Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы 1 человека

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67216

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology, 2Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы подробно описываем методы характеристики способности фермента сохранять функцию при инкубации при 37 °C в сыворотке крови человека, фармакологическое свойство, называемое его стабильностью в сыворотке. Эта способность может быть ключевым фактором в прогнозировании фармакокинетического профиля фермента и его пригодности для терапевтического использования.

Аннотация

Понятие стабильности фермента обычно используется для обозначения термостабильности фермента — его способности сохранять структуру и активность при повышении температуры. Для терапевтического фермента другие показатели стабильности также могут иметь решающее значение, в частности, его способность сохранять функцию в сыворотке крови человека при 37 °C, которую мы называем стабильностью сыворотки. В данной статье мы описываем анализ in vitro для оценки сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы I (HsADA1) дикого типа Homo sapiens с использованием микропланшетной процедуры, основанной на абсорбции. В частности, в данной рукописи описывается приготовление буферов и реагентов, метод организации коинкубации HsADA1 в сыворотке, метод анализа тестовых образцов с помощью считывателя микропланшетов и сопутствующий анализ для определения доли активности, которую фермент HsADA1 сохраняет в сыворотке в зависимости от времени. Далее мы обсудим соображения по адаптации этого протокола к другим ферментам на примере фермента кинурениназы Homo sapiens , чтобы помочь адаптировать протокол к другим ферментам, где стабильность сыворотки представляет интерес.

Введение

Следующий метод позволяет пользователю количественно оценить способность фермента сохранять свою активность при воздействии условий, которые имитируют те, с которыми он столкнется после внутривенной инъекции. Метод in vitro имитирует такие условия in vivo и состоит из инкубации фермента в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C и временного анализа сохранения активности фермента. Мы называем способность фермента сохранять активность в этих условиях стабильностью его сыворотки крови, а метод анализа активности фермента использует различия в абсорбции между субстратом фермента и полученным продуктом. Концепция стабильности сыворотки является не только ферментоспецифичной, но и применяется к нескольким другим методам лечения. Например, сывороточная стабильность аптамеров РНК, нацеленных на шиповидные белки COVID, ранее оценивалась путем мониторинга их деградации после инкубации с сывороткой плода 1 телят. Антибактериальные пептиды также были оценены на предмет их способности подавлять рост бактерий после инкубации с объединенной сывороткой 2человека.

HsADA1 является ферментом, который катализирует превращение аденозина или 2-дезоксиаденозина в инозин или 2-дезоксиинозин,соответственно3. Аденозин имеет пик поглощения 260 нм, в то время как инозин поглощается сильнее всего при 250нм4. Этот сдвиг пиков поглощения может быть обнаружен на микропланшете по снижению интенсивности поглощения на длине волны 260 нм, когда HsADA1 добавляется к аденозину. Фермент HsADA1 имеет важное значение для организма человека, и его дефицит вызывает тяжелый комбинированный иммунодефицит (ADA-SCID)5. Бычий гомолог HsADA1, BtADA1, может быть использован в качестве ферментозаместительной терапии для лечения ADA-SCID, и ранее мы показали, что дикий тип HsADA1 теряет свою активность при инкубации с объединенной сывороткой человека, что потенциально препятствует его использованию в качестве терапевтического6. Поэтому мы выбрали фермент дикого типа HsADA1, чтобы продемонстрировать процедуру определения стабильности фермента в сыворотке крови. Подробный метод очистки HsADA1 был описан ранее6.

В следующем протоколе (как подробно описано на рисунке 1) мы демонстрируем, как проводить совместную инкубацию HsADA1 дикого типа в объединенной сыворотке крови человека при 37 °C. В течение этого времени отбираются тестовые образцы в определенные моменты времени и замораживаются для последующего анализа. После того, как все образцы были взяты, проводится анализ на микропланшетах, в ходе которого каждый образец объединяется с субстратом, при этом результирующее снижение абсорбции является корреляцией с сохраненной активностью фермента. Представлены репрезентативные результаты, иллюстрирующие сывороточную стабильность HsADA1, и, поскольку этот показатель может иметь отношение к определению потенциальной терапевтической ценности других ферментов, мы также обсуждаем соображения по адаптации этого протокола к модифицированному ферменту кинурениназе Homo sapiens (HsKYNase) и любым ферментам в более общем плане. HsKYNase является ферментом, участвующим в метаболизме триптофана и способным расщеплять побочные продукты триптофана кинуренин и гидрокси-кинуренин (OH-Kyn) в антраниловую кислоту и гидроксиантраниловую кислоту (OH-AA) соответственно. Фермент-опосредованная модуляция метаболизма триптофана может иметь терапевтическое значение7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Инкубация сыворотки

  1. Приготовьте 10-кратный запас HsADA1 в 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) при конечной концентрации 10 мкМ. Разморозьте 15 мл аликвоты объединенной человеческой сыворотки и предварительно нагрейте ее до 37 °C. Разогрейте 50 мл аликвоты 1x PBS до 37 °C.
  2. Приготовьте инкубационные смеси ферментов и сыворотки, добавив 100 мкл 10x запаса HsADA1 к 900 мкл объединенной человеческой сыворотки в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, называемой смесью фермент + сыворотка. В отдельную микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания добавьте 100 мкл 10x HsADA1 к 900 мкл 1x PBS для сравнения с несывороточным контролем, называемым смесью фермент + 1x PBS. Конечная концентрация HsADA1 в каждой смеси составит 1 мкМ.
  3. Приготовьте дополнительный контроль в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем связывания, состоящей из 100 мкл 1x PBS, смешанного с 900 мкл объединенной человеческой сыворотки. Это послужит неферментным контролем для смеси фермент + сыворотка. Дополнительно сделайте контроль, состоящий из 1 мл 1x PBS. Это будет служить в качестве неферментативного контроля для фермента + 1x PBS смеси.
  4. Распределите 100 мкл каждой смеси с этапа 1.2 в отдельные пробирки с низким уровнем связывания и разбавьте 1:1 100 мкл 30% (v/v) глицерина в 1x PBS. Мгновенную заморозку жидким азотом и хранить при температуре -80 °C. Эти образцы будут иметь временную точку дня 0, а концентрация HsADA1 в них составит 500 нМ. Повторите этот шаг для смесей без ферментов из 1.3. Запечатайте все ферменты и контрольные смеси прозрачной пленкой и поместите их в инкубатор с температурой 37 °C.
  5. Через 24 ч внесите 100 мкл каждого инкубированного образца и разбавьте 1:1 100 мкл 30% (v/v) глицерина в 1x PBS. Мгновенную заморозку жидким азотом и хранить при температуре -80 °C. Эти образцы будут временной точкой дня 1. Верните все ферментные и контрольные смеси в инкубатор при температуре 37 °C. Повторите этот шаг через 72 ч и 120 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвотированные образцы не обязательно должны быть мгновенно заморожены. В качестве альтернативы пользователь может выполнить анализ на основе микропланшетов сразу после взятия каждого образца, хотя при каждом тестировании образца необходимо готовить свежие стандартные кривые и запасы аденозинового субстрата.

2. Анализ на микропланшетах

  1. Подготовьте считыватель микропланшетов, настроив протокол кинетического считывания (рис. 2) для измерения поглощения при длине волны 260 нм с кратчайшим интервалом считывания в течение 30 мин и предварительно нагрейте считыватель до заданного значения 37 °C.
  2. Разморозьте все собранные образцы на льду. Разбавьте каждый размороженный образец в соотношении 1:10 с использованием 1x PBS, предварительно нагретого до 37 °C, в качестве разбавителя в микроцентрифужных пробирках с низким уровнем связывания. Новая концентрация HsADA1 в этих образцах составит 50 нМ.
  3. Также сделайте 10-кратное разведение до 1x PBS из контрольного образца сыворотки, не содержащего ферментов. Кроме того, приготовьте 5 мМ аденозина, добавив 66,8 мг аденозина к 50 мл 1x PBS. Приготовьте 250 μМ разведение аденозина, добавив 400 μL аденозинового запаса к 7 600 μL 1x PBS и предварительно подогрейте его до 37 °C в инкубаторе.
  4. В 96-луночный УФ-совместимый микропланшет добавьте 160 мкл 250 мкМ разведения аденозина и 40 мкл каждого разведенного образца белка в трех экземплярах, чтобы получить общий объем 200 мкл. Это дает конечную концентрацию аденозина 200 мкМ и конечную концентрацию фермента 10 нМ.
  5. Повторите разведение для контрольных образцов, добавив 40 мкл разбавленной сыворотки или 1x PBS контрольной группы и 160 мкл 250 мкМ аденозина в тройном разведении. Это также дает конечную концентрацию аденозина 200 мкМ, но без фермента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно сначала добавить все разведенные ферменты и контрольные образцы по отдельности на микропланшет, а затем добавить аденозиновый субстрат с помощью 12-канальной микропипетки для сокращения общего времени загрузки. Кроме того, на этом этапе необходимо использовать УФ-прозрачные пластины, чтобы предотвратить искажение измеренного сигнала поглощения на самой пластине.
  6. Измерьте поглощение каждой лунки при длине волны 260 нм в течение 30 минут при 37 °C. После этого экспортируйте данные в электронную таблицу для дальнейшего анализа.

3. Анализ данных считывателя микропланшетов

  1. Определите наклон линейной области данных о поглощении в зависимости от времени для первых нескольких минут данных микропланшета. Для образцов, разбавленных сывороткой, это соответствовало первым ~120 с. Для 1x PBS-разбавленных образцов это соответствовало первым ~270 с. Этот наклон убывающих значений поглощения будет иметь отрицательное числовое значение и будет иметь единицы изменения в единицах поглощения в секунду (ΔA260/с).
  2. Вычтите наклон отрицательного контроля, состоящего из объединенной сыворотки крови человека, из наклона данных фермента + сыворотки. Проделайте ту же операцию со смесью фермент + 1x PBS, вычитая наклон элемента управления 1x PBS.
  3. Нормализуем все скорректированные уклоны до исходного уклона при t=0 ч, чтобы получить долю оставшейся активности, используя уравнение 1.
    figure-protocol-1Уравнение 1
  4. Составьте график зависимости оставшейся активности от времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунках представлены результаты пробирного анализа при проведении с диким типом HsADA1. На рисунках 3A, B показаны кривые снижения абсорбции на длине волны 260 нм образцов, полученных из 1x PBS/сывороточно-ферментных смесей для HsADA1 дикого типа после добавления аденозина. Это снижение абсорбции в зависимости от временных данных является тем, что пользователь может ожидать после успешного завершения анализа на микропланшетах, и аналогично данным об абсорбции, которые мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе используется изменение абсорбции при преобразовании субстрата в продукт для измерения активности фермента. Таким образом, подложка и продукт должны иметь различные спектральные профили. Это относится к аденозину и инозину, которые имеют различные спектральные профили и коэффициенты экстинкции в диапазоне 260-265 нм 6,8,12,13. Этот анализ вдохно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

JB и MRJ являются изобретателями по патентам или патентным заявкам, связанным с ферментами аденозиндезаминазой и/или кинурениназа. У всех остальных авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [1DP2CA280622-01] и финансированием Biolocity. Мы благодарим доктора Марию Дженнингс и Андреа Фокс за предоставление векторов экспрессии HsADA1 и HsKYNase.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АденозинSigma AldrichA9251-25G25 г
BioTek Synergy HT Считыватель
микропланшетов Eppendorf LoBind Микроцентрифужные пробирки: Protein Fisher Scientific 13-698-7952 мл
глицеринаFisher Scientific G33-44 л
HsKYNase66-W102H-T333NСобственная
сыворотка человека, объединеннаяMP Biomedicals92931149100 мл
гидроксикинуренинаCayman Chemicals27778
Инозин TCII003725 г
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1Corning21-040-CM
Пиридоксаль 5-фосфат моногидрат, 99% Thermo Scientifc2281700101 г
UV-STAR MICROPLATE, 96 ЛУНКА, COC, F-BOTTOMGreiner Bio 
Аденозиндеаминаза дикого типа человека 1в домашних
655801 условиях

Ссылки

  1. Valero, J., et al. A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).
  2. Iannuzo, N., et al. High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability. ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).
  3. Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation. Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).
  4. Li, W., et al. Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength. Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).
  5. Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency. Front Immunol. 7, 314(2016).
  6. Jennings, M. R., et al. Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant. Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).
  7. Blazeck, J., et al. Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme. Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).
  8. Lu, J., Grenache, D. G. Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids. Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).
  9. Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity. MethodsX. 7, 100982(2020).
  10. Bokman, A. H., Schweigert, B. S. 3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate. Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).
  11. Tanford, C. Advances in protein chemistry. 23, Academic Press. 121-282 (1968).
  12. Tritsch, G. L. Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity. Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).
  13. Gracia, E., et al. The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors. FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).
  14. Kalckar, H. M. Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism. J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).
  15. Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography. J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).
  16. Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase. J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).
  17. Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels. J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).
  18. Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. Photochemical and thermal reactivity of kynurenine. Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).
  19. Demain, A. L., Vaishnav, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).
  20. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  21. Faber, M. S., Whitehead, T. A. Data-driven engineering of protein therapeutics. Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).
  22. Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. Enzyme stabilization by virus-like particles. Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Стабильность ферментатерапевтический ферментмикропланшетный анализизмерение абсорбциибелковая инженериясыворотка крови человекаактивность ферментафермент кинурениназа
Определение сывороточной стабильности фермента аденозиндезаминазы 1 человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.