Скрининг ковалентных фрагментов с использованием количественного анализа необратимого привязки

Summary

Количественный анализ необратимого связывания (qIT) — это основанный на флуоресценции метод идентификации ковалентных фрагментов, которые избирательно взаимодействуют с белком-мишенью. Здесь подробно описывается протокол для описания анализа qIT, включая примеры результатов.

Abstract

Соединения, образующие ковалентные связи с определенными белками-мишенями, обладают целым рядом преимуществ в качестве химических зондов и терапевтических агентов. Чаще всего, умеренно реакционноспособные, электрофильные малые молекулы используются для образования ковалентных связей с отдельными боковыми цепями цистеина в определенных белках. Электрофильные подходы к открытию лигандов, в соответствии с которыми библиотека электрофильных малых молекул проверяется на белковую мишень, стали популярными, поскольку они позволяют избежать необходимости трудоемкой последующей установки электрофильной боеголовки. Однако такой скрининг сложен, поскольку электрофильные лиганды могут демонстрировать широкий диапазон различных скоростей спонтанной реакции с цистеинами. Количественно-необратимый привязка (qIT) предлагает основанный на флуоресценции метод идентификации и разработки ударов, который нормализует данные для этих различий в реактивности внутренних соединений. Определены скорости реакции отдельных соединений с белком-мишенью и сравнены с реакционной способностью соединения с неструктурированным трипептидом глутатионом (который является показателем спонтанной реакции соединения), что позволяет идентифицировать соединения, которые преимущественно реагируют с интересующим белком. Эта методология была успешно применена для идентификации селективных ковалентных фрагментов в отношении нескольких мишеней для лекарств, включая основную протеазу SARS-CoV-2, циклин-зависимую киназу 2 и RAP27A. В этой статье мы демонстрируем применение qIT к белку-мишени для получения количественного и надежного набора данных, позволяющего определить приоритетность хит-лигандов для будущей разработки.

Introduction

Цистеин-реактивные целевые ковалентные лиганды (молекулы, которые оказывают биологическое действие, реагируя с выбранным остатком цистеина на определенный белок) становятся все более популярными в качестве химических средств и терапевтических средств в последние десятилетия¹. Они обычно состоят из умеренно реакционноспособного электрофила (например, акриламида, хлорацетамида или винилсульфона), присоединенного к лигандной группе с высоким сродством к^{белку-мишени 2}. В идеале лиганд-белковое взаимодействие происходит по двухступенчатому механизму, включающему первоначальное связывание нековалентного лиганда с последующим образованием необратимой ковалентной связи между цистеином-мишенью и электрофилом³.

Несколько ранних целевых ковалентных лигандов, включая ингибитор тирозинкиназы Брутона ибрутиниб, были разработаны путем предоставления ранее идентифицированному обратимому лиганду электрофильной ручки⁴. Однако такой подход не всегда успешен, и другие попытки показали, что электрофильная установка требует^{значительной оптимизации}. Вместо этого в последние годы стали более популярными электрофильные подходы, в частности, с использованием электрофильных фрагментов. Они обычно включают инкубацию библиотеки электрофилов с белком и последующий отбор соединений с повышенной скоростью реакции по отношению к цистеину, которая, как предполагается, индуцируется продуктивными нековалентными взаимодействиями между лигандом и связывающим карманом⁶. Примечательно, что эти методы были успешно применены при разработке ингибитора KRAS (G12C) Соторасиб¹.

Скрининг с использованием электрофилов сопряжен с рядом уникальных проблем по сравнению с традиционным скринингом на основе нековалентных лигандов, главным образом из-за высокой вариабельности реакционной способности внутри и между классами боеголовок⁷. Большинство цистеин-реактивных электрофилов со временем вступают в реакцию со всеми остатками цистеина, подвергшимися воздействию растворителей, независимо от какого-либо избирательного взаимодействия с белком-мишенью. Таким образом, занятость лиганда со временем будет увеличиваться почти для всех электрофилов, и без учета реакционной способности выбор попаданий часто будет смещен в сторону более реактивных фрагментов,^{которые быстрее} атакуют мишень.

Кроме того, методы скрининга с использованием электрофилов часто используют масс-спектрометрию для обнаружения образования белок-лигандного аддуктова, которое ограничено по пропускной способности⁹. Регулярный отбор проб реакции требуется в течение длительного периода времени (от нескольких часов до нескольких дней) для правильной характеристики кинетики реакции для библиотеки соединений с различной^{электрофильностью10}. Таким образом, для скрининга из 300 фрагментов, отобранных в 10 временных точках, потребуется 3000 масс-спектров, что превышает пропускную способность большинства белковых масс-спектрометрических систем. Поэтому желательны методы мониторинга образования аддуктов белок-лиганд с более высокой пропускной способностью.

Описанный здесь подход, количественный анализ необратимого привязки (qIT), представляет собой метод скрининга с использованием электрофилов, который контролирует собственную реактивность и использует простое флуоресцентное считывание⁷. Белок, или глутатион (неструктурированный, содержащий тиол трипептид, используемый в качестве контроля собственной реактивности) инкубируют с библиотекой электрофильных фрагментов, и обычные образцы отбирают для гашения в раствор CPM (7-диэтиламино-3-(4'-малеймидилфенил)-4-метилкумарин, агент для количественного определения флюорогенного тиола). Образование аддукта между цистеином и электрофильным фрагментом уменьшает количество тиола, доступного для реакции с CPM, уменьшая результирующую флуоресценцию при гашении. Таким образом, флуоресценция CPM действует как прокси для непрореагировавшего тиола, позволяя определить кинетику тиоловой реакции с каждым электрофильным фрагментом. Электрофильные фрагменты со значительно повышенной реакционной способностью белка по отношению к глутатиону выбраны в качестве хитов и приоритизированы для дальнейшей разработки (рис. 1).

Рисунок 1: Схема qIT. Схематический обзор анализа qIT. (создано с помощью BioRender). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Выбор попаданий с использованием значений REF контролирует собственную реакционную способность и гарантирует, что фрагменты будут выбраны в качестве попаданий только в том случае, если они образуют продуктивные нековалентные взаимодействия с белковой мишенью. Простое считывание флуоресценции также означает, что анализ qIT обладает широкими возможностями масштабирования и не требует методов мониторинга реакций, основанных на масс-спектрометрии.

Здесь описана комплексная процедура анализа qIT с примерами результатов, иллюстрирующими эффективность анализа и выбор попадания.

Protocol

1. Построение библиотеки фрагментов

1. Спроектируйте библиотеку электрофильных фрагментов и либо синтезируйте их, либо купите. Библиотеки электрофильных фрагментов обычно состоят из слабо реакционноспособных электрофилов (таких как акриламиды, хлорацетамиды и винилсульфанилсульфаниламиды), присоединенных к разнообразному массиву химических каркасов. Библиотеки электрофильных фрагментов широко доступны у коммерческих поставщиков, а более подробная информация об их проектировании и изготовлении рассматривается в других разделах ^5,11.
2. Растворите каждое соединение в ДМСО до концентрации 50 мМ, затем введите другое соединение в каждую лунку столбцов с 3 по 22 пластовой пластины на 384 лунки, называемой библиотечной пластиной фрагментов.
   1. Дозируйте ДМСО в каждую лунку столбцов 1, 2, 23 и 24 для положительного и отрицательного контроля. Расположение пластин может варьироваться в зависимости от количества просеиваемых соединений (Рисунок 2). Объем, добавляемый к библиотечной пластине, будет зависеть от количества проводимых сит, учитывая, что на один сит qIT требуется примерно 1,8 мкл из каждой скважины. Подготовьте эту таблицу библиотеки фрагментов заранее и храните ее при температуре 4 °C.

Рисунок 2: Схема расположения пластин. Обзор схемы расположения 384-луночных планшетов qIT Probsay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Установка для анализа (Рисунок 3)

1. Приготовьте следующие растворы: раствор рекомбинантного белка (целевой белок в любом буфере), буфер для анализа qIT (150 мМ NaCl, 25 мМ Hepes (pH 8)), буфер для гашения qIT (150 мМ NaCl, 25 мМ Hepes (pH 7,5)) и растворы сложных исходных материалов (электрофильный фрагмент (50 мМ) в ДМСО).
   Примечание: pH 8 используется в реакционном буфере для ускорения реакции между остатком цистеина-мишени и фрагментами, что позволяет измерять скорость реакции даже для чрезвычайно слабо реакционноспособных фрагментов. Несколько более низкий pH 7,5 используется в буфере для гашения, поскольку тиоэфирная связь, образующаяся между малеимидом CPM и тиолом цистеина, склонна к гидролизу при более основных pHs (например, предыдущая работа показала, что конъюгаты цистеин-малеимид гораздо более стабильны при pH 7,3, чем pH 8¹²).
2. Извлеките исходные растворы фрагментов ДМСО из хранилища и оставьте их при комнатной температуре минимум на 2 часа, чтобы составные запасы оттаяли.
3. Буфер для анализа Degas qIT путем барботирования с газообразным аргоном в течение примерно 30 минут.
4. Тщательно замените раствор целевого белка в дегазированный буфер для анализа qIT. Важно отметить, что восстановители, такие как DTT и TCEP, должны быть тщательно удалены до концентраций < 100 нМ, поскольку они будут мешать количественному определению тиола. Этот шаг может быть выполнен с помощью повторяющейся серии буферных обменов, как описано ниже.
   1. Разбавить белковый раствор сверх дегазированного буфера qIT в фильтрующем блоке, сконцентрировать с помощью центрифугирования (4000 x g, 4 °C, 15 мин) и повторить. Как правило, требуется 4 раунда 1 из 15 разведений для достаточного удаления DTT (1 мМ) из 1 мл исходного раствора рекомбинантного белка, хотя этот этап может быть скорректирован в зависимости от концентрации восстановителя в исходном растворе рекомбинантного белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, диализ раствора целевого белка против большого избытка дегазированного буфера для анализа qIT может привести к тому же результату.
5. Раствор целевого белка (полученный на стадии 2.1) разбавляют до концентрации белка 15 мкМ в буфере для анализа дегазированного qIT. Требуется примерно 9 мл раствора целевого белка для заполнения 384-луночного планшета достаточным мертвым объемом.
6. Приготовьте 1,5% (v/v) суспензию TCEP-агарозы в дегазированном буфере для qIT анализа. На одну просеивающую пластину требуется примерно 9 мл агарозной суспензии TCEP.
7. Дозируйте 20 мкл раствора агарозы TCEP в каждую лунку из двух 384-луночных планшетов.
8. Приготовьте запас глутатиона 15 мкМ в дегазированном буфере для анализа qIT. Его следует готовить непосредственно перед нанесением покрытия, так как глутатион быстро окисляется в растворе без восстановителя.
9. Диспонируйте 20 мкл буфера для анализа qIT в колонки 1 и 2 обоих 384-луночных планшетов.
10. Диспонируйте 20 мкл 15 мкМ белка или раствора глутатиона (в соответствии с предполагаемым планшетом) в колонки 3-24 384-луночного планшета. Они называются белковой реакционной пластиной и реакционной пластиной глутатиона. Оставьте уменьшаться при RT на 1 час.
11. Введите 58,2 мкл дегазированного буфера для анализа qIT в каждую лунку 384-луночного планшета, затем перенесите 1,8 мкл из каждой соответствующей лунки планшета для библиотеки фрагментов для создания планшета для разбавления соединения, где каждое соединение разбавляется до концентрации 1,5 мМ в буфере для анализа qIT плюс 3% ДМСО.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг упрощается благодаря станции с 384 дозаторами, которая позволяет перекачивать составные запасы для каждой скважины за одну операцию.
12. После 1-часовой инкубации белка и глутатиона с TCEP-агарозой перенесите 20 мкл раствора соединения из каждой лунки планшета для разбавления соединения в реакционные планшеты с белком и глутатионом, чтобы начать анализ. Этот шаг также упрощается благодаря станции с 384 дозаторами. Этапы анализа обобщены на рисунке 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация фрагментов может быть изменена по мере необходимости, и при желании можно повторить анализ qIT для попаданий при более низких концентрациях, чтобы подтвердить, что сродство к белку не является артефактом высокой концентрации фрагментов. Относительно высокая концентрация фрагментов используется для повышения k_pro и_{k GSH}, чтобы обеспечить точное определение скоростей для слабо реакционноспособных соединений (которые могут проявлять t_1/2(GSH) > течение 24 ч в условиях анализа). Кроме того, несмотря на то, что концентрация фрагментов в 500 мкМ является высокой, для скрининга фрагментов используются концентрации от высоких мкМ до низких мМ, например,¹³.
13. Запустите таймер - анализ начался, и закалки должны выполняться в определенные временные точки в соответствии с разделом ниже.

Рисунок 3: Резюме анализа qIT. Краткое изложение, иллюстрирующее ключевые этапы настройки реакции qIT-анализа. (создано с помощью BioRender). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Закалка CPM

ПРИМЕЧАНИЕ: Закалка CPM выполняется для количественной оценки количества непрореагировавшего тиола, остающегося в реакционных пластинах белка и глутатиона. Они должны выполняться в дискретных временных точках (например, обычно используются следующие временные точки: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 и 1440 минут), чтобы можно было контролировать кинетику реакции.

1. Приготовьте исходные растворы CPM (500 мкМ) в ДМСО, распределите их по 111,2 мкл аликвот в микроцентрифужных пробирках и храните при температуре -20 °C. Эти запасы CPM могут быть подготовлены заранее, и на момент закалки потребуется 1 аликвота.
2. Приготовьте закалочный раствор CPM (1,4 мкМ) путем размораживания замороженного стокового раствора CPM (500 мкМ) и добавления его в буфер для гашения 40 мл qIT.
3. Дозируйте 27 мкл закалочного раствора CPM в каждую лунку из двух 384-луночных планшетов - две требуются для гашения как белковых, так и глутатионных реакционных планшетов. Они называются CPM-закалочными пластинами, подготавливайте их максимум за 30 минут до использования.
4. Центрифугируйте белковую реакционную пластину при давлении 200 x g в течение 3 минут, чтобы убедиться, что TCEP-агароза гранулирована.
5. В заранее определенные моменты времени перенесите 3 мкл образца из каждой лунки белковой реакционной пластины на предварительно заполненную закалочную пластину CPM. Этот шаг также упрощается с помощью 384-дозаторной станции.
6. Смешайте закалочную пластину CPM, отсасывая и дозируя 3 x 25 μл. Важно извлечь образец из верхней части лунки, чтобы избежать аспирации ТЦЭП-агарозы на дне, что будет препятствовать закалке СРМ.
7. Повторите шаги 3.4-3.6 с помощью пластины для реакции глутатиона.
8. Инкубировать закалочные пластины CPM (подготовленные в 3,4-3,6 раза) при комнатной температуре в течение 1 ч.
9. Измерьте интенсивность флуоресценции закалочной пластины CPM (возбуждение при 384 нм и излучение при 470 нм).

4. Анализ данных и выбор хитов

1. Для каждой закалки рассчитывайте Z' как меру качества анализа. Любые закалки CPM с Z' < 0,5 следует игнорировать.
   Z' = 1 - ((3σ_{положительное управление} + 3σ_{отрицательное управление}) / (μ_{положительное управление} - μ_{отрицательное управление}))
   где σ = стандартное отклонение интенсивности флуоресценции и μ = среднее значение интенсивности флуоресценции
2. Рассчитать средние значения флуоресценции для отрицательных и положительных контрольных лунок (столбцы 1 и 2, 23 и 24 соответственно).
3. Хорошо нормализуйте каждую реакцию до средних значений флуоресценции положительного и отрицательного контроля:
   % модифицированный = 100 x (флуоресценция в сложной лунке - отрицательная контрольная флуоресценция) / (положительная контрольная флуоресценция - отрицательная контрольная флуоресценция)
4. Отдельно отстройте график зависимости % модифицированного от времени для каждого соединения, реагирующего с глутатионом и белком-мишенью.
5. Подгонка нормализованных % модифицированных по времени данных к однофазной экспоненциальной модели распада как для реакции с белком, так и с глутатионом с использованием уравнения:
   % Модифицированный = ae ^{- kt + c}
   Где a = диапазон % измененных значений, k = скорость реакции, t = время, c = % измененного значения за бесконечное время. Аппроксимация кривой и определение параметров могут быть выполнены с помощью коммерческого программного обеспечения (например, Graphpad).
6. Используйте скорость, с которой фрагменты реагируют с белком (k_pro) и глутатионом (k_GSH), чтобы рассчитать значение коэффициента повышения скорости (REF) для каждого фрагмента:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Используйте значения REF для выбора фрагментов попадания. Это может быть выполнено путем установки порога REF (например, REF > 3), произвольной частоты попаданий (например, top 2%) или путем выбора фрагментов со стандартными отклонениями REF 3 больше среднего геометрического.

Results

Анализ qIT используется здесь для идентификации попаданий ковалентных фрагментов для безымянного одиночного цистеинового белка. MgCl₂ (10 мМ) добавляли в реакционные буферы, так как известно, что целевой белок связывается с ионами Mg²⁺ . Скрининг проводили в трех экземплярах, и определяли скорость, с которой каждый фрагмент реагировал как с белком-мишенью (k_pro), так и с глутатионом (k_GSH). Значения Z были больше 0,5 для всех закалочных пластин и в среднем 0,75 для закалки белка и 0,79 для закалки глутатиона, что указывает на отличные результаты анализа. Затем значения REF были рассчитаны для каждого фрагмента и выбраны места, где REF > 3.

Репрезентативные результаты (рис. 4) представляют собой пример отбора попаданий с помощью анализа qIT. Соединение 1 реагировало с остатком цистеина на белке-мишени в 6,0 раз чаще, чем с глутатионом, и, используя критерий REF > 3, было выбрано в качестве хита (рис. 4B). Это ускорение скорости указывает на наличие шаблонизирующего эффекта, в результате чего нековалентные взаимодействия позиционируют 1 в правильной ориентации цистеина на белке-мишени для реакции с хлорацетамидной боеголовкой. В отличие от этого, 2 является примером непораженного фрагмента, поскольку реакция между 2 и остатком цистеина-мишени не ускоряется по сравнению с реакцией между 2 и глутатионом. Отсутствие ускорения скорости указывает на отсутствие продуктивных нековалентных взаимодействий, позиционирующих 2 в правильной ориентации для реакции с остатком цистеина-мишени.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты. Результаты показывают мониторинг реакции белков и глутатиона с помощью qIT для (A) высокой внутренней реактивности, возможного ложноположительного фрагмента попадания и (B)фрагмента попадания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Анализ qIT обеспечивает эффективную и удобную платформу для скрининга цистеин-реактивных электрофильных фрагментов против целевого белка. Тем не менее, существуют критические соображения, которые могут помешать проведению анализа, если их не учитывать должным образом. В частности, белки-мишени должны включать только один цистеин, подверженный воздействию поверхности, чтобы быть пригодными для скрининга qIT, поскольку другие остатки цистеина будут реагировать с CPM и мешать флуоресцентным измерениям. В предыдущих случаях, когда белки-мишени содержали множественные цистеины, подверженные воздействию поверхности (например, для основной протеазы SARS-CoV-2, малой ГТФазы RAP27A и циклин-зависимой киназы 2), ранее успешно использовались скрининговые конструкции с удаленными интерферирующими остатками. Однако эффективность этой стратегии будет варьироваться в зависимости от белка 10,14,15.

Кроме того, поскольку анализ qIT измеряет снижение количества тиола, доступного для реакции с CPM с течением времени, любой фактор, снижающий долю доступных тиолов, такой как окисление тиола или агрегация белка, может снизить эффективность анализа. Буферная дегазация и использование иммобилизованного восстановителя (TCEP-агарозы) обеспечивают медленное окисление тиола, а любое остаточное окисление должно быть снижено путем нормализации измерений флуоресценции до уровня положительных контрольных лунок. Однако проблемы могут возникнуть, когда неравномерное распределение TCEP-агарозы между скважинами вызывает неравномерное окисление тиола. Таким образом, равномерное покрытие ТЦОП агарозой имеет важное значение для проведения анализа, что может быть сложной задачей, поскольку частицы агарозы ТЦОП оседают в резервуарах для дозирования.

Агрегация белков также может быть проблемой, так как условия анализа (24-часовая инкубация при комнатной температуре) относительно суровы. Стратегии устранения неполадок, такие как слияние целевых белков с солюбилизирующими метками, изменение реакционных буферов или проведение анализа при более низких температурах, могут снизить агрегацию и решить проблемы стабильности белков. Определенные фрагменты также могут индуцировать агрегацию белков, что опять же снижает долю тиола, доступного для реакции с CPM, и создает ложноположительные результаты. Ортогональная валидация попаданий с использованием масс-спектрометрии интактного белка является эффективным методом выявления таких случаев, поскольку ложноположительные попадания создают небольшую популяцию меченых видов или вообще не создают ее при инкубации с целевым белком.

При учете этих соображений анализ qIT имеет некоторые явные преимущества по сравнению с другими методами скрининга ковалентных фрагментов. Отбор попаданий с помощью REF гарантирует, что попадания будут выбраны только в том случае, если они образуют продуктивные нековалентные взаимодействия с белком-мишенью. Электрофильность осколков изменяется на больших расстояниях, как между различными боеголовками, так и внутри классов боеголовок; Например, предыдущая работа обнаружила несколько сотен вариаций скорости реакционной способности глутатиона между акриламидами¹⁰. Такой широкий диапазон электрофильности может затруднить различение фрагментов с высокими значениями k_pro из-за эффекта шаблонизации от тех, которые просто обладают высокой реакционной способностью, что может привести к выбору высокореактивных фрагментов в качестве ложноположительных попаданий. Например, 2 реагирует с остатком цистеина-мишени быстрее, чем 1 и, без учета собственной реакционной способности, может быть выбрано в качестве попадания. Тем не менее, 2 не реагирует с остатком цистеина-мишени с большей скоростью, чем с глутатионом, что указывает на то, что большее k_pro 2 по отношению к 1 обусловлено большей внутренней реакционной способностью фрагмента, а не эффектом шаблона.

Простое флуоресцентное считывание, используемое в анализе qIT для количественного определения остаточного тиола, также является весьма предпочтительным. Другие методы скрининга ковалентных фрагментов используют масс-спектрометрию интактного белка для определения скорости, с которой фрагменты реагируют с белком-мишенью, и LC-MS для определения скорости, с которой глутатион реагирует с фрагментами, оба из которых требуют специализированного оборудования и не обладают достаточной пропускной способностью ^8,16. Удобное считывание флуоресценции делает анализ qIT очень масштабируемым и требует только общедоступного лабораторного оборудования.

В совокупности эти инновации создают надежный и масштабируемый метод скрининга ковалентных фрагментов, который сводит на нет необходимость в оборудовании для масс-спектрометрии.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Газ аргон		BOC I1149
Corning 384-луночный, низкий фланец, плоскодонные пробирные пластины	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Иммобилизованный TCEP-агарозный	пирс	77712
Микропланшетный ридер	CLARIOstar
Пломбы для ПЦР	BioRad	MSA5001
восстановленный L-глутатион	Sigma-Aldrich	G4251
Натрия хлорид	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7