Методическая статья

Отбор проб N-метил-N-нитрозурного повреждения сетчатки у крыс и многоиндексная оценка патологических изменений

571 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67159

⸱

13 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру забора образцов сетчатки крыс с использованием окрашивания гематоксилин-эозином, анализа TUNEL и вестерн-блоттинга для обнаружения патологических изменений и апоптоза в сетчатке после внутрибрюшинного введения N-метил-N-нитрозурии.

Аннотация

Ретинопатия может наблюдаться при большинстве глазных заболеваний и поздних осложнениях сахарного диабета. Специфические клетки пигментного эпителия, а также повреждение и дегенерация зрительных клеток являются основными признаками ретинопатии. Многие традиционные лекарственные средства показали значительную клиническую эффективность в лечении ретинопатии. Как быстро и полностью получить сетчатку глаза является ключевым этапом в исследованиях традиционной медицины для лечения ретинопатии. В этом исследовании мы стремимся предоставить стандартизированную и осуществимую процедуру отбора проб N-метил-N-нитрозомочевины (MNU), вызванного повреждением сетчатки крысы, и многоиндексной оценкой патологических изменений. Крысам вводили внутрибрюшинно 60 мг/кг MNU однократно, чтобы вызвать повреждение сетчатки, а образцы сетчатки были получены через 7 дней. Кроме того, мы проводили окрашивание гематоксилин-эозином для оценки патологических изменений сетчатки. Определение скорости апоптоза и белка апоптоза с помощью TUNEL и вестерн-блоттинга. Эти стандартизированные протоколы забора образцов сетчатки и оценки патологических изменений полезны для содействия изучению механизма ретинопатии и открытию новых и эффективных традиционных трав.

Введение

Пигментный ретинит (РП) является наследственным заболеванием сетчатки, приводящим к слепоте1. Частота возникновения РП составляет от 1/3500 до 1/5000, влияя на зрительную функцию около 2,5 миллионов человек в мире. Это одно из наиболее известных заболеваний, приводящее к ухудшению зрения у людей, налагающее значительное бремя на все общество2. Заболевание характеризуется постепенной потерей функции пигментных эпителиальных клеток сетчатки и прогрессирующим апоптозом фоторецепторов. На ранних стадиях у пациентов возникает куриная слепота, которая проявляется в виде дефектов периферического поля зрения и в конечном итоге приводит к потерецентрального зрения3. Таким образом, ингибирование апоптоза фоторецепторов сетчатки является ключевым направлением профилактики и лечения РП.

Апоптоз клеток сетчатки является общим признаком РП человека и модельных животных4. Внутрибрюшинное введение N-метил-N-нитрозомочевины (MNU) в дозу 60 мг/кг крысам в течение 7 дней может вызвать апоптоз и потерю фоторецепторных клеток сетчатки, и это широко используемая животная модель RP 5,6. Анализ изменений патологической структуры, специфического клеточного апоптоза и связанной с апоптозом экспрессии белка ткани сетчатки у модельных животных может обеспечить эффективные экспериментальные данные и теоретическую поддержку в изучении патогенеза РП человека и скрининговых препаратах 7,8. Таким образом, качество образцов сетчатки определяет достоверность экспериментальных данных. Однако, из-за особенностей глазной ткани, существует очень мало сообщений о том, как получить сетчатку глаза крысы9.

В этой статье представлена простая, быстрая, стандартизированная и работоспособная процедура забора образцов сетчатки у крыс для преодоления вышеуказанных недостатков. Для анализа патологических изменений в повреждении тканей сетчатки и апоптозе у крыс используются окрашивание гематоксилин-эозином (HE), опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой дезоксиуридинтрифосфат-дигоксигенин ник-энд (TUNEL) и вестерн-блоттинг. Все методы основаны на опыте нашей исследовательской группы в конкретных операционных процессах.

Протокол

Все протоколы и хирургические процедуры были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Нинся (номер этики: No 2020-Q066). Самцы крыс SPF Sprauge-Dawley (SD) в возрасте 7-8 недель и весом 200-220 г были приобретены в Медицинском университете Нинся с номером лицензии на животное SCXK (Ning) 2020-0001. Все животные были выращены в Центре лабораторных животных Медицинского университета Нинся. Температура и влажность были подходящими, световой цикл дня и ночи сохранялся, а пища и вода были бесплатными и достаточными.

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовка материалов
    1. Подготовьте крысиные пластины, аппараты для ингаляционной анестезии, встроенные коробки, замороженные пробирки для хранения, одноразовые хирургические перчатки и маски, бутылочки с широким горлышком, 4% параформальдегид, пакеты со льдом, офтальмологические ножницы, офтальмотерапевтический пинцет, хирургические лезвия и рукоятки ножей, микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и заранее простилизуйте их (см. Таблицу материалов).
  2. Подготовка животных
    1. Случайным образом разделите 20 самцов SD крыс на модельную группу (n=10) и контрольную группу (n=10). Модельным крысам внутрибрюшинно вводят 60 мг/кг MNU, а контрольным крысам внутрибрюшинно вводят тот же объем физиологического раствора.
    2. После 7 дней инъекции кормите крыс голоданием и дайте им свободно пить в ночь перед взятием образца.
    3. На следующий день положите крысу лежа на операционный стол и используйте маску для введения анестезии с использованием 4% изофлурана и 2 л/мин кислорода. Измерьте глубину анестезии, сжав центр стопы, чтобы наблюдать за реакцией крыс.

2. Забор проб сетчатки для определения белкового фактора

  1. Зафиксируйте глазницу крысы левой рукой и удалите глаз с умеренной силой правой рукой с помощью офтальмологических изгибающих щипцов. Поместите глазное яблоко в сагиттальное положение в холодную стеклянную посуду.
  2. Левой рукой держа офтальмологический прямой пинцет для фиксации глазного яблока, а правой рукой держите хирургическое лезвие, сделайте продольный разрез на 2 мм рядом с местом хрусталика.
  3. Отрежьте роговицу офтальмологическими ножницами вдоль разреза, аккуратно снимите хрусталик, стекловидное тело и обнажите наглазник.
  4. Поместите дно наглазника на кончик микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл, поверните наглазник над трубкой и обнажите сетчатку (сетчатка имеет бледно-желтый цвет).
  5. Удалите всю сетчатку вдоль склеральной стенки глазного яблока с помощью офтальмологического гнущегося пинцета, затем поместите ее в замороженную пробирку и храните в резервуаре с жидким азотом для дальнейшего использования (рисунок 1).

3. Забор сетчатки для патологоанатомического исследования и специфического окрашивания клеток

  1. Левой рукой используйте пинцет для глаз, чтобы приподнять уголок глаза крысы. Правой рукой с помощью хирургического лезвия вырезайте отверстие диаметром 4 мм вдоль угла глаза крысы.
  2. С помощью пинцета для глаз зажмите край глазного яблока в отверстии в левой руке. С помощью офтальмологических ножниц отрежьте окружающие ткани по краю глазного яблока, уделяя при этом внимание очистке окружающих тканей глазного яблока.
  3. Отделите ткани вокруг зрительного нерва на заднем полюсе глазного яблока с помощью пинцета, перережьте зрительный нерв и обратите внимание на его сохранение. Затем удалите глазное яблоко.
  4. Промойте удаленное глазное яблоко в физрастворе, чтобы удалить остатки крови, прокатайте его на фильтровальной бумаге, чтобы впитать лишнюю воду, и положите на холодную фольгу.
  5. Зафиксируйте глаз с помощью офтальмологического пинцета. Хирургическим лезвием сделайте продольный разрез 4 мм вдоль стыка роговицы и сетчатки.
  6. Удалите роговицу офтальмологических ножницами, сделайте круговой надрез вдоль разреза, аккуратно удалите хрусталик и стекловидное тело.
  7. Поместите оставшийся наглазник со зрительным нервом в закладную коробку и зафиксируйте его в 4% параформальдегиде.
  8. Поместить в параформальдегид фиксированные образцы в парафин и нарезать на ломтики размером 4 мкм для окрашивания HE и окрашивания TUNEL7.

4. HE-окрашивание сетчатки глаза крысы

  1. Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 10 минут, повторите процесс еще 10 минут, затем абсолютный этанол в течение 5 минут, повторите обработку этанолом еще 5 минут, затем обработайте 95% спиртом в течение 5 минут, затем в 85% спирте на 5 минут и, наконец, в 75% спирте на 5 минут.
  2. Окрашивание гематоксилином: Промойте ломтик деионизированной водой в течение 5 минут. Используйте 100 μл раствора для окрашивания гематоксилина и окрашивайте в течение 5 минут, смывайте деионизированной водой в течение 5-10 секунд. Добавьте 100 μл 1% этанола соляной кислоты на 30 с, промойте деионизированной водой в течение 20 мин и добавьте 100 мкл 0,2% аммиачной воды на 1 мин. Смыть деионизированной водой в течение 5 минут.
  3. Окрашивание эозином: Используйте 100 мкл раствора для окрашивания эозина в течение 5 минут и прополощите деионизированной водой в течение 30 секунд.
  4. Обезвоживание и запечатывание: Погрузите ломтики в 70% спирт на 5 минут, затем в 85% спирт на 5 минут, затем 90% спирт на 5 минут и абсолютный этанол на 5 минут. Повторите обработку абсолютным этанолом еще 5 минут, затем погрузите в ксилол на 5 минут и повторяйте процесс еще 5 минут. Наконец, запечатайте, добавив примерно 100 мкл нейтральной смолы на поверхность ломтиков, а затем накройте ее покровным стеклом.
  5. Визуализация предметных стекол: расположите окрашенные срезы на микроскопе, отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока изображение не станет четко видимым, установите увеличение в 400x и сделайте снимок.
  6. Измерьте общую толщину сетчатки и внешнюю толщину сетчатки: Измерьте общую толщину сетчатки и внешнюю толщину сетчатки (толщину внешнего ядерного слоя и слоя фоторецептора), а также рассчитайте процент толщины наружной сетчатки
    Толщина наружной сетчатки (%) = (толщина наружной сетчатки/общая толщина сетчатки) x 100.

5. Определение скорости апоптоза фоторецепторных клеток сетчатки методом TUNEL

  1. Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 10 минут, повторите процесс еще 10 минут, затем поместите в абсолютный этанол на 5 минут и повторяйте этот шаг еще 5 минут. Выполните обезвоживание, поместив 95% спирт на 5 минут, 90% спирт на 5 минут, 80% спирт на 5 минут, 70% спирт на 5 минут и промыть деионизированной водой в течение 5 минут.
  2. Промыть 0,85% раствором натрия хлорида в течение 5 мин и PBS в течение 5 мин. Закрепить параформальдегидом с использованием 4% параформальдегида на 15 минут. Промойте PBS в течение 5 минут, и повторяйте процесс еще 5 минут.
  3. Инкубация и равновесие7: Инкубировать с раствором протеиназы К 20 мкг/мл для разложения в течение 15 мин, уравновешивать в равновесном буфере в течение 10 мин и инкубировать с рекомбинантным концевым буфером дезоксинуклеотидилтрансферазы (rTdT) при 37 °C в течение 60 мин.
  4. Реакция остановки: Добавьте 100 μL в стандартный раствор цитрата (2x раствор SSC) в течение 15 минут. Промойте PBS в течение 5 минут, и повторяйте процесс еще 5 минут.
  5. Ядерный краситель: Добавить 100 μL 4', реагент 6-диамидин-2-фениндл (DAPI) в течение 5 мин. Промойте деионизированной водой в течение 5 минут, и повторите процесс еще 5 минут.
  6. Герметизация: Протрите излишки ксилола вокруг ломтиков и запечатайте, добавив примерно 100 мкл нейтральной смолы на поверхность ломтиков, а затем накройте ее покровным стеклом.
  7. Микроскопия: поместите окрашенные срезы на микроскоп, отрегулируйте фокус микроскопа для четкой видимости, установите увеличение до 400x и сделайте снимок. Наблюдайте за зеленой флуоресценцией на длине волны 520 ± 20 нм с помощью стандартного флуоресцентного фильтра. Обратите внимание на синий DAPI на длине волны 460 нм.
  8. Рассчитайте частоту апоптоза: измерьте значения зеленой флуоресценции и синей флуоресценции внешнего слоя ядра сетчатки. Рассчитайте частоту апоптоза следующим образом:
    Частота апоптозных клеток = значение зеленой флуоресценции/значение синей флуоресценции x 100.

6. Вестерн-блоттинг 10

  1. Лечение лизисным буфером: измельчите и гомогенизируйте одну замороженную сетчатку 50 мкл холодного лизисного буфера (1 мл лизисного буфера, содержащего 5 мкл ингибитора фосфатазы, 1 мкл ингибитора протеазы и 5 мкл 100 мМ PMSF).
  2. При условии ультразвуковой обработки с частотой 28 кГц в течение 5 с на ледяной бане; Повторите 3 раза. Центрифугируйте при 4 °C в течение 5 минут при 10 000 x g для удаления клеточного мусора. Держите надосадочную жидкость.
  3. em>6.3Количественное определение белка: Определение концентрации белка с помощью набора реагентов для анализа белка BCA.
  4. em>6.4Электрофорез: Загрузить образец белка 50 мкг и разделить на 12% электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).
  5. Перенос на мембрану: Электрофоретический перенос на мембраны из ПВДФ с использованием системы электрофоретического переноса.
  6. Подразделяйте мембраны: Подразделяйте мембраны и анализируйте каждый интересующий белок, β-актин и GAPDH из одного переноса.
  7. Блокировка: Заблокируйте мембраны на 1 ч в TBST, содержащем 5% обезжиренного молока комнатной температуры.
  8. Инкубация первичного антитела: инкубация с первичным антителом расщепленной каспазы-9 (разведение 1:200), расщепленной каспазы-3 (разведение 1:200), расщепленной каспазы-7 (разведение 1:200) и β-актина (разведение 1:1000) в течение ночи при 4 °C. Промойте мембраны с TBST в течение 5 минут, повторите 3 раза.
  9. Инкубируйте второе антитело: Инкубируйте с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000) в течение 2 ч при комнатной температуре. Промойте мембраны с TBST в течение 5 минут, повторите 3 раза.
  10. Экспозиция: Визуализируйте меченые белки с помощью субстрата вестерн-блоттинга и, наконец, обнажите мембраны для визуализации белковых полос в автоматическом режиме экспозиции.
  11. Рассчитайте содержание белка7 , измерив плотность полосы белка.

7. Статистический анализ

  1. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения SPSS 19.0 и представьте их в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Выполнение статистического анализа наблюдаемых значений с использованием одностороннего дисперсионного анализа. Примем p< 0,05 как статистически значимый.

Результаты

После окрашивания HE все слои сетчатки крыс контрольной группы имели четкую тканевую структуру, упорядоченное расположение клеток и равномерное окрашивание, при этом структура сетчатки крыс модельной группы была значительно повреждена, наружный слой сетчатки оказался тоньше, наружный ядерный слой был практически полностью интегрирован с внутренним стержневым слоем, расположение клеток в слое было крайне нарушено, Количество клеточных слоев было значительно уменьшено, а толщина фоточувствительного клеточного слоя и внешнего ядерного слоя стала значительно тоньше. Толщина наружного слоя сетчатки в контрольной и модельной группах составила 48% и 23% соответственно (p < 0,01; Рисунок 2).

Метод TUNEL показал, что в контрольной группе апоптотические клетки не были обнаружены, но в модельной группе было некоторое количество апоптотических клеток во внешнем ядерном слое крыс (p < 0,01), а положительное отношение TUNEL составило 9,6% (рис. 3).

Семейство белков каспаз является одним из основных семейств, осуществляющих апоптоз. Среди них расщепленная каспаза 3, расщепленная каспаза 7 и расщепленная каспаза 9 являются классическими индикаторами, используемыми для оценки клеточного апоптоза7. Результаты вестерн-блоттинга показали, что по сравнению с контрольной группой экспрессия расщепленной каспазы 3, расщепленной каспазы 7 и расщепленной каспазы 9 в сетчатке модельной группы была достоверно увеличена (p<0,01; Рисунок 4). Это указывает на то, что MNU может явно вызывать апоптоз клеток сетчатки.

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. После внутрибрюшинного введения MNU в течение 7 дней (7d) была получена сетчатка сетчатки крыс, находящихся под наркозом, для окрашивания HE и TUNEL. Сокращения: MNU = N-метил-N-нитрозомочевина; HE = гематоксилин-эозин; TUNEL = терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, опосредованная дезоксиуридинтрифосфат-дигоксигенином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные гистопатологические изображения окрашивания ПЭ на 7-й день после введения МНУ. (А) Окрашивание ПЭ через 7 дней (7d) после введения МНУ. (В) Соотношение наружной сетчатки. Данные представлены в виде среднего ± SD (n=6). Статистический анализ наблюдаемых значений был выполнен с использованием одностороннего дисперсионного анализа. ** p < 0,01 против контроля. Сокращения: GCL = слой ганглиозных клеток; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = слой ядра; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; PRL = фоторецепторный слой; MNU = N-метил-N-нитрозомочевина; HE = гематоксилин-эозин. n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ TUNEL показывает апоптоз фоторецепторов, индуцированный MNU у крыс. (A) Через 7 дней (7d) после введения MNU TUNEL-положительные клетки (зеленого цвета) были представлены в ONL у крыс, получавших MNU. (B) Положительное отношение TUNEL. Данные представлены в виде среднего ± SD (n=6). Статистический анализ наблюдаемых значений был выполнен с использованием одностороннего дисперсионного анализа. ** p < 0,01 против контроля. Сокращения: GCL = слой ганглиозных клеток; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = слой ядра; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; PRL = фоторецепторный слой; MNU = N-метил-N-нитрозомочевина; TUNEL = терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, опосредованная дезоксиуридинтрифосфат-дигоксигенином. n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Экспрессия расщепленной каспазы 3, расщепленной каспазы 7 и расщепленной каспазы 9 в сетчатке крыс на 7-й день после введения MNU. (A) Репрезентативные данные по экспрессии расщепленной каспазы. (В) Соотношение расщепленных каспаз 3/β-актина. (В) Соотношение расщепленных каспаз 7/β-актин. (D) Соотношение расщепленных каспаз 9/β-актина. Данные представлены в виде среднего ± SD (n=6). Статистический анализ наблюдаемых значений был выполнен с использованием одностороннего дисперсионного анализа. ** p < 0,01 против контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

РП является распространенным заболеванием сетчатки в клиниках. Начало, тяжесть и прогрессирование РП связаны с генами и генетическими модусами и зависят от окружающей среды 8,11. РП включает семейный РП и эпизодический РП, из которых семейный РП составляет около 60% пациентов. Путем отслеживания семейной генетической истории на сегодняшний день было идентифицировано 83 гена, связанных с РП, в то время как случайный РП составляет около 40%, что означает, что у этого типа пациентов отсутствует семейный анамнез и имеет нерегулярныйгенетический паттерн. Несмотря на то, что апоптоз фоторецепторных клеток сетчатки, вызывающий потерю зрительной функции у пациентов с РП, является общепризнанным, основной механизм гибели фоторецепторов при РП остается неясным 12,13,14. В связи с ограниченным доступом к ткани сетчатки человека, которая в основном получается при витрэктомии, экстракция ткани сетчатки от модельных животных до сих пор является распространенным методом в фундаментальных исследованиях РП14,15.

Сетчатка представляет собой прозрачную мембрану, расположенную во внутреннем слое глазной луковицы, со стекловидным телом внутри и сосудистой оболочкой, расположенной близко к внешней стороне. Сетчатка начинается от зубчатого края спереди и заканчивается у диска зрительного нерва сзади. Это начальная часть формирования видения16. Образцы сетчатки модельных животных в основном используются для ПЦР-анализа сетчатки, выявления вестерн-блоттинга, наблюдения патологической структуры тканей, иммуногистохимического окрашивания, иммунофлуоресцентного исследования, оценки плотности микрососудов, выделения и культивирования клеток и т.д.17,18. Требования к забору проб сетчатки для разных тестовых индексов различны. Отбор проб сетчатки для определения белкового фактора у модельных животных и отбор проб сетчатки для срезов с парафином являются распространенными операционными методами скрининга препаратов на RP8. Однако из-за очень тонкого и сложного строения глазного яблока модельного животного процесс удаления мешающих тканей в глазу и получения образцов сетчатки осложняется. В процессе забора проб может наблюдаться потеря ткани сетчатки, загрязнение, деградация белка и отслойка сетчатки. Эти факторы будут оказывать влияние на качество и количество экстракции белка сетчатки, а также на эффект окрашивания срезов и результаты определения экспериментальных показателей. Поэтому необходима соответствующая процедура забора образцов сетчатки.

Крайне важно упростить сложное и уловить ключевое звено сбора для того, чтобы усовершенствовать технику сбора сетчатки у модельных животных. Быстрое воздействие на сетчатку и полное удаление сетчатки, насколько это возможно, являются ключевыми этапами отбора проб сетчатки для определения белкового фактора у модельных крыс. В этом исследовании глазные яблоки извлекались непосредственно после анестезии, чтобы сэкономить время забора проб. Хитрость для обнажения сетчатки заключается в том, чтобы повернуть наглазник над трубкой объемом 1,5 мл, что было экономически выгодно и практично и могло полностью отслаить сетчатку от склеральной стенки. Эта процедура проста, быстра, экономична и способствует практике работы экспериментального персонала, поэтому ее можно завершить за 5 минут. В процессе забора образцов сетчатки для патологического исследования и специфического окрашивания клеток сохранение свежести и структурной целостности сетчатки является ключевым этапом для получения высококачественного окрашивания. Перфузия формальдегидом из левого предсердия с последующим получением сетчатки глаза – один из методов, который часто используют исследователи, но он трудоемкий, а формальдегид плохо пахнет и доставляет дискомфорт оператору. В этом исследовании ткань вокруг глазного яблока разделяется на кольцо после анестезии для поддержания его целостности. После того, как зрительный нерв был перерезан и сохранен, отделите ткани вокруг него на заднем полюсе глазного яблока и удалите глазное яблоко. Различные отделы глазного яблока были точно расположены вместе со зрительным нервом. Наконец, с опорой на содержимое глаза был сделан разрез, роговица была отрезана кольцом, хрусталик и стекловидное тело были отслалены, а также получена наглазница, соединяющая зрительный нерв (сетчатка расположена на склеральной стенке внутри наглазника). В этом процессе операция должна быть щадящей, чтобы сохранить целостность сетчатки. Процедура операции не только значительно улучшает скорость сбора материалов, но также может поддерживать полную нормальную структуру и форму глазного яблока и может быть точно локализована в различных частях глазного яблока после извлечения глазного яблока. После умелой операции операция может быть завершена за 8 минут. Используя вышеуказанные методы забора образцов сетчатки, наша исследовательская группа получила относительно идеальные результаты детекции белкового фактора, результаты окрашивания HE и результаты окрашивания TUNEL.

Несмотря на то, что существующий метод забора образцов сетчатки имеет некоторые преимущества, он все еще нуждается в совершенствовании. В процессе забора проб сетчатки для определения белкового фактора, после обнажения сетчатки, также существует риск неполного рассечения сетчатки или потери при взятии сетчатки путем сгибания пинцета из-за ограниченной точки опоры изгибающегося пинцета. Поэтому необходимо совершенствовать инструменты для диссекции сетчатки. С другой стороны, в процессе экстракции сетчатки для патологического исследования и специфического окрашивания клеток, после изоляции глазного яблока, в процессе стриппинга хрусталика и стекловидного тела, стенка глазного яблока разрушается из-за потери поддержки со стороны глаза, что легко вызвать стриппинг сетчатки. Таким образом, операция должна быть быстрой, щадящей и соответствующей силы, а оператор должен часто практиковаться. Таким образом, наши процедуры забора образцов сетчатки все еще нуждаются в совершенствовании, чтобы в большей степени способствовать исследованиям защитного эффекта и механизма традиционной медицины против РП.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Научно-исследовательским проектом Департамента высшего образования города Нинся (NYG2022029).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имиджер Amersham GE680
Персульфат аммония  Boster Biological Technology Co., LtdA8090
Аналитические весыMettler ToledoME104E Набор
для квантования белка BCA  Кен Ген Биотех. Co. LtdKGP902
расщепленная каспазаза-3 антителоКлеточная сигнализация Технология#9664
расщепленная каспаза-7 антителоКлеточная сигнализация8438
расщепленная каспаза-9 антителоКлеточная сигнализация9507
тупиковая флуориметрическая система TUNELPromegaG3250
глицин  Boster Biological Technology Co., LtdAR1200
Козий антикролик IgG H& L (HRP)АнтителаBiossbs-80295G-HRP
Сыворотка для козBiosharpBL210A
Высокая скорость  дробилкаThermo Fisher  НаучныйAG22331
Immobilon-P SQ Трансферные мембраныMerck Millipore. LtdISEQ00010
изофлуранRWD Life ScienceR510-22-10
МетанолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Считыватель микропланшетовThermo Fisher  Научный1510
МикроскопOlympusIX73
Предметное стеклоCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Methyl-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766– Духовка 100G
ShanghaiYuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Page Pre-solution (30% )Doublehelix Biology Science and Technology Co.,LtdL3202A
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26617
PBS bufferBiosharpG4202
SDS-PAGE Белковый буфер для загрузки (5& раз;)Beyotime BiotechnologyP0015
Сухое обезжиренное молокоBioFroxx1172GR500
Sprague Dawleyкрысы Медицинский университет НинсяSCXK (Ning) 2020-0001
TEMED  Boster Biological Technology Co., LtdAR1165
Набор для экстракции всего белка  Кен Ген Биотех. Co. LtdKGP2100
Транс-Блот-модульBIO-RAD1703935
базе Tris  Boster Biological Technology Co., LtdAR1162
Tweezer Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-актиноваятехнология передачи сигналов клеток#4970
# #

Ссылки

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

TUNEL
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.