Методическая статья

Стандартизация нового полуавтоматического программного обеспечения для измерения наростов нейритов

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализы роста нейритов дают количественную оценку регенеративных нейронных процессов. Преимущество этого полуавтоматического программного обеспечения заключается в том, что оно сегментирует тела клеток и нейриты отдельно, создавая маску, и измеряет различные параметры, такие как длина нейритов, количество точек ветвления, площадь кластера «клетка-тело» и количество кластеров клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективные методы визуализации в реальном времени имеют решающее значение для оценки морфологии нейронов с целью измерения роста нейритов в режиме реального времени. Правильное измерение роста нейритов было давней проблемой в области исследований в области нейробиологии на протяжении многих лет. Этот параметр служит краеугольным камнем в многочисленных экспериментальных установках in vitro , начиная от диссоциированных культур и органотипических культур и заканчивая клеточными линиями. Количественно оценивая длину нейрита, можно определить, сработало ли конкретное лечение или усилилась регенерация аксонов в различных экспериментальных группах. Цель данного исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать надежность и точность программного обеспечения для анализа разрастания нейритов Incucyte Neurotrack. Это полуавтоматическое программное обеспечение доступно в системе покадровой микроскопии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с широко используемыми методологиями при количественной оценке длины нейритов в фазово-контрастных изображениях. Алгоритм маскирует и количественно оценивает несколько параметров на каждом изображении и возвращает метрики нейронных клеток, включая длину нейритов, точки ветвления, кластеры клетка-тело и площади кластера клеток-тел. Во-первых, мы проверили надежность и точность программного обеспечения, сопоставив его значения с данными ручного плагина NeuronJ из Фиджи. Во-вторых, мы использовали алгоритм, который способен работать как на фазово-контрастных изображениях, так и на иммуноцитохимических изображениях. Используя специфические нейрональные маркеры, мы подтвердили возможность проведения анализа роста нейритов на сенсорных нейронах in vitro на основе флуоресценции. Кроме того, это программное обеспечение может измерять длину нейритов при различных условиях затравки, начиная от отдельных клеток и заканчивая сложными нейронными сетями. В заключение следует отметить, что программное обеспечение предоставляет инновационную и экономичную по времени платформу для анализа роста нейритов, прокладывая путь к более быстрому и надежному количественному определению.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В седалищных нервах можно измерить регенерацию аксонов1. Кроме того, исследования in vitro показали возможность мониторинга вырастания аксонов 2,3 для понимания его различных фаз, от прорастания аксонов до аксональной дегенерации, как в здоровых, так и в поврежденных нейронах. Отслеживая эти процессы, можно измерить такие параметры, как аксональная полярность, инициация, стабильность и ветвление. Последний параметр имеет решающее значение для понимания нейропатического восприятия боли 4,5,6. Аналогичным образом, аксональная дегенерация может контролироваться in vivo7 или in vitro 8,9. Во время роста нейритов актин и цитоскелетные сети микротрубочек стабилизируются или изменяются в соответствии с потребностямиклетки. Актиновый цитоскелет реорганизуется, что позволяет формировать конус роста аксона, а микротрубочки перестраиваются в пучки для стабилизации растущего нейрита11. Для изучения нейритного роста центральных и периферических нейронов in vitro количественно определены три общих параметра: общая длина аксона, максимальное расстояние и точки ветвления. Эти параметры используются для изучения реакции нейронов на лечение (т.е. нейротрофины, соединения, ингибиторы, ретиноевая кислота, миРНК, шРНК) или у генетически модифицированных животных 12,13,14. Чтобы оценить, имеют ли нейроны более удлиненные нейриты и/или большее разветвление, эти три параметра позволяют нам оценить морфологию нейрона. Измерение длины нейрита является наиболее важным параметром в нескольких экспериментальных установках in vitro. Из ганглиев дорсальных корней выполняют в основном два типа культур: диссоциированную культуру in vitro или органотипическую культуру целых эксплантов DRG. В любом случае, длина нейрита является золотым параметром для оценки результата эксперимента. В линии моторных нейроноподобных клеток (NSC-34) вырастание и ветвление аксонов измеряются после дифференцировки, индуцированной ретиноевой кислотой15,16. Фактически, измеряя вырост нейритов, можно определить, сработало ли конкретное лечение17, скорость роста18 или способность к регенерации после процедуры травмы19.

Вопрос о том, как правильно оценить рост нейритов, на протяжении многих лет представлял собой значительное количество проблем в области исследований. Тем не менее, стандартизация измерений длины нейритов не существует. Одними из наиболее часто используемых методов для культивирования клеток in vitro являются, например, ручной плагин NeuronJ на Fiji18,20 или MetaMorph21,23 и полуавтоматический Neurolucida23,24. Помимо ручных методологий, существуют и автоматические методы, такие как плагин NeuriteTracer на Fiji25, программное обеспечение HCA Vision26,27 или WIS-NeuroMath 2,28. Другие, менее точные методологии основаны на измерении общего размера нейронов. Эти методы включают измерение векторного расстояния от тела клетки до кончика самого длинного аксона29 или анализШолля 30. Тем не менее, эти методы измерения подходят для культур с очень низкой плотностью или отдельных нейронов. Более того, все эти методологии в основном используются на окрашенных нейронах или нейронах, экспрессирующих генетически кодируемые флуорофоры (например, GFP, Venus, mCherry). Тип нейрона и плотность клеточной культуры сильно влияют на выбор методики измерения. Например, ручная сегментация нейронов с очень запутанной и сложной морфологией, таких как нейроны DRG, может легко стать невыполнимой задачей. Если извилистые нейроны уже представляют собой проблему для сегментации, то нейронные сети полностью недосягаемы для ручных подходов из-за их очень сложной организации.

С одной стороны, ручная сегментация очень точна, потому что она выполняется человеческими глазами и интеллектом; С другой стороны, это действительно отнимает много времени. Основным недостатком являются повышенные временные затраты, требуемые ручными методами. По этой причине для анализа приобретается всего несколько нейронов, что делает его менее точным и дорогостоящим с точки зрения времени. Автоматические или полуавтоматические подходы, с другой стороны, частично сокращают временные затраты. Однако у них есть и некоторые недостатки. Автоматические методы необходимо обучить, чтобы они работали должным образом, и если программное обеспечение недостаточно интерактивно с пользователем, сегментация может быть ошибочной.

Помимо измерения роста нейритов, количество точек ветвления также является ценной информацией. При ручной сегментации можно рассчитать количество точек ответвления, в то время как с векторным расстоянием это невозможно. При автоматических методах обычно указывается количество точек ветвления, тогда как при анализе Шолля его приходится вычислять по математической формуле.

В данной статье мы стремимся описать функциональность и эффективность этого полуавтоматического программного обеспечения при измерении общей длины аксонов и других параметров. Аппарат позволяет автоматически получать изображения в определенные моменты времени или проводить долгосрочные исследования (дни, недели, месяцы), сохраняя физиологическую среду для живых клеток. Измерение роста нейритов с помощью фазово-контрастной покадровой визуализации позволяет осуществлять непрерывный мониторинг кинетики и роста нейритов. Кроме того, можно также контролировать гибель клеток путем добавления в среду специфических красителей, нацеленных на мертвые клетки 31,32,33. Несмотря на то, что программное обеспечение было выпущено в 2012 году, мы первыми стандартизировали эту методологию воспроизводимым и непредвзятым образом для точной количественной оценки роста нейритов. Однако важно отметить, что программное обеспечение не входит в комплект поставки устройства. Несмотря на эти дополнительные расходы, его использование дает значительные преимущества при измерении общей длины аксонов и других параметров, тем самым способствуя исследованиям в области нейронауки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сканирование сосуда на машине

ПРИМЕЧАНИЕ: Детектирование осуществляется с помощью встроенной камеры Basler Ace 1920-155 мкм.

  1. Откройте программу, нажав «Подключиться к устройству » и выбрав «Расписание» - «Для приобретения». Затем нажмите знак + .
  2. Укажите, будет ли судно сканироваться повторно или только 1 раз, выбрав опцию «Сканировать по расписанию » или «Сканировать один раз сейчас» соответственно.
  3. Выберите «Создать », чтобы создать совершенно новое судно для сканирования. Если новое судно не добавлено, создайте новое сканирование, используя один из вариантов, описанных ниже.
    1. Выберите «Копировать текущий», чтобы создать новое судно путем копирования судна из текущего расписания. Выберите «Копировать предыдущее», чтобы создать новое судно путем копирования ранее отсканированного судна.
    2. Выберите «Добавить сканирование », чтобы восстановить ранее отсканированный сосуд для дополнительного сканирования.
  4. Выберите тип сканирования в зависимости от анализа и области применения. Для анализа выберите Стандартный.
  5. Укажите параметры сканирования. Выберите один из вариантов «Ячейка за ячейкой»: «Нет», «Адгезивная ячейка за ячейкой» или «Неадгезивная ячейка за ячейкой» и укажите каналы изображения в зависимости от используемых флуоресцентных молекул. Выберите параметр «Нет» для культивирования сенсорных нейронов у взрослых и эмбрионов. Для строк ячеек выберите параметры Нет или Прикреплять ячейки по ячейкам .
  6. Выберите объектив микроскопа (4x, 10x, 20x). Приобретайте с большим увеличением (20x) в первичных культурах, в то время как в клеточных линиях достаточно 10x.
  7. Выберите тип сосуда для сканирования из предложенных вариантов. Укажите местоположение судна в ящике, выбрав его положение на виртуальной карте ящика.
  8. Укажите шаблон сканирования для получения изображения, выбрав лунки для сканирования. Выберите нужное количество изображений в лунке. Появится оценка продолжительности сканирования.
  9. Предоставьте информацию о судне, введя название, и укажите табличку карты, нажав на знак + .
  10. Нажмите Далее. Выберите Тип анализа (Analysis Type) и нажмите кнопку Далее (Next). Появится экран сводки выбранных параметров. Если все верно, нажмите «Сканировать сейчас», и сканирование начнется.

2. Настройка для анализа фазово-контрастных изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ Neurotrack может быть выполнен только на изображениях, ранее полученных аппаратом.

  1. Выберите отсканированный сосуд для анализа. Выберите «Анализ запуска». Выберите Создать новое определение анализа.
  2. Выберите Neurotrack. Выберите «Каналы изображения». Выберите репрезентативный набор изображений для выполнения анализа. Выберите все изображения для каждой скважины для обучения алгоритма.
  3. Уточните параметры определения анализа, настроив следующие параметры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию нейриты сегментированы пурпурным цветом, а тела клеток — желтым. Есть возможность изменить цвета по своему усмотрению.
    1. Для сегментации кластера «клетка-тело» отрегулируйте следующее, как описано ниже.
      1. Режим сегментации: сегментация изображений выполняется для того, чтобы отличить тела клеток от фона и невритов. Выберите между Яркостью и Текстурой. Для первичных культур и клеточных линий выберите режим Яркость.
      2. Настройка сегментации: используйте ползунок, чтобы настроить чувствительность сегментации в сторону большего количества фона или большего количества ячеек. Он варьируется от 0 (фон) до 2 (ячейки). Он увеличивает или уменьшает размер желтой маски. Переместите ползунок в сторону 0 (Фон), чтобы размер желтой маски постепенно уменьшался, оставляя место для пурпурной маски. Обратное происходит, если ползунок перемещается в сторону 2 (Cells).
    2. Для очистки настройте следующее, как описано ниже.
      1. Заполнение отверстий (мкм2): Отрегулируйте это значение, чтобы удалить любые отверстия в маске тела ячейки, размер которых меньше области, указанной пользователем.
      2. Настройка размера (пикселей): Увеличьте (если положительно) или уменьшите (если отрицательно) желтую маску на указанное количество пикселей. Он колеблется от -10 до +10. Отрегулируйте этот параметр, чтобы добавить или удалить желтую сегментацию на высококонтрастных объектах, таких как мертвые клетки и клеточный мусор.
      3. Минимальная ширина ячейки (мкм): Выберите значение, определяющее размер, при котором тела клеток будут считаться нейритами.
    3. Для кластерных фильтров типа «клетка-тело» отрегулируйте следующее, как описано ниже.
      1. Площадь (мкм2): Установите минимальное и максимальное значение площади тела клетки. Значения выше и ниже установленных значений не будут рассматриваться как тела клеток.
    4. Для параметров нейритов отрегулируйте следующее, как описано ниже.
      1. Фильтрация: Уменьшает маскировку дефектов мелких сосудов и мусора. Выбирайте между вариантами «Нет», «Лучше» и «Лучший». Выбирайте None только для очень чистых культур и сосудов. Выбирайте Better для более быстрой обработки за счет потери обнаружения очень мелких нейритов. Он может быть достаточным для клеток с толстыми или высококонтрастными невритами; Кроме того, он может быть полезен для судов с большим количеством дефектов или мусора. Выберите «Лучший» для более длительного времени обработки, но это самая чувствительная настройка фильтра, обеспечивающая обнаружение очень мелких нейритов.
      2. Чувствительность нейрита: используется для регулировки чувствительности обнаружения. Повышение чувствительности для обнаружения более мелких нейритов. Он колеблется от 0.25 (Меньше) до 0.75 (Больше).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Он увеличивает или уменьшает чувствительность программного обеспечения к распознаванию нейритов. Если ползунок сдвинуть в сторону 0,25 (Меньше), то программное обеспечение будет строже распознавать нейриты. Вместо этого, если ползунок сдвинут в сторону 0,75 (Больше), программное обеспечение будет менее строгим в этом детектировании, и, следовательно, большее количество дефектов (т. е. клеточный мусор, грязь) будет считаться нейритами.
      3. Ширина нейрита (мкм): используйте его для настройки обнаружения в соответствии с размером нейронов. Это может быть 1, 2 или 4. При его увеличении более тонкие нейриты не будут учитываться. Установите значение 1 для первичных культур сенсорных нейронов взрослого человека и 2 для клеточных линий и культур эмбриональных сенсорных нейронов.
  4. Нажмите кнопку Предварительный просмотр текущего , чтобы визуализировать сегментированное изображение. Для каждого изображения будут предоставлены следующие измерения: длина нейрита (мм/мм2), точки ветвей нейрита (на мм2), кластеры клетка-тело (на мм2) и площадь кластера клетка-тело (мм2/мм2).
  5. Повторите шаги 2.3 и 2.4 для всех выбранных изображений. Нажмите Далее.
  6. Выберите Время сканирования и колодец для анализа. Назначьте имя определения и, при необходимости, примечания к анализу. Нажмите Далее > Готово.

3. Настройка для иммуноцитохимического анализа (ИКХ) изображений

  1. Выполните те же действия, что и в версиях 2.1 и 2.4. Выберите каналы изображения для нейритов и ядер. Выберите Набор изображений; выберите Все изображения для каждой скважины, чтобы обучить алгоритм.
  2. Уточните параметры определения анализа, настроив следующие параметры, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию нейриты сегментированы синим цветом, в то время как тела клеток — фиолетовым. Тем не менее, цвета могут быть изменены по желанию.
    1. Сегментация кластера «клетка-тело»: используйте эту команду для сегментации изображения на интересующие объекты. Оцените яркость фона в каждом пикселе изображения. После того, как фон будет найден, выполните один из следующих вариантов.
      1. Без вычитания фона: используйте это для сегментации без изменения исходного изображения. Выберите между адаптивным или фиксированным порогом. Адаптивный: фон используется для поиска объектов, но не вычитается явно; с помощью этой опции можно установить корректировку порога (GCU). Fixed Threshold: на исходном изображении обнаруживаются объекты, яркость которых превышает этот порог; с помощью этой опции можно установить порог (GCU).
      2. Вычитание фона: Используйте эту опцию для вычитания фона из изображения с помощью преобразования Цилиндра, а затем примените к нему пороговое значение. С помощью этой опции установите Радиус и Порог. Радиус: используется диск этого радиуса; Диск должен быть достаточно большим, чтобы он не помещался полностью внутри какого-либо объекта на изображении. Порог: объекты, которые ярче этого порога, обнаруживаются на изображении, вычитаемом из фона.
    2. Очистка: Используйте для этого следующую опцию.
      1. Заполнение отверстий (мкм2): Используйте это для удаления любых отверстий в маске тела ячейки, которые меньше указанной области.
      2. Настройка размера (пикселей): Используйте это для увеличения (если положительного) или уменьшения (если отрицательного) фиолетовой маски на указанное количество пикселей. Диапазон составляет от -10 до +10. Он добавляет или удаляет фиолетовый цвет на высококонтрастных объектах, таких как мертвые клетки и клеточный мусор.
      3. Минимальная ширина ячейки (мкм): Используйте это для определения размера, при котором клеточные тела будут считаться нейритами.
    3. Кластерные фильтры клеточного тела: Используйте следующий параметр для применения фильтров.
      1. Площадь (мкм2): Установите минимальное и максимальное значение площади тела клетки. Значения выше и ниже установленных значений не будут рассматриваться как тела клеток.
    4. Параметры нейрита: Используйте следующую опцию для их установки.
      1. Грубая чувствительность нейритов: используйте эту функцию для регулировки яркости нейритов. Чувствительность следует повысить, если интенсивность флуоресценции невритов низкая. Оно варьируется от 0 (Меньше) до 10 (Больше). Это увеличивает или уменьшает чувствительность программного обеспечения к распознаванию менее ярких нейритов. Оптимальные значения колеблются от 7 до 10; Обратите внимание, что если оно установлено на 10, то весьма вероятно, что при измерении нейрита будет учитываться и фон.
      2. Тонкая чувствительность нейрита: используйте эту функцию для регулировки чувствительности обнаружения. Чувствительность должна быть увеличена для обнаружения более мелких нейритов. Он колеблется от 0.25 (Меньше) до 0.75 (Больше). Он увеличивает или уменьшает чувствительность программного обеспечения к распознаванию мелких и менее ярких нейритов. Если ползунок сдвинут в сторону 0,25 (меньше), программа не будет учитывать слабые нейриты. Вместо этого, если ползунок сдвинут в сторону 0,75 (Больше), программа обнаружит также очень слабые (почти фоновые) нейриты.
      3. Ширина нейрита (μм): используйте это для настройки обнаружения в соответствии с размером нейронов. Это может быть 1, 2 или 4. При его увеличении более тонкие нейриты не будут учитываться. Установите его на 1 для первичных культур взрослых сенсорных нейронов, на 2 для клеточных линий и культур эмбриональных сенсорных нейронов.

4. Экспорт данных

  1. Откройте анализ. Нажмите на «Метрики графика».
  2. Выберите метрику, временные точки и интересующие вас скважины.
  3. Выберите опцию группировки между Все, Нет, Столбцы, Строки и Репликации карты пластин.
  4. Нажмите на кнопку «Экспорт данных » и выберите папку назначения и, при необходимости, другие параметры. Будет создан файл .txt.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина предоставит одно среднее значение выбранной метрики для каждой скважины. Во время анализа требуется ручное аннотирование для получения значений одного изображения.

5. Экспорт изображений

  1. Откройте сосуд. Нажмите « Экспортировать изображения и фильмы».
  2. Выберите тип экспорта изображений.
    1. Выберите «Как отображается », чтобы экспортировать изображения как отображаемые. Нажмите «Далее» и выберите интересующие вас изображения для экспорта. Нажмите Далее.
      1. Выберите тип последовательности между одним фильмом или серией изображений и временными точками интереса. Нажмите Далее.
      2. При необходимости настройте параметры экспорта и нажмите «Далее». Задайте выходную папку, формат файла и имя файла, затем нажмите «Экспорт».
    2. Выберите «Как сохранено », чтобы экспортировать изображения в формате RAW. Выберите тип изображения.
      1. Выберите интересующие вас временные точки и колодцы. Нажмите Далее. Задайте выходную папку, формат файла и имя файла, затем нажмите «Экспорт».
  3. Экспорт изображений с помощью масок сегментации
    1. Откройте анализ. Нажмите на иконку слоев изображения. Выберите нужные каналы масок (фазы нейрита и фазы кластер клетка-тело). Выполните шаг 5.2.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Алгоритм измерения нароста нейритов способен обнаруживать нейриты как в нейронных сетях, так и в отдельных нейронах. Он создает желтую маску, которая сегментирует объекты с высокой контрастностью, такие как тела клеток, клеточный мусор, мертвые клетки, эксплантации тканей и тени. Кроме того, пурпурная маска появляется на нейритах различной толщины. Значения длины нейрита приведены в мм/мм2, что указывает на то, что длина аксона была разделена на площадь изображения, которая равна 0,282739мм2 и постоянна для каждого условия сканирования. Следовательно, чтобы получить чистые значения длины нейрита в мм, числа, предоставленные программным обеспечением, необходимо умножить на площадь изображения.

Полуавтоматический и ручной метод
Используемое программное обеспечение представляет собой полуавтоматическую методологию измерения общей длины аксона. Чтобы оценить точность работы программного обеспечения, мы провели измерения на тех же нейронах ручным методом с помощью плагина NeuronJ. Как показано на рисунке 1, маска сегментации на нейронах очень похожа между двумя методами (рисунок 1A).

Кроме того, мы провели статистический анализ полученных значений для изучения их корреляции. Корреляционный анализ Спирмена показал высокий коэффициент r 0,8526, что является убедительным доказательством точности алгоритма (рис. 1B). Автоматическое измерение требует высоких стандартов качества культуры, основанных на ее чистоте, плотности и чистоте. Результаты, полученные с помощью полуавтоматической сегментации, воспроизводимы и не зависят от индивидуального суждения. Непредвзятая воспроизводимость является проблемой для ручных методологий.

Иногда полуавтоматические ошибки сегментации могут возникать по разным причинам. На фазово-контрастных изображениях грязь в культуре может быть обнаружена как нейриты с помощью полуавтоматической сегментации. Более того, присутствие разных типов клеток может нарушить процесс сегментации. При ручной сегментации таких проблем не возникает, потому что ее выполняют человеческие глаза. Тем не менее, если такие проблемы возникают, их можно преодолеть с помощью иммуноцитохимических изображений в качестве контроля.

Сегментация нейритов
Для первичных культур взрослых нейронов DRG оптимальной отправной точкой для надежного фазового анализа является равномерное расположение нейронов в лунке и чистая культура. Если во время посева происходят ошибки и клетки концентрируются в одном месте, как показано на рисунке 2A-B, значения будут скорее оценочными, чем близким отражением реальности. В таких ситуациях желтая маска будет покрывать большую часть нейритов между ячейками (рис. 2A-B), что приведет к потере длины нейритов. Более того, программное обеспечение будет значительно смещено в распознавании нейритов, и весьма вероятно, что пурпурная маска появится на объектах, которые не являются нейритами (рисунок 2D). На оптимальном изображении должно быть до 15 нейронов при 20-кратном увеличении.

Когда нейроны правильно покрыты и культура чистая, как показано на рисунке 3A-B, рекомендуется отрегулировать ползунок сегментации по направлению к фону (0,5 - 0,7; Рисунок 3В). Это помогает уменьшить желтый компонент, который будет появляться на высококонтрастных объектах на изображении, например, точки ветвления, которые должны быть пурпурного цвета. Более того, если нейриты выделены жирным шрифтом, чувствительность нейритов в диапазоне от 0,4 до 0,5 должна быть достаточной для покрытия большинства из них (рис. 3C-D).

Еще одна распространенная ситуация, которая может возникнуть, — это грязная культура с большим количеством клеточного мусора и мертвых клеток, как показано на рисунке 4A-B. В таких условиях возникает множество высококонтрастных объектов. Поэтому желательно увеличить размер желтой маски, подстроив ползунок сегментации в сторону ячейки или увеличив параметр настройки размера (+1, +2 и так далее); Рисунок 4С). Тем не менее, было бы также полезно немного снизить чувствительность нейритов, чтобы предотвратить ошибочную идентификацию программным обеспечением как нейритов объектов, которые не являются нейритами как таковыми. (Рисунок 4C-D).

Иногда нейриты могут казаться очень тонкими и бледными, как показано на рисунке 5A-B, что создает проблемы для программного обеспечения при их точной сегментации (рисунок 5D). В этом случае целесообразно повысить чувствительность нейритов не менее чем до 0,6 (рисунок 5С). Однако следует помнить, что чем выше чувствительность, тем больше вероятность того, что программное обеспечение будет неправильно помечать объекты, которые не являются нейритами как таковыми (рисунок 5D). Можно принять некоторые меры предосторожности, чтобы предотвратить чрезмерное увеличение смещения чувствительности, например, отрегулировав ползунок сегментации в сторону ячеек. Однако, если нейриты слишком тонкие, чтобы их можно было обнаружить с помощью программного обеспечения, значения длины нейритов будут смещены в любом случае.

В случае иммуноцитохимических снимков основная проблема лежит на заднем плане. Помимо условий посева, к которым применяются вышеупомянутые правила, основным источником смещения является сама флуоресценция. Программное обеспечение эффективно распознает очень яркие нейриты, в то время как более тонкие и менее интенсивные нейриты остаются позади (рис. 6A-B). Чтобы предотвратить потерю длины нейрита, тонкую чувствительность нейрита можно увеличить до 0,75 (рис. 6C). Тем не менее, настоятельно рекомендуется снизить грубую чувствительность нейритов по крайней мере до 8-9, чтобы предотвратить чрезмерное смещение обнаружения, рассматривая нейриты на заднем плане (рис. 6C-D). Если последний не уменьшить, то весь фон будет сегментирован, как показано на рисунке 7.

Распространенной проблемой при получении флуоресценции является рассеяние света. Часто на иммуноцитохимических изображениях на изображении присутствуют вспышки, которые существенно влияют на качество и точность анализа (рисунок 8A-B). В такой ситуации мало что можно сделать для улучшения анализа, и значения будут носить скорее оценочный характер. Рассеяние света препятствует распознаванию нейритов, так что будут обнаружены только очень яркие нейриты (рис. 8C-D). Еще одной проблемой иммуноцитохимических изображений является качество окрашивания как такового. Часто из-за человеческих ошибок аксоны могут быть нарушены (рисунок 9А), а тела клеток могут быть оторваны во время промывки (рисунок 9В). Эти ошибки представляют собой критическую проблему, поскольку значения длины нейритов теряют точность и аккуратность. Следовательно, интерпретация биологических данных изменяется, что приводит к неправильным выводам.

Для эмбриональных культур ситуация иная. В этом типе культуры преобладает наличие глиальных клеток. Следовательно, количество ошибок значительно увеличивается, поскольку программное обеспечение также обнаруживает слизистую оболочку глиальных клеток (рис. 10A-B). Чтобы свести к минимуму эту проблему, ползунок сегментации следует переместить в сторону ячеек, обычно около значений 1,7-2 (рис. 10C-D). Такой подход гарантирует, что большая часть глиальных клеток покрыта желтой маской и, таким образом, не учитывается при измерении длины нейритов. Еще один полезный совет заключается в том, чтобы держать ширину нейритов равной 2, так как эмбриональные нейроны в культуре обычно демонстрируют биполярную или униполярную форму с толстыми нейритами (рис. 10C-D). Эта мера предосторожности отфильтровывает большую часть слизистой оболочки глиальных клеток, которые обычно очень тонкие. Наконец, будьте осторожны, чтобы не увеличивать чувствительность нейритов слишком сильно; В противном случае то, что было отфильтровано параметром ширины нейрита, будет снова включено в измерение длины нейрита.

В случае эмбриональных культур, где преобладает компонент глиальных клеток, иммуноцитохимия может быть лучшим вариантом. При специфическом окрашивании нейронов решается проблема сегментации глии, так как глия не будет окрашиваться, что делает анализ намного проще и точнее (рис. 11).

Наконец, программное обеспечение также может быть использовано для оценки программы дифференцировки клеточных линий и/или ИПСК для оценки состояния их роста. Таким образом, применение схожих параметров и мер предосторожности может быть использовано для разных целей.

Что касается процесса дифференцировки, то была доказана надежность программного обеспечения в клеточной линии NSC-34 (гибридная клеточная линия, состоящая из клеток нейробластомы мыши и мотонейронов, полученных из спинного мозга мышиных эмбрионов) в процессе созревания в мотонейроноподобные клетки. Что касается первичных культур DRG, то оптимальной отправной точкой для хорошего анализа является равномерный посев клеток. За недифференцированными и дифференцированными клетками после обработки ретиноевой кислотой можно наблюдать с помощью приобретений в течение всего периода культивирования или, как показано на рисунке 12, в последний момент времени.

Действительно, помимо длины нейрита, алгоритм также предоставляет параметр точки ветвления. Однако важно отметить, что параметр точки ветвления не представляет точное количество точек ветвления; Скорее, он указывает на плотность ветвления на изображении, выраженную в мм/мм2. На это измерение существенное влияние оказывают остатки в культуре и концентрация семян. Поэтому плотность нейронов на изображении и чистота культуры являются решающими факторами для получения достоверных значений. Если культура содержит много клеточного мусора, не отфильтрованного желтой маской, они будут включены в длину нейрита, а также в измерение точки ветвления.

Следовательно, рекомендуется нормализовать эти значения для количества клеток, так как количество нейронов на изображении влияет на длину нейритов и измерения точек ветвления.

Сегментация тел клеток
Среди всех параметров, предоставляемых системой, выделяют кластер клетка-тело и площадь кластера клетка-тело. Однако эти два параметра ненадежны для использования в качестве значений для подсчета ячеек. Как показано на рисунке 4, программное обеспечение сегментирует высококонтрастные объекты в желтой маске, включая тени, вызванные средним движением в скважине. Кроме того, он также сегментирует мертвые клетки и клеточный мусор (Рисунок 4). Для получения достоверного подсчета клеток растущих нейронов можно использовать ручной метод, такой как инструмент Cell Counter на Фиджи (рис. 13).

Сводка предлагаемых параметров анализа, отсортированных по типу культуры, представлена в таблице 1 для фазовых изображений и в таблице 2 для иммуноцитохимических изображений. Кроме того, в таблице 3 приведена сводка предложенных параметров анализа для решения конкретных задач.

figure-results-1
Рисунок 1: Корреляционный анализ между ручной и полуавтоматической сегментацией нейритов. (A) Слева репрезентативное фазовое изображение нейрона, сегментированного с помощью плагина NeuronJ на Фиджи. Справа репрезентативное фазовое изображение нейрона сегментировано с помощью полуавтоматического программного обеспечения. (Б) Простой метод линейной регрессии на 20 нейронах был проанализирован как ручными, так и полуавтоматическими методами. Коэффициент корреляции Спирмена r = 0,8526, p**** < 0,0001. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Ошибка посева в культуре сенсорных нейронов взрослого человека. (A) Репрезентативное фазовое изображение ошибки засева. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Желтая маска сегментирует клеточные тела, пурпурная маска сегментирует нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Верхняя панель: увеличение ошибки сегментации тела клетки (желтая маска) из-за кластеризации тел клеток. Нижняя панель: увеличение на погрешность сегментации нейритов (пурпурная маска) из-за клеточного мусора. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Идеальная культура сенсорных нейронов взрослого человека для анализа роста нейритов. (A) Репрезентативное фазовое изображение идеальных условий засева для анализа роста нейритов. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Желтая маска сегментирует клеточные тела, пурпурная маска сегментирует нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Увеличение сегментации тела клетки (желтая маска) и сегментации нейритов (пурпурная маска). Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Возмущающие элементы в анализе роста нейритов в культуре взрослых сенсорных нейронов. (A) Репрезентативное фазовое изображение клеточного мусора и теней из-за движений среды. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Желтая маска сегментирует клеточные тела, пурпурная маска сегментирует нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Увеличьте погрешность сегментации тела клетки (желтая маска) и сегментации нейритов (пурпурная маска) из-за клеточного мусора и теней движущейся среды. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Анализ разрастания тонких нейритов в культуре сенсорных нейронов взрослого человека. (А) Репрезентативное фазовое изображение нейронов, характеризующееся очень тонкими нейритами. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Желтая маска сегментирует клеточные тела, пурпурная маска сегментирует нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Верхняя панель: увеличение потери длины нейритов из-за пределов обнаружения сегментации нейритов (пурпурная маска). Нижняя панель: увеличение на погрешность сегментации нейритов (пурпурная маска) на посторонних предметах. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Яркость нейритов при анализе роста нейритов в культуре взрослых сенсорных нейронов. (A) Репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) нейронов, характеризующихся очень яркими и густыми нейритами. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Фиолетовая маска сегментирует тела клеток, синяя – нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Верхняя панель: увеличение ошибки сегментации тела клетки (фиолетовая маска) из-за толщины нейритов. Нижняя панель: увеличение на потерю длины нейритов из-за интенсивной флуоресценции яркости толстых нейритов. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Фоновая флуоресценция при анализе роста нейритов в культуре сенсорных нейронов взрослого человека. (A) Репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) высокого фонового флуоресцентного шума. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Фиолетовая маска сегментирует тела клеток, синяя – нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Увеличьте погрешность сегментации нейритов (синяя маска) из-за интерференции фоновой флуоресценции. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Анализ рассеяния света в нейритах культуры сенсорных нейронов взрослого человека. (A) Репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) рассеяния света. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Фиолетовая маска сегментирует тела клеток, синяя – нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Верхняя панель: увеличение на потерю длины нейрита из-за интерференции рассеяния света. Нижняя панель: увеличьте ошибку сегментации тела клетки (фиолетовая маска). Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Ошибки процедуры окрашивания, влияющие на качество, мешающие анализу роста нейритов культуры взрослых сенсорных нейронов. (А) Слева репрезентативное фазовое изображение взрослых сенсорных нейронов. Справа репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) сломанных невритов в результате промывки в процессе окрашивания. (Б) Слева репрезентативное фазовое изображение взрослых сенсорных нейронов. Справа репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) удаления клеточного тела в результате смывов процедуры окрашивания. Изображения были получены через 48 ч после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 10: Идеальная эмбриональная (E13.5) культура сенсорных нейронов для анализа роста нейритов. (A) Репрезентативное фазовое изображение идеальных условий посева для анализа роста нейритов в культуре эмбриональных сенсорных нейронов. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Желтая маска сегментирует клеточные тела, пурпурная маска сегментирует нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Увеличение сегментации тела клетки (желтая маска) и сегментации нейритов (пурпурная маска). Изображения были получены через 24 часа после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11
Рисунок 11: Идеальная эмбриональная (E13.5) культура сенсорных нейронов для анализа роста нейритов. (A) Репрезентативное иммуноцитохимическое изображение (нейрональный маркер Tuj1) идеальной культуры эмбриональных сенсорных нейронов для анализа роста нейритов. (B) Репрезентативное автоматически сегментированное изображение. Фиолетовая маска сегментирует тела клеток, синяя – нейриты. (C) Иллюстративный анализ нароста нейритов, определение параметров. (D) Увеличьте сегментацию клеточного тела (фиолетовая маска) и сегментацию нейритов (синяя маска). Изображения были получены через 24 часа после посева. Увеличение 20x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12
Рисунок 12: Дифференцированные клетки NSC-34 имеют повышенное количество нейритов и ветвления по сравнению с недифференцированными контрольными клетками. Репрезентативные изображения ячеек NSC-34. Верхняя панель: недифференцированные клетки NSC-34 (контроль). Нижняя панель: дифференцированные клетки NSC-34 после 96 часов обработки ретиноевой кислотой. В левой части обеих панелей находятся фазово-контрастные изображения, в то время как в правой части обеих панелей автоматически сегментируются изображения (сома в желтом цвете, нейриты в пурпурном). Снимки были получены через 96 ч после посева. Увеличение 10x. Масштабная линейка, 50 мкм. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-13
Рисунок 13: Инструмент Cell Counter на Фиджи. Ручной подсчет клеток выполняется на фазовом изображении идеальных условий засеменения для анализа роста нейритов. Увеличение 20x. Фигурка была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Тип культурыКультивирование DRG у взрослых особей (фаза)Эмбриональная культура DRG (фаза)НБК-34 (фаза)
Увеличениев 20 разв 20 разВ 10 раз
Режим сегментацииЯркостьЯркостьЯркость
Корректировка сегментации0.5 - 0.71.7 - 21
Настройка размера (пикселей)0, +1, +20, +10
ФильтрацияЛучшийЛучшийЛучший
Чувствительность к нейритам0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Ширина нейрита122

Таблица 1: Краткое изложение предложенных параметров определения анализа для культур сенсорных нейронов взрослого человека, эмбриональных (E13.5) культур сенсорных нейронов и культур NSC-34 на изображениях фазового контраста.

Тип культурыВзрослая культура DRG (ICC)Эмбриональная культура DRG (ICC)
Увеличениев 20 разв 20 раз
Режим сегментацииЯркостьЯркость
Корректировка сегментации0.5 - 0.71.7 - 2
Настройка размера (пикселей)0, +1, +20, +1
ФильтрацияЛучшийЛучший
Грубая чувствительность нейрита8 - 98 - 9
Тонкая чувствительность нейритадо 0,750.5 - 0.75
Ширина нейрита12

Таблица 2: Резюме предложенных параметров определения анализа для культур сенсорных нейронов взрослого человека, эмбриональных (E13.5) культур сенсорных нейронов и культур NSC-34 на иммуноцитохимических изображениях.

ВЫПУСКПРЕДЛОЖЕНИЯ
Грязная культураПереместите ползунок сегментации в сторону ячеек
Увеличьте параметр adjust size (+1,+2...)
Немного снижает чувствительность нейритов
Бледные/тонкие нейритыПовысить чувствительность нейритов (не менее 0,6)
Отрегулируйте ползунок сегментации по направлению к ячейкам.
Тонкие нейриты в ICCПовышение чувствительности мелких нейритов (до 0,75)
Снизить грубую чувствительность нейритов (не менее чем до 8-9)
Глиальные клеткиОтрегулируйте ползунок сегментации в сторону ячеек (1.7-2)
Ширина нейрита при 2

Таблица 3: Резюме предложенного анализа параметров определения для решения конкретных задач в различных типах культур.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное измерение того, как растут нейроны в здоровых, травмированных и больных условиях, является критическим параметром во многих экспериментальных установках в области нейробиологии. Будь то работа с органотипическими культурами целых эксплантов DRG или диссоциированных культур, правильное измерение роста аксонов было серьезной проблемой в течение последних 20 лет. Без надежной и точной количественной оценки роста нейритов невозможно оценить, было ли эффективным специфическое лечение, такое как ретиноевая кислота (в течение 4 дней) для клеток NSC-3434 или нейротрофины (в течение 1-2 дней) для эмбриональных нейронов DRG14,35. Нейроны обычно демонстрируют непрерывный рост, когда здоровы; Однако после травмы скорость роста аксонов увеличиваетсяв 12,13 раза. Время имеет решающее значение при измерении роста аксонов; Поэтому, прежде чем начать эксперимент, важно провести пробный тест, чтобы определить оптимальное время для фиксации клеток на основе кривой плато скорости их роста.

Выбор метода, ручного или автоматического, знаменует собой переломный момент с точки зрения временных затрат и точности. Некоторые из наиболее распространенных мануальных методов включают NeuronJ18,20 и Metamorph (Visitron)2,22,28. Ручные методы требуют от пользователей ручного отслеживания нейритов, что занимает чрезвычайно много времени и требует изображений отдельных клеток. При ручной сегментации нейритов нейронные сети полностью недосягаемы. Как правило, эти методологии измеряют только самый длинный аксон или используют векторное измерение расстояния, тем самым теряя важную информацию, такую как количество точек ветвления и общая длина аксона. Некоторое улучшение обеспечивается анализом Шолла30, который в любом случае ограничен условиями с одной клеткой. Анализ отдельных клеток сопряжен с несколькими проблемами, начиная с посева клеток. Нейроны должны быть покрыты в очень низкой концентрации, что может быть не самым подходящим условием роста для каждого типа клеток. Еще одна проблема возникает с получением изображения. Обычно конфокальный микроскоп используется для визуализации, что требует обученных пользователей и флуоресцентных нейронов и не является ни быстрым, ни экономически эффективным. С помощью конфокального микроскопа получаются изображения с высоким разрешением, но в каждом эксперименте визуализируется очень мало нейронов. Это представляет собой ограничение, поскольку для достижения достаточного количества нейронов требуется больше биологических реплик.

Некоторые автоматические методологии, такие как NeuroMath 2,28, решают проблему трудоемкой сегментации нейритов, которая выполняется автоматическим способом.

Однако из-за нехватки времени этот модуль измерения наростов нейритов обеспечивает более быстрые результаты при получении изображений на аппарате для цейтраферной микроскопии. Последнее, вместе с этим программным обеспечением, значительно повышает эффективность времени и затрат как для студентов, так и для главных исследователей.

Машина сбора данных позволяет создать достаточно полную карту скважины, получая переменное количество изображений в зависимости от диаметра скважины. Это представляет собой значительное преимущество, поскольку несколько нейронов визуализируются одновременно. Тем не менее, достижение только 20-кратного увеличения является достаточным и подходящим для анализа изображений с помощью программного обеспечения. Его мощность основана на его способности обучаться на наборе изображений и выполнять полуавтоматическое измерение общей длины аксонала. Кроме того, программное обеспечение может работать как с отдельными нейронами, так и с нейронными сетями. Программное обеспечение способно сегментировать нейриты и тела клеток с помощью двух разных масок. Желтая маска сегментирует все высококонтрастные объекты на изображении, такие как тела клеток, клеточный мусор и тени. Пурпурная маска, напротив, сегментирует нейриты. Точность и аккуратность программного обеспечения были доказаны сегментацией одних и тех же нейронов как с помощью программного обеспечения, так и с помощью NeuronJ. С точки зрения статистического анализа, значения длин нейритов хорошо коррелируют с высоким коэффициентом корреляции Спирмена.

Оценив надежность метода, мы перешли к анализу различных условий испытаний. Для проведения оптимального анализа требуются некоторые меры предосторожности. Во-первых, нейроны должны быть равномерно засеяны в лунке, избегая пятен с высокой концентрацией клеток. Кластеризация нейронов приводит к тому, что программное обеспечение теряет точность обнаружения нейритов. Еще одной переменной, влияющей на точность и достоверность анализа, является чистота культуры. Предпочтительна чистая культура с небольшим количеством клеточного мусора и мертвых клеток. Тем не менее, программное обеспечение способно компенсировать такие проблемы за счет модуляции чувствительности нейритов и маски сегментации тела клетки. Как уже упоминалось выше, желтая маска сегментирует высококонтрастные объекты, среди которых также есть тени, вызванные движением среды в скважине. Тени могут покрывать нейриты, что приводит к потере длины нейритов. Тем не менее, такую проблему легко решить, позволив носителю успокоиться перед получением изображения.

Алгоритм способен выполнять количественное определение длины нейритов как на фазово-контрастных изображениях, так и на иммуноцитохимических изображениях. Когда речь идет о флуоресценции, необходимо принять другие меры предосторожности для получения надежного анализа. Во-первых, качество окрашивания оказывает глубокое влияние на результат анализа. Если нейриты ломаются или сегментируются, а тела клеток отрываются во время промывок, анализ теряет прочность и надежность. Кроме того, флуоресценция сама по себе представляет собой потенциально возмущающий элемент для анализа. Поскольку фокусировка выполняется машиной автоматически, объектив фокусирует очень яркие объекты, такие как артефакты, тела клеток или толстые нейриты. В результате остаются более тонкие и менее яркие нейриты, что затрудняет пользователю правильное измерение длины нейритов.

Как следствие, анализ фазовых изображений может быть более обоснованным по сравнению с анализом иммуноцитохимических изображений. Программное обеспечение способно работать со многими различными морфологиями нейронов, от самых сложных и сложных до самых простых, как в виде отдельных клеток, так и в нейронных сетях. Таким образом, он может быть использован во многих различных областях исследований, начиная от первичных культур нейронов, поступающих из центральной или периферической нервной системы различных стадий развития, до нейронов и клеточных линий, полученных из iPSC, таких как NSC-34.

Несмотря на значительный потенциал программного обеспечения, можно отметить некоторые ограничения. Во-первых, точность сегментации клеточного тела неоптимальна. Следовательно, такие параметры, как кластер клеточных тел и площадь кластера клеточных тел, не могут быть надежно использованы для подсчета клеток. Во-вторых, в дополнение к необходимым мерам предосторожности для оптимальной сегментации нейритов, недостаточно толстые аксоны могут быть исключены из измерения длины нейритов, что приводит к потере данных.

Параметр точки ветвления сталкивается с проблемами, связанными с обоими типами сегментации. Тени, мертвые клетки или мусор в культуре, которые локализуются на точках ветвей, скрывают их, поскольку они покрываются сегментацией клеточного тела. Более того, в случае тонких нейритов надежность параметра точки ветвления снова сильно нарушается.

Кроме того, автоматическая фокусировка во время получения изображения иногда может быть неоптимальной. Максимальное увеличение машины ограничено 20-кратным увеличением, что может быть недостаточным для наблюдения более мелких деталей или флуоресценции в тонких структурах, таких как нейриты. Кроме того, машина лучше всего работает с однородными пластиковыми подложками. Если в колодец вставлен покровный стеклопакет, фокусировка на стекле может не сработать, что приведет к частичному размытию изображения. Однако это программное обеспечение применимо не только к нейронам, но и к совершенно другим областям исследований, таким как рост грибов36.

Учитывая все обстоятельства, мы считаем, что этот модуль измерения роста нейритов является надежным инструментом для быстрого, объективного и эффективного измерения нейритов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые потенциально могли бы создать конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотим поблагодарить Алессандро Верчелли за критические комментарии и техническую поддержку Sartorius за помощь. Наши исследования по этим темам были щедро поддержаны грантом Риты-Леви Монтальчини 2021 года (MIUR, Италия). Это исследование было профинансировано Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини. Исследования D.M.R. проводились во время и при поддержке итальянского национального межуниверситетского курса PhD в области устойчивого развития и изменения климата (ссылка: www.phd-sdc.it).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа АMerck / Roche10103586001
Dispase II (нейтральная протеаза, класс II)Merck / Roche4942078001
модифицированная орлиная среда DulbeccoMerck / SigmaD5796
Фетальная бывиновая сыворотка Merck / SigmaF7524
Смесь питательных веществ Ham's F-12 (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 с L-глютаминомEurocloneECM0135L
сбалансированным солевым раствором Hanks'EurocloneECM0507L
HBSS (10X), без кальция, без магния, без фенола красныйThermoFisher Scientific14185045
Сыворотка для крупного рогатого скота с характеристиками HyClone (США)CytivaSH30071.03
Incucyte, программное обеспечение для анализа Neurotrack Sartorius9600-0010
L-15 среда (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Мышиный белок ламинина, натуральныйThermoFisher Scientific23017015
L-цистеинMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 среда без L-глутаминаEurocloneECB0020L
мыши NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Нейробазальная среда [-] ГлутаминThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Онтарио, Канада)CLU140
Папаин из папайи латексSigmaP4762
Пенициллин-стрептомицин (5,000 Ед/мл)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Плотность 1,130 г/мл)Цитива17089101
раствор поли-D-лизина (1 мг/мл)EMD Millipore/MerckA-003-E
раствор поли-L-лизина (0-01%)SigmaP4832
Рекомбинантный человеческий NT-3PeproTech450-03
Ретиноевая кислотаMerck / SigmaR2625
Раствор трипсина-ЭДТАSigmaT3924
β-тубулин III (Tuj1) антителоMerck / SigmaT8660

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи