Методическая статья

Создание новой системы перфузии легких ex vivo для легких крыс после смерти от кровообращения

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67168

⸱

18 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-Japan Friendship Institute of Clinical Medicine, 2Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, 3Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Цель состоит в том, чтобы разработать новую модель перфузии легких ex vivo (EVLP) у крыс, которая может поддерживать стабильную функцию легких в течение 4 часов на протяжении всего EVLP, и предоставить отрасли специфику реализации, которая предложит надежный метод применения EVLP к моделям грызунов.

Аннотация

Растущий дефицит донорских легких для трансплантации вызвал значительный интерес к использованию органов, полученных от доноров после сердечной смерти (DCD). Тем не менее, важнейшей проблемой остается максимизация количества жизнеспособных легких, отвечающих строгим критериям для клинического использования. Перфузия легких ex vivo (ЭВЛП) является перспективной технологией для оценки и потенциального улучшения функции донорских легких. В данной статье описывается разработка экономически эффективной и воспроизводимой экспериментальной платформы для мелких животных, специально разработанной для исследований ЭВЛП. Эта платформа предлагает высокую степень индивидуализации, позволяя исследователям адаптировать экспериментальные параметры для решения конкретных исследовательских вопросов в области EVLP. Команда создала модель крысы для моделирования DCD и реализовала двухэтапный подход к сохранению. Легкие подвергали статическому хранению в холоде с использованием раствора перфузата при температуре 4 °C в течение 4 ч с последующей нормотермической ЭВЛП в течение еще 4 ч. Исследователи оценивали различные параметры функции легких, включая легочное сосудистое сопротивление, легочную динамическую податливость, измерения перфузата в крови и гибель апоптотических клеток в тканях легких. Исследование демонстрирует, что EVLP может значительно улучшить функциональные характеристики легких DCD по сравнению с простым хранением в холоде при 4 °C, предполагая, что EVLP обладает потенциалом для смягчения ишемии-реперфузионного повреждения и улучшения функции трансплантата после смерти циркулятора, тем самым увеличивая пул трансплантируемых легких.

Введение

Трансплантация легких (LTx) остается единственным окончательным методом лечения пациентов с терминальной стадией заболевания легких. Успех трансплантации легких зависит от наличия высококачественных донорских легких с адекватной функцией. Тем не менее, растущий список ожидания на трансплантацию легких возник во всем мире из-за критической нехватки донорских легких1. Многие пациенты в списке ожидания испытывают ухудшение здоровья или даже смерть во время ожидания подходящего донорского легкого в разумные сроки2. Поэтому крайне важно расширить пул потенциальных трансплантатов, чтобы удовлетворить потребности пациентов, ожидающих трансплантации. Донорство после сердечно-сосудистой смерти (DCD)1,3 и ex vivo lung perfusion (EVLP)4,5 - это две многообещающие стратегии для увеличения количества доступных для трансплантации легких. В настоящее время донорство после смерти мозга (DBD)6 является основным источником трансплантации легких. Однако из-за текущей нехватки трансплантатов DCD набирает обороты. Этот сдвиг обусловлен ограничениями трансплантатов DBD, где изменения в кровотоке, искусственной вентиляции легких, инфекции и аспирации могут поставить под угрозу качество трансплантата. Качество трансплантата напрямую влияет на исход лечения пациента и долгосрочную выживаемость после трансплантации. Процесс перфузии легких ex vivo (EVLP) эффективно увеличил количество доступных трансплантаций легких за счет повторной оценки трансплантатов легких от доноров после сердечной смерти (DCD), что привело к аналогичным результатам как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе7,8. Целью данного исследования была разработка экстракорпоральной системы перфузии легких у крыс с циклически мертвыми легкими и точная оценка доноров DCD. Чтобы снизить вероятность первичной дисфункции трансплантата (ПГД), вред донорам DCD class9 может быть сведен к минимуму с помощью молекулярной диагностики10 и применения специализированных таргетных методов лечения.

EVLP - это метод, который воспроизводит естественную среду легких вне тела, поддерживая нормальную физиологическую температуру. Он позволяет непрерывно контролировать и оценивать легкие11,12, продлевает время хранения трансплантатов13, а также использует внешнюю перфузию, вентиляцию и лекарства для улучшения качества маргинальных легких, делая их пригодными для трансплантации14. О первом успешном использовании маргинальных донорских легких для трансплантации легких с помощью EVLP сообщили Steen et al. в 200715. С тех пор использование технологии EVLP постепенно стало интегрированным в клиническую практику16,17. Впоследствии команда из Торонто адаптировала подход EVLP, используя вентиляцию с низким дыхательным объемом и низкой скоростью потока в сочетании с идеальной стратегией защиты легких центробежного насоса; Это приводило к устойчивой перфузии в течение 12 ч18.

EVLP предлагает несколько преимуществ, включая снижение риска первичного отторжения трансплантата, минимизацию отека легких, смягчение воспаления, связанного со смертью мозга, подготовку иммунной системы реципиента к трансплантации и предотвращение инфекций легких, аспирации, тромбоэмболии легочной артерии и ишемии-реперфузионного повреждения14,19,20. Несмотря на то, что ЭВЛП обладает значительными преимуществами, существует потребность в усовершенствованных методах повышения качества трансплантата.

В настоящее время нет единого мнения о конкретных настройках для перфузии и вентиляции на платформе EVLP для крыс. Ohsumi et al.21 разработали новую модель для изучения того, как донорские легкие, которые прошли через длительные периоды холодной ишемии (CIT), могут сохранить свою функцию легких во время процесса перфузии легких ex vivo (EVLP) и после трансплантации. На международном уровне было предпринято несколько попыток создать модели перфузии легких (EVLP) на крысах ex vivo22,23,24,25,26,27 для достижения более надежной и точной перфузии. Поэтому крайне важно разработать экономически эффективную, высоковоспроизводимую и строго контролируемую систему EVLP для мелких животных, чтобы облегчить дальнейшие исследования в этой области. Существующие системы EVLP для мелких животных часто являются дорогостоящими и имеют ограниченную гибкость с точки зрения изменения условий эксплуатации для различных исследовательских потребностей. В данной статье предлагается экономически эффективная и адаптируемая конструкция системы EVLP. Кроме того, в нем подробно объясняются технические и хирургические шаги, необходимые для его реализации. Мы использовали модель с использованием умерших крыс с остановкой кровообращения, чтобы продемонстрировать, что EVLP улучшает качество легких DCD, тем самым увеличивая пул жизнеспособных доноров легких для трансплантации. Мы стремимся поделиться нашим успешным опытом, чтобы помочь другим исследователям в создании легкодоступной платформы EVLP для мелких животных после сердечно-сосудистой смерти.

Протокол

Экспериментальными животными были самцы крыс SD весом 250-400 г. Крысы содержались в стандартных экспериментальных условиях при температуре 18-22 °С с контролируемым 12-часовым циклом «свет-темнота» и имели свободный доступ к пище и воде. Комитет по уходу за животными и их использованию Института клинических исследований Китайско-японской больницы дружбы одобрил эксперименты на животных и провел их в соответствии с руководящими принципами. Все операции проводились под общим наркозом. На рисунке 1 представлена принципиальная схема и реальное изображение системы EVLP для справки. Конкретная марка и модель всех используемых приборов и оборудования подробно описаны в Таблице материалов

1. Конструкция аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печатный пластик кажется многообещающим выбором для устройства. Однако, исходя из нашего ограниченного опыта, трудно регулировать усилие при завязывании узлов пластиковыми материалами; Слишком малое усилие может привести к соскальзыванию трубки, а слишком большое усилие может заблокировать пластиковую трубку. Металлические жесткие трубки позволяют избежать этих проблем и относительно долговечны, поэтому они используются здесь.

  1. Подключите модуль к пластиковой трубе и используйте железную рамную подставку и регулируемую подъемную платформу, чтобы расположить все детали на соответствующей высоте. Добавьте 150 мл перфузии в резервуар для хранения жидкости, откройте перистальтический насос и установите скорость потока на 20 мл/мин, чтобы перфузия заполнила трубку.
  2. 1.2Зашлифуйте круглую канавку для эндотрахеальной интубации. Приготовьте газовую смесь, содержащую 8%О2, 6%СО2 и 86%Н2 в виде гипоксического газа. Пропустите гипоксический газ в перфузионную систему через искусственную мембрану легкого. Проветрите с чистым кислородом в течение 5 минут перед измерением газов крови.
  3. Сделайте легочную артерию и предсердные канюли из полых трубок из нержавеющей стали 304, изогнутых в соответствии с анатомией крыс (Рисунок 2A). Измельчите круговую канавку для интубации артерии. Сделайте отверстие на дистальном конце стенки предсердной канюли и отполируйте кольцевую борозду на внешней стенке (Рисунок 2C). Установите вытяжное устройство перед вводом трубки в перфузионную трубку легочной артерии.
  4. Подключите трехходовой клапан к системе внешней циркуляции водяной бани и отрегулируйте температуру резервуара, органного отсека и перфузата легочной артерии. Минимизируйте длину соединительной трубы, не относящейся к водяной бане, и контролируйте погрешность температуры во всех точках устройства в диапазоне ± 0,2 °C. Желаемая температура для дизайна исследования составляет 37 °C.
  5. Заполните линию контроля давления физиологическим раствором и отрегулируйте устройство контроля давления на той же высоте, что и легкое донора. Откройте клапан, чтобы соединить линию контроля давления с линией легочной артерии и линией венозной перфузии, запустите сборщик данных и установите ноль. Контролируйте артериальное перфузионное давление и давление венозного возврата в режиме реального времени.

2. Обезболивание крыс

  1. Надевайте средства индивидуальной защиты: хирургические маски, перчатки и одноразовый комбинезон перед работой с крысами и тканями крыс
    2. .
  2. Взвесьте крыс и запишите их вес. Наполните шприц 1000 Ед/кг гепарина и введите его в хвостовую вену с помощью иглы.
  3. Поместите крыс в закрытую индукционную камеру и обезболите их 3% газом изофлураном. Зажмите пальцы ног крыс; Если ответа нет, это указывает на то, что крысы достигли желаемой глубины анестезии. В противном случае продолжайте увеличивать время анестезии. Наносите стерильную офтальмологическую мазь для профилактики сухости глаз.
  4. Подготовьте несколько швов (3-0 или 4-0). Перенесите крыс на операционный стол, расположите их в лежачем положении, закрепите швами, продезинфицируйте спиртовым спреем.

3. Забор донорского легкого

  1. Поместите голову крысы в маску для анестезии и поддерживайте анестезию, подавая воздух, содержащий 1,5% изофлурана. Зажмите пальцы ног крыс; Если ответа нет, это указывает на то, что крысы достигли желаемой глубины анестезии.
  2. Сделайте продольный разрез 2-3 см хирургическими ножницами для грызунов по средней линии шеи перед трахеей, разрежьте кожу, рассеките мышечную ткань перед трахеей, полностью обнажите трахею.
  3. Освободите пространство за трахеей, проденьте через нее шов 3-0 и завяжите свободный узел для последующего использования. Сделайте V-образный разрез на 0,5 см хирургическими ножницами грызуна над узлом в трахее, вставьте трахеальную трубку (14G) в трахею, затяните шовный узел и закрепите трахеальную трубку (рисунок 3A).
  4. Подсоедините трахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких, включите его и начните вентиляцию легких.
  5. Часто контролируйте и записывайте жизненно важные показатели, чтобы обеспечить анестезию и изменения жизненно важных показателей до тех пор, пока смерть не будет подтверждена.
  6. Инициируйте маневры рекрутирования легких, возобновите искусственную вентиляцию легких в режиме контролируемого давления и проветривайте в течение 5 мин. Используйте следующие параметры: PEEP 3 смH2O, соотношение вдоха: выдох (I:E) 1:2, частота дыхания 40 вдохов/мин и FiO2 0,5.
  7. Зажмите трахею и дайте легким пройти 1 ч теплого ишемического времени (WIT). После периода WIT извлеките легкие, как описано ниже, и случайным образом разделите их на три группы: (1) прямой забор легких, (2) 4-часовая холодостатическая консервация (CS) и (3) 4-часовая оценка EVLP.
  8. Для прямого забора легких берут образцы полученных донорских легких без какой-либо обработки для различных анализов. В течение 4 часов для сохранения холодного статического электричества (CS) храните донорские легкие в холодильнике при температуре 4 °C в течение 4 часов, а затем возьмите образец для обнаружения. Оценка ЭВЛП через 4 часа. Для оценки ЭВЛП через 4 часа выполните шаг 5.
  9. Отрегулируйте операционный стол в наклонное положение под углом 45° и ногами.
  10. Удалите шерсть с помощью бритвы с середины груди и живота крысы, продезинфицируйте ее йодом 3x и накиньте хирургическим полотенцем.
  11. Хирургическими ножницами грызуна сделайте продольный разрез по средней линии живота на 6-7 см, разрежьте кожу, откройте брюшную стенку к брюшной полости, обнажите органы брюшной полости. С помощью ватного тампона аккуратно протолкните кишечник к правой стороне брюшной полости, чтобы обнажить нижнюю полую вену позади них.
  12. С помощью шприца введите раствор 1000 ЕД/кг гепарина в нижнюю полую вену. Подождите 5 минут, чтобы обеспечить достаточную гепаринизацию крови. Гепарин предотвращает образование микротромбов в легочной артерии.
  13. Разрежьте ножницами нижнюю полую вену крысы, обескровливая ее. Начинайте искусственную вентиляцию легких с начальных настроек аппарата ИВЛ при дыхательном объеме 3 мл/кг, положительном давлении в конце выдоха (PEEP) 2 смН2О, частоте дыхания 60 вдохов/мин и соотношении I:E 1:2.
  14. Используйте щипцы для поднятия мечевидного отростка; сделайте продольный разрез вдоль грудины снизу вверх. Используйте расширитель ребер, чтобы обнажить грудную полость. Удалите ткань тимуса, чтобы обнажить сердце и основные кровеносные сосуды под ним.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие крыс хрупкие; Избегайте прикосновения к ним или органам брюшной полости металлическими инструментами. Для лучшей видимости аккуратно отодвиньте легкие в сторону ватной палочкой.
  15. Освободите аорту крысы и пространство за легочной артерией, проложите через нее шов 3-0 и завяжите свободный узел для последующего использования.
  16. Сделайте V-образный разрез диаметром 2-3 мм на передней поверхности выходного тракта правого желудочка, вставьте канюлю легочной артерии в легочную артерию через разрез и затяните предварительно наложенный шов, чтобы зафиксировать канюлю (рисунок 3B).
  17. Разрежьте кончик сердца крысы, вставьте кровоостанавливающие щипцы в левый желудочек, нарушите клапаны между левым желудочком и левым предсердием и убедитесь, что выходной тракт левого предсердия свободен.
  18. Подключите канюлю легочной артерии к контуру перфузии и промойте остаточную кровь со скоростью 0,6-1 мл/мин, используя 15 мл раствора с низким содержанием калия. Промывайте до тех пор, пока легкие не станут белыми или пока перфузионная жидкость, выходящая из левого желудочка, не станет белой.
  19. Наложите шов за сердцем и оберните желудочек; вставьте канюлю левого желудочка через разрез в левом желудочке; и затяните предварительно наложенный шов, чтобы зафиксировать канюлю (Рисунок 3C).
  20. Отрежьте трахею над трахеальной трубкой, приподнимите трахею и с помощью ножниц отделите соединительную ткань позади трахеи вниз до уровня диафрагмы.
  21. Отрежьте нижнюю полую вену и главную легочную артерию над диафрагмой; удалите сердце и легкие (Рисунок 3D).
  22. Чтобы легкие оставались надутыми, в конце ингаляции немедленно зажмите нижнюю треть трахеи, соберите сердце и легкие и поместите их в раствор с низким содержанием калия для консервации.
  23. Поместите сердце и легкие в указанное положение контура EVLP и подключите канюлю левого желудочка к контуру перфузии (Рисунок 4A).

4. Инициализация системы перфузии легких ex vivo

  1. Соберите схему ЭВЛП: подключите трубку, оксигенатор, резервуар, перистальтический насос и камеру органа.
  2. Перед перфузией заполните контур ЭВЛП 120 мл раствора для восстановления перфузии легких, который содержит 1000 единиц гепарина натрия, 50 мг цефоперазона и 50 мг метилпреднизолона. Избавьтесь от пузырьков воздуха в трубке, чтобы использовать вытяжное устройство в конце перфузии легочной артерии.
  3. Установите водяную баню на комнатную температуру и начните циркуляцию теплой воды для нагрева всего контура EVLP.
  4. Откройте компьютерную программу сбора данных и подключите датчик давления в легочной артерии, датчик массы легких, датчик скорости насоса и датчик температуры к цепи EVLP и регистратору.
  5. Заполните трубку для мониторинга артериального давления обычным физиологическим раствором, отрегулируйте высоту стола в соответствии с высотой подаваемого легкого, подключите трубку для контроля давления к легочной артерии и трубке венозной перфузии, откройте клапан, запустите сборщик данных и обнулите систему.
  6. Откройте клапан гипоксического газа, пропустите гипоксический газ через мембранное легкое в течение 10 минут, пока перфузионный раствор не достигнет стабильного гипоксического состояния, закройте газовый клапан и приостановите работу перистальтического насоса, ожидая прибытия донорского легкого для перфузии легких ex vivo.
  7. Подготовьте операционный стол и хирургические инструменты рядом с платформой EVLP для мелких животных и предварительно простерилизуйте их с помощью паровой стерилизации под высоким давлением.

5. Перфузия легких ex vivo

  1. Наполните пузырьковую ловушку достаточным количеством перфузионного раствора, чтобы предотвратить попадание пузырьков в легкие (вызывающее воздушную эмболию).
  2. Поместите сердечно-легочный блок в камеру органа, подключите его к устройству EVLP, включите аппарат искусственной вентиляции легких и перистальтический насос и запустите перфузию EVLP (рисунок 4B).
  3. Начинайте перфузию с 20% от целевой скорости потока; постепенно увеличивайте скорость потока до целевой скорости потока в течение 1 ч; рассчитывайте целевую скорость потока как 20% от сердечного выброса (75 мл/мин/250 г веса донора).
  4. Установите теплообменник на 40 °C, чтобы поддерживать температуру легких на уровне 37,5 °C. В течение 20 мин температура перфузионного раствора увеличивается с 25°С до 37°С.
  5. Снимите эндотрахеальный зажим через 20 минут после начала перфузии. Начните искусственную вентиляцию легких с частотой дыхания (ОР) 60 уд/мин, положительным давлением в конце выдоха (ПДВ) 3 смЧ2О и начальным дыхательным объемом (ТД) 4 мл/кг, достигая максимального дыхательного объема 6 мл/кг в течение 10 минут.
  6. Запустите поток гипоксического газа (8% CO2, 6% O2 и 86% N2) для поддержания поступления перфузионного раствора PCO2 в легочную артерию в диапазоне от 35 до 45 мм рт. ст. одновременно во время вентиляции.
  7. Постоянно контролируйте скорость потока перфузионного раствора, артериовенозное давление, пиковое давление дыхательных путей и параметры функции легких во время перфузии.

Результаты

Для определения того, насколько эффективно EVLP сохранила легкие доноров DCD, необходимо оценить количество апоптотических клеток, выявленных с помощью окрашивания TUNEL, уровни воспалительных маркеров (определенные в перфузате с использованием набора QAH-INF-1) и общий внешний вид (окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)) бьющихся сердец донорских легких во всех группах. Все легкие доноров DCD подвергались 4-часовой перфузии. В большинстве легких наблюдалась стабильная податливость с постепенным снижением в течение 4-часового периода (Рисунок 5B). Значимых различий в сосудистом сопротивлении и уровнях оксигенации легочного транспланта среди легких доноров DCD выявлено не было (Рисунок 5A,C). Уровни глюкозы в перфузате снижались со временем, при этом значимых различий между отдельными крысами не наблюдалось (Рисунок 5D). Уровни электролитов в перфузате оставались схожими во всех группах (Рисунок 5E-F).

Окрашивание TUNEL проводили методом маркировки концов разрывов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP с использованием набора для детекции апоптоза в соответствии с инструкциями производителя по выявлению апоптотических ядер. Окрашивание TUNEL применяли для количественной оценки апоптоза (программируемой гибели клеток) альвеолярных эпителиальных клеток в легких доноров DCD при различных условиях консервации. Слепой анализ количества апоптотических клеток выявил значительно большее число положительных клеток в донорской группе по сравнению с другими группами. Кроме того, в группе холодной консервации наблюдалось большее количество положительных клеток по сравнению с легкими доноров DCD, подвергнутыми перфузии EVLP (Рисунок 6). Для оценки патологоанатомических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), использовали пять независимых переменных: 1) инфильтрация воспалительных клеток в альвеолярное пространство, 2) утолщение альвеолярных перегородок, 3) внутри- и внеальвеолярное кровоизлияние, 4) внутриальвеолярный отек и 5) образование гиалиновых мембран. Переменные оценивали по шкале от 0 до 4: 0 = отсутствует, 1 = слабо выражено, 2 = умеренно, 3 = выражено и 4 = тяжело. Сумма баллов по всем переменным определяла общий балл повреждения легких. Общий балл повреждения легких в группе EVLP был значимо ниже, чем в группе холодной статической консервации и в контрольной группе (Рисунок 7A). В группе холодной статической консервации продолжительностью 4 ч наблюдаются утолщение стенок альвеол и альвеолярные кровоизлияния (Рисунок 7B). В группе EVLP сохраняется нормальная структура альвеол (Рисунок 7C).

Схема установки для искусственного кровообращения, мембранного оксигенирования, экспериментальный метод.
Рисунок 1: Схема и фотография контура ex vivo перфузии легких (EVLP) мелких животных. Буквы на схеме соответствуют буквам на фотографии и описывают функцию каждого компонента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Компоненты хроматографической системы; схема металлических соединителей, фитингов и частей трубок.
Рисунок 2: Изготовленные на заказ канюли. (A) Канюля легочной артерии. (B) Канюля трахеи. (C) Канюля левого предсердия. (D) Набор канюль для перфузии легких крысы ex vivo. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема хирургической процедуры на грызуне, показывающая этапы сердечно-сосудистой диссекции и обнажения органов.
Рисунок 3: Изоляция легкого крысы. (A) Канюля трахеи установлена в нужное положение и зафиксирована шелковой нитью. (B) Легочная артерия канюлирована и перевязана ранее наложенной шелковой нитью. (C) Канюля левого предсердия зафиксирована шелковой нитью. (D) Соединительная ткань тупо диссектируется для извлечения блока сердце-легкое. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема эксперимента по перфузии органов; A: соединения трубок, B: орган в камере сохранения для исследования.
Рисунок 4: Установка для перфузии легких крысы. (A) Блок «сердце-легкие» помещен в контур перфузии легких ex vivo. (B) Правильно вентилируемое и перфузируемое легкое, подключенное к контуру EVLP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики физиологических параметров с течением времени: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, глюкоза, натрий, калий.
Рисунок 5: Функция легких во время протокола EVLP у крыс. (A-F) Функция легких и анализ газов крови донорских легких, подвергнутых EVLP после 1 ч времени теплой ишемии (WIT). (A) Индекс оксигенации легких. (B) Динамическая податливость легких (Cdyn). (C) Легочное сосудистое сопротивление (PVR). (D) Уровень глюкозы в перфузате через 4 ч после начала EVLP. (E) Уровень натрия в перфузате через 4 ч после начала EVLP. (F) Уровень калия в перфузате через 4 ч после начала EVLP. Планки погрешностей указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема TUNEL-анализа с окрашиванием DAPI, сравнение условий DCD, DCD+COLD и DCD+EVLP.
Рисунок 6: Репрезентативные изображения TUNEL-анализа для различных случаев. TUNEL-положительные клетки: зеленая флуоресценция указывает на апоптотические клетки; DAPI: синяя флуоресценция представляет ядра; Merge: все клетки, включая клетки, подвергающиеся программируемой клеточной смерти (апоптозу). DCD — группа прямого забора легких. DCD+COLD — группа 4-часового холодного статического хранения. DCD+EVLP — группа 4-часовой перфузии легких ex vivo (EVLP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма показателей повреждения легких и гистологический анализ легочной ткани, изображение экспериментальных результатов.
Рисунок 7: Показатели повреждения легких и гистологические результаты. (A) Показатели повреждения легких в контрольной группе, группе SCS и группе EVLP (*, p <0.05). (B) Репрезентативные срезы доноров при холодном статическом сохранении (SCS), окрашенные гематоксилином и эозином (H&E). Черная стрелка указывает на разрыв эпителия легочных капилляров, синие стрелки указывают на утолщение альвеолярных стенок. (C) Репрезентативные срезы доноров EVLP, окрашенные H&E. Красная стрелка указывает на инфильтрацию воспалительными клетками. (D) Репрезентативные срезы доноров с прямым забором органов (контроль), окрашенные H&E. Черные стрелки указывают на разрыв и кровоизлияние из эпителия легочных капилляров. Планки погрешностей указывают стандартное отклонение; анализ значимости проводился с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В этом исследовании представлена экономически эффективная и модульная конструкция платформы EVLP для мелких животных и валидация эффективности этой платформы в модели DCD на крысе. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЭВЛП может значительно улучшить качество легких умерших доноров, тем самым расширяя пул потенциальных доноров для трансплантации легких. Нехватка донорских легких для трансплантации остается критической проблемой. Для решения этой проблемы некоторые страны приступили к осуществлению программ DCD28. Этот подход предлагает ценную стратегию для увеличения количества жизнеспособных трансплантатов органов. Примечательно, что многочисленные исследования показали, что долгосрочные показатели выживаемости после трансплантации печени с использованием органов DCD сопоставимы с показателями с использованием органов из DBD29,30. Тем не менее, использование легких от доноров DCD остается ограниченным из-за обширных повреждений, вызванных длительной ишемией31. Эффективная оценка и использование ограниченных ресурсов легких, полученных от доноров DCD, обладают огромным потенциалом для смягчения нехватки легких, пригодных для трансплантации. ЭВЛП является перспективной методикой, которая позволяет улучшить качество легких и продлить время их сохранности до трансплантации. Чтобы проверить эффективность EVLP по сравнению с хранением в холоде при 4 °C, мы использовали модель циркуляторной смерти на крысах. Мы предполагаем, что наша техника перфузии может смягчить ущерб, вызванный ишемией-реперфузионным повреждением, и улучшить функцию легких после смерти от кровообращения. Наши экспериментальные результаты согласуются с недавними выводами, опубликованными Wang et al.32 и Hasenauer et al.33.

Поддержание постоянной температуры во всем контуре перфузии имеет решающее значение для оптимальной работы ЭВЛП. Однако во многих существующих системах EVLP отсутствуют надежные и адаптируемые механизмы контроля температуры. Системы одиночного теплообмена часто требуют регулировки, которая изменяет температуру в определенных местах. Эти колебания температуры могут повлиять на состав перфузионной жидкости, нарушить измерения индекса оксигенации и в конечном итоге поставить под угрозу точность экспериментальных результатов. Чтобы преодолеть эту трудность, была создана система EVLP, оснащенная тремя отдельными теплообменниками на водяной бане, которые были размещены в резервуаре, зонах перфузии легочной артерии и органной камере. Кроме того, в системе используется минимальное количество трубопроводов, что сводит к минимуму потери тепла и обеспечивает точный контроль температуры в диапазоне от 4 до 40 °C. Такая конфигурация обеспечивает высокоточный контроль температуры, при этом измеренные температуры в каждом сегменте контура отклоняются не более чем на ± 0,2 °C от заданного значения. Конструкция эффективно отвечает строгим требованиям к контролю температуры для экспериментов EVLP.

Модели мелких животных, благодаря своим меньшим органам, особенно восприимчивы к отеку легких и ателектазу34. Эти осложнения существенно затрудняют проведение длительных экспериментов по перфузии. Чтобы решить эту проблему и обеспечить оптимальную защиту легких во время перфузии, мы приняли подход Торонто, который в настоящее время является золотым стандартом в клинической практике. Этот метод включает в себя постепенное увеличение как расхода перфузата, так и вентиляции в течение установленного периода времени35. Перфузия начиналась при 10% от целевой скорости потока (20% от сердечного выброса = 75 мл/мин/250 г массы донора) и постепенно увеличивалась в течение 1 ч. Аналогичным образом, вентиляция начиналась с низкой скоростью (4 мл/кг), а дыхательный объем постепенно увеличивался до максимума в 6 мл/кг в течение 10 минут. Исследование также подчеркивает преимущества добавления бычьего сывороточного альбумина (БСА) к перфузату. Добавки БСА повышают коллоидосмотическое давление, тем самым уменьшая отек тканей36. У мелких животных ЭВЛП существуют две первичные конфигурации перфузии, основанные на канюляции предсердий: замкнутая и открытая петля. Системы с замкнутым контуром поддерживают постоянное низкое давление в предсердиях, имитируя физиологические условия и способствуя точному измерению газов крови. Исследование Linacr et al. показало, что поддержание определенного давления в предсердиях во время перфузии может улучшить функцию легких и уменьшить отек34. Тем не менее, скачки давления могут возникнуть, если мышца предсердий блокирует цепь. Кроме того, связывание предсердий и наличие пузырьков воздуха могут поставить под угрозу результаты экспериментов из-за потенциального повреждения волокон миокарда и нестабильных показаний давления7. Чтобы преодолеть эти ограничения и добиться эффективной перфузии с обратной связью, была изготовлена специально разработанная канюля для предсердий. Эта канюля имеет выступающий ортез на кончике для предотвращения обструкции мышцы предсердий. Кроме того, кольцевые бороздки вдоль корпуса канюли способствуют надежному размещению лигатуры. Кроме того, система включает в себя пузырьковые ловушки и методы предварительной перфузии для устранения воздушной эмболии и поддержания постоянного перфузионного давления.

Платформы EVLP для мелких животных пользуются популярностью в научных исследованиях благодаря своим многочисленным преимуществам: контролируемые условия содержания животных, экономичность, размещение больших размеров образцов и низкое потребление перфузионной жидкости. Кроме того, использование одной линии мелких животных (например, крыс в этом исследовании, а также морских свинок и кроликов 24,35,36) позволяет тщательно контролировать как диету, так и экспериментальные условия. Универсальность системы позволяет адаптировать ее для всех этих видов за счет регулировки параметров дыхания и скорости перфузионного потока. В сопроводительных видеороликах подробно описывается животная модель и процедуры ЭВЛП, что дает исследователям всестороннее понимание. Следуя этим протоколам, исследователи могут повысить успешность экспериментов, свести к минимуму страдания животных и сократить общее использование животных.

Несмотря на то, что в ходе исследования была создана доступная, модульная и удобная в использовании система EVLP для мелких животных, которая превосходит коммерческие варианты по стабильности, качеству перфузии и регулируемости, необходимы дальнейшие исследования для оптимизации протоколов EVLP, включая параметры перфузии и вентиляции, а также определения наиболее эффективных препаратов для защиты легких. Эта удобная и эффективная технология позволила успешно провести тестирование на многих донорских легких с использованием инфраструктуры. В настоящее время исследовательские усилия сосредоточены на восстановлении и сохранении легких от доноров.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным финансированием клинических исследований Национальной больницы высокого уровня и проектом "Элитные медицинские специалисты" Китайско-японской больницы дружбы (номера грантов[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] и [ZRJY2021-GG07]).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3,0 мм Медицинская асептическая трубкаZhifang Pump industry Co., LTD, Хэбэй, Китай3,0 ммВ циркуляции крови, а не кровеносных сосудов
Бычий сывороточный альбуминSigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Шанхай, КитайBSAV-ROПовышение коллоидно-осмотического давления перфузии
BP-100/102 Внутрисосудистый преобразователь артериального давленияiWorx Systems, Inc, Нью-Гэмпшир, СШАBP-100/102Записи о легочном сосудистом давлении у крыс
ЦефазолинBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Пекин, КитайPHR1291Антибактериальная инфекция
ДеоксигенаторDongguan Kewei Medical Instrument, Гуандун, КитайНет спецификации модели Заменитьфункцию легких крысы Газообмен в крови
F500 Аппарат общей анестезии для мелких животныхBeijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Пекин, КитайF500Введение газовой анестезии для обеспечения анестезии
Газовая смесь (6% O2, 8% CO2, 86% N2)Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Пекин, КитайНет спецификации моделиПоддержание кислотно-щелочного баланса крови, моделирование физиологии легочных сосудов
ТеплообменникChanghong Precision Instrument Center, Шэньчжэнь, КитайDHC-05-BКонтроль температуры в контуре перфузии
гепаринBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Пекин, КитайH0200000Антимикротромбоз
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd, Шэньчжэнь, КитайR510-22Крысы под наркозом
Изоляторная камераручной работы Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Шанхай, КитайНет спецификации моделиХранение легких крысы
i-STAT 1 Портативный клинический анализаторAbbott point of care, Inc, NJ, США300G Анализгазов крови при перфузии
iWorx RA-834 RecorderiWorx Systems, Inc, Нью-Гэмпшир, СШАRA-834Выход сигнала о давлении в легочных кровеносных сосудах
Многоканальный перистальтический насос LabMateZhifang Pump industry Co., LTD, Хэбэй, КитайLabMate2Поставляет энергию для процесса циркуляции перфузии
PERFADEX PlusXVIVO Перфузия, Гётеборг, ШвецияNAЛегкое от донора крысы было подвергнуто предварительному лалажу; раствор с низким содержанием калия.
легочная канюляИзготовлена из нержавеющей стали304 нержавеющая сталь/SUS3042,0/2,5 мм
Канюля для легочной веныИзготовлена из нержавеющей стали304 нержавеющая сталь/SUS3044,0 мм
QAH-INF-1 набор для анализаInnopsys, Parcd'Activité s Activestre
R415 Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животныхRWD Life Science Co., Ltd, Шэньчжэнь, КитайR415Вентиляция легких крысы
РезервуарShanghai Leighton Industrial Co., LTD, Шанхай, КитайЕмкость 1 лПерфузионное хранилище
SOLU-MEDROLBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Пекин, КитайM0639NA
Датчик температуры (TM-100)iWorx Systems, Inc, Нью-Гэмпшир, СШАTM-100Рекордная температура перфузии легких

Ссылки

  1. Domínguez-Gil, B., et al. Expanding controlled donation after the circulatory determination of death: Statement from an international collaborative. Intensive Care Med. 47 (3), 265-281 (2021).
  2. Valapour, M., et al. Optn/srtr 2020 annual data report: Lung. Am J Transplant. 22 Suppl 2, 438-518 (2022).
  3. Holm, A. M., Courtwright, A., Olland, A., Zuckermann, A., Van Raemdonck, D. ISHLT position paper on thoracic organ transplantation in controlled donation after circulatory determination of death (cdcd). J Heart Lung Transplant. 41 (6), 671-677 (2022).
  4. Chiu, S., Mills, S. E. A., Bharat, A. Expanding the lung donor pool and improving outcomes: Ex vivo lung perfusion. JAMA Surg. 154 (12), 1151(2019).
  5. Nakajima, D., Date, H. Ex vivo lung perfusion in lung transplantation. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 69 (4), 625-630 (2021).
  6. Furukawa, M., et al. Lung transplantation from donation after circulatory death, evolution, and current status in the United States. Clin Transplant. 37 (3), e14884(2023).
  7. Valenza, F., et al. Ex vivo lung perfusion to improve donor lung function and increase the number of organs available for transplantation. Transpl Int. 27 (6), 553-561 (2014).
  8. Divithotawela, C., et al. Long-term outcomes of lung transplant with ex vivo lung perfusion. JAMA Surg. 154 (12), 1143-1150 (2019).
  9. Egan, T. M., et al. Donation after circulatory death donors in lung transplantation. J Thorac Dis. 13 (11), 6536-6549 (2021).
  10. Kanou, T., et al. Cell-free DNA in human ex vivo lung perfusate as a potential biomarker to predict the risk of primary graft dysfunction in lung transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 162 (2), 490-499.e492 (2021).
  11. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the organ care system on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (expand): A single-arm, pivotal trial. Lancet Respir Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  13. Yeung, J. C., et al. Outcomes after transplantation of lungs preserved for more than 12 h: A retrospective study. Lancet Respir Med. 5 (2), 119-124 (2017).
  14. Cypel, M., Keshavjee, S. The clinical potential of ex vivo lung perfusion. Expert Rev Respir Med. 6 (1), 27-35 (2012).
  15. Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. Ann Thorac Surg. 83 (6), 2191-2194 (2007).
  16. Lindstedt, S., et al. Comparative outcome of double lung transplantation using conventional donor lungs and non-acceptable donor lungs reconditioned ex vivo. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 12 (2), 162-165 (2011).
  17. Wallinder, A., et al. Early results in transplantation of initially rejected donor lungs after ex vivo lung perfusion: A case-control study. Eur J Cardiothorac Surg. 45 (1), discussion 44-45 44-45 (2014).
  18. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 27 (12), 1319-1325 (2008).
  19. Frank, J. A., et al. Physiological and biochemical markers of alveolar epithelial barrier dysfunction in perfused human lungs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L52-L59 (2007).
  20. Inci, I., et al. Fibrinolytic treatment improves the quality of lungs retrieved from non-heart-beating donors. J Heart Lung Transplant. 26 (10), 1054-1060 (2007).
  21. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (1), L61-L70 (2020).
  22. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: Lessons learned from developing a rat evlp program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  23. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: Detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  24. Cleveland, W. J., et al. Design and implementation of a rat ex vivo lung perfusion model. J Vis Exp. (195), e64740(2023).
  25. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. 10 (199), e65981(2023).
  26. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  27. Van Zanden, J. E., Leuvenink, H. G. D., Verschuuren, E. aM., Erasmus, M. E., Hottenrott, M. C. A translational rat model for ex vivo lung perfusion of pre-injured lungs after brain death. PLoS One. 16 (12), e0260705(2021).
  28. Choi, K., et al. Early national trends of lung allograft use during donation after circulatory death heart procurement in the United States. JTCVS Open. 16, 1020-1028 (2023).
  29. Krutsinger, D., et al. Lung transplantation from donation after cardiocirculatory death: A systematic review and meta-analysis. J Heart Lung Transplant. 34 (5), 675-684 (2015).
  30. Sabashnikov, A., et al. Long-term results after lung transplantation using organs from circulatory death donors: A propensity score-matched analysis. Eur J Cardiothorac Surg. 49 (1), 46-53 (2016).
  31. Zhao, J., et al. The low utilization rate of donor lungs in china: A single-center experience. Ann Transplant. 26, e931409(2021).
  32. Wang, W., Qian, J., Zhu, M., Wang, Y., Pan, Y. Normothermic ex vivo lung perfusion outperforms conventional cold preservation in a deceased rat lung. Ann Transl Med. 10 (2), 99(2022).
  33. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  34. Linacre, V., et al. Importance of left atrial pressure during ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 35 (6), 808-814 (2016).
  35. Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: First brazilian experience using the il-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplant Proc. 42 (2), 444-447 (2010).
  36. Pacheco-Baltazar, A., Arreola-Ramírez, J. L., Alquicira-Mireles, J., Segura-Medina, P. Isolated lung perfusion system in the rabbit model. J Vis Exp. (173), e62734(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансплантация легкого крысымодель смерти при остановке кровообращениясохранение легкихлегочное сосудистое сопротивлениединамическая комплаентностьизмерение газов кровиишемически-реперфузионное повреждениеапоптотическая гибель клетокконтур перфузии
Создание новой системы перфузии легких ex vivo для легких крыс после смерти от кровообращения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.