Глазная система дрозофилы является полезным инструментом для изучения различных биологических процессов, в частности нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, ручная количественная оценка фенотипов шероховатого глаза может быть предвзятой и ненадежной. Здесь мы опишем метод, с помощью которого ilastik и Flynotyper используются для количественной оценки фенотипа глаза несмещенным образом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка фенотипов глаз Drosophila melanogaster : вычислительный подход, интегрирующий ilastik и flynotyper
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сложный глаз Drosophila melanogaster представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из около 800 омматидий, демонстрирующих симметричный и шестиугольный рисунок. Такая регулярность и легкость наблюдения делают глазную систему дрозофилы мощным инструментом для моделирования различных нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, способы количественной оценки аномальных фенотипов, такие как ручное ранжирование показателей тяжести глаза, имеют ограничения, особенно при ранжировании слабых изменений в морфологии глаза. Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны вычислительные подходы, такие как Flynotyper. Использование кольцевого фонаря позволяет получить более качественные изображения с доступом к целостности отдельных омматидий. Тем не менее, эти изображения не могут быть проанализированы Flynotyper напрямую из-за теней на омматидиях, создаваемых кольцевым светом. В этой статье мы описываем непредвзятый способ количественной оценки фенотипов шероховатости глаз, наблюдаемых в моделях болезни дрозофилы, путем объединения двух программ: ilastik и Flynotyper. Путем предварительной обработки изображений с помощью ilastik можно добиться успешной количественной оценки фенотипа шероховатого глаза с помощью Flynotyper.
Введение
Геном Drosophila melanogaster содержит ~75% ортологов генов, связанных с заболеваниями человека. Кроме того, во время развития глаза дрозофилы экспрессируются примерно две трети генов в геноме, что делает глаз дрозофилы выдающейся генетической системой для исследования различных молекулярных и клеточных функций, развитияи моделей заболеваний. Таким образом, глазная система дрозофилы является полезным экспериментальным инструментом для изучения различных биологических процессов.
Сложный глаз дрозофилы представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из ~800 омматидий, которые демонстрируют симметричный и шестиугольный узор3. Регулярность этого гексагонального рисунка может быть использована для оценки эффекта внесения мутаций и изменений экспрессии генов вморфологию глаза. Предыдущие исследования, которые требовали оценки морфологии глаза, в значительной степени полагались на ручное ранжирование тяжести фенотипов глаз, обнаруженных невооруженным глазом. Для ранжирования фенотипов глаза с помощью стереомикроскопа делают снимки внешней морфологии глаза 5,6. Фенотип глаза каждой группы оценивается путем разделения наружного глаза на четыре области и расчета доли дегенерации в каждой области 5,6. Затем значения используются для вычисления средних значений, которые сравниваются со значениями, полученными от контрольных мух7. Оценка основана на степени сращения, потере омматидий и организации щетины 7,8. Фотографии глаз мух, сделанные с помощью стереомикроскопа, получаются одним исследователем, а анализ фенотипа глаза выполняется другим исследователем с помощью тройных набороввалидации 7,8.
Когда дело доходит до ранжирования слабых изменений в морфологии глаза невооруженным глазом, существуют ограничения4. Для преодоления этих ограниченийбыли разработаны вычислительные подходы, такие как FLEYE и Flynotyper1,9. Flynotyper — это новый вычислительный метод для количественной оценки морфологических изменений в системе глаза дрозофилы1. Он автоматически обнаруживает глаз дрозофилы и отдельный омматидий, рассчитывая фенотипические баллы (P-баллы) на основе неровностейглаза1. Более высокий P-Score указывает на то, что глаз мухи более дегенерирован. Это программное обеспечение было успешно использовано для количественной оценки аномалии глаз дрозофилы 10. Несмотря на то, что Flynotyper обеспечивает автоматизированный процесс, его все еще нельзя успешно применять к некоторым изображениям глаз, полученным с помощью различных методов световой микроскопии.
Качественно мы отдаем предпочтение кольцевому источнику света по сравнению с одноточечным, так как он обеспечивает более точное представление каждого омматидия. Однако, когда используется кольцевой свет, он создает кольцеобразную тень в верхней части каждого омматидия из-за полусферической формы омматидия. Эта кольцеобразная тень препятствует точному обнаружению омматидии с помощью Flynotyper, что приводит к неправильному расчету P-баллов.
Чтобы решить эти проблемы, мы внедрили ilastik, основанный на машинном обучении инструмент для различных анализов, для классификации омматидий на изображениях глаз мухи11. Затем мы загрузили изображения, сгенерированные ilastik, в Flynotyper для расчета P-оценок. Это позволяет нам непредвзято количественно оценить морфологические дефекты глаз дрозофилы 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка к количественной оценке
- Скачайте и установите ilastik11, ImageJ и плагин ImageJ Flynotyper1. Ссылки на установку на сайте см. в Таблице материалов . Скачивайте соответствующие пакеты в соответствии с операционной системой компьютера (Mac, Windows, Linux и т.д.). Следуйте инструкциям по установке в точности так, как указано.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следование указаниям в точности так, как указано в предоставленных ссылках, является обязательным. Используемый компьютер должен иметь 64-разрядную операционную систему; В остальном других требуемых спецификаций нет. Технические характеристики системы, используемой для этого протокола, см. в Таблице материалов . - Используйте стандартное изображение для обучения модели машинного обучения. Сделайте снимок здорового глаза мухи с помощью светового микроскопа с кольцевым светом (например, w1118 x GMR-GAL4), используя центр глаза в качестве фокусной точки. Анализируйте самцов и самок отдельно; Поэтому приобретайте стандартный образ как для самцов, так и для представительниц женского пола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки могут сильно различаться в зависимости от микроскопа и камеры. Смотрите второй абзац обсуждения для получения более общей информации о подготовке к полету и получении изображений. - Сделайте снимки экспериментальных глаз мухи с теми же настройками, которые использовались для получения стандартного изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая ориентация имеет первостепенное значение для точной количественной оценки. Смотрите на рисунке 4 в качестве примера для правильной ориентации.
2. Использование ilastik для обнаружения омматидий по изображениям глаз мухи
- Перед началом анализа убедитесь, что все экспериментальные группы, независимо от условий эксперимента, находятся в одной папке с файлами, чтобы упростить следующие процессы. Убедитесь, что файлы названы правильно, чтобы идентифицировать экспериментальные группы и различать самцов и самок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем распечатать протокол и использовать компьютер для увеличения цифр, так как этот протокол легче всего следовать визуально. - Откройте программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется открывать другие приложения во время работы программного обеспечения; В противном случае компьютер может работать очень медленно, особенно в старых или менее надежных системах. - Нажмите на Создать новый проект | Другие рабочие процессы, выберите Cell Density Counting и выберите место для сохранения файла проекта (рисунок 1A).
- Нажмите на 1. Входные данные | Добавить новый | Добавьте отдельные изображения. Выберите стандартное изображение (рисунок 1B).
- Нажмите на 2. Выбор функций и выбор используемых функций. Выберите функции, показанные на рисунке 1C; Выберите больше значений сигма для увеличения чувствительности (например, 10, 15, 20 и т. д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечено слишком много флажков, программа может работать в течение длительного времени. - Нажмите на 3. Подсчитываем и устанавливаем значение сигмы переднего плана равным 5.00. Отметьте 50 или более отдельных омматидий с помощью инструмента «Передний план » на стандартном изображении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пятидесяти маркировок обычно достаточно для анализа; однако, чем больше омматидий помечено, тем точнее будут результаты (Рисунок 1D). - Нажмите на 3. Подсчитываем и с помощью инструмента «Фон» отмечаем внешнюю сторону омматидий (Рисунок 1E). Нарисуйте зеленые линии в форме решетки вокруг омматидии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с большим количеством отметок на омматидии, чем больше зеленых линий нарисовано, тем точнее будут результаты. - Нажмите на 4. Экспорт плотности | Выберите «Экспорт настроек изображения», чтобы задать параметры изображения (рисунок 1F). Нажмите на информацию о выходном файле | выберите Формат и tif для дальнейшего анализа в Flynotyper.
- Нажмите на 5. Пакетная обработка | Выберите Raw Data Files и выберите все экспериментальные фотографии мух для анализа (Рисунок 1G). Список импортированных изображений для анализа приведен в разделе «Выбрать файлы необработанных данных » (рисунок 1H). Нажмите «Обработать все файлы » в нижней части списка 5. Раздел «Пакетная обработка ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Напоминаем, что анализы у мужчин и женщин должны проводиться отдельно. В зависимости от используемого компьютера этот шаг может занять 10 минут или дольше, особенно если импортировано много изображений. - После завершения работы программы проверьте ту же папку с файлами, содержащую экспериментальные изображения «глаза мухи»; будут черные изображения с именем "YourSampleName_Probabilities" (Рисунок 1I).
3. Использование ImageJ для подготовки фотографий для Flynotyper
- Откройте файл .tif, сгенерированный ilastik (черные ящики) в ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый файл .tif, сгенерированный ilastik, должен обрабатываться отдельно. - С помощью инструмента Выделение прямоугольника (Rectangle Select ) создайте прямоугольник вокруг одного глаза. После того, как прямоугольник будет нарисован, обрежьте область, выбрав Ctrl + X или Ctrl + C (рис. 2A). Подождите, пока не появится черный ящик в форме контура прямоугольника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Операционная система компьютера определит, следует ли использовать 'Ctrl + X' или 'Ctrl + C'. Обычно «Ctrl + X» используется для Windows, а «Ctrl + C» — для Mac. - Откройте теперь вырезанный глаз мухи с помощью ImageJ; нажмите на Файл | Новое | Внутренний буфер обмена (рис. 2B).
- Сохраните вырезанный глаз мухи в формате JPEG, нажав на Файл | Сохранить как | Формат JPEG. Вырезанные изображения теперь находятся в той же папке с файлами, что и исходные экспериментальные изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить следующий шаг, рекомендуется создать новую папку с файлами под названием 'cut' и поместить все вырезанные изображения в эту папку.
4. Использование Flynotyper для расчета фенотипических баллов
- Откройте Flynotyper как плагин ImageJ, нажав на Плагины | Мухомор.
- Выберите «Добавить генотипы» и откройте папку, содержащую изображения вырезанных глаз мухи (папка с вырезанным файлом). Имя папки появится в разделе Генотипы (рис. 2C).
- Установите флажки «Световой микроскоп» и «Вертикально», но при необходимости отрегулируйте их соответствующим образом. Отметьте поля Стабильность и расстояние до центра в разделе Ранг Омматидия по: (Рисунок 2C).
- Для Числа рассмотренных омматидий введите 200.
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, 200 - это хорошее число, но корректируйте его в соответствии с предпочтениями. - Нажмите кнопку Run и дождитесь появления результатов анализа (Рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять 5 минут или дольше (или меньше) в зависимости от вычислительной мощности используемого компьютера. - Скопируйте и вставьте файл образца и P-Score в статистическое программное обеспечение для дальнейшего анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В предыдущем исследовании мы использовали этот протокол для определения генетических модификаторов мутантного белка VCP, связанного с боковым амиотрофическим склерозом с лобно-височной деменцией (БАС-ЛВД)12. Кроме того, этот метод также был использован в другой работе для оценки токсичности CHCHD10S59L-опосредованного ALS-FTD, даже при использовании более старогостереомикроскопа. Для дальнейшей проверки этих результатов мы использовали ilastik и Flynotyper при то...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Омматидии дрозофил представляют собой полезную систему для изучения различных биологических функций и генетических заболеваний. Регулярность омматидий является хорошим показателем для изучения влияния генетических мутаций4. Несмотря на то, что существует несколько методов вычисления омматидиальной регулярности, таких как ручное ранжирование, эти методы могут быть сильно смещены. Для преодоления этого предвзятого подходабыли разработаны
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Мы благодарим Педро Фернандеса-Фунеса за использование микроскопа и камеры, используемых в этом протоколе. Мы также хотели бы поблагодарить Аву Шапман за предоставленный отзыв о ясности протокола. Финансовая поддержка была оказана Нам Чул Киму Фондом неврологии Валлина.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Технические характеристики | Ryzen 5, 16 ГБ ОЗУ, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Скачать программное обеспечение можно здесь: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Не используйте Flynotyper 2.0. На момент публикации версия 2.0 была достаточно новой и этот протокол оптимизирован для оригинальной версии Flynotyper. |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Загрузите программное обеспечение здесь: https://www.ilastik.org/download.html | Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Скачайте версию 1.4.0.post1 в разделе Обычные сборки, соответствующие операционной системе вашего компьютера. |
| ImageJ | Загрузите программное обеспечение здесь: https://imagej.net/ij/download.html | Программное обеспечение с открытым исходным кодом. Использовались версии 1.53 и 1.54. 1.54 является обновленной версией и загружается по умолчанию. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | Система и программное обеспечение, используемые для получения z-стека. |
| Leica Z16 APO микроскоп с DMC2900 камерой | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | В тексте упоминается как Z-стек микроскоп и фотоаппарат. Этот продукт теперь заархивирован. |
Ссылки
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
- Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
