Количественная оценка фенотипов глаз Drosophila melanogaster : вычислительный подход, интегрирующий ilastik и flynotyper

Краткое содержание

Глазная система дрозофилы является полезным инструментом для изучения различных биологических процессов, в частности нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, ручная количественная оценка фенотипов шероховатого глаза может быть предвзятой и ненадежной. Здесь мы опишем метод, с помощью которого ilastik и Flynotyper используются для количественной оценки фенотипа глаза несмещенным образом.

Аннотация

Сложный глаз Drosophila melanogaster представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из около 800 омматидий, демонстрирующих симметричный и шестиугольный рисунок. Такая регулярность и легкость наблюдения делают глазную систему дрозофилы мощным инструментом для моделирования различных нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, способы количественной оценки аномальных фенотипов, такие как ручное ранжирование показателей тяжести глаза, имеют ограничения, особенно при ранжировании слабых изменений в морфологии глаза. Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны вычислительные подходы, такие как Flynotyper. Использование кольцевого фонаря позволяет получить более качественные изображения с доступом к целостности отдельных омматидий. Тем не менее, эти изображения не могут быть проанализированы Flynotyper напрямую из-за теней на омматидиях, создаваемых кольцевым светом. В этой статье мы описываем непредвзятый способ количественной оценки фенотипов шероховатости глаз, наблюдаемых в моделях болезни дрозофилы, путем объединения двух программ: ilastik и Flynotyper. Путем предварительной обработки изображений с помощью ilastik можно добиться успешной количественной оценки фенотипа шероховатого глаза с помощью Flynotyper.

Введение

Геном Drosophila melanogaster содержит ~75% ортологов генов, связанных с заболеваниями человека. Кроме того, во время развития глаза дрозофилы экспрессируются примерно две трети генов в геноме, что делает глаз дрозофилы выдающейся генетической системой для исследования различных молекулярных и клеточных функций, развития^{и моделей заболеваний.} Таким образом, глазная система дрозофилы является полезным экспериментальным инструментом для изучения различных биологических процессов.

Сложный глаз дрозофилы представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из ~800 омматидий, которые демонстрируют симметричный и шестиугольный узор³. Регулярность этого гексагонального рисунка может быть использована для оценки эффекта внесения мутаций и изменений экспрессии генов в^{морфологию глаза}. Предыдущие исследования, которые требовали оценки морфологии глаза, в значительной степени полагались на ручное ранжирование тяжести фенотипов глаз, обнаруженных невооруженным глазом. Для ранжирования фенотипов глаза с помощью стереомикроскопа делают снимки внешней морфологии глаза ^5,6. Фенотип глаза каждой группы оценивается путем разделения наружного глаза на четыре области и расчета доли дегенерации в каждой области ^5,6. Затем значения используются для вычисления средних значений, которые сравниваются со значениями, полученными от контрольных мух⁷. Оценка основана на степени сращения, потере омматидий и организации щетины ^7,8. Фотографии глаз мух, сделанные с помощью стереомикроскопа, получаются одним исследователем, а анализ фенотипа глаза выполняется другим исследователем с помощью тройных наборов^{валидации 7,8}.

Когда дело доходит до ранжирования слабых изменений в морфологии глаза невооруженным глазом, существуют ограничения⁴. Для преодоления этих ограничений^{были разработаны} вычислительные подходы, такие как FLEYE и Flynotyper1,9. Flynotyper — это новый вычислительный метод для количественной оценки морфологических изменений в системе глаза дрозофилы¹. Он автоматически обнаруживает глаз дрозофилы и отдельный омматидий, рассчитывая фенотипические баллы (P-баллы) на основе неровностейглаза¹. Более высокий P-Score указывает на то, что глаз мухи более дегенерирован. Это программное обеспечение было успешно использовано для количественной оценки аномалии глаз дрозофилы ¹⁰. Несмотря на то, что Flynotyper обеспечивает автоматизированный процесс, его все еще нельзя успешно применять к некоторым изображениям глаз, полученным с помощью различных методов световой микроскопии.

Качественно мы отдаем предпочтение кольцевому источнику света по сравнению с одноточечным, так как он обеспечивает более точное представление каждого омматидия. Однако, когда используется кольцевой свет, он создает кольцеобразную тень в верхней части каждого омматидия из-за полусферической формы омматидия. Эта кольцеобразная тень препятствует точному обнаружению омматидии с помощью Flynotyper, что приводит к неправильному расчету P-баллов.

Чтобы решить эти проблемы, мы внедрили ilastik, основанный на машинном обучении инструмент для различных анализов, для классификации омматидий на изображениях глаз мухи¹¹. Затем мы загрузили изображения, сгенерированные ilastik, в Flynotyper для расчета P-оценок. Это позволяет нам непредвзято количественно оценить морфологические дефекты глаз дрозофилы ¹.

Протокол

1. Подготовка к количественной оценке

1. Скачайте и установите ilastik¹¹, ImageJ и плагин ImageJ Flynotyper¹. Ссылки на установку на сайте см. в Таблице материалов . Скачивайте соответствующие пакеты в соответствии с операционной системой компьютера (Mac, Windows, Linux и т.д.). Следуйте инструкциям по установке в точности так, как указано.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следование указаниям в точности так, как указано в предоставленных ссылках, является обязательным. Используемый компьютер должен иметь 64-разрядную операционную систему; В остальном других требуемых спецификаций нет. Технические характеристики системы, используемой для этого протокола, см. в Таблице материалов .
2. Используйте стандартное изображение для обучения модели машинного обучения. Сделайте снимок здорового глаза мухи с помощью светового микроскопа с кольцевым светом (например, w1118 x GMR-GAL4), используя центр глаза в качестве фокусной точки. Анализируйте самцов и самок отдельно; Поэтому приобретайте стандартный образ как для самцов, так и для представительниц женского пола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки могут сильно различаться в зависимости от микроскопа и камеры. Смотрите второй абзац обсуждения для получения более общей информации о подготовке к полету и получении изображений.
3. Сделайте снимки экспериментальных глаз мухи с теми же настройками, которые использовались для получения стандартного изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая ориентация имеет первостепенное значение для точной количественной оценки. Смотрите на рисунке 4 в качестве примера для правильной ориентации.

2. Использование ilastik для обнаружения омматидий по изображениям глаз мухи

1. Перед началом анализа убедитесь, что все экспериментальные группы, независимо от условий эксперимента, находятся в одной папке с файлами, чтобы упростить следующие процессы. Убедитесь, что файлы названы правильно, чтобы идентифицировать экспериментальные группы и различать самцов и самок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем распечатать протокол и использовать компьютер для увеличения цифр, так как этот протокол легче всего следовать визуально.
2. Откройте программу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется открывать другие приложения во время работы программного обеспечения; В противном случае компьютер может работать очень медленно, особенно в старых или менее надежных системах.
3. Нажмите на Создать новый проект | Другие рабочие процессы, выберите Cell Density Counting и выберите место для сохранения файла проекта (рисунок 1A).
4. Нажмите на 1. Входные данные | Добавить новый | Добавьте отдельные изображения. Выберите стандартное изображение (рисунок 1B).
5. Нажмите на 2. Выбор функций и выбор используемых функций. Выберите функции, показанные на рисунке 1C; Выберите больше значений сигма для увеличения чувствительности (например, 10, 15, 20 и т. д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечено слишком много флажков, программа может работать в течение длительного времени.
6. Нажмите на 3. Подсчитываем и устанавливаем значение сигмы переднего плана равным 5.00. Отметьте 50 или более отдельных омматидий с помощью инструмента «Передний план » на стандартном изображении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пятидесяти маркировок обычно достаточно для анализа; однако, чем больше омматидий помечено, тем точнее будут результаты (Рисунок 1D).
7. Нажмите на 3. Подсчитываем и с помощью инструмента «Фон» отмечаем внешнюю сторону омматидий (Рисунок 1E). Нарисуйте зеленые линии в форме решетки вокруг омматидии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с большим количеством отметок на омматидии, чем больше зеленых линий нарисовано, тем точнее будут результаты.
8. Нажмите на 4. Экспорт плотности | Выберите «Экспорт настроек изображения», чтобы задать параметры изображения (рисунок 1F). Нажмите на информацию о выходном файле | выберите Формат и tif для дальнейшего анализа в Flynotyper.
9. Нажмите на 5. Пакетная обработка | Выберите Raw Data Files и выберите все экспериментальные фотографии мух для анализа (Рисунок 1G). Список импортированных изображений для анализа приведен в разделе «Выбрать файлы необработанных данных » (рисунок 1H). Нажмите «Обработать все файлы » в нижней части списка 5. Раздел «Пакетная обработка ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Напоминаем, что анализы у мужчин и женщин должны проводиться отдельно. В зависимости от используемого компьютера этот шаг может занять 10 минут или дольше, особенно если импортировано много изображений.
10. После завершения работы программы проверьте ту же папку с файлами, содержащую экспериментальные изображения «глаза мухи»; будут черные изображения с именем "YourSampleName_Probabilities" (Рисунок 1I).

3. Использование ImageJ для подготовки фотографий для Flynotyper

1. Откройте файл .tif, сгенерированный ilastik (черные ящики) в ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый файл .tif, сгенерированный ilastik, должен обрабатываться отдельно.
2. С помощью инструмента Выделение прямоугольника (Rectangle Select ) создайте прямоугольник вокруг одного глаза. После того, как прямоугольник будет нарисован, обрежьте область, выбрав Ctrl + X или Ctrl + C (рис. 2A). Подождите, пока не появится черный ящик в форме контура прямоугольника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операционная система компьютера определит, следует ли использовать 'Ctrl + X' или 'Ctrl + C'. Обычно «Ctrl + X» используется для Windows, а «Ctrl + C» — для Mac.
3. Откройте теперь вырезанный глаз мухи с помощью ImageJ; нажмите на Файл | Новое | Внутренний буфер обмена (рис. 2B).
4. Сохраните вырезанный глаз мухи в формате JPEG, нажав на Файл | Сохранить как | Формат JPEG. Вырезанные изображения теперь находятся в той же папке с файлами, что и исходные экспериментальные изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить следующий шаг, рекомендуется создать новую папку с файлами под названием 'cut' и поместить все вырезанные изображения в эту папку.

4. Использование Flynotyper для расчета фенотипических баллов

1. Откройте Flynotyper как плагин ImageJ, нажав на Плагины | Мухомор.
2. Выберите «Добавить генотипы» и откройте папку, содержащую изображения вырезанных глаз мухи (папка с вырезанным файлом). Имя папки появится в разделе Генотипы (рис. 2C).
3. Установите флажки «Световой микроскоп» и «Вертикально», но при необходимости отрегулируйте их соответствующим образом. Отметьте поля Стабильность и расстояние до центра в разделе Ранг Омматидия по: (Рисунок 2C).
4. Для Числа рассмотренных омматидий введите 200.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, 200 - это хорошее число, но корректируйте его в соответствии с предпочтениями.
5. Нажмите кнопку Run и дождитесь появления результатов анализа (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять 5 минут или дольше (или меньше) в зависимости от вычислительной мощности используемого компьютера.
6. Скопируйте и вставьте файл образца и P-Score в статистическое программное обеспечение для дальнейшего анализа.

Результаты

В предыдущем исследовании мы использовали этот протокол для определения генетических модификаторов мутантного белка VCP, связанного с боковым амиотрофическим склерозом с лобно-височной деменцией (БАС-ЛВД)¹². Кроме того, этот метод также был использован в другой работе для оценки токсичности CHCHD10^{S59L-опосредованного} ALS-FTD, даже при использовании более старого^{стереомикроскопа}. Для дальнейшей проверки этих результатов мы использовали ilastik и Flynotyper при той же мутации заболевания БАС-ЛВД, что и Baek et ^al.13; Тем не менее, необученный персонал лаборатории провел эксперимент и получил аналогичные результаты. Таким образом, комбинация ilastik и Flynotyper является надежным методом для объективной оценки дегенерации дрозофилы ommatidia .

Мы предпочитаем использовать кольцевой свет, потому что он позволяет лучше оценивать качество (Рисунок 3). Однако использование кольцевого света вызывает тень, которую Flynotyper не может напрямую анализировать. Чтобы решить эту проблему, мы предварительно обработали изображения в ilastik перед количественной оценкой P-оценок с помощью Flynotyper. В целом, P-баллы недегенеративного глаза мухи (GMR-GAL4) были значительно ниже по сравнению с умеренно дегенерированным глазом (2x_S81L) и сильно дегенерированным глазом (3x_S81L) (Рисунок 4A, B и Таблица 1). Это ожидаемый результат, так как более высокие P-оценки, полученные с помощью Flynotyper, указывают на более дегенерацию глаза¹. Когда ilastik не использовался, наблюдались незначительные различия в P-показателях между глазом без дегенерации и глазом с умеренной дегенерацией (Рисунок 4C и Таблица 1). Это говорит о том, что Flynotyper изо всех сил пытается точно идентифицировать узоры омматидий в условиях кольцевого освещения без использования ilastik. Это связано с тем, что Flynotyper предназначен для использования изображений, полученных с помощью двухточечного света, который преобразуется в оттенки серого с дополнительными настройками для определения омматидиального центра¹. Ilastik повторяет этот процесс, добавляя точку в центр каждого омматидия, что позволяет проводить количественную оценку в Flynotyper.

Рисунок 1: Пример рабочего процесса ilastik. (А) Создание нового проекта в ilastik. (Б) Выбор стандартного изображения. (C) Выбор значений сигма в разделе «Выбор функции». (D) Выделение на первый план омматидии чувствительности. (E) Маркировка фона омматидии для чувствительности. (F) Выбор способа экспорта обработанных файлов программным обеспечением. (G) Выбор экспериментальных изображений глаз мухи для анализа. (H) Демонстрация того, какие экспериментальные изображения глаз мухи будут проанализированы. (I) Готовый продукт после запуска программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Пример рабочего процесса Flynotyper. (А) Отбор только глаз мухи для дальнейшего анализа. (B) Открытие изображения разрезанного глаза в новом окне. (C) Выбор разрезов для анализа и параметров, которые должны быть проверены для анализа. (D) Примеры результатов. Фенотипические оценки представлены справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Качественные изображения глаз дрозофилы . Один и тот же глаз мухи, снятый кольцевым светом (слева) и двухточечным светом (справа) в невырожденном (вверху) и вырожденном (внизу) состояниях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Использование ilastik перед Flynotyper для точной количественной оценки фенотипа шероховатого глаза у дрозофилы. (A) Репрезентативные изображения глаз дрозофилы недегенерированного глаза (GMR-GAL4), умеренно дегенерированного глаза (2x_S81L) и сильно дегенерированного глаза (3x_S81L). (B) Результаты количественной оценки Flynotyper после использования ilastik. P-значения t-критерия двусторонней перестановки были рассчитаны для облегчения интерпретации результатов (GMR-GAL4 против 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 против 3x_S81L: p = 0) (C) Результаты количественной оценки с помощью Flynotyper без использования ilastik. Для облегчения интерпретации результатов были рассчитаны p-значения t-критерия двусторонней перестановки, которые помогли облегчить интерпретацию результатов (GMR-GAL4 против 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 против 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 для каждой группы. Точки данных дрожат или складываются по оси X для визуальной четкости. Сплошная горизонтальная линия представляет собой среднее значение. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ГМР-ГАЛ4		2x_S81L		3x_S81L
С ilastik	Без иластика	С ilastik	Без иластика	С ilastik	Без иластика
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Таблица 1: P-баллы при использовании Flynotyper с ilastik и при использовании только Flynotyper.

Дополнительный рисунок S1: Крепление для головки мухи настроено для получения изображений. Это пример того, как настроить получение изображений с помощью нескольких листов бумаги. Тем не менее, можно использовать любой метод, обеспечивающий правильную ориентацию головы и глаза мухи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Количественные результаты ilastik и Flynotyper при использовании сигма-значения 2,5 при выборе признака. Использование значения сигма, отличного от 5,0, при выборе признаков в ilastik может привести к неточному количественному оценке. В частности, значение сигма 2,5 приводит к потере чувствительности. Для облегчения интерпретации результатов были рассчитаны p-значения t-критерия двусторонней перестановки (GMR-GAL4 против 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 против 3x_S81L: p = 0). N = 3 для каждой группы. Точки данных дрожат или складываются по оси X для визуальной четкости. Сплошная горизонтальная линия представляет собой среднее значение. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Потеря чувствительности и неточные P-оценки из-за некротических пятен. Белые стрелки указывают на сегменты некротических пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: P-оценки при использовании сигма-значения 2,5 при выборе признака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Омматидии дрозофил представляют собой полезную систему для изучения различных биологических функций и генетических заболеваний. Регулярность омматидий является хорошим показателем для изучения влияния генетических мутаций⁴. Несмотря на то, что существует несколько методов вычисления омматидиальной регулярности, таких как ручное ранжирование, эти методы могут быть сильно смещены. Для преодоления этого предвзятого подхода^{были разработаны} полуавтоматические ^{инструменты1,11}.

Для точного количественного определения глаз необходимо оптимизировать подготовку и настройку мухи. Хотя мы понимаем, что у каждой лаборатории будет своя настройка, мы предоставляем следующую настройку в нашей лаборатории, чтобы дать читателям представление о том, как подготовить мух к получению изображений. Мух замораживают и хранят при температуре -80 °C. Мы использовали размер выборки 3, потому что, по нашему опыту, когда GMR-GAL4 сочетается с мутацией S81L, вариации среди популяции очень малы. Однако имейте в виду, что размер выборки должен быть скорректирован для проведения проверки значимости нулевой гипотезы. Чтобы закрепить мух для получения изображений, голова мухи опирается на очень маленький лист бумаги, который действует как подушка, так что центр глаза находится примерно в фокальной плоскости (дополнительный рисунок S1). В нашей лаборатории используется Z-stack микроскоп и камера (см. Таблицу материалов), так как это позволяет получать более четкие изображения, что позволяет наилучшим образом визуализировать весь глаз, поскольку глаз мухи имеет куполообразную форму. Тем не менее, функция Z-стека не является обязательным требованием для этого протокола, поскольку мы успешно использовали этот метод на более старом стереомикроскопе без функции Z-стека¹³. Кольцевой световой диск для регулировки яркости повернут не более чем на 1/4 вверх во избежание пересвета. Общая толщина наших образцов колеблется от 300 до 450 микрон.

В этом исследовании мы показали, что анализ глаз мух с помощью ilastik и Flynotyper дает объективные и надежные результаты количественной оценки омматидий. Мы проанализировали паттерны Drosophila ommatidia с помощью ilastik, инструмента анализа биоизображений на основе машинного обучения, чтобы отметить омматидии, а затем Flynotyper, вычислительного метода, используемого для измерения регулярности омматидий ^1,11. Мы предпочитаем использовать кольцевой свет для получения изображений для лучшей качественной оценки. Однако такой подход не позволяет Flynotyper получать количественные результаты с использованием этих изображений. Таким образом, ilastik реализован для предварительной обработки этих изображений, и эти обработанные изображения были успешно использованы с Flynotyper для получения количественных результатов. Когда изображения не были предварительно обработаны с помощью ilastik до Flynotyper, общие P-показатели между недегенеративными и дегенеративными глазами были одинаковыми. Это подчеркивает важность использования ilastik в первую очередь при внедрении кольцевого светильника для получения количественных результатов.

В наших методах есть некоторые ограничения. Настройки в ilastik могут сильно различаться и приводить к незначительным данным. Например, мы провели еще один набор анализов с использованием тех же изображений, но скорректировали значение сигма переднего плана в ilastik до 2,5 вместо 5. Это привело к потере чувствительности у умеренно дегенеративных фенотипов (дополнительный рисунок S2 и дополнительная таблица S1). Еще одним ограничением является потеря чувствительности в глазах при слишком большой дегенерации. По сравнению с 3x_S81L глазом, глаз с некротическими пятнами качественно гораздо более дегенерирован. Тем не менее, средний P-балл для 3x_S81L глаз составил 60,2, в то время как средний P-балл для глаз с некротическими пятнами составил 60,9. Таким образом, глаза со слишком сильной дегенерацией, такой как некротические пятна, также могут привести к потере чувствительности (дополнительный рисунок S3).

Важнейшим этапом этого протокола является выбор соответствующего стандартного образа, который используется для обучения ilastik. Невырожденное стандартное изображение с отчетливым контрастом между омматидиями и окружающими пигментными клетками, такими как красные или оранжевые глаза, приведет к более точной количественной оценке в Flynotyper. Еще одним важным шагом является выбор функций в ilastik, где чувствительность, представленная в виде сигма-значений, выбирается для тонкой настройки программного обеспечения машинного обучения (рис. 1D). Выбор слишком малого количества элементов может снизить чувствительность иластика, что приведет к неточной маркировке омматидий. Выбор слишком большого количества функций увеличит продолжительность времени и вычислительную мощность, необходимые для получения результатов, что снизит эффективность процедуры. В качестве альтернативы, если наблюдается заметная качественная дегенерация глаза, но результаты анализа не являются статистически значимыми, потенциальным решением может быть увеличение сигма-значения выбранных признаков. Тем не менее, выбор функций, предоставленный в этом протоколе, регулярно дает точные результаты. Следование критическим шагам в том виде, в котором они написаны, поможет устранить наиболее распространенные проблемы и устранить неполадки в будущем.

Таким образом, этот метод обеспечивает более качественные изображения, а также дает объективную и надежную количественную оценку глазной системы дрозофилы . Следовательно, этот метод может повысить полезность дегенерации глаза в качестве мощного инструмента для моделирования дегенеративных заболеваний в будущем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Технические характеристики			Ryzen 5, 16 ГБ ОЗУ, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Скачать программное обеспечение можно здесь: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Не используйте Flynotyper 2.0. На момент публикации версия 2.0 была достаточно новой и этот протокол оптимизирован для оригинальной версии Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Загрузите программное обеспечение здесь: https://www.ilastik.org/download.html	Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Скачайте версию 1.4.0.post1 в разделе Обычные сборки, соответствующие операционной системе вашего компьютера.
ImageJ		Загрузите программное обеспечение здесь: https://imagej.net/ij/download.html	Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Использовались версии 1.53 и 1.54. 1.54 является обновленной версией и загружается по умолчанию.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Система и программное обеспечение, используемые для получения z-стека.
Leica Z16 APO микроскоп с DMC2900 камерой	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	В тексте упоминается как Z-стек микроскоп и фотоаппарат. Этот продукт теперь заархивирован.