Методическая статья

Производство коллагена с нанофибриллярным рисунком для тканевой инженерии

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В следующем протоколе представлен метод экструзии на основе сдвига для получения коллагеновых гидрогелей с наноразмерными узорчатыми фибриллами, которые могут быть применены в широком спектре приложений тканевой инженерии.

Аннотация

Регенеративные биоматериалы предназначены для облегчения взаимодействия между клетками и материалом для восстановления поврежденных тканей и органов. Эти материалы предназначены для имитации биофизических свойств нативной ткани, обеспечивая клеточное фенотипическое и морфологическое руководство, которое способствует восстановлению ниши регенеративной ткани. Коллаген, преобладающий белок внеклеточного матрикса, является распространенным компонентом этих регенеративных биоматериалов благодаря своей биосовместимости и другим благоприятным свойствам. В настоящем исследовании описан новый и простой метод получения инженерного нанофибриллярного коллагена с направленным структурированием фибрилл. Благодаря манипуляциям напряжением сдвига, температурой и pH, фибриллогенез коллагена и выравнивание точно контролируются без необходимости использования специального оборудования. Этот подход позволяет создавать нанофибриллярные биоматериалы коллагена, которые имитируют нативную структуру тканей, проявляющих либо анизотропные, либо изотропные характеристики. Гибкость в структурировании коллагеновых нанофибрилл не только облегчает изучение наноразмерного моделирования поведения клеток, но и предлагает разнообразные возможности для применения структурированной тканевой инженерии.

Введение

Целью регенеративной медицины является ускорение регенерации и заживления тканей с помощью применения инженерных методов лечения. Один из подходов включает в себя создание конструкций из биоматериала, которые точно имитируют состав и структуру нативных тканей. При проектировании этих конструкций критически важным фактором является нативный лежащий в основе внеклеточный матрикс (ВКМ), который дает подсказки для пролиферации, миграции и дифференцировки клеток, в конечном итоге стимулируя регенерацию тканей 1,2. Нативная ВКМ преимущественно состоит из фибриллярного коллагена 3,4. В высокоорганизованных тканях, таких как скелетные мышцы и сухожилия, эти ВКМ демонстрируют выровненный рисунок, который является ключом к поддержке передачи силы через ткань, а также двигательной функции 5,6.

Полезность коллагена в качестве биоматериала для применения в тканевой инженерии выходит за рамки его широкого распространения в нативных тканях, поскольку он также демонстрирует хорошую биосовместимость, биоразлагаемость и сродство к клеткам 7,8,9. Последние достижения в разработке биоматериалов на основе коллагена были сосредоточены на уточнении биофизических свойств для лучшего управления механическими и биохимическими сигналами, которые необходимы для регенерации конкретных тканей. Создание биоматериалов коллагена с фибриллярной структурой in vitro относительно просто, так как кислоторастворимые молекулы коллагена способны самособираться в нанофибриллы при воздействии теплых температур и нейтрального pH10,11. Однако без управляемых манипуляций эти фибриллы будут формироваться в случайные сети, что сделает их непригодными для применения в анизотропной тканевой инженерии. Методы, способные получать выровненные фибриллы, включают электроспиннинг и мокрое прядение, наряду с другими методами экструзии в растворе12,13, сублимационной сушки14, электрохимического или магнитного изготовления15,16, осаждения сдвиговым потоком17, кристаллизации, индуцированной потоком18, гелево-экструзии19, индуцированного деформациейвыравнивания 20 и выравнивания под действием силы путем манипулирования текучей средой поток 21,22. Тем не менее, многие из этих методов либо не обладают высокой совместимостью с коллагеном, либо обеспечивают выравнивание на микроуровне, но не на наноуровне, требуют дополнительных этапов постобработки для индуцирования выравнивания и стабильности или требуют узкоспециализированного оборудования и реагентов, что затрудняет их широкое внедрение.

В настоящем исследовании представлен легкий метод изготовления нанофибриллярного коллагена на основе сдвига с выровненным или случайно ориентированным рисунком фибрилл без необходимости использования специализированного оборудования, такого как шприцевые насосы или электроспиннеры. Этот метод использует зависимость фибриллогенеза коллагена от pH. Приложение силы сдвига к кислотному мономерному коллагену в нейтрализующем буфере способствует выравниванию фибриллогенеза по направлению сдвига. Точно так же коллаген может быть вызван к фибриллогенезу в отсутствие сдвига, в результате которого образуются фибриллы со случайными узорами. Полученные 3D-коллагеновые полоски, состоящие либо из выровненного, либо случайно расположенного нанофибриллярного коллагена, могут служить инструментами для изучения влияния наноразмерного моделирования на поведение клеток. Кроме того, они предлагают разнообразные возможности как для анизотропных, так и для изотропных приложений тканевой инженерии 23,24,25,26,27. Рисунок может быть настроен в соответствии со структурой исследуемой нативной ткани. Коллагеновые полоски также могут быть объединены в пучки различного размера, чтобы служить в качестве трансплантированного инженерного терапевтического средства при различных размерах и формах травм.

Протокол

1. Приготовление диализованного коллагена ( Рисунок 1)

  1. Отрежьте диализную трубку длиной примерно 3 дюйма. Используйте трубки со следующими характеристиками: ширина по плоской поверхности 32 мм, диаметр по раздутости 20 мм и размер пор 4,8 нм.
  2. Регидратируйте диализные трубки в сверхчистой воде.
  3. Зафиксируйте один конец трубки зажимом для диализной трубки.
  4. Перенесите 5-6 мл коллагена I типа крысиного хвоста (концентрация: 9-10 мг/мл в 0,02 N уксусной кислоты) в трубку с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой 18 G. Зафиксируйте другой конец трубки, чтобы закрыть.
  5. Положите слой хлопьев полиэтиленгликоля (ПЭГ) толщиной 0,5-1 см на дно стеклянной посуды, а затем поместите диализную трубку, наполненную коллагеном, поверх слоя ПЭГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная тарелка размером 13 x 9 x 2 дюймов обычно может вместить ряд из 4-5 пробирок, наполненных коллагеном. Размер чашки можно регулировать в зависимости от необходимого объема коллагена.
  6. Добавьте еще хлопьев PEG, чтобы полностью покрыть трубку, и поставьте противень в холодильник при температуре 4 °C.
  7. Каждые 10-15 минут удаляйте влажные хлопья ПЭГ с поверхности диализной трубки и снова накрывайте трубку свежим слоем сухого ПЭГ. Верните блюдо в холодильник с температурой 4 °C.
  8. Повторите шаг 1,7 еще два раза, а через 30-35 минут смойте влажные хлопья ПЭГ с помощью водопроводной воды.
  9. Промойте трубку еще раз в ультрачистой воде и промокните трубку насухо салфеткой.
  10. Отсоедините один конец трубки и переложите диализованный коллаген (конечная концентрация: ~30 мг/мл) в микроцентрифужные пробирки. Кратковременно раскрутите пузырьки воздуха в коллагене с помощью мини-центрифуги (2000 x g, ≤30 с, комнатная температура [RT]) и храните при температуре 4°C для последующего использования.
  11. За сутки до использования загрузите коллаген в шприцы.
    1. С помощью иглы 16-го калибра наберите ~1 мл диализованного коллагена в шприц объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген является вязким веществом. Возможно, потребуется предварительно загрузить головку иглы коллагеном перед тем, как набрать больше коллагена. Снимите головку иглы и при необходимости удалите большие воздушные карманы
    2. Извлеките иглу и оберните головку шприца парапленкой.
    3. Храните шприц, наполненный коллагеном, в вертикальном положении при температуре 4° C в течение ночи, чтобы мелкие пузырьки воздуха лопнули.

2. Подготовка стеклянной крошки ( Рисунок 1)

ВНИМАНИЕ: Используйте средства защиты глаз для этой части протокола.

ПРИМЕЧАНИЕ: Специально покрытые гидрофобные стеклянные стекла используются для экспериментов с клеточными культурами. Горки должны обрабатываться за края, чтобы предотвратить удаление поверхностного покрытия. Выполните процедуру резки стекла на подходящей режущей поверхности.

  1. Измерьте и разметьте желаемые размеры стеклянной стружки с помощью перманентного маркера
    1. При создании 8-полосных лесов разметьте шаг примерно в 1 см по длинному краю горки. При необходимости отрегулируйте размеры в зависимости от желаемого размера строительных лесов.
  2. Используя прямую кромку (т.е. кромку 6-луночной пластины), проведите стеклорезом вниз по длине первого измерения, чтобы надрезать стекло.
  3. Предметное стекло либо сломается вдоль надрезанной линии само по себе, либо перевернет предметное стекло на салфетку (гидрофобной стороной вниз) и вручную надавит на область надреза.
  4. Отметьте покрытую поверхность гидрофобного предметного стекла этаноловым маркером.
  5. Промойте скол стекла в ультрачистой воде, чтобы удалить остатки стеклянной пыли.
  6. Высушите стеклянную стружку либо с помощью настольной форсунки для сжатого воздуха, либо сложив ее под углом в вытяжном шкафу.
  7. Повторите по мере необходимости для необходимого количества фишек. Храните чипсы в RT. Для достижения наилучших результатов в культивировании клеток используйте подготовленные чипсы в течение 7 дней.

3. Приготовление 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS)

  1. Наполните стеклянную бутылку 500 мл ультрачистой воды.
  2. Добавьте в флакон 10 таблеток PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что соотношение таблеток для 1x PBS составляет 1 таблетку на 500 мл. При необходимости отрегулируйте количество таблеток, если вы используете таблетки другого размера или марки.
  3. Добавьте в бутылку мешалку и положите на тарелку для размешивания до тех пор, пока таблетки не растворятся.
  4. В день изготовления гидрогеля переложите необходимый объем 10x PBS в конические пробирки объемом 50 мл.
  5. Поместите пробирки, наполненные PBS, на водяную баню при температуре 37 °C не менее чем на 15 минут до производства коллагена.

4. Изготовление выровненных коллагеновых нанофибрилл (Рисунок 2)

  1. Достаньте из холодильника шприц с коллагеном и прикрепите тупую иглу 22 G.
  2. Поместите предметное стекло в крышку 4-луночной пластины.
  3. Накройте предметное стекло достаточно подогретым 37 °C 10x PBS для погружения в него (30-50 мл).
  4. Держа шприц под углом примерно 30-45°, вручную выдавите тонкие полоски коллагена на стеклянную стружку со скоростью ~340 мм/с и расходом ~3,2 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите экструзию коллагена в течение 30-60 секунд после добавления подогретого PBS, чтобы убедиться, что PBS не охлаждается чрезмерно.
  5. Подождите 1-2 минуты, чтобы коллаген завершил фибриллогенез или пока коллаген не приобретет непрозрачный белый цвет.
  6. С помощью щипцов разрежьте коллагеновые полоски по длине. Убедитесь, что полоски достаточно длинные, чтобы 3-5 мм можно было согнуть под любым концом чипа.
  7. По одной аккуратно накидывайте полоски коллагена вдоль (параллельно зазубренной области) на подготовленную стеклянную крошку. Заправьте края под сколот.
  8. Продолжайте укладывать коллагеновые полоски до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые размеры.
  9. Поместите новообразованный гидрогель с коллагеном в две лунки 12-луночного планшета. Это обеспечивает приток воздуха во время процесса сушки и предотвращает прилипание хвостовых кончиков коллагена к нежелательным поверхностям.
  10. Оставьте гидрогели на столе для высыхания на 1-3 часа или пока кристаллы соли PBS не покроют 50%-90% поверхности гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время высыхания будет варьироваться в зависимости от размера гидрогеля и наличия лишней жидкости.
  11. Погрузите каждый гидрогель в 1x PBS примерно на 30-60 с или до тех пор, пока кристаллы соли не растворятся.
  12. Аккуратно промокните излишки PBS салфеткой.
  13. Поместите гидрогели обратно на пластину лунки и оставьте сохнуть в вытяжном шкафу на ночь.
  14. Храните высушенные гидрогели при температуре около 1 недели.

5. Изготовление случайных коллагеновых нанофибрилл (Рисунок 3)

  1. Достаньте из холодильника шприц с коллагеном и прикрепите тупую иглу 22 G.
  2. Выдавите коллаген со скоростью ~3,2 мл/мин на сухую стеклянную стружку. Выдавите достаточное количество коллагена, чтобы получить размеры, аналогичные выровненным коллагеновым гидрогелям. При необходимости предотвратите накопление пузырьков воздуха.
  3. Выдавите дополнительный коллаген, чтобы обернуть вокруг краев стеклянной крошки. Это сводит к минимуму риск случайной отслоения.
  4. С помощью щипцов погрузите экструдированный коллаген в 50 мл пробирки с подогретым 10x PBS.
  5. Подождите 45-60 с, пока коллаген не завершит фибриллогенез или пока коллаген не приобретет непрозрачный белый цвет.
  6. Аккуратно промокните излишки PBS салфеткой.
  7. Выполните шаги 4.9-4.14 для промывки и сушки гидрогелей

6. Стерилизация и регидратация

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в шкафу биобезопасности

  1. Стерилизуйте коллагеновые гидрогели и окружающие лунки в 70% этаноле в течение 15 минут.
    1. Кратковременно поднимите гидрогели в середине стерилизации с помощью щипцов, чтобы убедиться, что нижняя сторона стеклянной стружки и гидрогель находятся в контакте с этанолом.
  2. Удалите этанол и дайте гидрогелю высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
  3. Промойте гидрогели 3 раза в стерильном 1x PBS, по 10 минут каждый, чтобы удалить остатки этанола и регидратировать гидрогели. Гидрогели теперь готовы к использованию (клеточная культура и т.д.). Гидрогели можно ненадолго оставить в PBS после заключительного этапа промывки, если они не готовы к использованию сразу.

Результаты

Этот протокол описывает простую технику экструзии на основе сдвига для изготовления коллагеновых гидрогелей, состоящих либо из выровненных (Рисунок 2), либо случайно ориентированных (Рисунок 3) нанофибрилл. Моделирование нанофибрилл основано на точном контроле сил сдвига, которое достигается за счет комбинированной модуляции скорости вращения шприца и скорости экструзии коллагена. Оптимальными значениями для индукции выравнивания фибрилл ранее были определены скорость шприца 340 мм/с и скорость экструзии коллагена 3,2 мл/мин28,29. Этот баланс имеет решающее значение не только для образования выровненных нанофибрилл, но и для обеспечения функциональности гидрогелей в макромасштабе. Если это соотношение смещено, существует риск изготовления гидрогелей, которые не имеют ожидаемого рисунка, а также гидрогелей, содержащих коллагеновые полоски, которые являются слишком тонкими (<0,5 мм в диаметре), толстыми (>1,5 мм в диаметре) или волнистыми для использования. Например, слишком быстрое движение шприца в сочетании со слишком медленной скоростью экструзии приводит к образованию тонких полосок, в то время как противоположное соотношение дает толстые или волнистые полоски (рис. 4A-D), в зависимости от степени дисбаланса в соотношении. Эти различия в макроскопических свойствах могут создать достаточную вариабельность от полоски к полоске, чтобы повлиять на отложение клеток и локальную адгезию.

После экструзии и сборки коллагена производство гидрогеля проходит начальную фазу сушки, часто от 1 до 3 часов, прежде чем пройти этап промывки в 1x PBS (Рисунок 2 и Рисунок 3). Достижение оптимальных топографических результатов зависит от тонкого баланса между временем и интенсивностью этапа промывки. Недостаточная или несвоевременная промывка приводит к нарушению топографии волокон, о чем свидетельствуют отпечатки кристаллов соли PBS на фибриллах. Напротив, чрезмерное или преждевременное вымывание коллагена после изготовления приводит к растворению слоя коллагена, который покрывает топографические особенности (рис. 4E, F).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) подтверждает наличие выровненной или случайной ориентации нанофибрилл в коллагеновых гидрогелях. Как в выровненных, так и в случайных гидрогелях нанофибриллы имеют диаметр фибрилл в диапазоне от 30 до 50 нм29. Качественно очевидно, что выровненные гидрогели содержат одноосно выровненные нанофибриллы (рис. 5). Это выравнивание ранее было количественно определено с помощью 2D-анализа быстрого преобразования Фурье, в котором график выравнивания отображает два отчетливых пика, расположенных на расстоянии 180° друг от друга для выровненных гидрогелей, в отличие от случайно ориентированных гидрогелей, которые демонстрируют только низкочастотные пики28.

Светлопольные изображения миобластов первичных скелетных мышц мышей показывают, что анизотропное нанотопографическое управление коллагеновыми фибриллами способствует выравниванию клеток (рис. 6). Было показано, что эти коллагеновые гидрогели с наноструктурой индуцируют клеточное выравнивание не только в миобластах26, но и в других типах клеток, таких как эндотелиальные клетки23,24.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение получения коллагена сверхвысокой плотности и предметного стекла. (A-F) Процесс диализа коллагена: (A) подготовка диализной трубки в 3-дюймовые полоски и закрепление первого зажима, (B) загрузка исходного коллагена высокой плотности в трубку и закрепление второго зажима, (C) оболочка загруженной диализной трубки хлопьями полиэтиленгликоля (PEG), (D) удаление насыщенных хлопьев ПЭГ, (E) смывание хлопьев PEG водой и (F) хранение коллагена сверхвысокой плотности в микроцентрифужных пробирках. (Г-Л) Процесс резки предметных стекол: (G) получение предметных стекол для исследования, (H,I) надрезка предметного стекла стеклорезом с алмазным наконечником, (J) разбивание предметного стекла с незазубренной стороны, (K) промывка срезанного стекла водой, (L) сушка предметного стекла. Сделано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Согласованный процесс изготовления коллагенового гидрогеля. Шаг 1: Экструзия коллагена под сдвигом в 10-кратный нагретый буфер PBS и индукция фибриллогенеза; Шаг 2: Монтаж экструдированного коллагена на предметные стекла; Шаг 3: Монтаж дополнительного экструдированного коллагена для увеличения размера гидрогеля; и Шаг 4: Сушка коллагеновых гидрогелей. Сделано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Случайный процесс изготовления коллагенового гидрогеля. Шаг 1: Экструзия коллагена на предметные стекла (одиночная полоска); Шаг 2: Продолжительная экструзия коллагена увеличивает размер (множественные полоски); Шаг 3: Погружение экструдированного коллагена в 10-кратный буфер PBS для инициации фибриллогенеза; и Шаг 4: Сушка гидрогелей. Сделано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Возможные погрешности в процессе изготовления коллагенового гидрогеля. (A-F) Примеры (A) оптимально толстых коллагеновых полосок, (B) чрезмерно толстых коллагеновых полосок, (C) недостаточно толстых коллагеновых полосок, (D) волнистых коллагеновых полосок и (E,F) перемытых коллагеновых поверхностей, показанных с помощью сканирующей электронной микроскопии. Масштабная линейка = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Изображения выровненных и случайных коллагеновых гидрогелей с помощью сканирующей электронной микроскопии. Изображения были сделаны с помощью электронного микроскопа. Условия пучка были установлены на 2 кэВ, с диапазоном токов 25-100 пА и рабочим расстоянием 4-5 мм. Изображения последовательно сохранялись с разрешением 6144 x 4096 пикселей с временем выдержки 1 μс. Масштабная линейка = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Первичные мышиные миобласты, культивируемые на выровненных и случайных коллагеновых гидрогелях. Миобласты культивировали на гидрогелях в течение 3 дней до визуализации. Изображения в светлом поле были получены при 10-кратном увеличении с помощью инвертированного микроскопа. Стрелка обозначает выровненную ориентацию нанофибрилла. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Важнейшие этапы протокола можно разделить на три основные части: 1) фибриллогенез коллагена, 2) нанесение гидрогеля и 3) промывка. Процесс фибриллогенеза коллагена происходит спонтанно в нейтрализующих условиях и основан на самосборке отдельных молекул коллагена в более крупные стабилизированные фибриллярные структуры10,11. Это достигается за счет применения нейтрализующей буферной среды, такой как PBS 10x, которая нагревается до 37 °C и имеет решающее значение для управления электростатическими взаимодействиями, обеспечивающими полное развитие коллагена в фибриллы. Наноразмерное выравнивание фибрилляров достигается за счет приложения сил сдвига одновременно с возникновением фибриллогенеза. Наличие или отсутствие сдвига, а также скорость сдвига будут определять структуру фибрилл. Во-вторых, монтаж гидрогеля является ключевым этапом в укреплении стабильности материала путем обеспечения физических якорей во время процесса сушки, во время которого происходит сокращение и обезвоживание коллагена. Этот шаг особенно важен, если предполагается посев клеток in vitro, так как он прикрепляет коллаген к жесткому субстрату, предотвращающему неконтролируемое сокращение. Процесс монтажа немного отличается между гидрогелями со случайным и выровненным рисунком. Правильное прилегание случайных гидрогелей требует дополнительного отложения коллагена по краям монтажной поверхности (обычно стеклянной) до фибриллогенеза для его закрепления на поверхности. Гидрогели с выровненным рисунком оборачиваются по краям монтажной поверхности для той же цели крепления. Важным дополнительным соображением для выровненных гидрогелей является то, что первоначальное размещение коллагеновой полоски определяет форму и однородность гидрогеля. Последующая установка полоски определяется поверхностным натяжением нанесенного коллагена, при этом следует избегать прикосновения к гидрогелю после установки. Наконец, правильная сушка и промывка гидрогеля после монтажа жизненно важны для сохранения топографических особенностей гидрогеля. Недостаточная сушка с последующим мытьем 1x PBS или водой может привести к образованию растворенного или похожего на торт слоя коллагена. Чтобы предотвратить это, необходимо полное высыхание гидрогелей, которое может быть визуально подтверждено образованием кристаллов PBS и увеличением помутнения коллагена.

Коллагеновые гидрогели использовались как для исследований in vitro, так и для применения регенеративной инженерии in vivo 23,24,25,26,27. Важно отметить, что гидрогели изготавливаются в нестерильных условиях и должны быть стерилизованы перед любой формой клеточной культуры или трансплантации. Рекомендуемой формой стерилизации является 70% этанола, так как другие формы стерилизации, такие как ультрафиолетовое излучение, нарушают структуру нанофибрилл из-за сшивания и деградации молекулколлагена. Тем не менее, удаление этанола с помощью этапов выпаривания и промывки важно для минимизации остаточного этанола, который может нанести ущерб совместимости клеток. Вариабельность исходного коллагена от партии к партии может привести к вариабельности рабочей концентрации диализованного коллагена высокой плотности, что может повлиять на процесс фибриллогенеза. В зависимости от применения, случайное изотропное структурирование может быть предпочтительным по сравнению с выровненным анизотропным структурированием; Поэтому в текущий протокол мы включили оба подхода к модуляции организации фибрилл.

Ограничением метода экструзии на основе сдвига, описанного в этом протоколе, является то, что этот процесс в значительной степени ручен и зависит от пользователя. Для калибровки каждого оператора для получения воспроизводимых результатов требуется серьезное обучение и практика. Это означает, что пропускная способность может быть низкой и отнимать много времени для обеспечения точности. Некоторые из этих ограничений могут быть устранены с помощью высокоавтоматизированных методов машинного производства, таких как 3D-печать, электроспиннинг, мягкая литография и литография поверхностей. Однако, в отличие от этих других методов, эта полностью ручная процедура изготовления нанофибрилла не требует специализированного оборудования и является доступной и недорогой. По мере того, как совершенствование методологий 3D-печати и экономическая эффективность продолжают совершенствоваться, существует потенциал для адаптации и интеграции этого протокола с технологией 3D-печати. Такая интеграция, хотя пока и невозможна, повысит согласованность и пропускную способность этого протокола.

Изготовление двух различных гидрогелевых топографий дает уникальную возможность углубиться в нанотопографическое управление коллагеновыми фибриллами по клеточной морфологии, поведению и регенерации тканей. Наблюдая за реакцией на различные топографии фибрилл, мы можем получить представление о том, как наноразмерное структурирование субстрата влияет на фенотип клетки. Например, предыдущая работа показывает, что когда эндотелиальные клетки принимают удлиненную морфологию на вершине выровненных нанофибрилл, они демонстрируют противовоспалительный фенотип и повышенную устойчивость к нарушенным условиям кровотока. Эти результаты не только углубляют наше понимание развития атеросклеротических поражений, но и являются перспективными для разработки будущих атеропротекторных шунтирующих трансплантатов. Эти коллагеновые гидрогели могут быть использованы для применения в тканевой инженерии и обогащены факторами роста или клетками перед имплантацией для повышения терапевтической эффективности 25,26,27. Сравнительный анализ показывает, что гидрогели с выровненными топографиями демонстрируют превосходную регенерацию мышц и васкуляризацию по сравнению с гидрогелями со случайными топографиями26 и что эти гидрогели могут быть использованы в бесклеточной «готовой» форме, если они содержат миогенные факторы роста для усиления регенерации тканей в модели травмы мышей27. В то время как основное внимание до сих пор уделялось использованию этих гидрогелей в качестве потенциального терапевтического средства для мышечных травм, они могут быть применены в широком спектре регенеративных и тканевых инженерных приложений.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано финансированием со стороны Альянса по исследованиям и обучению в области регенеративной реабилитации, MTF Biologics, Фонда Орегонского университета здоровья и науки и Медицинского фонда Коллинза. K.M.H. был поддержан стипендией Национального научного фонда для аспирантов (DGE-1937961) и стипендией Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) (5TL1TR2371-8). K.H.N. был поддержан грантами от NIH/NHLBI (R00HL136701) и NIH/NIAMS (R01AR080150).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллаген I, высокая концентрация, рог крысиного хвостаCB354249
микроскоп Eclipse TE-2000-UNikonTE-2000-U Инвертированный микроскоп
Предметные стекла для сверхтолстого микроскопаFisher Scientific22-267-005Хорошо подходит для поверхности экструзии коллагена
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AСканирующий электронный микроскоп
Набор инструментов для резки стекла 2-20 мм Карандаш Подача масла Твердосплавный наконечникAmazon/MOARMORB07Y1D243HОпция для стеклореза
Hamilton Kel-F Hub Тупоконечные иглы (замок Люэра, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Иглы для экструзии коллагена
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Гидрофобные слайды
PBS ТаблеткиThermo Fisher Scientific18912014
Полиэтиленгликоль 8000Биореагенты FisherBP233-1
Бесшовная трубка для диализа целлюлозы Fisher ScientificS25645G
SnakeSkinThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware СтеклорезSynthware31-501-927Опция для стеклореза
Зажимы для диализа

Ссылки

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

Перепечатки и разрешения

Теги

Производство коллагена с нанофибриллярным рисунком для тканевой инженерии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.