Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство коллагена с нанофибриллярным рисунком для тканевой инженерии

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В следующем протоколе представлен метод экструзии на основе сдвига для получения коллагеновых гидрогелей с наноразмерными узорчатыми фибриллами, которые могут быть применены в широком спектре приложений тканевой инженерии.

Аннотация

Регенеративные биоматериалы предназначены для облегчения взаимодействия между клетками и материалом для восстановления поврежденных тканей и органов. Эти материалы предназначены для имитации биофизических свойств нативной ткани, обеспечивая клеточное фенотипическое и морфологическое руководство, которое способствует восстановлению ниши регенеративной ткани. Коллаген, преобладающий белок внеклеточного матрикса, является распространенным компонентом этих регенеративных биоматериалов благодаря своей биосовместимости и другим благоприятным свойствам. В настоящем исследовании описан новый и простой метод получения инженерного нанофибриллярного коллагена с направленным структурированием фибрилл. Благодаря манипуляциям напряжением сдвига, температурой и pH, фибриллогенез коллагена и выравнивание точно контролируются без необходимости использования специального оборудования. Этот подход позволяет создавать нанофибриллярные биоматериалы коллагена, которые имитируют нативную структуру тканей, проявляющих либо анизотропные, либо изотропные характеристики. Гибкость в структурировании коллагеновых нанофибрилл не только облегчает изучение наноразмерного моделирования поведения клеток, но и предлагает разнообразные возможности для применения структурированной тканевой инженерии.

Введение

Целью регенеративной медицины является ускорение регенерации и заживления тканей с помощью применения инженерных методов лечения. Один из подходов включает в себя создание конструкций из биоматериала, которые точно имитируют состав и структуру нативных тканей. При проектировании этих конструкций критически важным фактором является нативный лежащий в основе внеклеточный матрикс (ВКМ), который дает подсказки для пролиферации, миграции и дифференцировки клеток, в конечном итоге стимулируя регенерацию тканей 1,2. Нативная ВКМ преимущественно состоит из фибриллярного коллагена 3,4. В высокоорганизованных тканях, таких как скелетные мышцы и сухожилия, эти ВКМ демонстрируют выровненный рисунок, который является ключом к поддержке передачи силы через ткань, а также двигательной функции 5,6.

Полезность коллагена в качестве биоматериала для применения в тканевой инженерии выходит за рамки его широкого распространения в нативных тканях, поскольку он также демонстрирует хорошую биосовместимость, биоразлагаемость и сродство к клеткам 7,8,9. Последние достижения в разработке биоматериалов на основе коллагена были сосредоточены на уточнении биофизических свойств для лучшего управления механическими и биохимическими сигналами, которые необходимы для регенерации конкретных тканей. Создание биоматериалов коллагена с фибриллярной структурой in vitro относительно просто, так как кислоторастворимые молекулы коллагена способны самособираться в нанофибриллы при воздействии теплых температур и нейтрального pH10,11. Однако без управляемых манипуляций эти фибриллы будут формироваться в случайные сети, что сделает их непригодными для применения в анизотропной тканевой инженерии. Методы, способные получать выровненные фибриллы, включают электроспиннинг и мокрое прядение, наряду с другими методами экструзии в растворе12,13, сублимационной сушки14, электрохимического или магнитного изготовления15,16, осаждения сдвиговым потоком17, кристаллизации, индуцированной потоком18, гелево-экструзии19, индуцированного деформациейвыравнивания 20 и выравнивания под действием силы путем манипулирования текучей средой поток 21,22. Тем не менее, многие из этих методов либо не обладают высокой совместимостью с коллагеном, либо обеспечивают выравнивание на микроуровне, но не на наноуровне, требуют дополнительных этапов постобработки для индуцирования выравнивания и стабильности или требуют узкоспециализированного оборудования и реагентов, что затрудняет их широкое внедрение.

В настоящем исследовании представлен легкий метод изготовления нанофибриллярного коллагена на основе сдвига с выровненным или случайно ориентированным рисунком фибрилл без необходимости использования специализированного оборудования, такого как шприцевые насосы или электроспиннеры. Этот метод использует зависимость фибриллогенеза коллагена от pH. Приложение силы сдвига к кислотному мономерному коллагену в нейтрализующем буфере способствует выравниванию фибриллогенеза по направлению сдвига. Точно так же коллаген может быть вызван к фибриллогенезу в отсутствие сдвига, в результате которого образуются фибриллы со случайными узорами. Полученные 3D-коллагеновые полоски, состоящие либо из выровненного, либо случайно расположенного нанофибриллярного коллагена, могут служить инструментами для изучения влияния наноразмерного моделирования на поведение клеток. Кроме того, они предлагают разнообразные возможности как для анизотропных, так и для изотропных приложений тканевой инженерии 23,24,25,26,27. Рисунок может быть настроен в соответствии со структурой исследуемой нативной ткани. Коллагеновые полоски также могут быть объединены в пучки различного размера, чтобы служить в качестве трансплантированного инженерного терапевтического средства при различных размерах и формах травм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление диализованного коллагена ( Рисунок 1)

  1. Отрежьте диализную трубку длиной примерно 3 дюйма. Используйте трубки со следующими характеристиками: ширина по плоской поверхности 32 мм, диаметр по раздутости 20 мм и размер пор 4,8 нм.
  2. Регидратируйте диализные трубки в сверхчистой воде.
  3. Зафиксируйте один конец трубки зажимом для диализной трубки.
  4. Перенесите 5-6 мл коллагена I типа крысиного хвоста (концентрация: 9-10 мг/мл в 0,02 N уксусной кислоты) в трубку с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой 18 G. Зафиксируйте другой конец трубки, чтобы закрыть.
  5. Положите слой хлопьев полиэтиленгликоля (ПЭГ) толщиной 0,5-1 см на дно стеклянной посуды, а затем поместите диализную трубку, наполненную коллагеном, поверх слоя ПЭГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная тарелка размером 13 x 9 x 2 дюймов обычно может вместить ряд из 4-5 пробирок, наполненных коллагеном. Размер чашки можно регулировать в зависимости от необходимого объема коллагена.
  6. Добавьте еще хлопьев PEG, чтобы полностью покрыть трубку, и поставьте противень в холодильник при температуре 4 °C.
  7. Каждые 10-15 минут удаляйте влажные хлопья ПЭГ с поверхности диализной трубки и снова накрывайте трубку свежим слоем сухого ПЭГ. Верните блюдо в холодильник с температурой 4 °C.
  8. Повторите шаг 1,7 еще два раза, а через 30-35 минут смойте влажные хлопья ПЭГ с помощью водопроводной воды.
  9. Промойте трубку еще раз в ультрачистой воде и промокните трубку насухо салфеткой.
  10. Отсоедините один конец трубки и переложите диализованный коллаген (конечная концентрация: ~30 мг/мл) в микроцентрифужные пробирки. Кратковременно раскрутите пузырьки воздуха в коллагене с помощью мини-центрифуги (2000 x g, ≤30 с, комнатная температура [RT]) и храните при температуре 4°C для последующего использования.
  11. За сутки до использования загрузите коллаген в шприцы.
    1. С помощью иглы 16-го калибра наберите ~1 мл диализованного коллагена в шприц объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген является вязким веществом. Возможно, потребуется предварительно загрузить головку иглы коллагеном перед тем, как набрать больше коллагена. Снимите головку иглы и при необходимости удалите большие воздушные карманы
    2. Извлеките иглу и оберните головку шприца парапленкой.
    3. Храните шприц, наполненный коллагеном, в вертикальном положении при температуре 4° C в течение ночи, чтобы мелкие пузырьки воздуха лопнули.

2. Подготовка стеклянной крошки ( Рисунок 1)

ВНИМАНИЕ: Используйте средства защиты глаз для этой части протокола.

ПРИМЕЧАНИЕ: Специально покрытые гидрофобные стеклянные стекла используются для экспериментов с клеточными культурами. Горки должны обрабатываться за края, чтобы предотвратить удаление поверхностного покрытия. Выполните процедуру резки стекла на подходящей режущей поверхности.

  1. Измерьте и разметьте желаемые размеры стеклянной стружки с помощью перманентного маркера
    1. При создании 8-полосных лесов разметьте шаг примерно в 1 см по длинному краю горки. При необходимости отрегулируйте размеры в зависимости от желаемого размера строительных лесов.
  2. Используя прямую кромку (т.е. кромку 6-луночной пластины), проведите стеклорезом вниз по длине первого измерения, чтобы надрезать стекло.
  3. Предметное стекло либо сломается вдоль надрезанной линии само по себе, либо перевернет предметное стекло на салфетку (гидрофобной стороной вниз) и вручную надавит на область надреза.
  4. Отметьте покрытую поверхность гидрофобного предметного стекла этаноловым маркером.
  5. Промойте скол стекла в ультрачистой воде, чтобы удалить остатки стеклянной пыли.
  6. Высушите стеклянную стружку либо с помощью настольной форсунки для сжатого воздуха, либо сложив ее под углом в вытяжном шкафу.
  7. Повторите по мере необходимости для необходимого количества фишек. Храните чипсы в RT. Для достижения наилучших результатов в культивировании клеток используйте подготовленные чипсы в течение 7 дней.

3. Приготовление 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS)

  1. Наполните стеклянную бутылку 500 мл ультрачистой воды.
  2. Добавьте в флакон 10 таблеток PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что соотношение таблеток для 1x PBS составляет 1 таблетку на 500 мл. При необходимости отрегулируйте количество таблеток, если вы используете таблетки другого размера или марки.
  3. Добавьте в бутылку мешалку и положите на тарелку для размешивания до тех пор, пока таблетки не растворятся.
  4. В день изготовления гидрогеля переложите необходимый объем 10x PBS в конические пробирки объемом 50 мл.
  5. Поместите пробирки, наполненные PBS, на водяную баню при температуре 37 °C не менее чем на 15 минут до производства коллагена.

4. Изготовление выровненных коллагеновых нанофибрилл (Рисунок 2)

  1. Достаньте из холодильника шприц с коллагеном и прикрепите тупую иглу 22 G.
  2. Поместите предметное стекло в крышку 4-луночной пластины.
  3. Накройте предметное стекло достаточно подогретым 37 °C 10x PBS для погружения в него (30-50 мл).
  4. Держа шприц под углом примерно 30-45°, вручную выдавите тонкие полоски коллагена на стеклянную стружку со скоростью ~340 мм/с и расходом ~3,2 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите экструзию коллагена в течение 30-60 секунд после добавления подогретого PBS, чтобы убедиться, что PBS не охлаждается чрезмерно.
  5. Подождите 1-2 минуты, чтобы коллаген завершил фибриллогенез или пока коллаген не приобретет непрозрачный белый цвет.
  6. С помощью щипцов разрежьте коллагеновые полоски по длине. Убедитесь, что полоски достаточно длинные, чтобы 3-5 мм можно было согнуть под любым концом чипа.
  7. По одной аккуратно накидывайте полоски коллагена вдоль (параллельно зазубренной области) на подготовленную стеклянную крошку. Заправьте края под сколот.
  8. Продолжайте укладывать коллагеновые полоски до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые размеры.
  9. Поместите новообразованный гидрогель с коллагеном в две лунки 12-луночного планшета. Это обеспечивает приток воздуха во время процесса сушки и предотвращает прилипание хвостовых кончиков коллагена к нежелательным поверхностям.
  10. Оставьте гидрогели на столе для высыхания на 1-3 часа или пока кристаллы соли PBS не покроют 50%-90% поверхности гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время высыхания будет варьироваться в зависимости от размера гидрогеля и наличия лишней жидкости.
  11. Погрузите каждый гидрогель в 1x PBS примерно на 30-60 с или до тех пор, пока кристаллы соли не растворятся.
  12. Аккуратно промокните излишки PBS салфеткой.
  13. Поместите гидрогели обратно на пластину лунки и оставьте сохнуть в вытяжном шкафу на ночь.
  14. Храните высушенные гидрогели при температуре около 1 недели.

5. Изготовление случайных коллагеновых нанофибрилл (Рисунок 3)

  1. Достаньте из холодильника шприц с коллагеном и прикрепите тупую иглу 22 G.
  2. Выдавите коллаген со скоростью ~3,2 мл/мин на сухую стеклянную стружку. Выдавите достаточное количество коллагена, чтобы получить размеры, аналогичные выровненным коллагеновым гидрогелям. При необходимости предотвратите накопление пузырьков воздуха.
  3. Выдавите дополнительный коллаген, чтобы обернуть вокруг краев стеклянной крошки. Это сводит к минимуму риск случайной отслоения.
  4. С помощью щипцов погрузите экструдированный коллаген в 50 мл пробирки с подогретым 10x PBS.
  5. Подождите 45-60 с, пока коллаген не завершит фибриллогенез или пока коллаген не приобретет непрозрачный белый цвет.
  6. Аккуратно промокните излишки PBS салфеткой.
  7. Выполните шаги 4.9-4.14 для промывки и сушки гидрогелей

6. Стерилизация и регидратация

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в шкафу биобезопасности

  1. Стерилизуйте коллагеновые гидрогели и окружающие лунки в 70% этаноле в течение 15 минут.
    1. Кратковременно поднимите гидрогели в середине стерилизации с помощью щипцов, чтобы убедиться, что нижняя сторона стеклянной стружки и гидрогель находятся в контакте с этанолом.
  2. Удалите этанол и дайте гидрогелю высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
  3. Промойте гидрогели 3 раза в стерильном 1x PBS, по 10 минут каждый, чтобы удалить остатки этанола и регидратировать гидрогели. Гидрогели теперь готовы к использованию (клеточная культура и т.д.). Гидрогели можно ненадолго оставить в PBS после заключительного этапа промывки, если они не готовы к использованию сразу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает простую технику экструзии на основе сдвига для изготовления коллагеновых гидрогелей, состоящих либо из выровненных (Рисунок 2), либо случайно ориентированных (Рисунок 3) нанофибрилл. Моделирование нанофибрилл основано на точном контроле сил сдвига, которое достигается за счет комбинированной модуляции скорости вращения шприца и скорости экструзии коллагена. Оптимальными значениями для индукции выравнивания фибрилл ранее были определены ск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важнейшие этапы протокола можно разделить на три основные части: 1) фибриллогенез коллагена, 2) нанесение гидрогеля и 3) промывка. Процесс фибриллогенеза коллагена происходит спонтанно в нейтрализующих условиях и основан на самосборке отдельных молекул коллагена в более крупные стабилизированные фибриллярные структуры10,11. Это достигается за счет применения нейтрализующей буферной среды, такой как PBS 10x, которая нагревается до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано финансированием со стороны Альянса по исследованиям и обучению в области регенеративной реабилитации, MTF Biologics, Фонда Орегонского университета здоровья и науки и Медицинского фонда Коллинза. K.M.H. был поддержан стипендией Национального научного фонда для аспирантов (DGE-1937961) и стипендией Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) (5TL1TR2371-8). K.H.N. был поддержан грантами от NIH/NHLBI (R00HL136701) и NIH/NIAMS (R01AR080150).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллаген I, высокая концентрация, рог крысиного хвостаCB354249
микроскоп Eclipse TE-2000-UNikonTE-2000-U Инвертированный микроскоп
Предметные стекла для сверхтолстого микроскопаFisher Scientific22-267-005Хорошо подходит для поверхности экструзии коллагена
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AСканирующий электронный микроскоп
Набор инструментов для резки стекла 2-20 мм Карандаш Подача масла Твердосплавный наконечникAmazon/MOARMORB07Y1D243HОпция для стеклореза
Hamilton Kel-F Hub Тупоконечные иглы (замок Люэра, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Иглы для экструзии коллагена
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Гидрофобные слайды
PBS ТаблеткиThermo Fisher Scientific18912014
Полиэтиленгликоль 8000Биореагенты FisherBP233-1
Бесшовная трубка для диализа целлюлозы Fisher ScientificS25645G
SnakeSkinThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware СтеклорезSynthware31-501-927Опция для стеклореза
Зажимы для диализа

Ссылки

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

нанофибриллярный коллагенпаттернирование коллагенафибриллогенез коллагенавнеклеточный матриксдиализная трубканапряжение сдвигаколлагеновый гидрогельвыравнивание клетокрегенеративные биоматериалы
Производство коллагена с нанофибриллярным рисунком для тканевой инженерии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.