Методическая статья

Количественная оценка митохондриального дыхания в цельных дрожжевых клетках

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

8 ноября 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

В этой статье

Краткое содержание

Митохондриальное дыхание в цельных клетках дрожжей является ценным показателем биоэнергетики клеток. Здесь мы представляем протокол количественной оценки этого фенотипа, применимый к различным видам дрожжей.

Аннотация

Метаболизм в основном координируется наличием клеточной энергии и условиями окружающей среды. Анализы для понимания того, как клетки адаптируют энергетический метаболизм к различным условиям питания и окружающей среды, дают ценную информацию для выяснения молекулярных механизмов. Окислительное фосфорилирование является основным источником АТФ в большинстве клеток, а активность митохондриального дыхания является ключевым компонентом окислительного фосфорилирования, поддерживая потенциал митохондриальной мембраны для синтеза АТФ. Митохондриальное дыхание часто изучается в изолированных митохондриях, в которых отсутствует клеточный контекст. В данной работе мы представляем метод количественной оценки митохондриального дыхания в интактных дрожжевых клетках. Этот метод применим к любым видам дрожжей, хотя обычно он используется для клеток Saccharomyces cerevisiae. Сначала проверяется рост дрожжей в конкретных условиях. Затем элементы промываются и ресуспендируются в деионизированной воде в соотношении 1:1 (w/v). Затем клетки помещаются в камеру оксиметра при постоянном перемешивании, а электрод Кларка используется для количественной оценки потребления кислорода. Некоторые молекулы последовательно помещаются в камеру и отбираются в соответствии с этим эффектом в цепи переноса электронов или синтезе АТФ. Ингибитор АТФазы олигомицин сначала добавляют для измерения дыхания в сочетании с синтезом АТФ. После этого с помощью разъединителя измеряется максимальная дыхательная способность. Наконец, добавляется смесь ингибиторов цепи переноса электронов, чтобы отбросить потребление кислорода, не связанное с митохондриальным дыханием. Данные анализируются с помощью линейной регрессии для получения наклона, представляющего скорость потребления кислорода. Преимущество этого метода в том, что он специфичен для митохондриального дыхания дрожжей, поддерживая клеточный контекст. Важно подчеркнуть, что ингибиторы, используемые для количественного определения митохондриального дыхания, могут различаться в зависимости от вида дрожжей.

Введение

Митохондрии играют фундаментальную роль в клеточной биоэнергетике, поскольку они являются основным источником АТФ для большинства клеток, и несколько путей сходятся и зависят от активности митохондриальных путей1. Окислительное фосфорилирование необходимо для синтеза АТФ, который сочетает транспорт электронов через цепь переноса электронов для снижения активности кислорода и F1F 0-АТФазы, синтезируя АТФ с использованием потенциала митохондриальной мембраны, образующегося из-за потока электронов2. Таким образом, митохондриальное дыхание является частью окислительного фосфорилирования3.

Цепь митохондриального дыхания содержит четыре комплекса или, в некоторых случаях, дрожжевой комплекс I-дефицитный (например, Saccharomyces cerevisiae), три комплекса и три белка дегидрогеназы4. Дыхательные комплексы локализуются во внутренней митохондриальной мембране; некоторые дрожжи представляют собой каноническую электронно-транспортную цепь с комплексом I (НАДН-дегидрогеназа) или тремя НАДН-дегидрогеназами: убихинон (Co Q), комплекс II (сукцинат-убихиноноксидоредуктаза), комплекс III (убихинон-цитохромоксидоредуктаза), цитохром с (Cyt c) и комплекс IV (цитохром-с-оксидаза)5,6. Транспорт электронов через комплексы позволяет перекачивать протоны из матрицы митохондрий в межмембранное пространство, формируя потенциал митохондриальноймембраны7. Протоны, расположенные в межмембранном пространстве, перекачиваются в обратном направлении, по направлению к матриксу митохондрий с помощью F1F0 -АТФазы для синтеза одной молекулы АТФ на четыре закачиваемых протона8.

Измерения митохондриального дыхания дают ценную информацию о целостности митохондрий, биоэнергетике клеток и дыхательной способности митохондрий9. Функция митохондриального дыхания может быть проанализирована in vitro или in situ с использованием различных методов. Тем не менее, анализ митохондриального дыхания в интактных клетках может дать ряд преимуществ, поскольку он охватывает весь клеточный метаболизм, поскольку при использовании целыхклеток учитываются взаимодействия клеток с окружающей средой и внутриклеточный метаболизм. Кроме того, использование интактных клеток позволяет легко оценивать различные условия эксперимента и обнаруживать минимальные изменения, которые не могли наблюдаться в изолированных митохондриях10,11. Еще одним преимуществом количественного определения митохондриального дыхания в интактных клетках является то, что эффекты митохондриальной пролиферации и локализациисохраняются12.

Митохондриальное дыхание млекопитающих в интактных клетках описано оченьподробно12, оставляя в стороне изучение других эукариотических организмов, таких как дрожжи. В данной работе мы предлагаем метод количественной оценки митохондриального дыхания, адаптированный к протоколам дрожжей млекопитающих. Таким образом, в этой методике были использованы концепции количественной оценки митохондриального дыхания у млекопитающих. Например, этот метод разделен на различные этапы, как и протокол млекопитающих: 1) базальное дыхание (субстратнозависимое), 2) АТФ-связанное дыхание (через ингибирование АТФ-синтазы), 3) максимальная способность дыхания (использование размыкателя, который обеспечивает проницаемость протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану), 4) ингибирование митохондриального дыхания (использование смеси ингибиторов дыхательной цепи для отказа от потребления кислорода для других источников, отличных от митохондриальное дыхание)11,13. Таким образом, целью данной статьи является представление протокола для количественной оценки митохондриального дыхания у дрожжей.

Протокол

1. Питательные среды и подготовка посевного материала

  1. Приготовьте 100 мл дрожжевого экстракта-пептон-декстрозы среды (YPD), добавив 1 г дрожжевого экстракта, 2 г пептона казеина и 2 г глюкозы в 95 мл дистиллированной воды. Распределите 3 мл по стеклянным пробиркам объемом 10 мл, стерилизуйте при 121 °C и 1,5 фунта на квадратный дюйм в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может храниться при температуре 4 - 8 °C до 1 месяца.
  2. Инокулируйте стеклянную пробирку объемом 10 мл, содержащую 3 мл среды YPD, 250 мкл дрожжевых клеток, сохраняющих глицерин при температуре -20 °C. Инкубировать в течение ночи при постоянном перемешивании при 200 об/мин и 30 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации может варьироваться у некоторых видов дрожжей (например, Kluyveromyces marxianus имеет оптимальную температуру роста 37 °C).
  3. Заполните чашку Петри (60 x 15мм2) стерильным 2% YPD агаром (добавьте 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона казеина, 20 г глюкозы и 20 г бактериологического агара к 950 мл дистиллированной воды) и прорежьте чашку Петри дрожжевыми клетками, выращенными в стеклянной пробирке объемом 10 мл с помощью стерильной петли. Инкубируйте чашку Петри при 30 °C до появления изолированных колоний.
  4. Приготовьте предварительный посев путем инокуляции стерильной стеклянной пробирки объемом 10 мл, содержащей 3 мл среды YPD с содержанием глюкозы 2%, двумя или тремя выделенными дрожжами колониями из чашки Петри. Инкубировать в течение ночи при постоянном перемешивании при 30 °C.

2. Условия произрастания и план эксперимента

  1. В колбу Эрленмейера объемом 500 мл, содержащую 100 мл стерильной синтетической полной среды (среда СК; 0,18 г азотной основы дрожжей без аминокислот, 0,5 г сульфата аммония, 0,2 г дикалийфосфата, 1 г дрожжевых синтетических добавок и глюкозы согласно экспериментальному дизайну, в 98,02 мл дистиллированной воды) культуру дрожжей с начальным наружным диаметром600 ~ 0,1, это примерно 3 мл ночного предварительного прививки (наружный диаметр600 ~ 3). Определите условия окружающей среды или дополните химическую задачу, которую необходимо проверить в митохондриальном дыхании (например, добавив 100 мкМ ресвератрола). Подготовьте систему управления автомобилем в отдельной колбе для химической нагрузки. Протестируйте не менее трех биологических репликатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать минимальную среду для отбрасывания шума питательных веществ в анализе, а минимальная среда, предложенная на данном этапе, используется для S. cerevisiae и может отличаться для других видов дрожжей. Наконец, концентрация глюкозы в питательных средах имеет решающее значение для предотвращения подавления глюкозы или эффекта Крэбтри, который подавляет митохондриальное дыхание; Концентрации ниже 0,5% (w/v) давали хорошие реакции в митохондриальном дыхании, сопровождавшиеся высокими темпами роста S. cerevisiae. У кребтри-отрицательных дрожжей высокие концентрации глюкозы не влияли на митохондриальное дыхание (например, у K. marxianus).
  2. Взвесьте пустую коническую пробирку объемом 50 мл и используйте ее для сбора клеток в середине логарифмической фазы (наружный диаметр600 ~ 0,5) путем центрифугирования при 4000 x g в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя фаза логарифма рекомендуется для проверки митохондриального дыхания, поскольку именно в фазе роста энергетический метаболизм более активен.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 3 раза 25 мл деионизированной воды. Взвесьте коническую трубку с грануляторами (влажный вес) и вычтите вес конической трубки, чтобы получить влажный вес ячеистой трубки.
  4. Суспендируйте гранулу в 2 мл деионизированной воды.
  5. Запишите концентрацию клеток путем деления сырого веса на 2 мг клеток/мл. Это значение важно для определения того, сколько объема необходимо добавить, чтобы получить 50 мг клеток для анализа.

3. Анализ потребления кислорода (полярография)

  1. Для сбора данных используйте кислородный электрод типа Кларка, подключенный к монитору YSI5300A и компьютеру.
    1. Поместите в камеру полярографа 5 мл морфоэтанолсульфокислоты, отрегулированной до pH 6, с триэтаноламином (буфер MES-TEA; 10 мМ) и 50 мг клеток (сырой массой). Аккуратно поместите электрод, следя за тем, чтобы не было пузырей.
    2. Включите монитор YSI5300A, компьютер для сбора данных и камеру для перемешивания. Настройте монитор YSI5300A, выбрав диск настройки канала 1 в AIR. Отрегулируйте канал 1 на 100% с помощью диска калибровки канала 1 и стабилизируйте сигнал в течение 5 минут на уровне 100%.
    3. Начните записывать данные в компьютер и измерять время с помощью хронометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор YSI5300A не оснащен компьютером или программой сбора данных; Это может быть реализовано пользователем извне.
    4. Используйте боковое каналирование электрода в камере оксиметра для последовательного добавления окисляемого субстрата, олигомицина, развязки и смеси ингибиторов дыхательной цепи.
  2. Добавьте окисляемый субстрат (глюкозу, глицерин, L-лактат или другой источник углерода в соответствии с планом эксперимента) до конечной концентрации 10 мМ с помощью хроматографического шприца. Держите камеру закрытой все время и с постоянным помешиванием. Запишите процентное потребление воздуха в течение 2-3 мин для определения базального дыхания.
    Глюкоза, глицерин и L-лактат используются для анализа цепи переноса электронов в различных участках дыхательной цепи: метаболизм глюкозы снижает NAD+ с образованием NADH и используется для анализа всей дыхательной цепи; глицерин передает электроны убихинону и используется для оценки дыхательной цепи из убихинона; наконец, L-лактат уступает свои электроны цитохрому с и используется для определения эффекта от цитохрома с14. Эти субстраты могут варьироваться в зависимости от ферментативных способностей видов дрожжей.
  3. Добавить олигомицин для получения конечной концентрации 0,01 мМ в камере оксиметра с помощью хроматографического шприца для оценки АТФ-сцепленного дыхания и записи процентного расхода воздуха в течение 2-3 мин.
  4. Дополните разъединитель 3-хлорфенилгидразона карбонилцианидом (ССХК) для получения конечной концентрации 0,015 мМ в камере оксиметра с помощью хроматографического шприца для определения максимальной дыхательной способности и рекордного процентного расхода воздуха в течение 2-3 мин.
  5. С помощью хроматографического шприца добавьте ингибиторы цепи переноса электронов: сначала 2-теноилтрифторацетон (TTFA), а затем антимицин А (АА) в конечных концентрациях 1 мМ и 1 мг/мл соответственно. Измеряйте каждый ингибитор в течение 2-3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторы цепи переноса электронов могут различаться у разных видов дрожжей; Это следует учесть на данном этапе.
  6. Проведите скрининг каждого источника углерода независимо друг от друга (т. е. глюкозы, глицерина или L-лактата). Повторите шаги с 3.3 по 3.5 для каждого источника углерода. Промойте камеру 3 раза с 70% этанолом и 3 раза с деионизированной водой после каждого использования.

4. Обработка данных

  1. Используйте кривые потребления кислорода (графики зависимости процента воздуха от времени) для расчета наклонов окисляемого субстрата (базальное дыхание), олигомицина (АТФ-связанное дыхание), CCCP (максимальное дыхание), AA и TTFA (не митохондриальное дыхание; Рисунок 1). Рассчитайте индивидуальные уклоны для каждого дополненного состава, используя линейную регрессию, как описано ниже.
    1. Создайте новый файл проекта в статистическом программном обеспечении. Выберите XY в разделе Создать. Выберите опцию Ввести или Импортировать данные в новую таблицу в разделе Таблица данных.
    2. Выберите «Числа» в подразделе X в разделе «Параметры». Нажмите на кнопку Ввести 3 репликации значений в параллельных подстолбцах в подразделе Y в разделе Параметры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формат таблицы состоит из одного столбца X и нескольких столбцов Y, каждый из которых имеет 3 подстолбца с именами A: Y1 и A: Y2.
    3. Введите данные о времени в столбцы X (например, 0, 2, 4, 6, 8 с или 0, 1, 2, 3 мин). Запишите процентное содержание воздуха в столбцах Y.
    4. Сделайте приспособленность линейной регрессии. Нажмите «Анализировать» в строке меню. В опции «Анализ» выберите «Простая линейная регрессия при анализе XY» и нажмите «ОК».
    5. Получите значение наклона из таблиц «Результаты в данных» в левой части экрана.
  2. Запишите значения наклона в таблицу данных и вычтите значение наклона, полученное из смеси ингибиторов дыхания (AA и TTFA), из значений наклона, полученного из окисляемого субстрата, олигомицина и CCCP, для отбрасывания потребления кислорода из источников, отличных от митохондриального дыхания.
  3. Полученные значения умножьте на 237 мкМ O2. Эта величина считается растворимостьюО2 в буферной митохондриальной среде, уравновешенной воздухом (20,9%О2) при 25 °С; Это значение изменяется в зависимости от температуры, высоты над уровнем моря и используемого буфера.
  4. Перевести в минуты; полученные значения представляют собой μM от O2 за время, в зависимости от того, как построено время, чтобы получить μM от O2/мин.
  5. Делят на 50, то есть на мг используемых клеток; Клеточный MG может варьироваться в зависимости от плана эксперимента. Наконец, потребление кислорода выражается в виде μM of O2/мг клеток x min

Результаты

Этот метод митохондриального дыхания может быть использован для других видов дрожжей, кроме S. cerevisiae, таких как Scheffersomyces stipitis15 и K. marxianus16. Тем не менее, в репрезентативных целях мы представляем результаты только для S. cerevisiae. Хорошо известно, что S. cerevisiae проявляет преобладающий респираторный метаболизм при низких концентрациях глюкозы (ниже 0,8 мМ)17,18. Таким образом, для подтверждения респираторного фенотипа S. cerevisiae его выращивали в двух концентрациях глюкозы для стимуляции (0,5% глюкозы) и ограничения (5% глюкозы) митохондриального дыхания18,19. Как и ожидалось, результаты, полученные в базальном дыхании (окисляемый субстрат), АТФ-связанном дыхании (олигомицин) и максимальной дыхательной способности (CCCP), подтверждают характерный энергетический метаболизм S. cerevisiae (рис. 2). Мы наблюдали более высокие значения потребления кислорода (базальное дыхание, АТФ-связанное дыхание и максимальная дыхательная способность) в клетках, выращенных с 0,5% глюкозы, по сравнению со значениями, полученными в клетках, выращенных с 5% глюкозы (рис. 2).

Кроме того, в анализах использовались три субстрата: глюкоза, глицерин и L-лактат. Целью использования различных субстратов является оценка различных частей митохондриальной дыхательной цепи. В этих условиях митохондриальное дыхание не показало существенных субстрат-зависимых изменений, поскольку не было добавлено лечение для нарушения дыхательной цепи (рис. 2).

Для оценки эффективности методики мы использовали кверцетин – соединение, которое негативно влияет на митохондриальное дыхание20. Полученные данные показали, что кверцетин достоверно снижает митохондриальное дыхание в клетках, выращенных в средах с добавлением 0,5% глюкозы (рис. 3). С другой стороны, клетки, выращенные в средах с добавлением 5% глюкозы, не оказывали существенного негативного влияния кверцетина (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативная кривая потребления кислорода. Получена кривая потребления кислорода в клетках S. cerevisiae, выращенных в средах СК (0,5% глюкозы). Цветами обозначены различные наклоны, получаемые при подложке, развязках и добавках ингибиторов. Зеленый: Субстрат использовал глюкозу и соответствующее наклону базальное дыхание. Синий: олигомицин, ингибитор АТФ-синтазы, наклон, используемый для определения АТФ-сцепленного дыхания. Желтый: CCCP, размыкатель, наклон, используемый для оценки максимального дыхания. Серый и красный: ингибиторный комплекс II и III соответственно; Наклон, используемый для определения потребления кислорода, не зависит от митохондрий. Сокращения: CCCP = 3-хлорфенилгидразон карбонилцианид; TTFA = 2-теноилтрифторацетон; AA = антимицин А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализы потребления кислорода в клетках S. cerevisiae, выращенных с содержанием глюкозы 0,5% и 5%. Митохондриальное дыхание оценивается по потреблению кислорода, измеренному при базальном дыхании, максимальной дыхательной способности и АТФ-связанном дыхании в клетках S. cerevisiae , выращенных в СК с добавлением 0,5% и 5% глюкозы. Для оценки их специфического влияния на цепь переноса электронов использовали три субстрата: глюкозу (НАДН-дегидрогеназы), глицерин (пул убихинонов) и L-лактат (цитохром с). (А) базальное дыхание с содержанием глюкозы 5% и 0,5% с глюкозой, глицерином и L-лактатом в качестве субстратов; (В) максимальное дыхание при 5% и 0,5% глюкозы с глюкозой, глицерином и L-лактатом в качестве субстратов; (В) АТФ-сцепленное дыхание при 5% и 0,5% глюкозы с глюкозой, глицерином и L-лактатом в качестве субстрата. Результаты представлены в виде среднего ± S.D. из трех независимых экспериментов, каждый из которых имеет два технических повторения. Односторонняя ANOVA с последующим тестом Тьюки (p ≤ 0,05; разные буквы: значимая разница, те же буквы: нет существенной разницы) для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Кверцетин ограничивал митохондриальное дыхание при низкой концентрации глюкозы в выращенных клетках S. cerevisiae . Измерение потребления кислорода проводили при базальном дыхании, максимальной дыхательной способности и АТФ-связанном дыхании в клетках S. cerevisiae , выращенных в средах СК (0,5% глюкозы) с добавкой кверцетина (100 мкМ). Для растворения раствора кверцетина использовался этанол. Результаты представлены в виде среднего ± S.D. из трех независимых экспериментов, каждый из которых имеет два технических повторения. Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента (*, ** p ≤ 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Кверцетин не влияет на митохондриальное дыхание при высокой концентрации глюкозы у S. cerevisiae. Потребление кислорода определяли при базальном дыхании, максимальной дыхательной способности и АТФ-связанном дыхании в клетках S. cerevisiae , выращенных в среде СК (5% глюкозы) с добавкой кверцетина (100 мкМ). Этанол используется для растворения раствора кверцетина. Результаты показывают среднее значение ± S.D. из трех независимых экспериментов, каждый из которых имеет два технических повторения. Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента (p ≤ 0,05; нс: незначимый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Фосфорилирование митохондриального дыхания играет фундаментальную роль в нескольких путях, которые зависят от потенциала митохондриальной мембраны и поддерживают уровень АТФ за счет окислительного фосфорилирования. Понимание того, как условия окружающей среды и питания влияют на митохондриальное дыхание дрожжей, служит инструментом для выяснения молекулярных механизмов.

Важно рассмотреть следующие важные шаги для получения надежных результатов от этого метода. Перемешивание >200 об/мин имеет решающее значение для получения достаточной биомассы в условиях респираторного роста для тестирования митохондриального дыхания; Условия перемешивания ниже 200 об/мин вызывают плохой рост и образование биомассы, что может повлиять на скорость потребления кислорода, поскольку клетки выживают в менее насыщенной кислородом среде. Концентрацию глюкозы в среде устанавливают в соответствии с фенотипом дрожжей (Crabtree-положительный или отрицательный); это имеет решающее значение в случае дрожжей, положительных по методу Крэбтри, поскольку высокие концентрации глюкозы подавляют митохондриальное дыхание и могут оказывать смещение в интерпретации данных. Например, у S. cerevisiae глюкоза вызывает катаболическую репрессию, подавляя митохондриальное дыхание при высоких концентрациях глюкозы21,22. На основании этих данных получены более низкие значения базального дыхания, АТФ-связанного дыхания и максимального дыхания клеток, выращенных при высокой концентрации глюкозы (5%), по сравнению с дрожжевыми клетками, выращенными при низкой концентрации глюкозы (0,5%). Ингибиторы дыхательной цепи следует тщательно подбирать в зависимости от восприимчивости дрожжей; Это имеет решающее значение для отказа от источников потребления кислорода клетками, отличных от митохондриального дыхания.

Субстраты, митохондриальные разъединители и ингибиторы используются для определения различных параметров митохондриального дыхания в интактных клетках. Тем не менее, их использование имеет некоторые ограничения. Например, необходимо учитывать неспецифические мишени за пределами митохондрий митохондриальных ингибиторов и разъединителей в интактных клетках, чтобы избежать смещения в интерпретации потребления кислорода. Кроме того, использование альтернативных источников углерода для скрининга места действия в дыхательной цепи должно быть проверено более детально, поскольку побочные продукты метаболизма глицерина или L-лактата могут окисляться с целью восстановления NAD+ или FAD+, которые уступают электроны и активируют дыхательную цепь, поскольку дегидрогеназы NADH и комплекс II, соответственно. Наконец, S. cerevisiae и другие дрожжи содержат PDR-транспортеры, такие как Yor1p (белок резистентности дрожжей к олигомицину), что предполагает отток олигомицина из клеток23. Кроме того, для валидации использования олигомицина в S. cerevisiae для количественного определения митохондриального дыхания необходимы анализы с использованием PDR-дефицитных клеток, например, штамма AD1-8, в котором удалены основные транспортеры PDR и факторы транскрипции PDR1/PDR3.

Использование интактных клеток для количественного определения митохондриального дыхания поддерживает клеточный контекст, обеспечивая более надежную технику для изучения влияния питательных веществ или окружающей среды на биоэнергетику дрожжей. Кроме того, использование интактных дрожжевых клеток для количественного определения митохондриального дыхания является более экономичным и, на техническом уровне, более простым, чем изолированные митохондрии. Кроме того, как и в изолированных анализах митохондрий, различные источники углерода указывают на место действия некоторых молекул в дыхательной цепи. В качестве доказательства концепции, этот метод подтверждает, что добавки ресвератрола влияют на дыхательную цепь на уровне НАДГ-дегидрогеназы, поскольку ингибирование ресвератрола базального дыхания наблюдается только с глюкозой, а не с глицерином или L-лактатом24. Исследования in vitro с солюбилизированным комплексом I показали, что ресвератрол конкурирует с НАД+, влияя на активность комплекса I25. Это подтверждает фенотип, наблюдаемый в интактных клетках с помощью представленной здесь методики. Кроме того, этот метод также надежен для изучения негативного влияния химических веществ на митохондриальное дыхание дрожжей. Например, кверцетин является полифенолом, широко изучаемым в последние десятилетия. Среди основных обнаруженных доказательств было показано, что он ограничивает митохондриальное дыхание в интактных клетках, что было подтверждено сложной активностью дыхательной цепи26,27. Важно отметить, что в различных исследованиях сообщалось о влиянии ингибирования кверцетина на митохондриальное дыхание в различных модельных исследованиях28.

Важно иметь подробное описание метаболизма дрожжей, в том числе биоэнергетического, поскольку эти микроорганизмы могут быть патогенами животных, в том числе человека, а также используются в качестве клеточных фабрик или в биотехнологических приложениях.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Tecnológico Nacional de México (грант 20026.24-PD), присужденным LAMP.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-теноилтрифторацетон (TTFA)MerckT27006Комплекс ингибиторов II
3-хлорфенилгидразона карбонилцианид (CCCP)MerckC2759Развязка митохондриального дыхания   
Absolut ethanolMerck 107017Для растворения кверцетина 
AgarMerckA1296YPD агаровый препарат
сульфат аммония гранулированный (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC бульонный препарат
Антимицин А (AA)MerckA8674Комплекс ингибиторов III
aYSI5300A--------Monitor 
ЦентрифугаHermleZ 206 AДля центрифугирования ячеек
типа Кларк кислород--------Электрод 
Компьютер--------Для сбора данных 
Дикалийфосфат K2HPO4J.T. Baker3252-05SC Приготовление бульона
ГлюкозаMerckG7021YPD Приготовление бульона
ГлицеринMerckG5516Добавка субстрата для субстрата 
ЛактатMerckL1250Субстрат для средних добавок 
Олигомицин из Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Ингибирование митохондриальной АТФ-синтазы
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000Inoculum инкубационные стеклянные пробирки и колба 
Пептон из казеина, ферментативный дигестMerck82303YPD бульон приготовление
Quercetin Merck337951Для снижения митохондриального дыхания
Uracil MerckU0750SC бульон
Дрожжевой экстрактMerckY1625YPD бульон
Азот дрожжей без аминокислот и сульфата аммонияMerckY1251SC бульон
Дрожжи синтетические Drop-out среда добавки без урацилаMerckY1501SC бульон

Ссылки

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Saccharomyces Cerevisiae

Похожие статьи