Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель ишемической комы головного мозга, индуцированная модифицированной четырехсосудистой окклюзией

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67161

⸱

5 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, 2School of Medicine, Foshan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процесс индукции модели ишемической комы головного мозга с использованием модифицированного метода четырехсосудистой окклюзии.

Аннотация

Кома, вызванная ишемией головного мозга, является наиболее серьезным осложнением ишемии головного мозга. Четырехсосудистая окклюзия может создать модель ишемической комы головного мозга для исследования заболевания и разработки лекарств. Тем не менее, обычно используемый метод четырехсосудистой окклюзии в основном включает введение электрокоагуляционной ручки в двустороннее крыловидное отверстие первого шейного позвонка за шеей для электрокоагуляции позвоночных артерий. Этот процесс несет в себе риск неполной электрокоагуляции, кровотечения, повреждения ствола головного и спинного мозга. Через двадцать четыре часа после операции крысам под наркозом проводят перевязку сонной артерии перед шеей. Две операции подвергают крыс более высокому риску заражения и увеличивают экспериментальный период. В этом исследовании, во время одной хирургической процедуры, был использован передний шейный разрез для определения ключевого участка, где позвоночная артерия проникает в первый шейный позвонок. Двусторонние позвоночные артерии были прижиганы электрокаутеризацией в визуальных условиях, в то время как двусторонние общие сонные артерии были разделены для размещения свободных узлов. Когда конечности крыс начинали дергаться, двусторонние общие сонные артерии быстро перевязывались, вызывая ишемическую кому. Этот метод позволяет избежать риска инфицирования, вызванного двумя хирургическими операциями, и прост в выполнении с высоким процентом успеха, что является полезным ориентиром для соответствующих практикующих врачей.

Введение

Ишемическое повреждение головного мозга является наиболее распространенным повреждением головного мозга в клинической практике, на его долю приходится примерно 75% случаев цереброваскулярных заболеваний. Ишемия может приводить к тяжелым вторичным повреждениям головного мозга изаболеваниям1,2, а кома является наиболее тяжелым симптомом, вызванным ишемическим гипоксическим повреждением головного мозга. Это также конечный путь для многих критических состояний3. Кома является критическим и тяжелым заболеванием в клинической практике, с которым трудно справиться4. Чем дольше длится кома, тем больше потенциальная опасность. Своевременное пробуждение является основной целью в предотвращении ухудшения и прогрессирования состояния. Несмотря на то, что инъекции налоксона имеют широкий спектр клинического применения для повышения бодрствования, они все же имеют некоторые побочные эффекты. Поэтому разработка безопасных и эффективных препаратов, способствующих бодрствованию, является актуальной проблемой, требующей решения. Создание простой и удобной в эксплуатации модели ишемической комы головного мозга имеет важное значение для выяснения патогенеза ишемической комы и для разработки лекарств 6,7,8.

Целью данного исследования является представление простой и удобной для новичков модели индуцирования глобальной ишемической комы путем электрокоагуляции двусторонних позвоночных артерий (ВА) и временного лигирования двусторонних общих сонных артерий (ОСА). Предыдущий протокол включал обнажение двустороннего крыловидного отверстия первого заднего шейного позвонка во время первой операции и электрическое прижигание крыловидного отверстия для блокирования двусторонних ВА. Вторая операция была выполнена через 24 ч для индуцирования тотальной ишемической комы путем лигирования двусторонних CCA 9,10,11,12. Однако из-за невидимости существует риск неполной электрокоагуляции, кровотечения, травмы ствола мозга и спинного мозга, а также длительного экспериментального периода. Поэтому необходимо решать эти вопросы.

Здесь мы представляем усовершенствованный метод моделирования ишемической комы. Основная процедура включает в себя выполнение срединного переднего разреза шейки матки, выполнение электрической резекции двусторонних ВА в визуальных условиях и кратковременное лигирование двусторонних ОСА во время одной операции для блокирования кровоснабжения всего мозга, что приводит к торможению быстрой электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и коме. Этот метод также вызывает кратковременную непрерывную кому после реперфузии. Эта процедура проста в выполнении, удобна для новичков и снижает риск вторичного травматического инфицирования у животных, тем самым сокращая экспериментальный период.

Протокол подходит для исследования глобальной ишемической комы, вызванной остановкой сердца. Он также идеально подходит для изучения ишемической деменции, в основном потому, что область мозга гиппокампа чрезвычайно чувствительна к ишемии; Таким образом, транзиторная ишемия головного мозга может привести к повреждению или даже потере13 нейронов гиппокампа, что приводит к когнитивной дисфункции. Таким образом, протокол может служить ориентиром для практикующих врачей, изучающих ишемию головного мозга, ишемическую кому и ишемическую деменцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол эксперимента был проведен в соответствии с требованиями Комитета по использованию лабораторных животных и Комитета по уходу и использованию животных в учреждениях Университета Фошань (Регистрационный номер: 2023-643656). Для исследования были использованы самцы крыс Sprague Dawley (SD) (200 г ± 20 г, возраст 6-8 недель). Все данные исследований на животных были составлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Имплантация электродов ЭЭГ

  1. Введите 0,05 мг/кг атропина подкожно за 15 минут до анестезии для предотвращения обструкции дыхания и асфиксии, вызванной выделениями. Внутримышечное введение 20 мг/кг золетила и 5 мг/кг ксилазина для обезболивания крыс14. Используйте пинцет, чтобы зажать пальцы ног крысы, чтобы подтвердить глубокую анестезию.
  2. Удалите шерсть с головы крысы с помощью бритвы для волос. Зафиксируйте голову крысы на стереотаксическом устройстве для мозга с помощью непроникающих ушных планок. С помощью стерильных ватных тампонов трижды нанесите этанол и повидон-йод на операционное место для дезинфекции кожи.
  3. Разрежьте кожу головы крысы вдоль обезглавленного шва хирургическим лезвием. Удалите мышцу, покрывающую череп, и полностью обнажите череп. Используйте стерильные ватные палочки, чтобы остановить кровотечение на протяжении всего процесса.
  4. Высушите поверхность черепа феном с помощью шарика для промывания ушей, чтобы зубной цемент плотно прилегал к черепу. Отметьте положение установки гвоздя в виде черепа (Диаметр 1,2 мм, Длина 3 мм) черным маркером (Рисунок 1, шаг 1). Конкретными позициями являются передняя точка родничка и четыре других участка.
  5. С помощью иглы шприца объемом 10 мл вращайте и просверливайте четыре области последовательно. Вставить в череп последовательно четыре гвоздя для черепа, обеспечивая контакт с корой головного мозга (рисунок 1, шаги 2-3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные ватные тампоны для впитывания крови в случае кровотечения, чтобы предотвратить ржавление костных ногтей.
  6. Оберните серебряную проволоку электрода ЭЭГ вокруг ногтя черепа. Вживите электромиографический электрод в мышцу и зафиксируйте его швом 6-0.
  7. Смешайте базовую смолу для зубных протезов с самоустанавливающимся порошком для протеза и закрепите электрод на черепе. Используйте шарик для промывания ушей, чтобы нагнетать воздух на поверхность стоматологического цемента, чтобы ускорить отверждение.
  8. Введите 10 000 единиц пенициллина для предотвращения инфекции. Разместите каждую крысу в отдельной клетке, чтобы предотвратить взаимные разрывы и повреждение электродов. Подкожно вводили 0,2 мг/кг мелоксикама в течение трех дней подряд для облегчения послеоперационной боли. Подождите 3 дня для восстановления ран крыс и фиксации электродов (Рисунок 1, шаг 4).

2. Хирургический процесс модели ишемической комы головного мозга

  1. Через три дня повторно обезболите крыс и поместите их в лежачее положение. Используйте стерильные ватные тампоны для дезинфекции места операции с помощью трех повторных применений йода с последующим ополаскиванием/салфеткой на спирту. Сделайте скальпелем надрез длиной около 2-3 см от верхнего края грудины вдоль середины шеи (рисунок 1, шаг 5).
  2. Тупо отделите подкожную клетчатку и грудиноподъязычную мышцу, полностью обнажив трахею и мышцы longus colli с обеих сторон трахеи15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стимуляции трахеи на протяжении всей процедуры.
  3. Тупо отделите длинные мышцы colli от уровня щитовидной железы вниз, обнажив первый и второй шейные позвонки. Расширьте область шеи с помощью расширителя крысиной ткани, полностью обнажив место операции.
  4. С помощью тонких щипцов осторожно отделите видимые в шейном межпозвонковом пространстве мышцы и ткани, обнажив характерное место, где позвоночная артерия входит в первый шейный позвонок. Можно наблюдать, что позвоночная артерия проходит через первый шейный позвонок (рисунок 1, шаг 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение шприца объемом 1 мл под шею обеспечивает более чистое пространство для хирургических манипуляций.
  5. Разогрейте электрокоагуляционную ручку и введите ее в эту область на 3-5 с, чтобы убедиться, что позвоночная артерия электрокоагулирована и разорвана. Отделите мышцы и фасцию по внутреннему краю грудино-ключично-сосцевидной мышцы, обнажите и освободите двусторонние CCA и завяжите свободный узел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрокоагуляционная ручка должна быть предварительно нагрета; В противном случае он не сможет быстро свернуть позвоночную артерию, что приведет к кровотечению. Обе позвоночные артерии электрокоагулируются, а вокруг ОСА завязываются свободные узлы.
  6. Быстро затяните первый свободный узел, чтобы заблокировать кровоток в CCA, когда крысы приходят в сознание и демонстрируют подергивание конечностей, в то время как детектор ЭЭГ обнаруживает активные сигналы ЭЭГ и ЭМГ. Крысы будут сопротивляться в течение нескольких секунд, а затем постепенно терять сознание (Рисунок 1, шаг 7).
  7. После отпускания фиксации обратите внимание на то, что конечности крысы стали жесткими, рефлекс выпрямления исчезает, но дыхание сохраняется. На этом этапе электромиограмма (ЭМГ) показывает прямую линию, а ЭЭГ быстро подавляется, что указываетна то, что модель ишемии головного мозга, индуцированная 4-ВО, была успешной.
    Примечание: Угнетение дыхания возникает у некоторых крыс во время двустороннего лигирования CCA. Быстрая механическая стимуляция может восстановить спонтанное дыхание у некоторых крыс.
  8. В соответствии с «методом контрольной завязкииглы 16» свяжите ОСА иглой шприца диаметром 0,5 мм с использованием нейлоновой нити 6-0 на расстоянии около 1,5 см от разветвления ОСА, ВСА и ЭХА. Аккуратно вытащите иглу; этот второй узел впоследствии приведет к сужению сонной артерии (Рисунок 1, шаг 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лигатура, используемая при стенозе CCA, должна быть изготовлена из стабильного нейлонового материала. Капроновая нить не подвержена влиянию крови и не загустевает; в противном случае это может вызвать крайний стеноз ОСА у крыс и увеличить уровень смертности.
  9. После 30 минут ишемии развяжите первый узел, и ОСА подвергнется реперфузии, но второй узел приведет к стенозу ОСА, вызывая длительную кому (Рисунок 1, шаг 9). Закройте подкожную клетчатку рассасывающимися монофиламентными нитями, а кожу — нерассасывающимися монофиламентными швами.

3. Восстановление животных

  1. Поместите крыс на изоляционные прокладки и введите 10 000 единиц пенициллина, чтобы предотвратить заражение. Подкожно вводите 0,2 мг/кг мелоксикама в течение трех дней подряд для облегчения послеоперационной боли.
  2. После 60 минут реперфузии убедитесь, что крысы постепенно восстанавливаются.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Из-за воспаления и других стимулов, вызванных имплантацией электродов, ЭЭГ может быть нестабильной, поэтому крысам необходимо восстанавливаться в течение 3 дней. Крысы с нормальной ЭЭГ и ЭМГ через 3 дня могут быть включены в состав для подготовки модели комы. Когда крысы находились под наркозом, активность ЭЭГ и ЭМГ была немного подавлена, но протекала гладко. Существенных изменений активности ЭЭГ и ЭМГ после электрокоагуляции, блокирующей двусторонние ВА, не наблюдалось. Примерно через 30 мин препарат метаболизировался,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Четырехсосудистая окклюзия вызывает глобальное ишемическое и гипоксическое повреждение головного мозга, которое может симулировать острую кому, остановку сердца, асфиксию, шок, тяжелую аритмию и другие критические клинические состояния, вызванные ишемией головного мозга в клинической практике. Между тем, окклюзия четырех сосудов может привести к повреждению в основном гиппокампа17,18, который является основной функциональной обла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82173781 и 82373835), Исследовательским проектом для постдокторантов (BKS212055), Проектом научно-технических инноваций Фошаньского научно-технического бюро (2320001007331), Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2019A1515010806), Ключевыми полевыми проектами (интеллектуальное производство) общих университетов провинции Гуандун (2020ZDZX2057) и Научно-исследовательскими проектами (характерные инновации) общего Университеты провинции Гуандун (2019KTSCX195).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16-канальная микрофибровая фотоэлектродная решеткаJiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd2605
4-0 Хирургический шовNantong Holycon Medical Devices Co., Ltd.B-104
6-0 Хирургический шовный материалNingbo MEDICAL Needle Co., Ltd.JM1216-742417
ЭЭГ-электродKedou Brain machine Technology Co., LtdKD-EEGEMG
Электрокоагуляционная ручкаCONPUVON Company465
Lunion Stage Автоматическая система постановки снаShanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.1336
Миниатюрная ручная дрель для черепаRayward Life Technology Co., Ltd87001
Пенициллин натрияChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
SD крысыSPF ( Пекин ) Biotechnology Co., Ltd.180-220г
Гвоздь для черепаGLOBALEBIO,LTD/
Стереотаксический инструментRayward Life Technology Co., Ltd68801
Zoletil 50Vic Trading (Shanghai) Co., LTDBN 88SHA

Ссылки

  1. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  2. Rong, M., et al. A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion. J Vis Exp. (207), e67060(2024).
  3. Hoesch, R. E., Koenig, M. A., Geocadin, R. G. Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies. Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).
  4. You, W., et al. Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury. Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).
  5. He, F., Jiang, Y., Li, L. The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails. Medicine (United States). 95 (37), e4729(2016).
  6. Shukla, D. Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine. Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).
  7. Cossu, G. Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery. Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).
  8. Li, J., Cheng, Q., Liu, F. K., Huang, Z., Feng, S. S. Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature. Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).
  9. Pulsinelli, W. A., Levy, D. E., Duffy, T. E. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model. Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).
  10. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).
  11. Plaschke, K., et al. Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure. J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).
  12. Sugio, K., Horigome, N., Sakaguchi, T., Goto, M. A model of bilateral hemispheric ischemia- modified four-vessel occlusion in rats: To the editor. Stroke. 19 (7), 922(1988).
  13. Sadelli, K., et al. Global cerebral ischemia in rats leads to amnesia due to selective neuronal death followed by astroglial scar formation in the CA1 layer. Neurobiol Learn Mem. 141, 168-178 (2017).
  14. Song, B. W., et al. 1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174(2015).
  15. Sun, W., et al. A modified four vessel occlusion model of global cerebral ischemia in rats. J Neurosci Methods. 352, 109090(2021).
  16. Xiaobing, J., et al. Modifying the four vessel occlusion to establish ischemic brain injury coma model in rats. Sichuan Med J. 29 (4), 384-386 (2008).
  17. Wang, W., et al. Levodopa improves cognitive function and the deficits of structural synaptic plasticity in hippocampus induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Front Neurosci. 14, 586321(2020).
  18. Zhan, L., Lu, X., Xu, W., Sun, W., Xu, E. Inhibition of MLKL-dependent necroptosis via downregulating interleukin-1R1 contributes to neuroprotection of hypoxic preconditioning in transient global cerebral ischemic rats. J Neuroinflammation. 18 (1), 97(2021).
  19. Konaka, K., Miyashita, K., Ishibashi-Ueda, H., Naritomi, H. Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries. Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).
  20. Ferreira, E. D. F., Romanini, C. V., Mori, M. A., de Oliveira, R. M. W., Milani, H. Middle-aged, but not young, rats develop cognitive impairment and cortical neurodegeneration following the four-vessel occlusion/internal carotid artery model of chronic cerebral hypoperfusion. Eur J Neurosci. 34 (7), 1131-1140 (2011).
  21. Ma, B., et al. Protective effects of extract of Coeloglossum viride var. bracteatum on ischemia-induced neuronal death and cognitive impairment in rats. Behav Pharmacol. 19 (4), 325-333 (2008).
  22. Song, Y. Y., Chen, Y. H., Li, J. F., Sun, W. A review of animal models of vascular dementia. Chin J Comp Med. 33 (12), 75-85 (2023).
  23. Liu, B., et al. Autophagy activation aggravates neuronal injury in the hippocampus of vascular dementia rats. Neural Regen Res. 9 (13), 1288-1296 (2014).
  24. Li, J., Takeda, Y., Hirakawa, M. Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex. J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).
  25. Rishitha, N., Muthuraman, A. Ameliorative potential of thymoquinone in four vessel occlusion induced vascular dementia in rats. Alzheimer Dement. 19 (S13), e71053(2023).
  26. Oruc, S., et al. The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats. Life Sci. 154, 79-86 (2016).
  27. Lu, D., et al. A modified method to reduce variable outcomes in a rat model of four-vessel arterial occlusion. Neurol Res. 38 (12), 1102-1110 (2016).
  28. Idt-Kastner, R. S., Paschen, W., Ophoff, B. G., Hossmann, K. A. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats. Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).
  29. McBean, D. E., Kelly, P. A. T. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).
  30. Todd, N. V., Picozzi, P., Alan Crockard, H., Russell, A. R. R. Reperfusion after cerebral ischemia: Influence of duration of ischemia. Stroke. 17 (3), 460-466 (1986).
  31. Toda, S., et al. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia - Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature. Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).
  32. Ma, R., Lu, D., Wang, J., Xie, Q., Guo, J. Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol. Biomed Pharmacother. 164, 114668(2023).
  33. Ji, X. Y., et al. Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats. Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).
  34. Martínez-Alonso, E., et al. Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia. Int J Mol Sci. 22 (19), 10327(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

окклюзия позвоночных артерийлигирование сонных артерийметод электрокоагуляцииЭЭГ-мониторингмодель на крысахглобальная ишемия головного мозганеврологическое восстановление
Модель ишемической комы головного мозга, индуцированная модифицированной четырехсосудистой окклюзией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.