощью ключа сожмите устройство до самой тонкой формы.
  6. Установите на место устройство HTS, выполнив шаги 3.5-3.8.
  7. Забинтуйте мышь, выполнив шаги 2.17 и 2.18.

6. Забор ткани HTS (POD 19)

ПРИМЕЧАНИЕ: Забор ткани может происходить на любом этапе процесса. Мы собрали ткань всего за 4 дня растяжения, чтобы изучить ранние временные точки; тем не менее, ткань наиболее стабильно собирается в POD 19 (через 2 недели после начала штамма). Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для вскрытия, скальпель, щипцы Адсона) перед операцией. Чтобы получить фотографии шрама с течением времени, устройство можно снимать перед каждым этапом растяжения, чтобы сфотографировать шрам перед повторным наложением устройства и повторным воздействием механической нагрузки. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание. Настольный вытяжка может быть выключен, когда газ изофлуран больше не используется.

  1. Подготовьте операционную область, обезболите мышь и снимите повязку, выполнив шаги 3.1-3.4.
  2. Принесите мышь в жертву из-за вывиха шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потянуть кожу и не порвать тыльную сторону мыши.
  3. Используйте ножницы для препарирования или средство для снятия скоб с кожи, чтобы удалить скобки. Срежьте швы. Аккуратно снимите устройство HTS, стараясь не порвать кожу.
  4. С помощью скальпеля или ножниц разрежьте кожу вокруг шрама HTS. Сохраните кожу для гистологического анализа в желаемом виде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кожа будет использоваться для транскриптомного или белкового анализа (например, количественной ПЦР, вестерн-блоттинга, анализа одиночных клеток), обязательно иссекайте только рубцовую ткань HTS, чтобы свести к минимуму количество окружающей здоровой ткани. Это гарантирует, что анализ захватит только рубцовую ткань.
  5. Соскребите устройства HTS с помощью скальпеля. Поместите устройства в стакан с 70% этанолом, чтобы размягчить остатки клея или ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После замачивания в 70% этаноле устройства могут потребовать дополнительной протирки, соскабливания и очистки перед автоклавированием.

7. Измерение средней ширины рубца

ПРИМЕЧАНИЕ: Это было достигнуто с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJ, и информация была записана в электронную таблицу.

  1. Откройте изображения в ImageJ. Обведите края шрама с помощью инструмента « Многоугольник ». Нажмите « Анализ» | «Измерить », чтобы измерить эту область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шрам можно определить по его обесцвечиванию и отсутствию волосяных фолликулов.
  2. Измерьте длину шрама от конца до конца с помощью инструмента «Сегмент ». Нажмите «Анализ» | «Измерить », чтобы измерить эту длину.
  3. Измерьте длину 1 см или любую другую стандартизированную единицу длины на рисунке, используя инструмент «Сегмент ». Нажмите «Анализ» | «Измерить », чтобы измерить эту длину.
  4. Используя таблицу, возьмите Площадь шрама (в пикселях; px) и разделите ее на Длину шрама (px length). В результате получается средняя ширина шрама в пикселях.
  5. Разделите этот результат на измеренную стандартную единицу длины (длину в пикселях). Результатом будет средняя ширина рубца в единице стандартной единицы длины (например, см), используемой для эксперимента.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы наглядно продемонстрировать эффективное использование протокола HTS и выявить успешные «положительные» результаты, модель была создана, как показано на рисунке 3A. В репрезентативном исследовании были две группы: группа без контроля растяжения (n = 6) и группа с механическим растяжением HTS (n = 6), в которых уровни механической деформации, подобные человеческим, индуцировались через разрез для создания HTS, как показано на рисунке 3B, C. В рамках экспериментального плана, представленного на рисунке 3A-C, была сделана общая фотография рубца на POD 5, 9, 15 и 19. Шрамы были прослежены с помощью ImageJ и проанализированы на предмет средней ширины шрамов в разные временные точки (Рисунок 3D). Средняя ширина рубца была построена в зависимости от времени и между группами на рисунке 3E. После применения механической деформации в POD 5, где шрамы существенно не различались между Stretch и Control, в группе Stretch наблюдались значительно более широкие рубцы, чем в Control, достигая максимальной ширины 0,99 мм в POD 9 (p = 0,045). Эта значительно большая ширина рубца по сравнению с контролем сохранялась при POD 15 (p = 0,043) и 19 (p = 0,045). Рекомендуется делать общую фотографию только в те дни, когда необходимо удалить устройство HTS (т.е. устройство HTS достигло максимального расширения и его необходимо снова прикрепить или во время эксплантации), поскольку устройство блокирует надлежащее фотографирование шрама. В этом протоколе изображения и анализ ширины рубца в нескольких временных точках дают читателю более четкое представление о прогрессировании раны модели.

Анализ ткани HTS может быть выполнен различными способами, такими как окрашивание ИГХ на фиброзные маркеры, окрашивание H&E и трихромом для изучения гистологических участков рубца, окрашивание пикросириусом в красный цвет для оценки коллагеновой архитектуры рубцов и другие методы анализа ран — все они исторически использовались лабораторией. 8,21,24,25,27,28(Рисунок 4). На рисунке 4 показаны гистологические особенности ткани HTS, такие как приподнятая рубцовая ткань (рисунок 4A), потеря структур придатков и волосяных фолликулов (рисунок 4B), выравнивание коллагеновых волокон в направлении механической нагрузки (рисунок 4C) и коллагеновые завитки (рисунок 4F). На рисунке 4 также показано иммуногистохимическое окрашивание плотности тучных клеток и сосудистой сети мышиного HTS и сравнение его с тканями HTS человека (рисунок 4D, E, G, H). Кроме того, анализ рубца HTS может быть проведен с помощью анализа отдельных клеток, если ткань была собрана, подготовлена и доставлена в биоинформатическое ядро сразу после эксцизии.

figure-results-1
Рисунок 1: Подготовка устройства HTS и тыльной поверхности мыши. (А) Процесс модификации 13-миллиметрового небного экспандера для создания устройства HTS, (1) демонстрация исходной структуры экспандера, (2) изгиб рукавов на 90° вверх для верхних плеч и вниз для нижних плеч, когда устройство лежит ровно, (3) результат первоначального изгиба, когда рычаги теперь идеально параллельны корпусу устройства, (4) сгибание рычагов для формирования конечного устройства с измерениями; Каждый рычаг должен быть согнут на 90° внутрь страницы, как показано на (5) конечном устройстве. (B) Полностью собранное устройство HTS под различными углами, как в невыдвинутом, так и в выдвинутом виде. (C) Последовательные шаги по подготовке тыльной стороны мыши: (1) начальное состояние шерстью, (2) после бритья и (3) после нанесения пасты для депиляции. (D) Процедура создания дорсального разреза: (1) маркировка места разреза направляющей линией 2 см, (2) выполнение разреза, (3) наложение швов на рану, (4) наложение марли Telfa и (5) фиксация с помощью клеевой повязки. (E) Общая фотография (1) разреза и (2) после наложения швов на разрез закрыт. Аббревиатура: HTS = гипертрофическое рубцевание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Позиционирование и растяжение устройства HTS. (A) Иллюстрация правильного расположения устройства HTS на тыльной стороне мыши, обеспечивающее правильное выравнивание с местом разреза. На левом изображении показано расположение устройства с заднего положения. На правом изображении показано расположение устройства сбоку. (B) Иллюстрация крепления устройства HTS: (1) первоначальное размещение, (2) расположение швов, (3) расположение скоб кожи. (C) Демонстрация растяжения устройства HTS с помощью маркированного ключа устройства HTS: (1) начальная конфигурация, (2) приложение натяжения, (3) окончательное расширенное состояние, предназначенное для приложения постоянной механической деформации через заживающий разрез для стимулирования образования гипертрофического рубца, применение расширения на 2 мм. (D) Общая фотография приложения натяжения к устройству HTS с маркировкой ключа устройства HTS. (E) Грубая фотография полностью забинтованной мыши. Аббревиатура: HTS = гипертрофическое рубцевание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Применение механического напряжения для развития рубцов. (A) Хронология экспериментальной процедуры от создания разреза (POD 0) до приложения механической нагрузки (POD 4) и через период растяжения (POD 5 - POD 19), завершающийся эксплантацией тканей (POD 19). (B) Иллюстрация двух групп: группы без контроля растяжения и группы с механическим растяжением HTS. (C) Схема поперечного сечения, показывающая разницу в реакции тканей между группами No Stretch Control и Stretch HTS. (D) Репрезентативные общие изображения рубцов групп No Stretch Control и Stretch HTS в послеоперационные дни (POD 5, 9, 15 и 19), с гипертрофированными рубцами, прочерченными желтой пунктирной линией. (E) Количественный анализ средней ширины рубца с течением времени, демонстрирующий значительные различия в развитии рубца между группами No Stretch и Stretch, с погрешностями, представляющими стандартное отклонение. Существенные отличия отмечены звездочками (*). Статистический анализ проводили с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Значения *p < 0,05 считались статистически значимыми. Сокращения: HTS = гипертрофическое рубцевание; POD = послеоперационный день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Гистология рубца. Эта гистология мышиного рубца была собрана после 2 недель механического стресса в нашей ранее опубликованной работе9,26. (A) На более крупном изображении показана гистологическая визуализация поперечного сечения рубца методом H&E, в то время как в правом нижнем углу представлена гистологическая визуализация поперечного сечения рубца, показывающая, как приподнята область рубца. (B) На более крупном изображении показана гистологическая визуализация поперечного сечения рубца методом H&E, в то время как в правом нижнем углу представлена гистологическая визуализация поперечного сечения рубца, показывающая, как область рубца демонстрирует потерю структур придатков и волосяных фолликулов. (C) На более крупном изображении показано красное изображение поперечного сечения рубца, в то время как в правом нижнем углу представлена трихромная гистологическая визуализация поперечного сечения рубца, показывающая выровненные коллагеновые волокна в направлении механической нагрузки. (D) На более крупном изображении показана визуализация иммуногистохимии CD117 в ткани мышей HTS, в то время как в правом нижнем углу представлена визуализация иммуногистохимии CD117 в тканях человека, демонстрирующая плотность тучных клеток, сравнимую с тканями HTS человека. (E) На более крупном изображении показана визуализация иммуногистохимии CD31 сосудистой сети в мышиной ткани HTS, в то время как в правом нижнем углу представлена визуализация иммуногистохимии CD117 в тканях человека, демонстрирующая плотность тучных клеток, сравнимую с тканями HTS человека. (F) Коллагеновые завитки, видимые в зрелых гипертрофических рубцах человека на изображении в правом нижнем углу, также видны на нагруженных мышиных рубцах через 24 недели в обведенной области на мышиной визуализации H&E. (G) Репрезентативные общие изображения рубцов контрольной группы (разрез + без растяжения), контрольной группы растяжения (без разреза + растяжение) и группы с растяжением HTS. (H) Показывает иммуногистохимический анализ при сравнении контрольной группы (разрез + без растяжения) и группы с растяжением HTS. При использовании ко-окрашивания фиброзных маркеров pEPF, aSMA и YAP с DAPI наблюдается увеличение фиброзных маркеров в группе HTS. A-F были адаптированы из Aarabi, S. et al.9. G,H были адаптированы из Mascharak, S. et al. Перепечатано с разрешения FASEB26. Сокращения: HTS = гипертрофическое рубцевание; H&E = гематоксилин и эозин; pEPF = Ангролированно-положительный фибробласт; aSMA = альфа-актин гладкой мускулатуры; YAP = Да-ассоциированный белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная модель HTS является экономически эффективным и высоковоспроизводимым методом индуцирования HTS с помощью механотрансдукции и разработки потенциальных методов лечения. Несмотря на то, что для эффективного использования модели существует начальная кривая обучения, с практикой протокол может быть выполнен любым исследователем без хирургической подготовки. Использование этой модели позволяет исследователям лучше понять формирование HTS и роль механотрансдукции в заживлении ран, что может привести к ощутимым улучшениям в уходе за ранами пациентов. Видеодемонстрация, сопровождающая этот протокол, в идеале сократит кривую обучения исследователей и будет способствовать плавному внедрению этой модели в будущие исследования. Тем не менее, в протоколе есть ряд критически важных шагов, которые могли бы выиграть от дальнейшего разъяснения для повышения ясности для пользователей.

В хронологическом порядке от начала протокола, первым ключевым шагом является закрытие хирургического разреза в послеоперационный день 0 (POD 0). Крайне важно, чтобы разрез был полностью закрыт слоями кожи в идеальном положении29. Это необходимо для того, чтобы разрез зажил должным образом и не открылся после установки устройства и создания напряжения в ране. Если рана открывается (расхождение), животное не следует использовать для дальнейших экспериментов.

При размещении устройства HTS на POD 4 крайне важно обеспечить одинаковое натяжение на тыльной стороне мыши. При правильном размещении устройства натяжение будет равномерным по всему разрезу, что снижает риск приложения переменной силы, которое может привести к неоптимальным результатам эксперимента (неравномерному рубцеванию). Если устройство установлено неправильно, части разреза не будут одинаково получать в среднем 2 мм отвлечения через день, чтобы вызвать HTS. Расширение устройства должно устранить дряблость кожи и сделать ее подтянутой. В то же время необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить чрезмерного растяжения устройства, которое может привести к раскрытию раны. Если устройства используются для нескольких раундов экспериментов, вращающаяся шестерня, в которую помещен ключ для расширения и сжатия устройства, может ослабнуть. Если это происходит, следует изготовить новое устройство, а старое утилизировать.

Когда напряжение начинается в POD 5, следует начать проводить любую терапию, направленную на профилактику рубцов. Методы лечения, такие как мази для местного применения, обычно назначаются через день, когда напряжение возникает путем нанесения на место разреза. Гидрогели аналогичным образом размещаются над местом разреза. Системная терапия может вводиться в кровоток либо через хвостовую вену, либо ретроорбитально.

Рекомендуется побриться и/или слегка нанести депиляционную пасту на спину мыши вокруг шрама на POD 19 или перед фотографированием шрама. Это улучшает видимость и последующий анализ размера рубца с помощью ImageJ. Кроме того, при использовании пасты для депиляции следует ошибаться в сторону меньшего количества пасты и более короткого периода времени. Чрезмерное воздействие пасты на тыльную сторону мыши может вызвать химические ожоги, которые могут помешать процессу заживления ран. Кожа мыши тоньше кожи человека и более подвержена химическиможогам.

Мышиная модель HTS по своей сути ограничена, поскольку она не использует человеческую кожу и, таким образом, не может полностью воспроизвести человеческую HTS. Тем не менее, он имеет значительное количество логистических преимуществ по сравнению с другими животными моделями; Выполненная должным образом, эта модель мыши HTS надежна, недорога и проста в исполнении. Биологически HTS индуцируется за счет физического увеличения механической сигнализации. Другие модели ВТСП у кроликов индуцируют ВТС на ухе или тыльной стороне с использованием термической и химической травмы 30,31,32. Кожа на вентральной стороне уха кролика во время заживления не вовлекает много клеток, кроме клеток кожи, таких как хондроциты 1,30. Другим методом является модель ожога HTS на свиной коже33, но он может быть сложным с точки зрения логистики с точки зрения стоимости и обработки. Модель свиньи, вероятно, наиболее похожая на повторение человеческой HTS; Тем не менее, это дорогостоящий метод сбора первоначальных результатов. Последней моделью HTS является ксенотрансплантация человеческой HTS-кожи мышам, но это может вызвать иммунный ответ и не исследует образованиеновых рубцов.

Вышеупомянутые методы индуцирования ВТГ на животных моделях не вызывают адекватной естественной реакции организма на заживление таким же образом, как образуются шрамы от ВТСП у человека. В отличие от этого, мышиная модель HTS, основанная на механотрансдукции, использует механическую деформацию для инициирования гипертрофического рубцевания, что близко отражает человеческий HTS 1,9,21. Этот метод основан на физиологическом процессе передачи сигналов механотрансдукции для захвата биомеханики основных тканей и движущих сил клеточной популяции, вызывающих фиброз. Эта модель оптимальна для изучения биологических мишеней для ингибирования или даже индуцирования путей механотрансдукции, что потенциально может привести к открытию новых трансляционных терапий.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов или других конфликтов, связанных с содержанием данной статьи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана премией Центра стоматологической, оральной и черепно-лицевой регенерации тканей и органов в рамках междисциплинарного трансляционного проекта при поддержке Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (U24 DE026914) (G.C.G.) и гранта на трансляционные исследования Фонда пластической хирургии (837107) (K.C.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 мл стакан PYREX GriffinMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta мини триммерAesculap
AutoClip SystemТонкие хирургические инструменты12020-00
BD марки изопропиловый спирт тампоныFisher Scientific13-680-63
Бупренорфин SR (0,5 мг/мл)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 самки (6– 8 недель)Лаборатория Джексона000664
стерильной марлей CovidienFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM неадгезивные прокладкиFisher Scientific, Covidien1961
Стоматологическая хирургическая линейкаDoWell Dental ProductsS1070
Крем для депиляции (Nair Hair Remover Lotion)Church& Дуайт, CVS339823
Этанол 70% растворFisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft СотрудничествоMicrosoft.comпрограммным обеспечением 
ImageJImageJ, Уэйн Расбандimagej.netпрограммное обеспечение 
Система ингаляционной анестезииVetEquip922130
Ирис ножницы 4½ in. нержавеющаяMcKesson43-2-104
Изофлуран, USPDechra Veterinary Products17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Необходимо только в том случае, если нет свободных производственных площадей или производственных цехов 
Leone Rapid Palatal Expander- 13 ммGreat Lakes Dental Technologies125-004Ключ, необходимый для расширения и крепления устройства, будет поставляться с этим продуктом в коробке
Жидкая репеллентная простыня 75 x 90 см с отверстием для клея 6 x 9 смOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx MedequipDepot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Иглодержатель 5 дюймов с зубчатыми губкамиMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comпрограммное обеспечение 
Офтальмологическая мазь PuralubeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comпрограммное обеспечение 
Хирургический маркеркожи McKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191поролоновый адгезивный повязк 
Грелка Thermo-PeepK& H, Тканевые
4¾ дюймовые нержавеющие 1 x 2 зубаMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB
щипцы Amazon

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mony, M. P., Harmon, K. A., Hess, R., Dorafshar, A. H., Shafikhani, S. H. An updated review of hypertrophic scarring. Cells. 12 (5), 678(2023).
  2. Limandjaja, G. C., Niessen, F. B., Scheper, R. J., Gibbs, S. Hypertrophic scars and keloids: Overview of the evidence and practical guide for differentiating between these abnormal scars. Exp Dermatol. 30 (1), 146-161 (2021).
  3. Cao, X., Sun, L., Luo, Z., Lin, X., Zhao, Y. Aquaculture derived hybrid skin patches for wound healing. Engineered Regeneration. 4 (1), 28-35 (2023).
  4. Ishise, H., et al. Hypertrophic scar contracture is mediated by the trpc3 mechanical force transducer via nfkb activation. Sci Rep. 5 (1), 11620(2015).
  5. Padmanabhan, J., et al. Allometrically scaling tissue forces drive pathological foreign-body responses to implants via rac2-activated myeloid cells. Nat Biomed Eng. 7 (11), 1419-1436 (2023).
  6. Kussie, H. C., et al. Avenanthramide and β-glucan therapeutics accelerate wound healing via distinct and nonoverlapping mechanisms. Adv Wound Care (New Rochelle). 13 (4), 155-166 (2024).
  7. Chen, K., et al. Disrupting biological sensors of force promotes tissue regeneration in large organisms. Nat Commun. 12 (1), 5256(2021).
  8. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (5), 986-991 (2018).
  9. Aarabi, S., et al. Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis. FASEB J. 21 (12), 3250-3261 (2007).
  10. Aarabi, S., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Hypertrophic scar formation following burns and trauma: New approaches to treatment. PLoS Med. 4 (9), e234(2007).
  11. He, J., et al. Mechanical stretch promotes hypertrophic scar formation through mechanically activated cation channel piezo1. Cell Death Dis. 12 (3), 226(2021).
  12. Weng, W., et al. Ellipsoidal porous patch with anisotropic cell inducing ability for inhibiting skin scar formation. Engineered Regeneration. 3 (3), 262-269 (2022).
  13. Lawrence, J. W., Mason, S. T., Schomer, K., Klein, M. B. Epidemiology and impact of scarring after burn injury: A systematic review of the literature. J Burn Care Res. 33 (1), 136-146 (2012).
  14. Ziolkowski, N., et al. Psychosocial and quality of life impact of scars in the surgical, traumatic and burn populations: A scoping review protocol. BMJ Open. 9 (6), e021289(2019).
  15. Gauglitz, G. G., Korting, H. C., Pavicic, T., Ruzicka, T., Jeschke, M. G. Hypertrophic scarring and keloids: Pathomechanisms and current and emerging treatment strategies. Mol Med. 17 (1-2), 113-125 (2011).
  16. Fu, X., et al. Oxygen atom-concentrating short fibrous sponge regulates cellular respiration for wound healing. Advanced Fiber Materials. 5 (5), (2023).
  17. Fu, X., et al. Living electrospun short fibrous sponge via engineered nanofat for wound healing. Advanced Fiber Materials. , (2022).
  18. Fomovsky, G. M., Holmes, J. W. Evolution of scar structure, mechanics, and ventricular function after myocardial infarction in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (1), H221-H228 (2010).
  19. Macintyre, L., Baird, M. Pressure garments for use in the treatment of hypertrophic scars--a review of the problems associated with their use. Burns. 32 (1), 10-15 (2006).
  20. Brissett, A. E., Sherris, D. A. Scar contractures, hypertrophic scars, and keloids. Facial Plast Surg. 17 (4), 263-272 (2001).
  21. Chen, K., et al. Disrupting mechanotransduction decreases fibrosis and contracture in split-thickness skin grafting. Sci Transl Med. 14 (645), eabj9152(2022).
  22. Ogawa, R., et al. Clinical applications of basic research that shows reducing skin tension could prevent and treat abnormal scarring: The importance of fascial/subcutaneous tensile reduction sutures and flap surgery for keloid and hypertrophic scar reconstruction. J Nippon Med Sch. 78 (2), 68-76 (2011).
  23. Chen, K., Henn, D., Gurtner, G. C. Holy grail of tissue regeneration: Size. Bioessays. 44 (9), e2200047(2022).
  24. Sivaraj, D., et al. Nitric oxide-releasing gel accelerates healing in a diabetic murine splinted excisional wound model. Front Med (Lausanne). 10, 1060758(2023).
  25. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodelling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).
  26. Mascharak, S., et al. Preventing engrailed-1 activation in fibroblasts yields wound regeneration without scarring. Science. 372 (6540), eaba2374(2021).
  27. Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio Protoc. 13 (3), e4606(2023).
  28. Wang, P. H., Huang, B. S., Horng, H. C., Yeh, C. C., Chen, Y. J. Wound healing. J Chin Med Assoc. 81 (2), 94-101 (2018).
  29. Azmat, C. E. Martha Council. Wound closure techniques. Statpearls. , StatPearls Publishing LLC. Treasure Island (FL). (2024).
  30. Tunca, M., et al. Cryosurgery to remove perichondrium for the rabbit ear hypertrophic scar model: A simplified method. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat. 28 (2), 57-59 (2019).
  31. Sun, Q., et al. The effects of timing of postoperative radiotherapy on hypertrophic scar in a rabbit model. Med Sci Monit. 26, e921263(2020).
  32. Zu, W., Jiang, B., Liu, H. Establishment of a long-term hypertrophic scar model by injection of anhydrous alcohol: A rabbit model. Int J Exp Pathol. 102 (2), 105-112 (2021).
  33. Molina, E. A., et al. Angiogenic gene characterization and vessel permeability of dermal microvascular endothelial cells isolated from burn hypertrophic scar. Sci Rep. 12 (1), 12222(2022).
  34. Li, Z., et al. A highly simulated scar model developed by grafting human thin split-thickness skin on back of nude mouse: The remodeling process, histological characteristics of scars. Biochem Biophys Res Commun. 526 (3), 744-750 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи