В этой статье мы подробно описываем методы характеристики способности фермента сохранять функцию при инкубации при 37 °C в сыворотке крови человека, фармакологическое свойство, называемое его стабильностью в сыворотке. Эта способность может быть ключевым фактором в прогнозировании фармакокинетического профиля фермента и его пригодности для терапевтического использования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы 1 человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Понятие стабильности фермента обычно используется для обозначения термостабильности фермента — его способности сохранять структуру и активность при повышении температуры. Для терапевтического фермента другие показатели стабильности также могут иметь решающее значение, в частности, его способность сохранять функцию в сыворотке крови человека при 37 °C, которую мы называем стабильностью сыворотки. В данной статье мы описываем анализ in vitro для оценки сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы I (HsADA1) дикого типа Homo sapiens с использованием микропланшетной процедуры, основанной на абсорбции. В частности, в данной рукописи описывается приготовление буферов и реагентов, метод организации коинкубации HsADA1 в сыворотке, метод анализа тестовых образцов с помощью считывателя микропланшетов и сопутствующий анализ для определения доли активности, которую фермент HsADA1 сохраняет в сыворотке в зависимости от времени. Далее мы обсудим соображения по адаптации этого протокола к другим ферментам на примере фермента кинурениназы Homo sapiens , чтобы помочь адаптировать протокол к другим ферментам, где стабильность сыворотки представляет интерес.
Введение
Следующий метод позволяет пользователю количественно оценить способность фермента сохранять свою активность при воздействии условий, которые имитируют те, с которыми он столкнется после внутривенной инъекции. Метод in vitro имитирует такие условия in vivo и состоит из инкубации фермента в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C и временного анализа сохранения активности фермента. Мы называем способность фермента сохранять активность в этих условиях стабильностью его сыворотки крови, а метод анализа активности фермента использует различия в абсорбции между субстратом фермента и полученным продуктом. Концепция ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Инкубация сыворотки
- Приготовьте 10-кратный запас HsADA1 в 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) при конечной концентрации 10 мкМ. Разморозьте 15 мл аликвоты объединенной человеческой сыворотки и предварительно нагрейте ее до 37 °C. Разогрейте 50 мл аликвоты 1x PBS до 37 °C.
- Приготовьте инкубационные смеси ферментов и сыворотки, добавив 100 мкл 10x запаса HsADA1 к 900 мкл объединенной человеческой сыворотки в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, называемой смесью фермент + сыворотка. В отдельную микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания добавьте 100 мкл 10x HsADA1 к 900 мкл 1x PBS для сравнения с несывороточным ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунках представлены результаты пробирного анализа при проведении с диким типом HsADA1. На рисунках 3A, B показаны кривые снижения абсорбции на длине волны 260 нм образцов, полученных из 1x PBS/сывороточно-ферментных смесей для HsADA1 дикого типа после добавления аденозина. Это снижение абсорбции в зависимости от временных данных является тем, что пользователь может ожидать после успешного завершения анализа на микропланшетах, и аналогично данным об абсорбции, которые мо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе используется изменение абсорбции при преобразовании субстрата в продукт для измерения активности фермента. Таким образом, подложка и продукт должны иметь различные спектральные профили. Это относится к аденозину и инозину, которые имеют различные спектральные профили и коэффициенты экстинкции в диапазоне 260-265 нм 6,8,12,13. Этот анализ вдохно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
JB и MRJ являются изобретателями по патентам или патентным заявкам, связанным с ферментами аденозиндезаминазой и/или кинурениназа. У всех остальных авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [1DP2CA280622-01] и финансированием Biolocity. Мы благодарим доктора Марию Дженнингс и Андреа Фокс за предоставление векторов экспрессии HsADA1 и HsKYNase.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аденозин | Sigma Aldrich | A9251-25G | 25 г |
| BioTek Synergy HT Считыватель | |||
| микропланшетов Eppendorf LoBind Микроцентрифужные пробирки: Protein | Fisher Scientific | 13-698-795 | 2 мл |
| глицерина | Fisher Scientific | G33-4 | 4 л |
| HsKYNase66-W102H-T333N | Собственная | ||
| сыворотка человека, объединенная | MP Biomedicals | 92931149 | 100 мл |
| гидроксикинуренина | Cayman Chemicals | 27778 | |
| Инозин | TCI | I0037 | 25 г |
| PBS, 1x pH 7.4+/- 0.1 | Corning | 21-040-CM | |
| Пиридоксаль 5-фосфат моногидрат, 99% | Thermo Scientifc | 228170010 | 1 г |
| UV-STAR MICROPLATE, 96 ЛУНКА, COC, F-BOTTOM | Greiner Bio | ||
| Аденозиндеаминаза дикого типа человека 1 | в домашних |
Ссылки
- Valero, J., et al. A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).
- Iannuzo, N., et al. High-throug....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
